KR101483250B1 - 우수한 골조직 재생 효과를 갖는 복합 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

우수한 골조직 재생 효과를 갖는 복합 지지체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

생분해성 고분자, 칼슘포스페이트 및 식물성 폴리페놀을 포함하는, 우수한 골조직 재상 효과를 갖는 복합 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 복합 지지체는 현저히 우수한 생체적합성, 생체 분해성, 다공성 및 부착성 뿐만 아니라 항균성 및 항염증성을 갖는다.

Description

우수한 골조직 재생 효과를 갖는 복합 지지체 및 이의 제조방법{composite scaffold having excellent osteogenesis and its manufacturing method}
우수한 골조직 재생 효과를 갖는 복합 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 생분해성 고분자, 칼슘포스페이트 및 식물성 폴리페놀을 포함함으로써, 우수한 생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성뿐만 항균성 및 항염증성을 갖는 복합 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
조직공학에서 인공기질은 세포외기질 (ECM)로서 역할을 한다. 유기 고분자를 주성분으로 하고 있는 세포외 기질은 조직의 구조를 지지하고, 세포들이 부착하여 증식 및 조직을 형성할 수 있도록 한다.
최근 손상된 생체 조직의 복원을 위하여 적절한 지지체에서 조직 세포를 체외 배양하여 실제의 장기와 유사한 구조와 기능을 가진 인공 조직을 형성함으로써, 생체내의 결손된 장기나 조직을 재생하거나 대체하려는 연구가 진행되고 있다. 체내에서 분리된 조직 세포를 체외에서 삼차원 구조를 가진 조직의 형태로 재구성하기 위해서는 지지체가 필수적이다.
현재 생체적합성이 있는 생분해성 고분자를 이용하여 세포/지지체 복합체를 체내 이식하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성 뿐만 아니라 항균성 및 항염증성이 우수한 복합 지지체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
일 측면에서,
생분해성 고분자, 칼슘포스페이트 및 식물성 폴리페놀을 포함하는 우수한 골조직 재생 효과를 갖는 복합 지지체가 개시된다.
다른 측면에서,
용매에 수용성 고분자를 용해시켜 고분자 템플레이트 용액을 형성하는 단계;
상기 고분자 템플레이트 용액에 칼슘전구체 용액, 인전구체 용액 및 식물성 폴리페놀을 첨가하여, 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 제조하는 단계; 및
상기 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 생분해성 고분자 용액에 분산시킨 후 전기방사하여, 섬유상 복합지지체를 제조하는 단계를 포함하는, 우수한 골조직 재생 효과를 갖는 복합 지지체가 개시된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 폴리페놀-칼슘포스페이트/생분해성 나노 고분자로 이루어진 복합 지지체는 칼슘포스페이트/생분해성 고분자로 이루어진 복합 지지체에 비해 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상의 현저히 우수한 생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성뿐만 아니라 항균성 및 항염증성을 나타낼 수 있다.
도1은 (a) 폴리카프로락톤 지지체, (b) 실시예 1의 복합 지지체, (c) 실시예 2의 복합 지지체, (d) 실시예 3의 복합 지지체, 및 (e) 비교예의 복합 지지체의 SEM 사진을 나타낸다.
도 2는 상기 도 1에 따른 지지체 (a)-(e)의 UV/vis spectrometer흡광도를 나타낸다.
도 3은 상기 도 1에 따른 지지체 (a)-(e)의 증식력과 부착력 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 상기 도 1에 따른 지지체 (a)-(e)의 세포의 분화력 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 상기 도 1에 따른 지지체 (a)-(e)의 골 형성력 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 상기 도 1에 따른 지지체 (a)-(e)의 골기질 형성력 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 상기 도 1에 따른 지지체 (a) 및 (d)의 항균성 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 상기 도 1에 따른 지지체 (a)-(e)의 항염증성 측정 결과를 나타낸다.
