KR102440783B1 - 폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 유-무기 복합체 - Google Patents

폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 유-무기 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 유-무기 복합체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 유·무기 복합체의 제조방법은 간단한 과정을 통해 상온에서의 반응을 통하여 폴리페놀 기반의 미네랄 입자를 제조하고, 이를 생체적용이 적합한 지지체 상에 코팅하여 골 재생 및 골 유착 효과가 뛰어난 유·무기 복합체를 고효율로 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 바이오 미네랄이 코팅된 유·무기 복합체는 골 이식재, 차폐막, 임플란트 등 다양한 골 재생 촉진 에 활용할 수 있는 용 다양한 소재의 개발에 활용될 수 있다.

Description

폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 유-무기 복합체{PREPARATION METHOD OF ORGANIC-INORGANIC COMPLEX COATED WITH MINERAL PARTICLE BASED ON POLYPHENOL AND ORGANIC-INORGANIC COMPLEX PREPARED BY THE METHOD}
본 발명은 폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 유-무기 복합체에 관한 것이다.
인간을 포함한 척추동물은 뼈의 재생 능력을 가지고 있지만, 질병이나 사고 또는 노화 등에 의해 뼈의 일부가 손실되어 수복되지 않는 경우가 발생한다. 일반적으로 뼈와 같은 골 조직의 결손부의 재생을 위해 특정 부위에 골이식재를 채운 후 차폐막으로 처리하는 방식으로 연조직의 개입을 막아 골 재생유도 활성을 높이는 골유도 재생술을 이용한다.
이러한 골유도 재생술을 위해서는 골에 결손이 생겼을 때 자연적인 재생과정을 증대시키고, 손상된 골세포들의 접착, 성장 및 분화를 위한 적합한 환경을 제공할 수 있는 골이식재와 차폐막이 필요하다. 이와 같은 골이식재와 차폐막은 수술 시에 손쉽게 조작이 가능해야 하며, 수술 이후에도 강도와 성질이 생체 내에서 그대로 유지될 수 있어야 한다.
한편, 한국특허공개 제10-2003-0022425호는 특정 생분해성 고분자와 커플링제를 일정비율로 반응시켜 커플링된 생분해성 고분자를 제조하고, 상기 커플링된 생분해성 고분자에 다시 가수분해가 가능한 세라믹 전구체와 수용성 칼슘염을 첨가한 후 졸-겔 반응을 통하여 유·무기상이 결합되어, 골 흡수 현상을 억제시킬 수 있는 유·무기 복합체의 제조방법에 관하여 개시하고 있으나, 이러한 유·무기 복합체는 물리적 강도를 충분히 확보하기가 어렵고 골조직을 효과적으로 유도시키지 못하며, 그 제조방법이 복잡하다는 문제가 있다.
이에 본 발명은 상온에서 이루어지는 간단한 과정을 이용하여 금속이온과 폴리페놀의 자가조립에 의해 미네랄 입자가 제조되고, 제조된 미네랄 입자가 유기물 표면에 빠르게 코팅되어, 골 재생 및 골 유착 효과가 뛰어난 유-무기 복합체를 제조할 수 있는 방법 및 이에 따라 제조된 유-무기 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,
(a) 모의체액(simulated body fluid, SBF)과 폴리페놀을 혼합하여 미네랄 입자를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 미네랄 입자를 지지체 표면에 코팅하는 단계;를 포함하는, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 미네랄이 코팅된 유-무기 복합체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 미네랄이 코팅된 유-무기 복합체를 포함하는 골 재생 촉진용 이식재를 제공한다.
본 발명에 따른 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법은 간단한 과정을 통해 상온에서의 반응으로 폴리페놀 기반의 미네랄 입자를 제조하고, 이를 생체적용이 적합한 지지체 상에 코팅하여 골 재생 및 골 유착 효과가 뛰어난 유-무기 복합체를 고효율로 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체는 골 이식재, 차폐막, 임플란트 등 다양한 골 재생 촉진에 활용할 수 있는 다양한 소재의 개발에 활용될 수 있다
도 1은 폴리페놀을 이용하여 제조되는 미네랄 입자의 형성과정을 나타낸 것이다.
