KR102181502B1

KR102181502B1 - 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법 및 상기 방법에 따라 제조된 고분자 복합체

Info

Publication number: KR102181502B1
Application number: KR1020180096049A
Authority: KR
Inventors: 신흥수; 사지쉬쿠마르; 이상민
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2020-11-23
Also published as: KR20200020391A

Abstract

본 발명은 본 생체적합성을 가지는 고분자 재료에 난용성인 EGCG를 용이하게 코팅할 수 있는 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 고분자 복합체를 제공하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법은 일가 금속 양이온 이용함으로써, 난용성인 EGCG를 생체적합성 재료에 용이하게 코팅할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체는 체내에서 EGCG를 초기에는 방출하여, 목표 조직에 즉각적인 골 재생 및 골 흡수 방지 효과를 나타내고, 이후 일정 이상의 양이 안정적으로 고분자 복합체 표면에 잔존함으로써, 지속적으로 목표 조직에 EGCG의 상기 효과를 장기간 동안 유도할 수 있다.

Description

에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법 및 상기 방법에 따라 제조된 고분자 복합체{PREPARATION METHOD OF POLYMER COMPLEX COATED WITH EPIGALLOCATECHIN GALLATE AND THE POLYMER COMPLEX PREPARED BY THE SAME METHOD}

본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 고분자 복합체에 관한 것이다.

에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG; Epigallocatechin gallate)는 녹차에 함유된 카테킨 화합물 중 하나이다. EGCG는 자연적인 항산화제로서 자체 독성이 없고 피부와 신체 기능에 있어 피부 노화 억제, 항산화, 항염, 항암, 지방 분해 효과가 있다고 알려져 있으며, 추출물의 형태로 포함되어 식이보충제, 식품, 음료, 치료제 등의 제품으로 개발되고 있다.

한편 난용성인 EGCG를 제제로 사용하기 위하여, 다른 분자들과 화학적 가교를 이용해 에멀젼을 만드는 방법(한국등록특허 제1299148호), 고분자 캡슐에 감싸 전달하는 방법 등이 연구되고 있으나, 이들 연구는 EGCG를 항산화, 항암, 항염, 항바이러스 등의 다양한 기능을 입증하고 이용하는 것에 초점이 맞춰져 있을 뿐으로, 구강전달제제 및 주사 전달법이 주를 이루고 있다. 그러나, 이와 같은 전달법 또는 제제형태는 EGCG를 목표 조직에 특이적으로 국소 전달하기 어렵고, 체내 순환체계를 통해 EGCG를 전달하는 방식이기 때문에, EGCG가 충분히 효과를 발휘하도록 체내에서 장시간 유지시키는 것이 어렵다는 문제가 있다.

종래의 EGCG를 이용한 체내 전달법 또는 제제형태는 EGCG의 항산화, 항암, 항 염, 항바이러스 효과 등을 얻기 위한 것으로, EGCG를 목표 조직에 특이적으로 국소 전달하기 어렵고, EGCG의 골 재생 효과 및 골 흡수 방지효과를 충분히 발휘하도록 체내에서 장시간 유지시키는 것이 어렵다. 한편, EGCG는 난용성 물질로 생분해성 생체적합성을 가지는 고분자 재료와 안정적으로 결합하여 복합체를 제조하기가 어렵다.

본 발명은 이러한 종래의 문제점을 해결하기 위해, 생체적합성을 가지는 고분자 재료에 난용성인 EGCG를 용이하게 코팅할 수 있는 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 고분자 복합체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,

본 발명은 버퍼용액에 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate) 및 일가 금속 양이온 첨가하여 중합용액을 제조하는 단계 및 상기 중합용액에 고분자 중합체를 침지하는 단계를 포함하는, 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체를 포함하는 골 재생 촉진용 차폐막을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체를 포함하는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 차폐막을 제공한다.

