KR20080104932A

KR20080104932A - 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는나노섬유 부직포

Info

Publication number: KR20080104932A
Application number: KR1020070084818A
Authority: KR
Inventors: 권오형; 전가영
Original assignee: 금오공과대학교 산학협력단
Priority date: 2007-05-29
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2008-12-03

Abstract

본 발명은 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액과 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 혼합용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 세포성장인자가 첨가된 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 나노섬유 부직포의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 나노섬유 부직포에 관한 것이다.

본 발명에 따른 나노섬유 부직포를 이용하면 창상 치료용 소재로 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 나노섬유 부직포를 인공피부 또는 조직배양용 스캐폴드에 적용하면, 뛰어난 밀착성과 및 우수한 공기투과도로 인하여 외부로부터의 세균 침투에 의한 감염을 방지할 수 있으므로, 손상된 조직을 효율적으로 재생시킬 수 있는 효과가 있다.

키토산, PHBV, 세포성장인자, 인슐린, 나노섬유, 전기방사, 창상피복제

Description

키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포{Nanofiber Nonwoven Comprising Chitosan, Biodegradable Polymer and Cell Growth Factor and Method of Preparing Thereof}

본 발명은 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액과 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 혼합용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 세포성장인자를 첨가한 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 나노섬유 부직포의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 나노섬유 부직포에 관한 것이다.

피부는 인체 중 가장 큰 표면적을 차지하면서 면역 기능을 수행하는 기관으로서 외부의 미생물, 자외선, 화학물질 등 여러 가지 유해환경으로부터 인체를 보 호하는 역할 및 인체의 수분증발을 억제함으로써 탈수를 방지하고 체온을 조절하는 역할을 하고 있으므로, 물리적 자극에 강해야 하고 탄력성이 있어야 하며 인체가 생명체를 유지하는 동안 그 역할을 충분히 수행해야 한다.

심한 화상, 외상, 창상, 욕창, 피부질환 등 다양한 원인에 의한 피부손상은 흔하게 일어나고 있는데, 예를 들어 일차봉합이 불가능한 창상은 피부이식이 불가피하여 상기와 같은 기능 수행에 심각한 결함을 남기기도 한다. 따라서, 손상된 피부조직의 복구는 중요한 문제이며, 이를 위한 방법으로 현재, 환자 자신의 피부를 이식하는 자가이식(autograph), 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식(homograph 또는 allograph) 및 동물의 피부를 이식하는 이종이식(heterograph 또는 xenograph)의 세 가지 방법이 있다. 이들 방법 중, 자가이식이 가장 이상적이나 화상부위가 광범위한 경우 조직을 확보하는데 제한이 따르며 채취 부위가 새로운 상처부위로 남게 되는 어려움이 있고, 피부를 떼어낸 건강한 부위에 새로운 외상이 발생되어 환자의 고통이 증가하고 완치까지의 기간이 장기화되는 문제점이 있다. 특히 심한 화상의 경우 이식에 사용가능한 건강한 피부가 충분하지 않기 때문에 수차례에 걸친 이식수술이 필요하다. 한편, 동종 이식은 영구적인 생착보다는 상처주변부의 세포의 이동과 치유를 돕는 역할을 하는 바, 미국과 중국에서 사체에서 채취한 피부를 글리세롤 등에 냉동 보존하여 일시적인 보호제로서 사용하기도 하며 사체의 피부에서 면역반응을 일으킬 수 있는 세포들을 완전히 제거한 탈표피화/탈세포화된 진피(de-epidermized dermis)의 형태로 만들어서 사용하기도 한다.

인공 피부는 일시적 피복형(temporary skin equivalent), 이른바 창상 피복 재와, 배양피부 또는 체내 이식용인 영구 생착형(permanent skin equivalent)의 두 가지로 대별된다. 창상 피복재는 화상, 외상, 창상, 욕창 및 피부질환에 대하여 상처치유, 살균, 흉터조직방지, 흉터조직억제, 상처회복 등의 효능을 갖게 하고, 체내로부터의 수분 누출 방지, 삼출액의 흡수 및 외부로부터 잡균 침입과 감염방지의 역할을 한다. 현재 주로 사용되고 있는 창상 피복재용 드레싱재는 필름형, 하이드로 콜로이드형, 하이드로겔형, 부직포형, 폴리우레탄 폼형등이 있으며 콜라겐이나 천연 다당류인 알지네이트, 키틴, 키토산을 이용한 다공성 막이나 돼지가죽의 동결건조물 등으로 제조되어 여러 가지 제품이 임상학적으로 사용되고 있다.

한편, 키틴과 키토산은 무독성, 환경 친화성, 생분해성 및 생체 적합성이 우수하여 여러 의료용 분야에 많이 활용되고 있는데, 특히 Prudden 등은 갑오징어의 뼈의 분말이 상처의 초기치유에 기여한다는 발견을 하여, 이들 중 어떤 성분이 상처치유 효과에 기여하는가를 연구한 결과, 키틴의 구성단위인 N-아세틸글루코스아민과 키토산의 구성단위인 글루코스아민이 상처치유에 관여한다는 결론을 얻었다 (Prudden et al ., Proc . 1 st International Conference Chitin / Chitosan , MIT 296:297, 1977).

또한, 다이네쉬 등은 키틴과 키토산 및 이들을 이용한 화합물을 이용한 상처 치유제, 인공 피부, 약전성재료, 혈액 응집제, 인공신장막, 생분해성 수술용 봉합사, 항균성 재료로의 적용 가능성과 우수한 기능성을 보고한 바 있으며 (Dinesh et al., Rev . Macromol . Chem . Phys ., C40 (1), 69:83, 2000), 또한 마리에판 등은 상처치유의 목적으로 키토산 박막이 도포된 침대보를 이용하였을 때 흉터를 예방하고 상처치유를 촉진할 수 있다는 연구결과를 보고하고 있다 (Mariefan et al ., ILEE Engineering In Medicine and Biology November / December, 1999).

그 밖에도, 독일특허 제1906155호 및 제1906159호는 키틴, 키토산 관련 창상피복재에 관한 최초의 특허로서, 상기 특허에 따르면 분쇄된 키틴 분말이 상처 회복에 좋다고 기재되어 있으며, 영국특허 제1252373호에도 이와 유사한 내용을 제시하고 있다. 미국 특허 제3632754호, 제3914413호에는 키틴이 창상 치유를 촉진시킨다는 내용이 기재되었으며, 유럽특허 제0089152호, 일본특허 제86141373호 등에는 키토산을 케라틴 또는 콜라겐과 복합시킨 필름으로 만들어 창상 보호제로 사용하는데 대하여 기재되어 있다.