본 명세서에 달리 정의되어 않는 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들어, "가지는", "이루어지는" 및 "구성되는"는 제한적이지 않다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성뿐만 아니라 항균성 및 항염증성이 우수한 복합 지지체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
지지체는 다공성 구조 내에 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 거의 대부분의 인체내 세포는 부착되어 성장되는 부착세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸된다. 따라서, 지지체는 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 적합한 환경을 제공할 수 있어야 한다.
지지체에 요구되는 물리화학적 특성으로는 생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성 등이 있다. 상기 용어 "생체적합성"은 지지체의 조건 중 가장 중요한 성질로서 이식물 또는 그 부산물이 생체 내에서 면역학적 염증반응을 일으키지 않는 성질을 의미한다. 상기 용어 "생체분해성"은 물리적, 기능적으로 지지체가 흡수되며 새로운 조직으로 대체되는 성질을 의미한다. 분해된 산물은 대사되거나 확산되어 몸 밖으로 빠져나가며 새롭게 생긴 조직만 남게 된다. 이때 지지체가 분해되는 속도와 새로운 조직이 생기는 속도를 맞춰주어야 한다. 분해가 너무 빠르면 새로운 조직이 형태를 가질 수 없고, 분해가 너무 느리면 새로 생성되는 기질의 확산을 방해하기 때문이다, 상기 용어 "다공성"은 지지체에 있어서 영양분과 부산물이 안팎의 소통을 통해 세포의 생활력을 유지하기 위해 충분한 크기와 수를 유지하는 성질을 의미한다. 상기 용어 "부착성"은 세포의 원래 환경을 만들기 위해 필요한 성질을 의미한다.
한편, 인체는 이물질이 침입하면 거부반응을 일으켜 인체를 보호하려는 기전을 가지고 있다. 따라서, 실제 장기와 유사하고, 제 기능을 충분히 발휘할 수 있으며, 이물 반응을 유발시키지 않는 생체재료의 개발이 절실히 요구되고 있다. 현재까지 인공장기용 재료인 생체재료는 생체적합성과 기계적 물성만을 개선하기 위한 방향으로 연구되어 왔으며, 이식 시에 발생하는 감염 줄이기 위한 연구는 거의 진행되고 있지 않다.
이에 본 발명자들은 생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성 뿐만 아니라 항균성 및 항염증성이 우수한 복합지지체를 개발하기에 이르렀다.
일 구현예에 따르면, 생분해성 고분자, 칼슘포스페이트 및 식물성 폴리페놀을 포함하는 복합지지체가 제공된다.
생분해성 고분자
상기 구현예에서, 생분해성 고분자는 폴리카프롤락톤(polycaprolactones), 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트(polyhydroxybutyrates), 폴리히드록시발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(polyorthocarbonates), 옥살산염 폴리알킬렌(polyalkylene oxalates), 숙신산염 폴리알킬렌(polyalkylenesuccinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성 단백질(modified proteins), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체(terpolymers), 이들의 조합물(combinations) 또는 혼합물(mixtures), 이들의 중합체 혼합물(polymer blends) 등으로부터 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생분해성 고분자는 복합지지체의 중량을 기준으로, 85 중량% 내지 95 중량%, 또는 80 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 상기 생분해성 고분자의 양이 95 중량%를 초과하는 경우, 복합지지체용 용액의 가파른 점도 상승에 의해 섬유 방사가 어려우므로 복합지지체의 제조가 불가능하다. 또한, 상기 생분해성 고분자의 양이 85 중량% 미만인 경우, 고분자의 섬유 형성능이 떨어지므로 직경이 균일한 섬유상 지지체로 얻기가 어렵고 다공성 및 생체분해성이 열악할 수 있다.
일 실시예에서, 폴리카프로락톤이 복합지지체의 중량을 기준으로 80 중량%의 양으로 사용되었다.
칼슘포스페이트
상기 구현예에서, 칼슘포스페이트는 인산의 수소 원자가 칼슘 원자로 치환된 화합물로서, 치아 및 골과 같은 인체 조직을 구성하는 대부분의 무기질은 아파타이트 결정형태의 칼슘포스페이트(CaP)로 구성되어 있으며, 인체 내에 이식된 칼슘포스페이트의 표면은 체액을 매개로 골 조직에 존재하는 아파타이트와 화학적으로 결합하여 골과 일체화될 수 있다.