본 발명에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법은 일가 금속 양이온 이용함으로써, 난용성인 EGCG를 생체적합성 재료에 용이하게 코팅할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체는 체내에서 EGCG를 초기에는 방출하여, 목표 조직에 즉각적인 골 재생 및 골 흡수 방지 효과를 나타내고, 이후 일정 이상의 양이 안정적으로 고분자 복합체 표면에 잔존함으로써, 지속적으로 목표 조직에 상기 EGCG의 효과를 장기간 동안 유도할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 EGCG가 코팅된 고분자 복합체의 응용방법의 일실시예를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법의 일실시예를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 일가 금속 양이온의 유무에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트의 코팅양의 차이를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 표면을 FT-IR로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 표면을 XPS로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 코팅 시간에 따른 고분자 중합체 위에 코팅되는 EGCG의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 코팅 시간에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체 표면의 물과의 접촉각을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체를 증류수에 담구어 시간이 지남에 따라 표면에 잔존하는 에피갈로카테킨 갈레이트의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 생체적합성을 인간 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells(hADSCs))를 형광염색하여 확인한 것이다.
도 10은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체 표면에 상기 줄기세포가 부착하는 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 생체적합성을 DNA assay를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 골 재생효과를 실험하기 위해 hADSCs의 세포질 염색의 결과를 통해 세포의 형태를 확인한 것이다.
도 13은 ALP를 통해 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 hADSCs의 골 분화 촉진 효과를 실험한 결과이다.
도 14는 칼슘량 정량을 통해 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 hADSCs의 골 분화 촉진 효과를 실험한 결과이다.
도 15는 Alizarin red S 염색을 통해 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체로 인한 hADSCs의 칼슘의 분포의 변화를 측정한 결과이다.
도 16은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체에서 골형성 세포분화의 마커인 OPN 단백질의 발현을 면역염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체에서 골 분화의 마커인 ALP 유전자 발현 정도를 Real-time PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체에서 골 분화의 마커인 RUNX2 유전자 발현 정도를 Real-time PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체에서 골 분화의 마커인 OPN 유전자 발현 정도를 Real-time PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체가 파골 세포를 사멸시키는 효과를 측정한 결과를 이미지로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체가 파골 세포를 사멸시키는 효과를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 22는 파골 세포를(Raw 264.7) 동일한 조건으로 7일간 배양한 후 세포질 염색을 기반으로 다핵을 가지는 세포의 수를 측정한 이미지를 나타낸 것이다.
도 23은 파골 세포를(Raw 264.7) 동일한 조건으로 7일간 배양한 후 세포질 염색을 기반으로 다핵을 가지는 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 24는 TRAP assay 결과를 통해 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체가 TRAP의 농도에 미치는 영향을 측정한 것이다.
도 25는 파골 세포의 분화 및 성장과 관련된 유전자의 발현 정도 평가 결과에서 TRAP, CTSK, NFATC1, RANK 네 가지의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 두개골 뼈가 결손된 동물모델에서 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체(E-PL)의 골 재생 촉진 효과를 나타낸 것으로, 이의 micro-CT 이미지분석 결과 및 재생된 골의 면적과 부피를 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 두개골 뼈가 결손된 동물모델에서 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체(E-PCL)의 골 재생 촉진 효과를 나타낸 것으로, 이의 micro-CT 이미지분석 결과 및 재생된 골의 면적과 부피를 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 동물모델에서 재생된 골 조직 절편을 헤마톡실린(hematoxylin) & 에오신(eosin) 염색 및 골드너의 트리크롬(goldner's trichrome) 염색법을 이용해 조직학적으로 골 재생 부분의 조직 모습 및 조직 종류를 관찰한 것이다.

본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG; Epigallocatechin gallate)가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법 및 상시 방법에 따라 제조된 고분자 복합체를 제공한다.

본 발명은 하나의 양태로, (S1) 버퍼용액에 에피갈로카테킨 갈레이트 및 일가 금속 양이온 첨가하여 중합용액을 제조하는 단계; 및 (S2) 상기 (S1) 단계의 중합용액에 고분자 중합체를 침지하는 단계를 포함하는, 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법을 제공한다.

상기 버퍼용액은 Bis-Tris, BES, CAPS, EPPS, TAPS, Bicine, Tris, Tricine, TAPSO, HEPES, TES, MOPS, PIPES, Cacodylate, SSC, MES, Succinic acid 버퍼용액 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 Bis-Tris 버퍼용액일 수 있다.

상기 버퍼용액은 pH가 6.0 내지 8.0일 수 있으며, 바람직하게는 6.5 내지 7.5일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 6.8 내지 7.2일 수 있다.

상기 일가 금속 양이온은 원소 주기율 표의 1족의 금속의 일가 양이온일 수 있으며, 바람직하게는 Na⁺일 수 있다.