한편, 대한민국 특허공고공보 제2410호, 유럽특허 제0089153호, 일본특허 제86141373호 등은 키토산 혹은 키틴 유도체의 다당류와 케라틴 혹은 콜라겐 등의 단백질을 이용한 다당류와 단백질 사이의 복합체를 창상피복재로 사용하는 것에 대하여 기술하고 있으며, 대한민국 공개특허공보 제98-13801호에서는 키토산이 함침된 부직포가 부착된 창상용 일회용 밴드가 기술되어 있다. 이상과 같이 키틴과 키토산을 인체 병리학적인 용도로 적용하려는 기술들은 이미 보고된 것이 많다.

우리나라에서 인공피부를 연구 개발하고 있는 업체로는 (주)엠씨티티, (주)태고사이언스, (주)웰스킨, 동아제약(주), (주)한스바이오메드 등이 있고, 키틴을 원료로 하는 키틴 부직포(Beschitin WTM)와 키틴 필름 (TegasorbTM), 키틴의 탈아세틸화물인 키토산과 콜라겐의 혼합 스폰지인 BASTM이 개발되어 상업화에 성공한 사례가 있다.

특히 한국등록특허 제545404호는 키틴 또는 키토산의 나노섬유(초극세섬유)를 구성성분으로 하는 부직포에 관한 것으로, 상기 특허의 나노섬유 부직포는 밀착성 및 공기투과도가 우수하고, 손상된 피부조직의 보호 및 세포 재생에 유리하므로 창상피복제나 인공피부, 조직공학용 스캐폴드 등으로서의 가능성을 제시하였지만, 본 발명에서는 나노섬유 부직포를 제조하기 위해 전기방사를 시도하였다는 점에서, 상기 특허와 큰 차별성이 있다.

멜트 브로운(Melt blown), 복합 방사, 분할 방사, 전기방사 등의 방법은 나노섬유를 제조하기 위한 방법으로서 섬유산업 분야에서 이미 상당부분 실용화되어 있는 기술로서, 그중에서도 1㎛이하의 섬유를 제조할 수 있는 전기방사 기술은 섬유직경, 섬유직경 분포, 섬유 표면 물성, pore구조, pore분포, 다공성, 제품의 두께 균일성, 제품의 단면 구조, 기계적 물성 등의 성능을 용이하게 설계할 수 있어 다양한 산업에 적용되고 있다. 특히 전기방사 기술로 얻어진 나노섬유 부직포는 매우 작은 직경을 가지며, 작은 공극을 갖고, 높은 비표면적을 갖는 매트를 제공할 수 있어 수분 및 통기성이 우수하고, 세균으로부터 상처를 보호하며, 체액이 스며들지 않기 때문에 제거가 용이하다. 따라서 최근 상처보호용 Wound dressing이나 인공피부 등을 제조하는데 있어 전기방사 기술이 탁월한 효과가 있다고 입증되고 있다.

상술한 바와 같이, 키틴과 키토산을 인체병리학적인 용도로 적용하려는 기술들은 이미 보고된 많은 연구성과가 있다. 하지만 기존의 기술에서는 키틴 또는 키토산을 인체적합성 소재로서의 가능성을 제시하였을 뿐 상업화시키지 못하였으며, 임상병리학적인 다양한 처리에 적합하면서 기능성이 최대로 발휘되는 효과적인 형태의 제품은 아직 출시되지 않고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 생체유래 고분자인 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 혼합한 다음, 전기방사법을 이용하여 나노섬유 부직포를 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 키토산 용액을 전기방사시킨 후, 잔류용매를 제거하고 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 키토산을 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액과 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 혼합용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 세포성장인자를 첨가한 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬 유 부직포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액과 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 혼합용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 세포성장인자를 첨가한 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되고, 평균 직경이 약 10~1000nm인 나노섬유 부직포를 제공한다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 키토산 용액을 전기방사시킨 후, 잔류용매를 제거하고 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 키토산을 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액과 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 혼합용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 세포성장인자를 첨가한 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액과 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; (c) 상기 혼합용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및 (d) 상기 세포성장인자를 첨가한 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계를 포함하는 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 생체유래 고분자인 키토산을 주성분으로 하여, 상기 키토산의 방사성, 기계적 안정성 및 물성을 보완하기 위해 생분해성 고분자를 혼합한 다음 세포성장인자를 첨가하여 제조된 나노섬유 부직포 및 상기 나노섬유 부직포를 이용한 창상피복재에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키토산의 점도는 5cps ~ 2000cps이고, 탈아세틸화도는 85%이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 산성 용액은 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid) 수용액, TFA(trifluoroacetic acid) 및 MC(methylene chloride)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 용매 또는 2 이상의 혼합용액인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전기방사는 키토산 용액의 농도 0.1~50중량%, 전압 5~100 kV, 유체속도 0.1~5 ml/h, 방사거리 3~30cm 및 습도 30% 이하의 조건으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 천연고분자 또는 합성고분자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 천연고분자는 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid), 젤라틴(gelatin), 실크(silk), 콜라겐(collagen), 셀룰로오스(cellulose), 알긴산(alginic acid) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 합성고분자는 PEO(poly ethylene oxide), PVA(polyvinyl alcohol), PHB(poly-beta-hydroxybutyrate), PHBV(3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate), PGA{poly(glycolic acid)}, PLA[poly(Lactic acid)], PLGA(polylactic-co-glycolic acid), PCL[poly(ε-caprolactone)], 폴리다 이옥사논(polydioxanone), 폴리오르소에스테르(polyorthoester) 및 폴리안하이드라이드(polyanhydride)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 TFE(tetrafluroethylene), 아세톤(acetone), TFA(trifluoroacetate), HFIP(hexafluoroisopropanol), MC(methylene chloride), 클로로포름(chloroform), DMSO(dimethylsulfoxide), DMF(dimethylformamide), THF(tetrahydrofuran), 아세트산(acetic acid) 및 포름산(formic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 용매 또는 2 이상의 혼합용매인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포성장인자는 인슐린(insulin), 콜라겐 펩타이드(collagen peptide), bFGF(basic Fibroblast Growth Factor, 염기성 섬유아세포 성장인자), EGF(Epidermal Growth Factor, 표피성장인자), PDGF(Platelet Derived Growth Factor, 혈소판 유래 성장인자 수용체), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 혈관내피 성장인자), TGF(Transforming Growth Factor, 전환 성장인자), FGF(Fibroblast Growth Factor, 섬유 아세포 성장인자), KGF(Keratinocyte Growth Factor, 각질세포 성장인자), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α, 종양 괴사 인자 α), 루펩틴(leupeptin) 및 항생제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항생제는 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계 항생제, 테트라사이클린(tetracycline)계 항생제, 페니실린(penicillin)계 항생제, 세파로스포린(cephalosporin)계 항생제, 마크로라이드(macrolide)계, 폴리펩타이 드(polypeptide)계 항생제, 린코사마이드(lincosamide)계 항생제, 설폰아마이드(sulfonamide)계 항생제, 플로르퀴놀론(fluoroquinolone)계 항생제, 카베페넘(carbepenems)계 항생제, 모노박탐(monobactams)계 항생제, 리팜핀(rifampin)계 항생제, 옥사졸도놈(oxazolidonones)계 항생제, 및 스트렙토그라민(streptogramin)계 항생제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