도 2는 10배 농도의 모의체액(10X SBF)을 이용한 제조된 미네랄 입자의 구조와 크기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 5배 농도의 모의체액(5X SBF)을 이용한 미네랄 입자의 표면과 내부 구조를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 폴리페놀에 의하여 형성된 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 지지체의 종류에 따른 유-무기 복합체의 표면 구조를 주사현미경을 이용하여 확인한 이미지이다.
도 6은 실제 체내 골조직의 미네랄 입자의 구조를 주사전자현미경을 이용하여분석한 이미지이다.
도 7은 본 발명에 따른 유-무기 복합체와 체내 존재하는 미네랄 성분인 수산화인회석(hydroxyapatite)을 X-선 회절분석 방법을 통하여 측정한 결과를 비교한 것이다.
도 8은 폴리페놀의 종류에 따른 유-무기 복합체의 표면 구조를 주사현미경을 이용하여 확인한 이미지이다.
도 9는 본 발명에 따른 유-무기 복합체의 항산화 효과를 확인하기 위하여, Tunel assay를 통하여 세포사멸 신호를 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 유-무기 복합체의 항산화 효과를 확인하기 위하여, qPCR 분석을 통해 세포사멸 관련 유전자(BCL-XL, BAX)와 항산화 유전자 (SOD-1, GPX-1)의 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 유-무기 복합체의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 활성산소 측정법(DCF-DA assay)을 이용하여 세포 내부의 활성산소의 발생 여부를 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 유-무기 복합체의 골분화 유도 효과를 확인하기 위하여, Ca assay를 통해 세포의 골분화 정도를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 유-무기 복합체의 골분화 유도 효과를 확인하기 위하여, 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)를 통하여 골분화 마커 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 유-무기 복합체가 이식된 두개골 결손 동물모델(생쥐)을 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 유-무기 복합체가 이식된 두개골 결손 동물모델(생쥐)의 골 재생 정도를 확인하기 위한 미세단층촬영법(μCT) 분석 이미지이다.
도 16은 본 발명에 따른 유-무기 복합체가 이식된 두개골 결손 동물모델(생쥐)의 재생된 골 부피를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 유-무기 복합체가 이식된 두개골 결손 동물모델(생쥐)의 재생된 골 면적을 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서의 유·무기 복합체는 폴리페놀을 포함하여 형성된 미네랄 입자 자체 및 형성된 미네랄 입자가 코팅된 유기물질을 포괄하는 것을 의미한다.
본 발명은 하나의 양태로, (a) 모의체액(simulated body fluid, SBF)과 폴리페놀을 혼합하여 미네랄 입자를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 미네랄 입자를 유기 지지체 표면에 코팅하는 단계;를 포함하는, 폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 모의체액은 유사체액은 인체의 혈장 내의 이온상태와 유사하게 만든 인공 혈장 용액으로, 원소 주기율 표의 1족 금속의 일가 양이온, 2족 금속의 2가 양이온, H2PO4 - 및 SO4 2-를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Na+, K+, Mg2+, Ca2+, H2PO4 - 및 SO4 2-를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 폴리페놀은 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate), 카테킨(catechin), 카테킨-3-갈레이트(catechin-3-gallate), 갈로카테킨(gallocatechin), 갈로카테킨-3-갈레이트(gallocatechin-3-gallate), 카테킨 갈레이트(Catechin gallate), 에피카테킨(Epicatechin), 갈로카테킨 갈레이트(Gallocatechin gallate), 에피갈로카테킨(Epigallocatechin), 갈릭산(Gallic acid), 탄닌산(Tannic acid) 및 퀘르세틴(Quercetin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 (a) 단계에서는 모의체액과 폴리페놀의 혼합물에 NaHCO3를 더 첨가하여 미네랄 입자를 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 미네랄 입자의 형성은 10 내지 40℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 40℃ 보다 바람직하게는 30 내지 40℃에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 하나의 구체적인 실시예로, 상기 지지체는 생체 내에서 무독성인 고분자를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 바이오 셀룰로오스, 폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL), 폴리락테이트-코-글라이콜레이트(poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리락트산(Poly Lactic Acid, PLA), 폴리-L-락트산(Poly-L-lactic acid, PLLA), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 폴리락테이트-코-카프로락톤(Poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), 폴리글리콜산 (Poly(glycolic acid), PGA), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리오쏘에스테르(Polyorthoester, POE), 알루미나 (Alumina), 폴리스티렌(Polystyrene, PS) 및 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로, 상기 제조방법에 따라 제조된, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체를 제공한다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로, 상기 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체를 포함하는, 골 재생 촉진용 이식재를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 폴리페놀을 이용한 미네랄 입자 제조
본 실시예 1에서는 폴리페놀을 이용하여 미네랄 입자를 제조하였다. 미네랄 입자의 형성과정은 도 1에 나타낸 바와 같다.