상기 고분자 중합체는 폴리(엡실론-카프로락톤)(poly(epsilon-caprolactone, PCL), 폴리락트산(poly lactic acid, PLA), 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoate, PHA), 폴리부틸렌 숙시네이트(polybutylene succinate, PBS), 폴리부틸렌 숙시네이트 아디페이트(polybutylene succinate adipate, PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(polybutylene adipate terphtalate, PBAT), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO) 및 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리(엡실론-카프로락톤)(poly(epsilon-caprolactone, PCL) 또는 폴리락트산(poly lactic acid, PLA)을 포함한 것일 수 있다.

에피갈로카테킨 갈레이트는 난용성 물질로 일반적으로 고분자 중합체에 잘 코팅되지 않으며, 코팅층이 형성되더라도 일정 시간 이상 유지되지 않는다.

본 발명은 상기 일가 금속 양이온을 이용함으로써, 한 단계의 공정만으로도 손쉽게 에피갈로카테킨 갈레이트를 고분자 중합체의 표면에 효과적으로 코팅할 수 있다.

에피갈로카테킨 갈레이트는 코팅이 이루어지는 동안 자체적인 산화 반응을 통해 중합되며, 일가 금속 양이온과 상기 중합된 에피갈로카테킨 갈레이트에 존재하는 카테콜 작용기 사이의 추가적인 협동 반응(coordination reaction)이 일어나게 된다. 상기 협동 반응을 통해 π-π 스태킹(stacking), 전하 이동(charge transfer) 또는 수소 결합과 같은 다양한 반응이 유도되어 궁극적으로 고분자 중합체의 표면에 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 일가 금속 양이온이 고분자 중합체의 표면에 에피갈로카테킨 갈레이트를 코팅하는 메커니즘에서 중요한 역할을 하며, 상기 일가 금속 양이온의 존재 여부에 따라 에피갈로카테킨 갈레이트의 코팅량에 현저한 차이가 나타난다는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체는 코팅된 에피갈로카테킨 갈레이트의 전체량 중에서 20 내지 35%가 초기에 복합체 코팅 표면으로부터 방출될 수 있다.

이는 코팅된 에피갈로카테킨 갈레이트가 다양한 결합에 의하여 존재하기 때문이며, 상대적으로 약하게 결합된 코팅 부분이 초기에 표면으로부터 방출되는 것이다. 상기 방출량 외에 나머지 에피갈로카테킨 갈레이트는 안정적으로 복합체 표면에 잔존하게 된다.

본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체는 이식된 체내에서 EGCG가 방출되어 일차적으로 주변 세포들과 상호작용을 할 수 있도록 함으로써, 목표 조직에 즉각적인 골 재생 촉진 및 골 흡수 방지 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체는, EGCG 방출 이후에도, 일정 이상의 EGCG가 유효한 양으로 고분자 복합체 표면에 안정적으로 잔존함으로써, 지속적으로 목표 조직에 골 재생 촉진 및 골 흡수 방지 효과를 장기간 동안 나타낼 수 있다. 바람직하게 상기 고분자 복합체는 에피갈로카테킨 갈레이트를 최초 코팅량의 65 내지 80%로 유지할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 코팅된 EGCG 중 약 30%가 일정기간 동안 방출되고, 이후엔 방출 후 남은 나머지 EGCG는 안정적으로 고분자 복합체 표면에 남아있는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체는 생체적합성이 매우 우수하다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조). 또한, 골 재생 효과(실시예 5 참조), 골 흡수 방지 효과(실시예 6 참조)가 매우 우수하다는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 실제 동물모델에서도 뛰어난 골 재생 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 7 참조).

따라서, 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체는 골 재생 촉진 또는 골 흡수 방지용 의료용 소재로 이용될 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니나, 조직공학용 이식체, 임플란트 차폐막, 손상된 조직의 재생을 위한 지지체, 골 재생 유도 물질의 전달 소재 및 골다공증 치료용 소재 등으로 이용될 수 있다(도 1 참조).

이에 본 발명은 다른 양태로서, 본 발명은 상기 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체를 포함하는 차폐막을 제공한다.

하나의 구체적인 실시예로, 상기 차폐막은 골 재생 촉진용 차폐막일 수 있다.