생체유래 고분자인 키토산이란, 새우 또는 게의 껍질로부터 제조되는 키틴의 탈아세틸화(deacetylation)물의 총칭이며, 지구상에서 셀룰로오스 다음으로 많이 존재하는 천연 고분자 재료로 최근에는 키틴과 키토산이 가지고 있는 생체적합성, 항미생물성, 생분해성 및 금속이온 흡착능의 기능이 밝혀짐에 따라, 섬유고분자 산업, 의공학, 의약 농·임업을 비롯한 첨단기술 분야에서 응용되기 시작했고 이에 대한 연구도 활발히 진행되고 있으며, 특히, 생체유래 고분자는 인체내에서 이물반응이 적고 생분해시 분해산물의 독성이 없어서 안정성을 보장할 수 있는 장점이 있다 (도 1).

상기 키토산은 점도가 5cps 이하일 경우, 점성이 부족하여 섬유화가 일어나지 않고 입자가 형성되는 특성을 나타내고, 점도가 2000cps 이상일 경우, 점성이 너무 커서 전기방사에 의해 나노섬유화가 이루어지지 않으므로, 본 발명에서는 점도가 5cps ~ 2000cps인 키토산을 이용하는 것이 바람직하고, 키토산의 탈아세틸화도가 85% 이하일 경우, 전기방사에 의한 나노섬유화가 수행되기가 어려우므로, 본 발명에서는 탈아세틸화도가 85% 이상인 키토산을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 나노섬유 부직포의 주성분인 키토산의 방사성, 기계적인 안정 성 및 물성을 보완하기 위하여 생분해성 고분자를 첨가하며, 상기 생분해성 고분자 중에서 생분해성 천연 고분자 또는 합성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에서는 상기 키토산의 물성을 보완하기 위하여 생분해성 고분자를 추가하여 첨가함으로써, 나노섬유 부직포를 제조할 수 있다. 키토산과 같은 천연고분자는 그 최대단점으로서 약한 물성이 지적되고 있는데, 이러한 키토산에 생분해성 고분자를 첨가함으로써, 기계적 물성, 생분해 거동 등과 같은 물성을 보완할 수 있으며, 수득하고자 하는 나노섬유 부직포의 특성에 맞추어, 생분해성 천연 고분자 또는 합성 고분자를 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 나노섬유 부직포를 의료용으로 사용할 경우에 피부재생 효율을 높이기 위하여 세포성장인자를 첨가하였으며, 본 발명에서는 세포성장인자로 인슐린을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않고, 아미고글리코사이드(aminoglycoside)계의 스트렙토마이신(streptomycin), 가나마이신(kanamycin), 겐타마이신(gentamycin), 아미카신(amikacin), 시소마이신(sisomycin), 네오마이신(neomycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 테트라사이클린(tetracycline)계의 클로르테트라사이클린(chlortetracycline, CTC), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline, OTC), 테트라사이클린(tetracycline), 미노사이클린(minocycline), 독시사이클린(doxycycline), 페니실린(penicillin)계의 제1세대 벤질페니실린(benzylpenicillin), 페녹시메틸페니실린(penoxymethylpenicillin), 천연페니실린, 암피실린(ampicillin), 아목사실린(amoxycillin), 바캄피실린(bacampicillin), 제2세대 (반합성페니실린) 메치실린(methicillin), 옥사실 린(oxacillin), 클록사실린(cloxacillin), 제3세대 피페라시린(piperacillin), 카베니시린(carbenicillin), 티카실린(ticarcillin), 세파로스포린(cephalosporin(세파로스포린)계의 제1세대 세파렉신(cephalexin), 세프라딘(cefradine), 세파졸린(cefazolin), 세파로리딘(cephaloridine), 제2세대 세파클러(cefaclor), 세프테졸(ceftezole), 세파만돌(cefamandole), 세푸로심(cefuroxime), 세포시틴(cefoxitin), 제3세대 세포피라미드(cefpiramide), 세포페라존(cefoperazone), 모시락탐(moxalactam), 세포티어(ceftiofur), 제4세대 세푸조남(cefuzonam), 마크로라이드(macrolide)계의 에리스로마이신(erythromycin), 스피라마이신(spiramycin), 타이로신(tylosin), 폴리펩타이드(polypeptide)계의 폴리마진(polymyxin) B, 바시트라신(bacitracin), 린코사마이드(lincosamide)계의 린코마이신(lincomycin), 클린다마이신(clindamycin), 설폰아마이드(sulfonamide)계의 설파디메톡신(sulfadimethoxine), 설파메라진(sulfamerazine), 설파치아졸(sulfathiazole), 설파다이아진(sulfadiazine), 설파에톡시피리다진(sulfaethoxypyridazin), 프로르퀴놀론(fluoroquinolone)계의 노플로삭신(norfloxacin), 시프로플로삭신(ciprofloxacin), 엔플로삭신(enrofloxacin), 오플로삭신(ofloxacin), 페플로삭신(pefloxacin) 및 후시딘산 소듐(sodium fusidate), 카베페넘(carbepenems)계의 이미페넘-실라스타틴(imipenem-cilastatin), 메로페넘(meropenem), 모노박탐(monobactams)계의 아트레오남(aztreonam), 리팜핀(rifampin)계의 리파부틴(rifabutin), 리팜핀(rifampin), 옥사졸도논(oxazolidonones)계의 리너졸리드(linezolid), 스트렙토그라 민(streptogramin)계의 퀴노프리스틴+달포프리스틴(quinopristin+dalfopristin) 등의 항생제가 사용될 수 있다. 또한, 상기 세포성장인자는 상처가 치유되는 과정에서 상처주변부의 세포의 이동 및 치유를 촉진하는 역할을 함으로써 효과적으로 창상이 치유되도록 한다.