구체적으로, 하기 표 1의 구성성분을 포함하는 농축된 모의체액(10X SBF 또는 5X SBF) 30 ml에 폴리페놀로 탄닌산(Tannic acid, TA)을 사용하여 폴리페놀이 포함된 미네랄 입자를 제조하기 위한 용액을 제작하였다. 상기 용액에 NaHCO3를 첨가하여 미네랄화를 개시하였다. 이 때 사용한 모의체액, 폴리페놀 및 NaHCO3의 농도는 하기 표 2에 나타난 바와 같다.
성분 NaCl KCl CaCl2 MgCl2 NaHPO4
농도(g/L) 58.43 0.3738 3.6754 1.016 1.4
구분 모의체액
(농도, ml)		 폴리페놀(탄닌산)
(mg/ml)		 NaHCO3
(M)
샘플 1 10배, 30 1 0.01
샘플 2 10배, 30 5 0.01
샘플 3 10배, 30 10 0.01
샘플 4 10배, 30 20 0.01
샘플 5 10배, 30 30 0.01
샘플 6 5배, 30 1 0.01
샘플 7 5배, 30 10 0.01
이 후, 샘플 1 내지 5는 1시간 동안, 그리고 샘플 6 내지 7은 30분 동안 37℃에서 용액을 교반하여 미네랄 입자를 제조하였다. 제조된 미네랄 입자는 고속원심분리기를 이용하여 4,000 rpm의 속도에서 10분 간 원심 분리하였다. 분리된 미네랄 입자를 세정한 후 동결건조기를 이용하여 건조하였다.
실시예 2: 폴리페놀을 이용하여 제조된 미네랄 입자의 구조 확인
상기 실시예 1에 따라 제조된 샘플 1 내지 5의 입자의 구조와 크기를 확인하였다. 입자의 구조는 주사현미경을 이용하여 확인하였고, 입자의 크기는 동적광산란(Dynamic light scattering, DLS) 분석방법을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 10배 농도의 모의체액(10X SBF)을 이용한 샘플 1 내지 5의 경우에는 입자의 지름이 400 ~ 2,000 nm인 것으로 확인되었다. 탄닌산(Tannic acid, TA)의 농도가 증가함에 따라 미네랄 입자가 더 고르게 형성이 되며, 크기가 작아지는 경향을 확인할 수 있다.
상기 실시예 1에 따라 제조된 샘플 6 내지 7의 입자의 표면과 내부 구조를 확인하였다. 입자의 표면과 내부 구조는 주사현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 5배 농도의 모의체액(5X SBF)을 이용한 샘플 6 내지 7의 경우에는 입자의 지름이 30~80 μm인 것으로 확인되었다. 입자는 표면이 매끈한 형태이며 내부는 해면골과 유사한 다공성 구조를 나타내는 것으로 확인되었다. 탄닌산의 농도가 증가함에 따라 전체 입자 크기와 내부 다공성 구조가 작아지는 경향을 확인할 수 있다.
실시예 3: 미네랄 입자가 코팅된 고분자 복합체 제조
본 실시예 3에서는 미네랄 입자(폴리페놀 기반의미네랄 입자)가 코팅된 복합체를 제조하였다. 본 실시예 3에 따른 복합체의 제조 과정은 도 4에 나타낸 바와 같다.