또 하나의 구체적인 실시예로, 상기 차폐막은 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 차폐막일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 고분자 중합체 제조

고분자 중합체를 제조하기 위한 재료로 5.7-8.5 dl/g 정도의 물성을 갖는 폴리락트산(poly lactic acid, PLA)을 사용하였다. PLA 고분자를 HFIP용액에 2mg/ml 농도로 녹여 전압 13kV, 콜렉터 회전속도는 100rpm로 전기 방사하여 고분자 중합체를 제조하였다. 제조된 PLA 고분자 중합체는 실험에 이용하기에 앞서 하루 동안 습기를 완전히 제거한 다음, 70% 에탄올과 자외선광으로 멸균하였다.

실시예 2. 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조

도 2는 본 발명에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 제조방법의 일실시예를 개략적으로 나타낸 것이다.

에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 1mg/ml를 NaCl 100mM이 포함된 비스-트리스(bis-Tris) 버퍼용액(pH 7.0) 100mM에 용해시켜 중합용액을 제조하였다. 상기 중합용액에 실시예 1에서 제조한 고분자 중합체를 침지하여 코팅하였다. 모든 단계는 37℃에서 수행되었다. EGCG가 코팅된 고분자 복합체를 증류수로 완전히 행군다음 실온에서 건조시켰다.

비교예로 코팅하는 조건에서 일가 금속 양이온이 EGCG의 코팅량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 제조방법에서 다른 조건은 동일하게 유지한 채, NaCl만을 첨가하지 않고 고분자 복합체를 제조하였다.

실시예 3. 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 표면 분석

본 발명의 제조방법에 따라 EGCG가 자가중합을 통해 고분자 중합체의 표면에 코팅되는 정도를 농도와 시간에 따라 분석하였다. 고분자 중합체의 표면 형태는 SEM 이미징 (JEOL JSM 6330F, Tokyo, Japan)을 사용하여 가시화하였다. 코팅된 EGCG의 양은 수정된 Folin-Ciocalteu 절차를 이용하여 검출하였다. FT-IR과 XPS의 분석법을 통해 표면에 존재하고 있는 원소를 분석하였고, 시간이 지남에 따라 잔존하고 있는 EGCG의 양을 평가하여 EGCG의 전달에 대한 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 NaCl의 유무가 코팅에 미치는 영향을 확인하였을 때, NaCl이 없는 조건에서 제조된 고분자 복합체(비교예)는 EGCG가 코팅이 거의 되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 이로써, 일가 금속 양이온의 존재가 EGCG코팅 메커니즘에서 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

도 4에 나타낸 바와 같이 FT-IR의 결과를 통해 EGCG가 코팅된 고분자 복합체의 표면 상에서 C=C, Phenol-OH peak를 관찰할 수 있었다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이 XPS 결과를 통해 EGCG의 페놀 기능성기에 의해 나타나는 특성을 관찰함에 따라 EGCG가 차폐막 표면에 성공적으로 코팅된 것을 확인할 수 있었다. 도 4 및 도 5에서, PL은 실시예 1의 EGCG가 코팅되지 않은 고분자 중합체를 의미하고, E-PL은 실시예 2의 EGCG가 코팅된 고분자 복합체를 의미한다.

한편, 도 6에 나타낸 바와 같이, 코팅 시간이 증가할 수록 고분자 중합체 위에 코팅되는 EGCG의 양이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이 물과의 접촉각(water contact angle)을 측정한 결과, 시간에 따라 EGCG 코팅의 양이 늘어나면서 접촉각이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터, EGCG의 코팅량이 증가함에 따라 고분자 복합체 표면의 친수성이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, EGCG가 코팅된 고분자 복합체를 증류수에 담그어 표면에 잔존하는 양을 측정해 보았을 때, 5일차까지 코팅된 EGCG 중 약 30%가 방출되고 이후엔 안정적으로 표면에 남아있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 생체적합성 평가

실시예 2의 EGCG가 코팅된 고분자 복합체(E-PL)와 EGCG가 코팅되지 않은 실시예 1의 고분자 중합체(PL) 위에서의 생장 정도 차이를 측정하였다.

고분자 복합체 위에 인간의 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells(hADSCs))를 배양한 후, 부착 정도를 측정하기 위해 형광염색을 실시하였다.

그 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 고분자 중합체(PL)에 비하여 실시예 2의 EGCG가 코팅된 고분자 복합체 표면(E-PL)에서 상기 줄기세포가 더 넓게 부착됨을 확인할 수 있었다.

또한, DNA assay를 실시하여 실시예 2의 EGCG가 코팅된 고분자 복합체(E-PL)와 EGCG가 코팅되지 않은 실시예 1의 고분자 중합체(PL) 위에서의 생장 정도 차이를 비교실험하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 줄기세포는 EGCG가 코팅된 고분자 복합체에서 통계적으로 유의한 정도의 생장율 향상을 나타냄을 알 수 있었다.