본 발명에서는 나노섬유 부직포를 제조하기 위하여 전기방사법을 적용한다.

전기방사법이란, 고분자 용액 또는 용융물에 높은 전하를 부여하여 고분자 젯(jet)을 발생시킴으로써 나노섬유 집합체를 얻는 방법으로, 거의 모든 고분자에 적용이 가능하며 비교적 간단한 장치를 이용하여 나노섬유를 제조할 수 있으며, 특히 나노섬유의 주된 용도인 의료용으로 사용할 경우에 전기방사법을 주로 적용한다. 이러한 전기 방사법을 이용하여 만들어진 나노섬유는 창상 피복재, 인공피부, 조직공학용 스캐폴드(scaffold) 등의 의학적 적용이 검토되고 있으며, 최근에는 약물을 결합시켜 DDS(Drug Delivery System, 약물전달시스템)로 응용하려는 시도가 있다.

한편, 전기방사법을 이용하여 일정한 형태의 나노섬유를 수득하기 위해서는 고분자가 용매에 균일하게 용해되어 있는 고분자 용액을 사용하여야 하므로, 본 발명에서는 전기방사법에 이용되는 키토산 용액 및 생분해성 고분자의 혼합용액을 균일한 용액으로 제조하기 위하여 상기 혼합용액을 상온에서 교반시켜 불순물이 없도록 완전히 용해시킨 후, 전기방사법을 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용한 전기방사장치는 0~60kV의 전압공급이 가능한 직류 고전압 발생장치(DC High Voltage Generator[40 kV/3 mA], Chungpa EMT Co.), 평판형 태(plate type support jack, 200×200 mm, Strainless steel)의 집전판 (collector), 고분자용액을 일정한 유량(Volum)과 유체속도(flow rate)로 제어하는 주사기펌프(syringe pump, KDS220, KD Scientific Inc.), 부피 10.0 ml인 주사기(Hamilton81620 gatight syringe, USA), 금속 주사기바늘(Hamilton91022 metal hub needle, 22 Guage [length: 50.8 mm, inner diameter: 0.41 mm], USA) 및 디지털 온/습도계(JB913R, Oregon scientific Inc., USA)로 구성되는 것을 특징으로 한다(도 2).

구체적으로, 본 발명에서는 다양한 공정인자 중 섬유형태에 중요한 영향을 주는 용액의 농도, 전압, 방사거리, 유체속도, 집전판의 형태 및 습도에 따른 각각의 나노섬유 부직포를 제조하여 구조 및 형태를 분석한 후, 재현성이 가장 좋은 전기방사조건으로 대량방사하여 회수하는 방법으로 전기방사법을 수행하였고, 특히, 본 발명에서는 키토산 용액 및 생분해성 고분자의 혼합용액의 농도 0.1~50중량%, 전압 5~100 kV, 방사거리 3~30cm, 유체속도(혼합용액의 토출속도) 0.1~5ml/h, 방사거리 3~30cm 및 습도 30% 이하의 전기방사 조건으로 전기방사를 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 방법 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되고, 평균 직경이 약 10~1000nm인 나노섬유 부직포에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 나노섬유 부직포는 창상치료용, 조직공학용 스캐폴드 및 조직유착방지막으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나에 이용되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 나노섬유 부직포는 직경이 나노크기의 초극세사로 이루어진 섬유집합체로서, 성질이 유연하고, 미세공간이 많은 다공성으로 분해 속도 및 약물 방출이 신속하고 상처부위에 쉽게 접착할 수 있다. 또한, 생분해성 고분자인 PHBV의 도입으로 인해 키토산의 점도와 탈아세틸화도의 영향 없이 균일하고 재현성 있는 나노섬유를 제조할 수 있을 뿐만 아니라 기계적인 물성 또한 우수하며 두 고분자사이의 조성비를 달리하여 분해속도 또한 조절 가능하여, 창상 치료용 소재로서 효과적으로 응용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서는 세포성장인자로 인슐린을 사용하였으나, 콜라겐 펩타이드, bFGF(basic fibroblast growth factor, 염기성 섬유아세포 성장인자), EGF(Epidermal Growth Factor, 표피성장인자), PDGF(Platelet Derived Growth Factor), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 혈관내피 성장인자), TGF(Transforming Growth Factor, 전환 성장인자), FGF(Fibroblast Growth Factor, 섬유 아세포 성장인자), KGF(Keratinocyte Growth Factor, 각질세포 성장인자), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), 루펩틴(leupeptin) 등 다양한 세포성장인자가 제한없이 사용될 수 있다.

하기 실시예에서는 생분해성 고분자로 PHBV[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)]를 사용하였으나, 천연 고분자, 합성 고분자 등 다양한 생분해성 고분자가 제한없이 사용될 수 있다.

실시예 1: 키토산 나노섬유 부직포의 제조

분자량 약 190kDa~310kDa의 키토산(Sigma Aldrich Co., 미국) 3 중량%를 90 v/v%의 아세트산 수용액에 첨가 및 교반하여 용해시켜, 농도가 3.2 중량%인 균일한 혼합용액을 제조하였다.

전기방사장치[직류 고전압 발생장치(DC High Voltage Generator[40 kV/3 mA], Chungpa EMT Co.),주사기펌프(syringe pump, KDS220, KD Scientific Inc.)]는 약 20% 이하의 습도와 38℃의 온도가 일정하게 유지되는 목재 챔버내에 전압은 20kV, 주사기 바늘 끝과 집전판의 거리(방사거리)는 13cm, 주사기 펌프의 유체 속도는 1 ml/h의 조건으로 설정하여, 상기 혼합용액을 평판형 집전판에서 5시간 동안 전기방사를 하여 섬유가 집적된 매트릭스를 수득하였다. 상기 전기방사에 의해 제조된 섬유가 집적된 매트릭스를 진공오븐에 넣고 진공 상태에서 약 4시간 정도 방치하여 잔류 용매를 제거하였다. 알콜을 이용하여 잔류용매를 완전히 제거하고, 중화하여 키토산 나노섬유 부직포를 제조하였다 (도 4). 상기에서 제조된 나노섬유 부직포를 SEM(Scanning Electron Microscope, 주사전자현미경)을 통해 확대하여 관 찰한 결과, 약 200nm의 직경을 가지는 나노섬유의 집합체인 것을 알 수 있었다 (도 5).

실시예 2: 키토산/인슐린 나노섬유 부직포의 제조

분자량 약 190kDa~310kDa의 키토산(Sigma Aldrich Co., 미국) 3 중량%를 90 v/v%의 아세트산 수용액에 첨가 및 교반하여 용해시킨 후, 인슐린 7 중량%를 첨가하여 농도가 3.2 중량%인 균일한 혼합용액을 제조하였다.