상기 칼슘포스페이트의 칼슘전구체 물질은 질산칼슘, 염화칼슘, 불화칼슘, 요오드화칼슘 및 수산화칼슘 등과 같은 수용성칼슘염, 또는 칼슘알콕사이드(Ca(OR)2) 및 다른 칼슘 에스테르를 포함하는 1종 또는 2종 이상의 유기칼슘화합물으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 칼슘포스페이트의 인전구체 물질은 산화인, 인산수소암모늄, 인산나트륨, 인산칼륨 등을 포함하는 1종 또는 2종 이상의 수용성인산염, 또는 알콕사이드 인산염, 페녹사이드 인산염, 에스테르 아인산염(P(OR)3), 에스테르 인산염(OP(OR)3), 포스폰산(HOP(OR)3) 또는 인산(ROP(OR)3) 등을 포함하는 하나 또는 그 이상의 유기인산화합물으로부터 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다 (상기 식에서, R은 알킬 또는 알킬기를 나타낸다).
상기 칼슘포스페이트는 예를 들면 하이드록시아파타이트, 옥시아파타이트, 카본네이트아파타이트, 플로로아파타이트, 클로로아파타이으, 브로모아파타이트, 트리칼슘포스페이트, 옥타칼슘포스페이트, 다이칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트로부터 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 칼슘포스페이트의 평균 입자 크기(직경)는 1000 nm 미만, 8000 nm 미만, 1000 nm 미만, 300 nm 미만, 100 nm 미만, 또는 50 nm 미만일 수 있다. 상기 칼슘포스페이트의 평균 입자 크기가 1000 nm를 초과하는 경우, 복합지지체 제조용 용액에서 침전이 빠르게 일어나므로 칼슘포스페이트 입자가 균일하게 분포된 복합지지체의 제조가 불가능해질 수 있다.
상기 칼슘포스페이트는 생분해성 고분자의 중량을 기준으로, 5 중량% 내지 15 중량%, 또는 10 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 상기 칼슘포스페이트의 양이 15 중량%를 초과하는 경우, 복합지지체의 표면이 불균일할 뿐만 아니라 다량의 비드 발생에 의해 복합지지체의 제조가 어려워 지고, 생체분해성이 열악해 질 수 있다. 또한, 상기 칼슘포스페이트의 양이 5 중량% 미만인 경우, 원하는 세포부착성, 세포성장 효과 및 항균성이 나타나지 않는다.
일 실시예에서, 1000 nm 미만의 직경을 갖는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HAP)가 5 중량%, 10 중량% 및 15 중량%의 양으로 사용되었다.
식물성 폴리페놀
상기 구현예에서, 식물성 폴리페놀은 식물에서 발견되는 화학물질의 일종으로서 분자 하나 이상의 페놀기를 가지고 있다.
상기 식물성 폴리페놀은 플라보노이드류, 이소플라보노이드류, 네오플라보노이드류, 갈로탄닌류 및 엘라고탄닌류, 카테콜 및 그의 유도체, 예를 들면 DL-3,4-디히드톡시페닐알라닌 또는 DL-DOPA, 카테콜아민류, 예를 들면 3-히드록시티라민 또는 도파민, 플로로글루시놀, 페놀산, 예를 들면, 카페인산, 디히드로카페인산, 프로트카테츄인산, 클로로겐산, 이소클로로겐산, 겐티신산, 호모겐티신산, 갈산, 헥사히드록시디페닌산, 엘라진산, 로즈마린산 또는 리토스펌산, 페놀산 유도체, 특히 그들의 에스테르류 또는 그들의 헤테로사이드류, 쿠르쿠민, 폴리히드록실화된 쿠마린류, 폴리히드록실화된 리그난류 또는 네오리그난류와 같은 모노시클릭 또는 폴리시클릭 식물성 폴리페놀류, 또는 실리마린과 같이 한가지 이상의 식물성 폴리페놀 또는 그의 유도체로부터 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물성 폴리페놀은 생성되는 칼슘포스페이트의 중량을 기준으로, 3 중량% 내지 10 중량%, 또는 5 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 상기 식물성 폴리페놀의 양이 10 중량%를 초과하는 경우, 함량 증가에 따라 최종 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트의 입자 크기가 1000 nm이상으로 가파르게 증가하므로 복합지지체의 제조에 사용하기가 어렵다. 또한, 상기 식물성 폴리페놀의 양이 3 중량% 미만인 경우, 원하는 항균성 및 항염증성 효과가 나타나지 않는다.