본 실시예 4의 실험결과로부터, 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체는 생체적합성이 매우 우수함을 알 수 있었다.

실시예 5. 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 골 재생 효과 평가

본 실시예 5에서는 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체의 골 유도 재생효과를 확인하였다. 지방 유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells(hADSCs))를 EGCG가 코팅된 고분자 복합체 표면에 분화유도 물질을 포함하지 않는 배양액 조건으로 배양한 다음, ALP 분석, Alizarin red S staining, 칼슘량 측정, 유전자 분석, 면역염색을 통해 줄기세포의 골 분화 정도를 측정하였다. 이들 분석 및 측정 방법을 통해 EGCG의 골 재생 능력을 평가할 수 있었다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 7일 동안 고분자 복합체 위에서 성장 배지조건으로 키워진 hADSCs의 세포질 염색의 결과를 통해 세포 형태를 확인할 수 있었다. 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, ALP(도 13) 및 칼슘량 정량(도 14)을 통해 본 발명에 따른 EGCG가 코팅된 고분자 복합체는 hADSCs의 골 분화를 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, Alizarin red S 염색을 통해 칼슘의 분포가 달라지는 결과를 확인할 수 있었다.

또한, 동일한 조건으로 세포를 배양한 후 OPN과 같은 골형성 세포분화의 마커인 단백질의 면역염색을 하였다. 그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 EGCG가 코팅된 고분자 복합체(E-PL)에서 발현량 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 유전자 발현 정도를 Real-time PCR을 통해 확인한 결과, 도 17 내지 도 19에 나타낸 바와 같이, 골 분화의 마커인 ALP(도 17), RUNX2(도 18), OPN 유전자(도 19)의 발현량이 상승하는 것을 확인할 수 있었다.

본 실시예 5의 실험 결과, 본 발명에 따른 EGCG가 코팅된 고분자 복합체가 우수한 골 재생을 촉진 효과를 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 골 흡수 방지 효과 평가

본 실시예 6에서는 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체가 골다공증의 원인인 골 흡수 작용을 방지하는 효과를 확인하기 위해 파골 세포(Raw 264.7 cell)의 세포반응을 실험하였다. 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체의 표면에서 키워진 파골 세포의 생존 정도를 Live & Dead assay를 통해 확인하고 RANKL 염색 및 유전자 분석을 통해 EGCG가 효과적으로 골 흡수를 방지하는 효과를 가지는지 여부를 확인하였다.

파골 세포(Raw 264.7)를 하루 동안 본 발명에 따른 고분자 복합체 위에서 배양하여 세포의 생존율을 Live & Dead assay를 통해 확인하였다. 그 결과, 도 20 및 도 21에 나타낸 바와 같이, EGCG가 코팅된 경우(E-PL)에 세포가 더 많이 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 체내의 골에서 흡수작용을 일으키는 파골 세포가 EGCG의 영향을 받아 사멸하고 골 흡수 작용을 억제하기 때문인 것으로 유추되었다.

또한, 파골 세포(Raw 264.7)를 동일한 조건으로 7일 동안 배양한 후 세포질 염색을 통해 다핵을 가지는 세포의 수를 측정하였다. 그 결과, 도 22 및 도 23에 나타낸 바와 같이, EGCG가 코팅된 고분자 복합체에서 파골 세포가 확연히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 24에 나타낸 바와 같이, 파골 세포의 기능과 관련된 TRAP assay 결과를 통해 EGCG가 코팅된 고분자 복합체에서 TRAP의 농도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었으며, 도 25에 나타낸 바와 같이 파골 세포의 분화 및 성장과 관련된 유전자의 발현 정도 평가 결과에서 TRAP, CTSK, NFATC1, RANK 네 가지의 mRNA 발현량이 EGCG그룹에서 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

본 실시예 6의 실험 결과를 통해 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체가 우수한 골 흡수 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 동물실험을 통한 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체의 골 재생능력 평가

두개골 결손 동물모델을 제조한 후, 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체를 차폐막으로 제조하여 이식하고 뼈의 재생 정도를 2 달 동안 평가하였다. 또한, 본 실시예 7에서는 고분자 중합체로 폴리락트산(PL) 대신 폴리(엡실론-카프로락톤)(PCL)을 이용하여 제조한 고분자 복합체를 추가적으로 제조하여 실험을 실시하였다.