전기방사장치[직류 고전압 발생장치(DC High Voltage Generator[40 kV/3 mA], Chungpa EMT Co.),주사기펌프(syringe pump, KDS220, KD Scientific Inc.)]는 약 20% 이하의 습도와 38℃의 온도가 일정하게 유지되는 목재 챔버내에 전압은 20kV, 주사기 바늘 끝과 집전판의 거리(방사거리)는 13cm, 주사기 펌프의 유체 속도는 1 ml/h의 조건으로 설정하여, 상기 혼합용액을 평판형 집전판에서 5시간 동안 전기방사를 하여 섬유가 집적된 매트릭스를 수득하였다. 상기 전기방사에 의해 제조된 섬유가 집적된 매트릭스를 진공오븐에 넣고 진공 상태에서 약 4시간 정도 방치하여 잔류 용매를 제거하였다. 알콜을 이용하여 잔류용매를 완전히 제거하고, 중화하여 키토산/인슐린 나노섬유 부직포를 제조하였다. 상기에서 제조된 나노섬유 부직포를 SEM을 통해 확대하여 관찰한 결과, 다공성이며, 약 200nm 의 직경을 가지는 나노섬유의 집합체인 것을 알 수 있었다 (도 3).

상기 결과에서 볼 수 있듯이, 섬유 집합체는 약 200nm의 균일한 굵기를 갖는 나노섬유가 부직포 형태로 서로 얽혀 있는 구조를 갖고 있었다. 종래의 기술로 제 조된 창상피복재용 필름이나 스폰지, 하이드로 젤 등은 분해 및 약물 방출 속도조절이 어려우나, 본 발명에서 제조된 나노섬유 부직포는 섬유의 직경이 나노스케일이기 때문에 매우 높은 비표면적을 가지며, 유연하고 3차원적 다공성 부직포 구조이므로 분해속도 및 약물 방출이 신속하고 상처부위에 쉽게 접착할 수 있다. 또한 다른 고분자와의 블렌딩 및 가교반응을 통해 분해 속도 또한 조절이 가능하다.

실험예 1: EDS ( energy dispersive spectroscopy , 에너지분광검출기 )분석을 통한 키토산/인슐린 나노섬유에서의 인슐린 확인

EDS는 전류의 인가에 의해 생성된 전자를 가속시켜 시료와 충돌시키고, 이 때 시료에서는 내부 전자가 입사전자에 의해 외부로 튀어나가 빈자리가 생성되면, 원자가 열역학적으로 에너지를 낮추기 위해 상위 궤도에 있는 전자가 빈자리로 천이되어 원자를 안정화시키고, 이러한 과정에서 두 에너지 궤도의 차이만큼이 X-ray의 형태로 발산되는데 이 에너지를 측정함으로써 시료의 정성분석이 가능하도록 만든 장비이다. X-ray 에너지는 모든 원자가 각자 다른 값을 가지고 있기 때문에 X-ray 에너지에 의해 모든 원자의 구분이 가능하다. 또한 X-ray 에너지는 K, L, M, N 등의 전자 궤도 껍질에 따라 각각 Ka, Kb, La 등으로 세분화되기 때문에 모든 에너지 값이 일치해야 정성분석이 정확한 결과를 나타낸다. EDS는 X축을 X-ray 에너지 값으로, Y축을 강도(intensity)(a. u) 갑으로 하여 그래프가 그려지는데, 이때 각 피크(peak)의 면적을 계산하여 검출된 원소들 간의 상대적인 정량법 비교가 가능하다.

EDS를 이용하여, 세포성장인자인 인슐린이 키토산/인슐린 나노섬유 부직포상에서 어떻게 분포되어 있는지를 관찰하였다. 즉, C, O, N으로 이루어진 키토산의 구조와는 달리 인슐린은 S-S 결합을 함유하고 있어 EDS 원소분석을 통해 인슐린의 함유 여부를 확인할 수 있었다.

EDS를 통하여 관찰한 결과, 세포성장인자로서 생리활성 물질인 인슐린을 함유한 키토산 나노섬유 부직포에서 S 원소를 확인할 수 있었고, 이는 키토산/인슐린 나노섬유 부직포가 인슐린을 함유하고 있음을 나타내는 것이다. 또한 직경이 다른 나노섬유에서 모두 S 원소가 확인되었고, 이는 인슐린이 나노섬유 부직포의 전반적인 부분에 골고루 분포하고 있음을 나타낸다 (도 6).

실험예 2: 키토산/인슐린 및 키토산 나노섬유 부직포에서의 세포 증식력 비교

실시예 1 및 실시예 2에서 각각 제조된 키토산 및 키토산/인슐린 나노섬유 부직포를 에탄올을 이용하여 멸균처리하여 중성화시키고, PBS(phosphate buffered saline)에 담근 후, 페트리 접시(petri dish)에 올려놓았다. 상기 키토산/인슐린 및 키토산 나노섬유 부직포에 normal human epidermal fibroblasts를 계대 배양한 섬유아세포를 105 cells/dish의 농도로 접종하였다. 이때, 상기 나노섬유 부직포 위에 유리로 제조된 링(ring)을 올려놓아 링 안쪽으로 상기 섬유아세포를 접종함으로써, 나노섬유 부직포의 표면에만 섬유아세포의 증식을 유도하였다. 또한, 배지로는 DMEM(DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)을 기본으로 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린 G-스트렙토마이 신(penicillin G-streptomycin)을 포함하는 배지를 사용하였다.

온도 37℃ 및 5% CO₂의 분위기의 인큐베이터 내에서 2시간, 1일 및 3일 동안 배양하여 SEM을 통해 세포의 초기 접착 및 증식 거동을 확인한 결과, 키토산/인슐린 나노섬유 부직포에서는 초기에 많은 세포가 접착되어 스프레딩(spreading) 정도가 보다 원활하게 이루어지는 것으로 나타났고 (도 7의 (a)), 단독 키토산 나노섬유 부직포에서도 둥근 모양의 세포의 접착이 일어나지만 거의 확산(spreading)되지 않는 것으로 나타났다 (도 7의 (b)).