구체적으로, 10배로 농축된 모의체액(10X SBF) 25ml에 폴리페놀을 첨가하여 혼합 용액을 제조하였다. 이 후, 7 cm x 7 cm의 크기의 정사각형의 지지체를 사각 플라스크에 고정한 후, 상기 혼합 용액에 침지하여 4시간 동안 37℃에서 60 rpm의 속도로 교반하여 반응시켜, 폴리페놀에 의하여 형성된 미네랄 입자가 코팅된 복합체를 제조하였다. 이 때 사용한 모의체액, 폴리페놀 및 지지체는 하기 표 3에 나타난 바와 같다.
구분 모의체액
(농도, ml)		 폴리페놀 지지체
에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)
(mg/ml)		 퀘르세틴
(QC)
(mg/ml)		 탄닌산
(TA)
(mg/ml)
샘플 8 10배, 25 1 - - 폴리스티렌(PS)
샘플 9 10배, 25 1 - - 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)
샘플 10 10배, 25 1 - - 유리(Glass)
샘플 11 10배, 25 1 - - 티타늄(Titanium)
비교예 1 10배, 25 - - - 폴리스티렌(PS)
비교예 2 10배, 25 - - - 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)
비교예 3 10배, 25 - - - 유리(Glass)
비교예 4 10배, 25 - - - 티타늄(Titanium)
샘플 12 10배, 25 1 - - 폴리카프로락톤(PCL)
샘플 13 10배, 25 - 1 - 폴리카프로락톤(PCL)
샘플 14 10배, 25 - - 1 폴리카프로락톤(PCL)
비교예 5 10배, 25 - - - 폴리카프로락톤(PCL)
실시예 4: 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체 제조 및 표면 구조 확인
3-1. 지지체 종류에 따른 유-무기 복합체의 표면 구조 확인
지지체의 종류에 따른 미네랄 입자의 코팅여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 3에 따라 제조된 유-무기 복합체(샘플 8 내지 11 및 비교예 1 내지 4)의 표면 구조와 실제 골조직의 미네랄 입자의 구조를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 지지체의 종류와 상관없이, 모의체액과 폴리페놀을 혼한합 용액을 사용한 경우 지지체 상에 폴리페놀 기반의 미네랄 입자가 형성(샘플 8 내지 11)되어 있는 반면, 모의체액(금속이온만 존재)만을 사용한 경우에는 지지체의 상에 바이오 미네랄 입자가 형성되지 않음(비교예 1 내지 4)을 확인할 수 있다.
도 6은 실제 체내 골조직의 미네랄 입자의 구조를 주사전자현미경을 이용하여분석한 결과이다. 도 5와 도 6을 비교하여 보면, 본 발명에 따른 미네랄 입자는 체내 골조직의 미네랄 입자와 구조가 유사함을 알 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유-무기 복합체(샘플 12)와 체내 존재하는 미네랄 성분인 수산화인회석(hydroxyapatite)을 X-선 회절분석(X-ray Diffraction; XRD) 방법을 통하여 측정한 결과를 비교하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유-무기 복합체는 체내 미네랄 성분과 유사한 X-선 회절분석 결과를 나타냄을 알 수 있다.
상기 분석 결과로부터, 본 발명에 따른 미네랄 입자는 구조가 매우 조밀하게 형성되고 실제 생체 내의 미네랄 입자의 구조와 매우 유사함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 다양한 재질의 지지체를 이용하여 실제 체내 조직과 유사한 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체를 효과적으로 제조할 수 있음을 확인할 수 있다.
4-2. 폴리페놀 종류에 따른 유-무기 복합체의 표면 구조 확인
폴리페놀 종류에 따른 미네랄 입자의 코팅여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 3에 따라 제조된 유-무기 복합체(샘플 12 내지 14 및 비교예 5)의 표면 구조를 주사현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 폴리페놀로 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, 샘플 12), 퀘르세틴(Quercetin, 샘플 13), 탄닌산(TA, 샘플 14)로 사용한 경우 모두 표면 작용기가 없는 폴리카프로락톤(PCL) 지지체 상에 매우 고르고 조밀한 바이오 미네랄(미네랄화된 폴리페놀) 구조를 형성하는 것을 확인할 수 있다. 폴리페놀이 첨가되지 않은 비교예 6(SBF only)의 경우 미네랄 형성이 조밀하지 못하고 쉽게 떨어져 나오는 것을 확인(붉은색 화살표)할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 다양한 종류의 폴리페놀을 이용하여 바이오 미네랄이 코팅된 유-무기 복합체를 효과적으로 제조할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 5: 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 기능성 평가
5-1. 유-무기 복합체를 이용한 3차원 미세조직체 제조
본 발명에 따른 바이오 미네랄이 코팅된 유-무기 복합체의 생물학적 특성 및 기능성을 평가하기 위하여, 상기 실시예 3의 방법에 따라 제조된 유-무기 복합체를 이용하여 3차원 미세조직체를 제조하였다.