실시예 7-1. 동물실험 모델 제작

직경 4 mm의 원형으로 두개골 상처를 두 개 만들고 실시예 2의 EGCG가 코팅된 고분자 복합체(E-PL)와 EGCG가 코팅되지 않은 실시예 1의 고분자 중합체(PL)를 직경 5 mm 정도의 원형으로 제작한 후 차폐막 형식으로 상처 부위를 덮어주었다. 동일한 방법으로 EGCG가 코팅된 고분자 복합체(PCL)와 EGCG가 코팅되지 않은 고분자 중합체(PCL)이용하여 동물실험 모델을 제작하였다.

실시예 7-2. Micro-CT 이미지 분석 및 계산

결손부위 위쪽 상처 부위를 상기 고분자 복합체와 고분자 중합체를 도입한 후 단단히 봉합해 준 뒤, 2 달 동안 쥐의 건강상태를 점검하며 2 달째 되는 날에 쥐를 안락사 한 후 두개골 부위를 들어내어 micro-CT로 재생된 부위를 이미지분석하고 재생된 골의 면적과 부피를 계산하였다.

그 결과, 도 26 및 도 27에 도시한 바와 같이, 차폐막으로 EGCG가 코팅된 고분자 복합체(E-PL 및 E-PCL)를 이용한 경우가 ECGC가 코팅되지 않은 고분자 중합체(PL 및 PCL)를 이용한 경우 보다 많은 골 재생이 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7-3. 조직학적 이미지 분석

Micro-CT 분석 이후 조직학 분석을 위해 각 그룹마다 두 개씩 샘플을 선정하고 조직이 실험 도중 손상되는 것을 방지하기 위해 멸균된 거즈와 스펀지로 감싸서 조직학용 케이스에 고정시켰다. 이후 처리를 거친 조직 절편은 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색 & 골드너의 트리크롬(goldner's trichrome) 염색법을 이용해 조직학적으로 골 재생 부분의 조직의 모습 및 조직의 종류 등을 관찰하였다.

그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, 두 이미지는 동일한 경향성을 보였으며, 본 발명에 따라 EGCG가 코팅된 고분자 복합체를 차폐막으로 이용한 그룹에서는 EGCG가 코팅되지 않은 고분자 중합체를 차폐막으로 이용한 다른 그룹들과 비교하여 두껍게 골화된 콜라겐 조직을 관찰할 수 있었다.

본 실시예 7의 실험 결과를 통해 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체는 실제 동물모델에서도 우수한 골 재생 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

이와 같이 본 발명에 따라 제조된 EGCG가 코팅된 고분자 복합체는 골 재생 효과가 우수하므로 골 재생 촉진용 차폐막에 적용될 수 있으며, 또한. EGCG가 골 흡수율을 낮추므로 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 차폐막에 적용될 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

(S1) 버퍼용액에 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate) 및 Na⁺를 첨가하여 중합용액을 제조하는 단계; 및
(S2) 상기 (S1) 단계의 중합용액에 점성이 5.7 - 8.5 dl/g인 고분자의 중합체를 침지하는 단계;를 통해 제조되고,
코팅된 에피갈로카테킨 갈레이트가 최초 코팅량 중 20 내지 35%가 방출되고, 최초 코팅량의 65 내지 80%는 차폐막 상에 유지되는 것을 특징으로 하는, 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 골 재생 촉진 차폐막용 고분자 복합체.
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제 1 항에 있어서,
상기 버퍼용액은 pH가 6.0 내지 8.0인 것을 특징으로 하는, 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 골 재생 촉진 차폐막용 고분자 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 고분자 중합체는 폴리(엡실론-카프로락톤)(poly(epsilon-caprolactone, PCL), 폴리락트산(poly lactic acid, PLA), 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoate, PHA), 폴리부틸렌 숙시네이트(polybutylene succinate, PBS), 폴리부틸렌 숙시네이트 아디페이트(polybutylene succinate adipate, PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(polybutylene adipate terphtalate, PBAT), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO) 및 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 골 재생 촉진 차폐막용 고분자 복합체.
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제 1 항에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체를 포함하는 골 재생 촉진용 차폐막.
제 1 항에 따른 에피갈로카테킨 갈레이트가 코팅된 고분자 복합체를 포함하는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 차폐막.