또한, 24-well cell culture plate에 상기 섬유아세포가 접종된 키토산 및 키토산/인슐린 나노섬유 부직포를 올려놓고, MTT 저장용액 1ml를 첨가한 후, 4시간 동안 배양한 다음 DMSO(dimethylsulfoxide) 1ml를 첨가하여 세포막을 녹여낸 후, ELISA Reader(효소면역측정기)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하고 MTT 분석법을 통하여 세포 활성정도를 측정결과, 3일간 배양되었을 때, 키토산 단독 나노섬유 부직포에서보다 인슐린/키토산 나노섬유 부직포에서 나노섬유 부직포의 활성 정도가 증가하는 것으로 나타났다 (도 8).

결국, 키토산/인슐린 나노섬유 부직포 상에서 섬유아세포의 접착 및 증식거동이 활발하게 이루어져, 세포성장인자로서 인슐린이 세포증식, 세포분열 및 세포외 기질 생성을 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: 키토산/PHBV[poly(3- hydroxybutyrate - co -3- hydroxyvalerate )]/인슐린 나 노섬유 부직포의 제조

분자량 약 190kDa~310kDa의 키토산(Sigma Aldrich Co., 미국) 6 중량%를 90 v/v%의 아세트산 수용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하고, PHBV 1.5 중량%를 TFE(tetrafluroethylene) 용매에 용해시켜 PHBV 용액을 제조한 다음, 키토산 및 PHBV의 비율이 8:2가 되도록 상기 키토산 용액과 PHBV 용액을 혼합시킨 후, 인슐린 7 중량%를 첨가 및 교반하여 농도가 4.3중량%인 균일한 혼합용액을 제조하였다.

전기방사장치[직류 고전압 발생장치(DC High Voltage Generator[40 kV/3 mA], Chungpa EMT Co.),주사기펌프(syringe pump, KDS220, KD Scientific Inc.)]는 30% 이하의 습도와 38℃의 온도가 일정하게 유지되는 목재 챔버내에 전압은 15kV, 주사기 바늘 끝과 집전판의 거리(방사거리)는 15cm, 유체 속도는 1 ml/h의 조건으로 설정하여, 상기 혼합용액을 평판형 집전판에서 5시간 동안 전기방사를 하여 섬유가 집적된 매트릭스를 수득하였다. 상기 전기방사에 의해 제조된 섬유가 집적된 매트릭스를 진공오븐에 넣고 진공 상태에서 약 4시간 정도 방치하여 잔류 용매를 제거하였다. 알콜을 이용하여 잔류용매를 완전히 제거하고, 중화하여 키토산/인슐린 나노섬유 부직포를 제조하였다. 상기에서 제조된 나노섬유 부직포를 SEM을 통해 확대하여 관찰한 결과, 다공성이며, 약 150nm ~ 200nm 의 직경을 가지는 나노섬유의 집합체인 것을 알 수 있었다 (도 9).

비교예 1: PHBV 나노섬유 부직포 및 다양한 조성의 키토산/ PHBV 나노섬유 부직포의 제조

PHBV 2 중량%를 TFE(tetrafluroethylene)용매에 용해시켜 PHBV 용액을 제조한 다음, 상기 PHBV 용액을 전기방사하여 PHBV 나노섬유 부직포를 제조하였다.

분자량 약 190kDa~310kDa의 키토산(Sigma Aldrich Co., 미국) 6 중량%를 90 v/v%의 아세트산 수용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하고, PHBV 1.5 중량%를 TFE(tetrafluroethylene) 용매에 용해시켜 PHBV 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액 및 PHBV 용액을 각각 5:5, 7:3 및 8:2의 비율로 혼합시켜 농도가 4중량%인 균일한 혼합용액을 제조하였다.

전기방사장치[직류 고전압 발생장치(DC High Voltage Generator[40 kV/3 mA], Chungpa EMT Co.),주사기펌프(syringe pump, KDS220, KD Scientific Inc.)]는 30% 이하의 습도와 38℃의 온도가 일정하게 유지되는 목재 챔버내에 전압은 15kV, 주사기 바늘 끝과 집전판의 거리(방사거리)는 15cm, 유체 속도는 1 ml/h의 조건으로 설정하여, 상기 혼합용액을 평판형 집전판에서 5시간 동안 전기방사를 하여 섬유가 집적된 매트릭스를 수득하였다. 상기 전기방사에 의해 제조된 섬유가 집적된 매트릭스를 진공오븐에 넣고 진공 상태에서 약 4시간 정도 방치하여 잔류 용매를 제거하였다. 알콜을 이용하여 잔류용매를 완전히 제거하고, 중화하여 키토산/PHBV 나노섬유 부직포를 제조하였다. 상기에서 제조된 나노섬유 부직포를 SEM을 통해 확대하여 관찰한 결과, 다공성이며, 약 150nm ~ 200nm 의 직경을 가지는 나노섬유의 집합체인 것을 알 수 있었다 (도 10).

실험예 3: 키토산/ PHBV /인슐린, PHBV 및 다양한 조성의 키토산/ PHBV 나노섬유 부직 포의 물 접촉각 측정

Contact Angle & Surface Tension Analyzer (Model: Phoenix 300, SEO Co. Ltd, Korea)를 이용한 Sessile drop method (distilled water, 5㎕)를 이용하여 실시예 3 및 비교예 1에서 각각 제조된 키토산/PHBV/인슐린, 및 PHBV 및 다양한 조성의 키토산/PHBV 나노섬유 부직포의 물 접촉각을 분석하였다.

물접촉각 측정은 고체표면의 특성을 분석하는데 가장 일반적인 방법으로, 시료표면에 일정량의 물방울을 떨어뜨려 고체와 액체의 접촉각을 측정함으로써 젖음성 (Wettability) 또는 친수성/소수성 정도를 평가하는데 중요한 척도로 이용된다.

물접촉각 측정분석의 정확성을 위해 각각의 나노섬유 부직포의 측정표면 위치를 골고루 분산하여 물방울을 5군데 떨어뜨려 측정하여 평균값 및 표준편차를 계산한 결과, 친수성을 띄고 있는 키토산의 함량이 많아질수록 물접촉각이 낮아짐을 확인할 수 있으며, 인슐린을 함유한 키토산/PHBV/인슐린 나노섬유 부직포의 경우 키토산과 PHBV의 비가 동일한 키토산/PHBV 보다 더욱 친수화됨을 확인할 수 있었다 (도 11).