샘플 12의 유-무기 복합체 10 μg(mE-CF)을 줄기세포에서 분화된 인간지방세포(Human adipose derived stem cells, hADSCs)와 융합하여 3차원 미세조직체를 제조하였다. 본 실시예에 사용된 모의체액, 폴리페놀, 지지체 및 세포는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
구분 모의체액
(농도)		 폴리페놀 지지체 세포
에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)(mg/ml)
mE-CF1 10배, 25ml 0.2 폴리카프로락톤
(PCL)		 hADSCs
mE-CF2 10배, 25ml 1.0 폴리카프로락톤 (PCL) hADSCs
비교예 6 - - - hADSCs
5-2. 항산화 효과 평가
본 발명에 따른 유-무기 복합체의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1.에 따라 제조된 3차원 미세조직체(mE-CF1 및 mE-CF2)가 있는 배양액에 500 μM의 H2O2를 처리하고 24시간 동안 배양을 진행하였다. 배양 후 Tunel assay를 통하여 세포사멸 신호를 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 유독한 농도의 활성산소(H2O2)를 처리하여 배양한 결과 세포로만 이루어진 3차원 미세조직체(비교예 6, Cell only)는 높은 세포사멸 신호를 나타낸 반면, 본 발명에 따른 유-무기 복합체를 이용한 샘플(mE-CF1 및 mE-CF2) 에서는 세포사멸 신호가 거의 관찰되지 않는 것으로 나타났다.
qPCR 분석을 통해 세포사멸 관련 유전자(BCL-XL, BAX)와 항산화 유전자 (SOD-1, GPX-1)의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, qPCR 분석 결과 본 발명에 따른 유-무기 복합체를 이용한 샘플(mE-CF1 및 mE-CF2)에서는 항산화 유전자(SOD-1, GPX-1)와 항세포사멸 유전자(BCL-XL)가 높게 발현되는 것으로 나타났으며, 세포사멸 유발 유전자(BAX)는 낮게 발현되는 것으로 나타났다. 세포로만 이루어진 3차원 미세조직체(비교예 6, Cell only)는 이와 반대의 경향성을 보이는 것을 확인하였다.
추가적으로 활성산소 측정법(DCF-DA assay)을 이용하여 세포 내부의 활성산소의 발생 여부를 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 실제로 본 발명에 따른 고분자 복합체를 이용한 샘플(mE-CF1 및 mE-CF2)에서는 비교예 5의 샘플(Cell o)nly)과 비교하여 H2O2 처리 후(H2O2(+))에도 활성산소가 발생하지 않은 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 바이오 미네랄이 코팅된 유-무기 복합체는 생체 내 적용 시 항산화 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
5-3. 골분화 유도 효과 평가
본 발명에 따른 유-무기 복합체의 골분화 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1.에 따라 제조된 3차원 미세조직체를 1일 및 14일 동안 각각 배양하였다. 배양된 3차원 미세조직체를 조직파쇄기로 분쇄한 후, Ca assay를 통해 세포의 골분화 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 14일 동안 3차원 줄기세포구조체를 배양한 결과, 비교예 5의 샘플(Cell only)과 비교하여 본 발명에 따른 유-무기 복합체를 이용한 샘플(mE-CF1 및 mE-CF2)에서는 현저히 많은 양의 칼슘이 존재함을 확인할 수 있다. 특히, 배양 1일차에 비교하여 그 양이 증가한 것으로 나타났다. 이를 통해 mE-CF1 및 mE-CF2의 3차원 미세조직체에서는 세포가 골분화하여 칼슘을 생산하였음을 알 수 있다.