일 실시예에서, 에피갈로카테킨 갈레이트 (Epigallocatechin gallate, EGCG)가 칼슘포스페이트 무기 입자의 중량을 기준으로 3 중량%, 5 중량% 및 10 중량%의 양으로 사용되었다.
다른 구현예에 따르면, 생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성 뿐만 아니라 항균성 및 항염증성이 우수한 복합지지체의 제조방법이 제공된다. 상기 방법은 용매에 수용성 고분자를 용해시켜 고분자 템플레이트 용액을 형성하는 단계; 상기 고분자 템플레이트 용액에 칼슘전구체 용액, 인전구체 용액 및 식물성 폴리페놀을 첨가하여, 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 생분해성 고분자 용액에 분산시킨 후 전기방사하여, 섬유상 복합지지체를 제조하는 단계를 포함하는 방법을 포함할 수 있다.
(a) 고분자 템플레이트 용액 형성단계
상기 구현예에서, 용매는 염화 메틸렌(methylene chloride), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 아니솔(anisole), 아세트산 에틸(ethyl acetate), 아세트산 메틸(methylacetate), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone), 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 물, 2-피롤리돈(2-pyrollidone), 구연산 트리에틸(triethyl citrate), 유산 에틸(ethyl lactate), 프로필렌 카보네이트(propylene carbonate), 벤질 알코올(benzyl alcohol), 벤조산 벤질(benzyl benzoate), 미글리올 810(Miglyol810), 이소프로판올(isopropanol), 에탄올(ethanol), 초임계 이산화탄소(super critical carbon dioxide), 아세토니트릴(acetonitrile) 또는 물로부터 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 증류수가 사용되었다.
상기 수용성 고분자는 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산 또는 피브리노겐로부터 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 알지네이트가 사용되었다.
(b) 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자 제조단계
상기 구현예에서, 단계 (b)는 상기 고분자 템플레이트 용액에 칼슘전구체 용액, 인전구체 용액 및 식물성 폴리페놀을 혼합하는 단계; 원심분리함으로써 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 침전물을 얻는 단계; 및 상기 침전물을 증류수로 세척하여 잔량의 불순물을 제거하여 나노크기의 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 입자를 얻는 단계로 이루어질 수 있다.
상기 칼슘전구체 용액, 인전구체 용액 및 식물성 폴리페놀을 혼합하는 단계에서 분산성을 높이기 위해 필요에 따라 분산제를 더욱 포함할 수도 있다. 예를 들면, 상기 분산제로서는 폴리에틸렌 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(c) 폴리페놀-칼슘포스페이트/생분해성 고분자 복합지지체 형성 단계
상기 구현예에서, 단계 (c)는 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 생분해성 고분자가 10 중량% 내지 20 중량% 녹아있는 용액에 분산시키는 단계; 및 전기방사함으로써 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트가 도입된 섬유상 복합지지체를 얻는 단계로 이루어질 수 있다.