실험예 4: In vitro 생분해 거동 실험

실시예 3 및 비교예 1에서 각각 제조된 키토산/PHBV/인슐린, PHBV 및 다양한 조성의 키토산/PHBV 나노섬유 부직포를 50*50 mm의 크기로 잘라 알콜로 멸균한 후 2 ml의 PBS에 침지하였다. 제조된 샘플을 5%의 이산화탄소 분위기의 incubator에 넣어 분해 거동을 알아보았다. 각각의 샘플을 날짜별로 꺼내어 나노섬유는 상온에 서 감압 건조하여 FE-SEM을 통해 분해정도를 관찰하여 in vitro 실험을 수행한 결과, 실시예 3의 키토산/PHBV/인슐린 나노섬유 부직포는 약 14일 정도에서 분해가 시작되는 반면, 비교예 1의 PHBV 및 다양한 조성의 키토산/PHBV 나노섬유 부직포는 약 14일 정도에서도 분해가 거의 일어나지 않았고, 특히 키토산/PHBV 나노섬유 부직포의 경우 키토산의 조성비가 낮을수록 분해되기 시작하는 시기가 늦어짐을 알 수 있었다 (도 12).

결국, 키토산을 주성분으로 하는 나노섬유 부직포에서, 나노섬유 직경을 조절한다든지, 생분해성 고분자인 PHBV의 조성비를 조절함으로써 분해속도를 조절할 수 있어, 창상치유와 동반하여 생분해가 일어나도록 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 인슐린과 같은 세포성장인자를 함유시킴으로써, 상처가 치료되는 과정 중에 신속하게 생리활성 물질을 분비하게 하여 상처 치료를 더욱 효율적으로 할 수 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 5: 나노섬유 부직포 표면에서의 세포 증식력 비교

실시예 3 및 비교예 1에서 각각 제조된 키토산/PHBV/인슐린, PHBV 및 키토산/PHBV 나노섬유 부직포를 에탄올을 이용하여 멸균처리하여 중성화시키고, PBS(phosphate buffered saline, 인산완충액)에 담근 후, 페트리 접시(petri dish)에 올려놓았다. 상기 키토산/PHBV/인슐린, PHBV 및 키토산/PHBV 나노섬유 부직포에 normal human epidermal fibroblasts를 계대 배양한 섬유아세포를 105 cells/dish의 농도로 접종하였다. 이때, 상기 나노섬유 부직포 위에 유리로 제조된 링(ring) 을 올려놓아 링 안쪽으로 상기 섬유아세포를 접종함으로써, 나노섬유 부직포의 표면에만 섬유아세포의 증식을 유도하였다. 또한, 배지로는 10% FBS 및 1% 페니실린 G-스트렙토마이신을 포함하는 배지를 사용하였다.

상기 접종된 섬유아세포를 온도 37℃ 및 5% CO₂ 분위기의 인큐베이터에서 2일, 4일 및 6일 동안 배양한 후, 24-well cell culture plate에 상기 섬유아세포가 접종된 키토산 및 키토산/인슐린 나노섬유 부직포를 올려놓고, MTT 저장용액 1ml를 첨가한 후, 4시간 동안 배양한 다음 DMSO(dimethylsulfoxide) 1ml를 첨가하여 세포막을 녹여낸 후, ELISA Reader(효소면역측정기)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하고 MTT 분석법을 통하여 세포 활성정도를 측정하였다.

그 결과, 키토산/PHBV 나노섬유 부직포 상에서 섬유아세포의 접착 및 증식거동이 활발하게 이루어지고, 이때, 키토산과 PHBV의 비율에 따라 세포의 접착 및 증식거동이 조금씩 차이를 나타냄을 확인할 수 있었으며, 세포성장인자인 인슐린을 함유한 키토산/PHBV/인슐린 나노섬유 부직포에서의 세포활성이 다른 나노섬유 부직포보다 우수함을 확인할 수 있었고, 세포성장인자를 함유한 키토산 나노섬유가 창상치료용으로 응용가능성이 기대되는 효과적인 소재임을 알 수 있었다 (도 13).

결국, 인슐린이 세포성장인자로서 세포증식, 세포분열 및 세포외 기질 생성 을 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용된 키토산의 분자구조를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에서 사용된 전기방사장치 시스템의 구성도를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 나노섬유 부직포의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 방법에 따른 키토산 및 인슐린을 함유하는 나노섬유 부직포를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 키토산 나노섬유 부직포의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 키토산/인슐린 나노섬유 부직포를 EDS로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명에 따른 키토산/인슐린 나노섬유 부직포(a)와 키토산 나노섬유 부직포(b) 상에서 세포를 증식시킨 후, SEM으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명에 따른 키토산/인슐린 나노섬유 부직포와 키토산 나노섬유 부직포 상에서 세포를 증식시킨 후, MTT 분석한 결과를 나타낸 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명에 따른 PHBV 나노섬유 부직포(a), 다양한 조성의 키토산/PHBV 나노섬유 부직포((b), (c) 및 (d))의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명에 따라 제조된 키토산/PHBV/인슐린 나노섬유 부직포의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 11은 다양한 나노섬유 부직포의 물 접촉각을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 다양한 조성의 나노섬유 부직포의 생분해 거동결과를 나타낸 사진이다.

도 13은 다양한 조성의 나노섬유 부직포의 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

<도 2의 전기방사장치 도면의 주요부분의 부호설명>

1: 부도체 소재의 피스톤 2: 전기방사용 주사기

3: 주사기 고정대 4: 평면형태의 집전판

5: 주사기 펌프 6: 에어콘(제습기능)

7: 환풍구 8: 전열기(용매 휘발촉진)

Claims

다음의 단계를 포함하는 키토산을 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법:

(a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 키토산 용액을 전기방사시킨 후, 잔류용매를 제거하고 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 키토산의 점도는 5 ~ 2000 cps이고, 탈아세틸화도는 85%이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 산성 용액은 아세트산(acetic acid) 수용액, 포름산(formic acid) 수용액, TFA(trifluoroacetic acid) 및 MC(methylene chloride)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 용액 또는 2 이상의 혼합용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 전기방사는 키토산 용액의 농도 0.1~50중량%, 전압 5~100 kV, 유체속도 0.1~5 ml/h, 방사거리 3~30cm 및 습도 1~30%의 조건 으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 단면의 평균 직경이 10~1000nm인, 키토산을 함유하는 나노섬유 부직포.
제5항에 있어서, 창상치료용 피복재, 조직공학용 스캐폴드 및 조직유착방지막으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나에 이용되는 것을 특징으로 하는 나노섬유 부직포.
다음의 단계를 포함하는 키토산 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법:

(a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 키토산 용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및