또한, 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)를 통하여 골분화 마커 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유-무기 복합체를 이용한 샘플(mE-CF1 및 mE-CF2)에서만 골분화 마커 단백질(Runx2, OPN)들이 발현된 것을 확인할 수 있다.
본 실시예를 통하여 본 발명에 따른 바이오 미네랄이 코팅된 유-무기 복합체는줄기세포의 골분화 유도 효과가 우수함을 알 수 있다.
5-4. in vivo 골 재생능 평가
본 발명에 따른 유-무기 복합체의 생체 내에서의 골 재생능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 5-1.에 따라 제조된 3차원 미세조직체(mE-CF2)를 도 14에 도시한 바와 같이 두개골 결손 동물모델(생쥐)에 이식하였다.
상기 3차원 미세조직체(mE-CF2)를 동물모델의 골 결손 부위에 이식한 후 8주 후 미세단층촬영법(μCT) 분석을 통해 골 재생 정도를 확인하였다. 상기 3차원 미세조직체(mE-CF2)를 처리한 그룹(mE-CF/spheroid)의 in vivo 골 재생능을 평가하기 위하여 대조군으로 골결손만 존재하는 그룹(Defect only)과 비교예 6의 3차원 미세조직체로 처리된 그룹(CF/spheroid)를 선정하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 미세단층촬영법으로 확인한 결과 본 발명에 따른 3차원 미세조직체를 처리한 그룹(mE-CF/spheroid)은 다른 그룹들(Defect only 및 CF/spheroid)과 차별화된 골 재생 효과가 관찰되었다.
도 16 및 도 17에 나타난 바와 같이, 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 결과 재생된 골 부피(BV/TV)(도 16)와 면적(도 17)은 본 발명에 따른 3차원 미세조직체를 처리한 그룹(mE-CF)에서 월등히 높은 것으로 나타났다.
이를 통해 본 발명에 따른 유-무기 복합체를 포함하는 3차원 미세조직체는 생체 내에서의 골 재생능이 우수함을 알 수 있고, 본 발명에 따른 미네랄화된 폴리페놀 입자(바이오 미네랄)가 코팅된 유-무기 복합체는 골 재생 촉진용 이식재 등 골 재생을 촉진할 수 있는 생체 내 이식 소재 등으로 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있다. .
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

  1. (a) 모의체액(simulated body fluid, SBF)과 폴리페놀을 혼합하여 미네랄 입자를 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 미네랄 입자를 지지체 표면에 코팅하는 단계;를 포함하고,
    상기 폴리페놀의 농도는 1mg/ml 내지 30mg/ml 이고,
    상기 미네랄 입자의 지름은 30μm 내지 80μm 또는 400 nm 내지 2,000nm인 것인,
    미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 모의체액은 Na+, K+, Mg2+, Ca2+, H2PO4 - 및 SO4 2-를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리페놀은 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate), 카테킨(catechin), 카테킨-3-갈레이트(catechin-3-gallate), 갈로카테킨 (gallocatechin), 갈로카테킨-3-갈레이트(gallocatechin-3-gallate), 카테킨 갈레이트(Catechin gallate), 에피카테킨(Epicatechin), 갈로카테킨 갈레이트(Gallocatechin gallate), 에피갈로카테킨(Epigallocatechin), 갈릭산(Gallic acid), 탄닌산(Tannic acid) 및 퀘르세틴(Quercetin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 모의체액과 폴리페놀의 혼합물에 NaHCO3를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 미네랄화는 10 내지 40℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 지지체는 바이오 셀룰로오스, 폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL), 폴리락테이트-코-글라이콜레이트(poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리락트산(Poly Lactic Acid, PLA), 폴리-L-락트산(Poly-L-lactic acid, PLLA), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 폴리락테이트-코-카프로락톤(Poly(lactide-co-caprolactone), PLCL), 폴리글리콜산 (Poly(glycolic acid), PGA), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리오쏘에스테르(Polyorthoester, POE), 알루미나 (Alumina), 폴리스티렌(Polystyrene, PS) 및 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따라 제조된, 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체.
  8. 제 7 항에 따른 미네랄 입자가 코팅된 유-무기 복합체를 포함하는, 골 재생 촉진용 이식재.
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