상기 구현예에서, 칼슘포스페이트와 생분해성 고분자의 중량비는 1:20 내지 3:20일 수 있다. 상기 칼슘포스페이트와 생분해성 고분자의 중량비가 1:20 미만의 경우, 원하는 세포부착성, 세포성장 효과 및 항균성이 나타나지 않을 수 있다. 또한, 상기 중량비가 3:20을 초과하는 경우 균일한 표면형상을 지닌 복합지지체의 제조가 어려워지고, 생체분해성이 열악해 질 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 폴리페놀-칼슘포스페이트/생분해성 고분자로 이루어진 복합지지체는 칼슘포스페이트/생분해성 고분자로 이루어진 복합 지지체에 비해 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상의 현저히 우수한 생체적합성, 생체분해성, 다공성 및 부착성 뿐만 아니라 항균성 및 항염증성을 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 복합 지지체는 치과 임플란트, 피부장치(percutaneous devices), 치주 처리(periodontal treatment), 치조골 증강(alveolar augmentation), 정형외과학(orthopedics), 턱과 얼굴 수술(maxillofacial surgery), 이비인후과학(otolaryngology) 또는 척추 수술 (spinal surgery) 등의 분야에서 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1
증류수 100 g에 알지네이트 0.1 g을 용해시켜 고분자 템플레이트 용액을 제조하였다. 상기 고분자 템플레이트 용액에 질산칼슘 용액, 제2인산암모늄용액 및 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 첨가하였다. 이때, 칼슘과 인의 비율은(Ca/P)은 1.67이 되도록 하였다. 상기 혼합물을 암모니아수를 사용하여 pH를 10으로 조절한 후, 원심분리함으로써 EGCG-함유 칼슘포스페이트 침전물을 얻었다. 상기 EGCG-함유 칼슘포스페이트를 5회 증류수를 사용함으로써 세척하여 EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 제조하였다.
폴리카프로락톤 15 중량%가 용해된 용액에 상기 EGCG -함유 칼슘포스페이트 나노입자를 5 중량% 양으로 분산시켰다. 상기 분산된 용액을 12 시간 상온에서 교반시킨 후 전기방사함으로써 복합 지지체를 제조하였다. 전기방사는 전압은 15 kV, 방사거리 15 cm, 용액 방사 속도는 4 ml/h로 고정하여 수행하였다.
실시예 2
EGCG -함유 칼슘포스페이트 나노입자를 10 중량%의 양으로 분산시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 복합 지지체를 제조하였다.
실시예 3
EGCG -함유 칼슘포스페이트 나노입자를 15 중량%의 양으로 분산시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 복합 지지체를 제조하였다.
비교예
EGCG를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 복합 지지체를 제조하였다.
1. 복합 지지체의 표면 관찰
상기 실시예 및 비교예에서 제조한 복합 지지체들의 형태를 주사전자현미경으로 조사하고 FTIR을 사용하여 복합 지지체의 표면을 관찰하였다. (a) 폴리카프로락톤 지지체, (b) 실시예 1의 복합 지지체, (c) 실시예 2의 복합 지지체, (d) 실시예 3의 복합 지지체, 및 (e) 비교예의 복합 지지체의 관찰 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1(a)로부터 폴리카프로락톤 지지체의 경우 섬유의 방향이 무질서한 부직포 형태이며, 비드 (bead)가 형성되지 않고 잘 발달된 섬유상을 나타냄을 알 수 있었다. 도 1(b) 내지 (d)로부터, EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자가 폴리카프로락톤 지지체 표면에 성공적으로 분포되었음을 알 수 있었다. 도 1(e)로부터 EGCG-비함유 칼슘포스페이트 나노입자가 폴리카프로락톤 지지체 표면에 성공적으로 분포되었음을 알 수 있었다.
또한, 상기 도 1에 나타낸 지지체 (a) 내지 (e)의 흡광도를 UV/vis spectrometer을 사용하여 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2(a)로부터 폴리카프로락톤 지지체의 경우 2949, 2865 cm-1 부근에서 CH2 stretching 피크, 1700, 1295 cm-1 부근에서 카보닐 (carbonyl, C=O) stretching 피크, 1293, 1157 cm-1에서 각각 C-O, C-C stretching 피크를 확인하였다. 도 2(b) 내지 (d)로부터 EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체의 경우에도 폴리카프로락톤 지지체와 동일한 특성을 나타내는 피크가 확인되었다. 한편, 560 cm- 1부근에서 PO4 3 - stretching 피크가 관찰됨으로써 칼슘포스페이트 입자가 성공적으로 폴리카프로락톤에 혼합되었음을 확인하였다. 도 2(e)는 560 cm- 1부근에서 PO4 3 - stretching 피크가 관찰됨으로써 EGCG-비함유 칼슘포스페이트 나노입자가 성공적으로 폴리카프로락톤에 혼합되었음을 확인하였다.