(c) 상기 세포성장인자가 첨가된 키토산 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계.
제7항에 있어서, 상기 키토산의 점도는 5cps ~ 2000cps이고, 탈아세틸화도는 약 85%이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 산성 용액은 아세트산(acetic acid) 수용액, 포름산(formic acid) 수용액, TFA(trifluoroacetic acid) 및 MC(methylene chloride)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 용액 또는 2 이상의 혼합용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포성장인자는 인슐린(insulin), 콜라겐 펩타이드(collagen peptide), bFGF(basic Fibroblast Growth Factor, 염기성 섬유아세포 성장인자), EGF(Epidermal Growth Factor, 표피성장인자), PDGF(Platelet Derived Growth Factor, 혈소판 유래 성장인자 수용체), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 혈관내피 성장인자), TGF(Transforming Growth Factor, 전환 성장인자), FGF(Fibroblast Growth Factor, 섬유 아세포 성장인자), KGF(Keratinocyte Growth Factor, 각질세포 성장인자), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α, 종양 괴사 인자 α), 루펩틴(leupeptin) 및 항생제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 항생제는 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계 항생제, 테트라사이클린(tetracycline)계 항생제, 페니실린(penicillin)계 항생제, 세파로스포린(cephalosporin)계 항생제, 마크로라이드(macrolide)계, 폴리펩타이드(polypeptide)계 항생제, 린코사마이드(lincosamide)계 항생제, 설폰아마이드(sulfonamide)계 항생제, 플로르퀴놀론(fluoroquinolone)계 항생제, 카베페넘(carbepenems)계 항생제, 모노박탐(monobactams)계 항생제, 리팜핀(rifampin)계 항생제, 옥사졸도놈(oxazolidonones)계 항생제 및 스트렙토그라민(streptogramin)계 항생제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 (c)단계의 전기방사는 혼합용액의 농도 0.1~50중량%, 전압 5~100 kV, 유체속도 0.1~5 ml/h, 방사거리 3~30cm 및 습도 1~30%의 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항 내지 제12항 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되고, 단면의 평균 직경이 10~1000nm인 키토산 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포.
제13항에 있어서, 상기 세포성장인자는 세포증식, 세포분열 및 세포외기질생성으로 구성된 군에서 선택되는 역할을 수행하는 것을 특징으로 하는 나노섬유 부직포.
제13항에 있어서, 창상치료용 피복재, 조직공학용 스캐폴드(scaffold) 및 조직유착방지막으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나에 이용되는 것을 특징으로 하는 나노섬유 부직포.
다음의 단계를 포함하는 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포의 제조방법:

(a) 키토산을 산성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하는 단계;

(b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 용액을 제조한 다음, 상기 키토산 용액과 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계;

(c) 상기 혼합용액에 세포성장인자를 첨가하는 단계; 및

(d) 상기 세포성장인자가 첨가된 혼합용액을 전기방사킨 후, 잔류용매를 제거하고, 중화시켜 나노섬유 부직포를 수득하는 단계.
제16항에 있어서, 상기 키토산의 점도는 5cps ~ 2000cps이고, 탈아세틸화도는 85%이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 (a) 단계의 산성 용액은 아세트산(acetic acid) 수용액, 포름산(formic acid) 수용액, TFA(trifluoroacetic acid) 및 MC(methylene chloride)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 용액 또는 2 이상의 혼합용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 (b) 단계의 생분해성 고분자는 천연고분자 또는 합성고분자인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 천연고분자는 폴리감마글루탐산(poly-γ-glutamic acid), 젤라틴(gelatin), 실크(silk), 콜라겐(collagen), 셀룰로오스(cellulose), 알긴산(alginic acid) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 합성고분자는 PEO(poly ethylene oxide), PVA(polyvinyl alcohol), PHB(poly-beta-hydroxybutyrate), PHBV(3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate), PGA{poly(glycolic acid)}, PLA[poly(Lactic acid)], PLGA(polylactic-co-glycolic acid), PCL[poly(ε-caprolactone)], 폴리다이옥사논(polydioxanone), 폴리오르소에스테르(polyorthoester) 및 폴리안하이드라이드(polyanhydride)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유기용매는 TFE(tetrafluroethylene), 아세톤(acetone), TFA(trifluoroacetate), HFIP(hexafluoroisopropanol), MC(methylene chloride), 클로로포름(chloroform), DMSO(dimethylsulfoxide) DMF(dimethylformamide), THF(tetrahydrofuran), 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid) 및 MC(methylene chloride)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 용매 또는 2 이상의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포성장인자는 인슐린(insulin), 콜라겐 펩타이드(collagen peptide), bFGF(basic Fibroblast Growth Factor, 염기성 섬유아세포 성장인자), EGF(Epidermal Growth Factor, 표피성장인자), PDGF(Platelet Derived Growth Factor, 혈소판 유래 성장인자 수용체), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 혈관내피 성장인자), TGF(Transforming Growth Factor, 전환 성장인자), FGF(Fibroblast Growth Factor, 섬유 아세포 성장인자), KGF(Keratinocyte Growth Factor, 각질세포 성장인자), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α, 종양 괴사 인자 α), 루펩틴(leupeptin) 및 항생제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 항생제는 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계 항생제, 테트라사이클린(tetracycline)계 항생제, 페니실린(penicillin)계 항생제, 세파로스포린(cephalosporin)계 항생제, 마크로라이드(macrolide)계, 폴리펩타이드(polypeptide)계 항생제, 린코사마이드(lincosamide)계 항생제, 설폰아마이드(sulfonamide)계 항생제, 플로르퀴놀론(fluoroquinolone)계 항생제, 카베페넘(carbepenems)계 항생제, 모노박탐(monobactams)계 항생제, 리팜핀(rifampin)계 항생제, 옥사졸도놈(oxazolidonones)계 항생제 및 스트렙토그라민(streptogramin)계 항생제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, (b)단계에서 키토산과 생분해성 고분자의 조성비가 1:9~9:1이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 (d)단계의 전기방사는 혼합용액의 농도 0.1~50중량%, 전압 5~100 kV, 용액의 토출속도 0.1~5 ml/h, 방사거리 3~30cm 및 습도 1~30%의 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항 내지 제26항 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되고, 단면의 평균 직경이 10~1000nm인 키토산, 생분해성 고분자 및 세포성장인자를 함유하는 나노섬유 부직포.
제16항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 키토산의 방사성, 기계적 강도 및 안정성을 향상시키는 역할을 수행하는 것을 특징으로 하는 나노섬유 부직포.
제28항에 있어서, 상기 세포성장인자는 세포증식, 세포분열 및 세포외기질생성으로 구성된 군에서 선택되는 역할을 수행하는 것을 특징으로 하는 나노섬유 부직포.
제28항에 있어서, 창상치료용 피복재, 조직공학용 스캐폴드(scaffold) 및 조직유착방지막으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나에 이용되는 것을 특징으로 하는 나노섬유 부직포.