2. 복합 지지체의 생체적합성 조사
상기 도 1에 나타낸 지지체 (a) 내지 (e)의 생체적합성을 골형성 전구세포 (MC3T3-E1, ATCC)를 사용하여 측정하였다.
세포의 증식력과 부착력 측정
세포 배양액으로 10% 우태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 α-MEM을 사용하였다. 24-well 세포 배양 플레이트에 상기 실시예 및 비교예에서 제조한 복합지지체를 넣었다. 그 다음, 접착이 복합지지체의 표면에서만 일어날 수 있도록, 유리링을 복합지지체 위에 두었다. 상기 지지체들은 사용하기 전에 UV를 이용하여 멸균처리 한 다음 무균상태에서 25 % 에탄올로 소독하고 PBS (phosphate buffered saline)를 이용하여 2회 세척하였다. 상기 골형성 전구세포를 5 × 104 cells/well의 농도로 복합지지체에 올린 링 안쪽으로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 환경에서 4시간, 1, 3, 5, 7일 동안 배양하여 세포의 부착과 증식을 관찰하였다. 각 배양기간 후 MTT 분석을 시행하였다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3으로부터 조골세포의 초기 점착은 폴리카프로락톤 지지체 3(a)와 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 3(b)-3(e) 모두에서 비슷한 경향을 나타내었다. 그러나 3일이 경과한 이후부터는, 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 3(b)-3(e) 의 증가 속도가 폴리카프로락톤 지지체 3(a) 보다 현저히 빠르게 진행되었다. 또한, 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 3(b)-3(e) 중에서도, EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 3(b)-3(d)가 EGCG-비함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 3(e) 보다 우수한 세포적합성을 나타내었다. 이는 복합 지지체 3(b)-3(d) 내에 존재하는 폴리페놀로 인한 폴리페놀-세포간의 상호작용 및 세포-세포간의 상호작용을 통해 세포의 증식 거동이 더욱 활발하게 이루어졌기 때문이다.
한편, 칼슘포스페이트가 15 % 함유된 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 3(d)의 생체적합성이 가장 우수하였다.
세포의 분화력 측정
알칼린 포스파타제(ALP) 활성 실험을 수행함으로써, 조골세포의 분화를 확인하였다. 3, 5, 7, 14일 동안 상기 복합 지지체 상에서 조골세포를 배양 후 ALP Assay Kit (GENTAUR)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 단, 필요한 부분에서는 부분적으로 본 실험에 적합하도록 재설계하였다. 재현성 검토를 위해서 각 복합지지체마다 4개 이상의 동일한 시료를 사용하여 상기 모든 세포 테스트를 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4로부터, 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 4(b)-4(e)의 조골세포 분화가 폴리카프로락톤 지지체 4(a) 보다 활발하게 이루어짐으로써 흡광도가 증가하였음을 확인하였다. 또한, 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 4(b)-4(e) 중에서도, EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 4(b)-4(d)가 EGCG-비함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 4(e) 보다 우수한 조골세포 분화를 나타내었다.
한편, 칼슘포스페이트가 15% 함유된 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 4(d)의 조골세포 분화력이 가장 우수하였다.
세포의 골 형성력 측정
조골세포 단백질인 오스테오칼신(OCN)의 발현 정도를 관찰함으로써, 지지체에서 세포의 골 형성능을 확인하였다. 3, 5, 7, 14일 동안 상기 복합 지지체 상에서 세포를 배양 후 OCN ELISA Kit (MyBioSource)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5로부터, 배양시간에 따라 세포에 의해 생성되는 OCN의 증가하기는 하였으나, 그 변화 정도는 크지 않았음을 확인하였다. 따라서, 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 5(b)-5(e)의 조골세포의 석회화가 폴리카프로락톤 지지체 5(a)에서의 석회화와 마찬가지로, 진행 중에 있음을 알 수 있다.
골 기질 형성력 관찰
알리자린 레드 에스(ARS) 염색을 사용함으로써, 석회화된 골 기질 형성 정도를 확인하였다. 세포를 4시간, 1, 3, 5, 7일 동안 배양하고, 포름알데히드로 세포를 고정한 후 ARS용액으로 염색하였다. 염색된 alizarin red를 정량화하기 위하여 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC)용액을 첨가하였다. 그 다음, 염색된 dye를 용해시켜 추출한 후, ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6으로부터, 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 6(b)-6(e)의 석회화가 폴리카프로락톤 지지체 6(a) 보다 활발하게 이루어짐으로써 흡광도가 증가하였음을 확인하였다. 또한, 폴리카프로락톤/칼슘포스페이트 복합 지지체 6(b)-6(e) 중에서도, EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 6(b)-6(d)가 EGCG-비함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 6(e) 보다 우수한 석회화를 나타내었다. 이는 EGCG가 화학물질들로부터 세포를 보호하는 항산화제로 작용함으로써, 뼈 손실을 방지하여 골밀도 향상시켰기 때문이다.
한편, 칼슘포스페이트가 15% 함유된 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 6(d)의 석회화가 가장 우수하였다.
3. 복합 지지체의 항균성 및 항염증성 조사
상기 도 1에 나타낸 폴리카프로락톤 지지체 (a) 및 EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 (d) 내에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, ATCC 6538)을 배양함으로써 상기 지지체들의 항균성을 관찰하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7로부터, 폴리카프로락톤 지지체 7(a)에서는 황색포도상구균이 빠른 속도로 증식하였으나, EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 7(d)에서는 황색포도상구균의 증식이 완전히 억제되었음을 확인하였다.
또한, 상기 도 1에 나타낸 지지체 (a) 내지 (e) 내에서 mouse 유래 탐식세포인 RAW264.7을 배양함으로써 상기 지지체들의 항염증성을 관찰하였다. 상기 탐식세포가 방출하는 염 pro-inflammatory 인자인 인터루킨-6(IL-6)의 양을 ELISA kit를 이용하여 정량한 후, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8로부터 EGCG-함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 8(b)-8(d)의 항염증성이 폴리카프로락톤 지지체 8(a) 및 EGCG-비함유 칼슘포스페이트 나노입자/폴리카프로락톤 복합 지지체 8(e)에서의 항염증성에 비해 30% 이상 개선되었음을 확인하였다.

Claims (12)

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  4. 생분해성 고분자는 복합지지체 전체 중량을 기준으로 86 중량% 내지 90 중량%를 함유하고, 칼슘포스페이트는 생분해성 고분자의 중량을 기준으로 11 중량% 내지 15 중량%의 양으로 함유되며 식물성 폴리페놀은 칼슘포스페이트의 중량을 기준으로 5중량%의 양으로 함유되는, 생분해성 고분자, 칼슘포스페이트 및 식물성 폴리페놀을 포함하는 골조직 재생용 복합 지지체.
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  7. 골조직 재생용 복합 지지체의 제조 방법으로, 상기 방법은:
    용매에 수용성 고분자를 용해시켜 고분자 템플레이트 용액을 형성하는 단계;
    상기 고분자 템플레이트 용액에 칼슘전구체 용액, 인전구체 용액 및 식물성 폴리페놀을 첨가하여, 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 제조하는 단계; 및
    상기 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 생분해성 고분자 용액에 분산시킨 후 전기방사하여, 섬유상 복합지지체를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
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  10. 제7항에 있어서,
    상기 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 나노입자를 제조하는 단계는:
    상기 고분자 템플레이트 용액에 칼슘전구체 용액, 인전구체 용액 및 식물성 폴리페놀을 혼합하는 단계;
    원심분리함으로써 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 침전물을 얻는 단계; 및
    상기 침전물을 증류수로 세척하여 잔량의 불순물을 제거하여 나노크기의 폴리페놀-함유 칼슘포스페이트 입자를 얻는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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