BR112019015891A2 - Hidrogel usando, como substrato, derivado de ácido hialurônico modificado com grupo galol e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

a presente invenção fornece uma plataforma de hidrogel usando, como um substrato, ácido hialurônico (ha) conjugado a uma porção de pirogalol (pg). o conjugado ha-pg da presente invenção pode ser rapidamente reticulado por dois métodos diferentes, em cada um dos quais é usado um agente oxidante ou um ph é ajustado. o hidrogel da presente invenção pode não só ter uma excelente biocompatibilidade, mas também pode ter características físicas controladas eficientemente, tais como, uma taxa de reticulação, elasticidade e resistência adesiva, dependendo de cada método de reticulação. com base nestas excelentes estabilidade e funcionalidade, o hidrogel da presente invenção pode ser usado em vários campos incluindo dispensação de fármacos, materiais biofarmacêuticos, tais como, um agente de curativo para ferimento ou agente antiadesivo, medicamentos e produtos cosméticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: HIDROGEL USANDO, COMO SUBSTRATO, DERIVADO DE ÁCIDO HIALURÔNICO MODIFICADO COM GRUPO GALOL E USO DO MESMO

Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se a um hidrogel com base em um derivado do ácido hialurônico modificado com um grupo galol e a um uso do mesmo. Fundamentos da Técnica [002] O interesse pelos biomateriais funcionais está aumentando, à medida que os mercados para as indústrias médica e de biotecnologia, para a indústria de cosméticos e similares estão se expandindo rapidamente. Em particular, o desenvolvimento de materiais biocompativeis usando polímeros naturais para os quais a estabilidade é assegurada, em vez de polímeros quimicamente sintetizados que podem causar toxicidade ou efeitos colaterais, está se tornando mais popular.

[003] Várias pesquisas e desenvolvimentos têm sido realizados sobre o ácido hialurônico como um material biocompatível. O ácido hialurônico é um polímero bioderivado que tem poucos efeitos colaterais quando aplicado ao corpo vivo, e é hidrofílico devido a uma estrutura química do açúcar contido no mesmo. Além disso, devido ao fato de conter muita umidade, o ácido hialurônico é conhecido por ter um efeito de tamponamento físico e um

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2/71 efeito lubrificante sobre o atrito nas articulações, além de estar envolvido na flexibilidade da pele. Além disso, o ácido hialurônico tem características de proteção contra a invasão bacteriana do exterior e é biodegradado pela hialuronidase em um organismo vivo quando transplantado para o organismo vivo. 0 ácido hialurônico é usado como um material importante para sistemas de dispensação de fármacos, fazendo com que o ácido hialurônico seja ligado a vários fármacos. Em particular, desde a aprovação pela Food and Drug Administration dos EUA, o ácido hialurônico tem sido amplamente usado como um biomaterial médico, um material de um arcabouço para engenharia de tecidos e um polímero para dispensação de fármacos. Além disso, o ácido hialurônico está presente em abundância em várias camadas diferentes da pele, e tem funções complexas, tal como uma função de prover umidade, uma função para auxiliar no tecido da matriz extracelular, uma função para atuar como material de enchimento, e uma função para estar envolvido no mecanismo de regeneração de tecido. No entanto, com o envelhecimento, quantidades de ácido hialurônico, colágeno, elastina e outros polímeros de matriz presentes na pele diminuem. Por exemplo, a exposição repetida aos raios ultravioleta do sol faz com que as células dérmicas não só diminuam sua produção de ácido hialurônico, mas também tenham uma taxa de degradação aumentada de ácido

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3/71 hialurônico. A perda deste material resulta em rugas, depressões, perda de umidade e/ou outras condições indesejáveis que contribuem para o envelhecimento. Portanto, como um dos métodos para melhorar a condição da pele, uma composição de enchimento contendo ácido hialurônico como um componente principal é amplamente usada.

[004] Como as tecnologias convencionais relacionadas com o ácido hialurônico, exemplos de síntese de derivados do ácido hialurônico insolúveis reticulados usando compostos tendo dois grupos funcionais, tais como, bisepóxido, bis-halogeneto e formaldeído foram descritos em várias peças da literatura. Em particular, a Patente U.S. N° 4.582.865 descreve um exemplo do uso de divinilssulfona para reticulação de ácido hialurônico; a Patente U.S. N° 4.713.448 descreve uma reação de reticulação usando formaldeído; e a Patente U.S. No. 5.356.883 descreve um exemplo de síntese para um gel derivado do ácido hialurônico cujo grupo carboxila foi modificado com 0acilureia ou N-acilureia usando várias carbodiimidas. Contudo, os produtos reticulados de ácido hialurônico preparados pelos métodos nestas patentes têm baixa estabilidade contra uma enzima degradante do ácido hialurônico e um alto teor de produtos químicos que não reagiram, o que pode causar biotoxicidade. Além disso, não

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4/71 é fácil controlar a reticulação ou propriedades físicas desses produtos, dependendo do uso pretendido. Assim, existem limitações na aplicação de tais produtos a vários materiais médicos. Por conseguinte, é ainda necessário desenvolver uma técnica capaz de controlar facilmente as propriedades físicas de um hidrogel do ácido hialurônico, mantendo ao mesmo tempo uma excelente biocompatibilidade do mesmo.

[005] Por conseguinte, a fim de resolver estes problemas, os presentes inventores esforçaram-se continuamente para desenvolver uma técnica capaz de melhorar a funcionalidade do ácido hialurônico que é um material biocompatível. Como resultado, os presentes inventores desenvolveram uma técnica de plataforma de hidrogel com base em ácido hialurônico modificado com um grupo pirogalol, e completaram a presente invenção com base nesta técnica.

Problema técnico [006] Consequentemente, um objetivo da presente invenção é prover um derivado do ácido hialurônico preparado por modificação do ácido hialurônico com um grupo pirogalol e um método para preparar o mesmo.

[007] Outro objetivo da presente invenção é prover um método para preparar um hidrogel derivado do ácido hialurônico, compreendendo uma etapa de reticulação dos

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5/71 derivados do ácido hialurônico.

[008] Ainda um outro objetivo da presente invenção é prover um hidrogel derivado do ácido hialurônico tendo uma estrutura na qual os derivados do ácido hialurônico são reticulados.

[009] Ainda um outro objetivo da presente invenção é prover um carreador de dispensação de fármaco ou um sistema de dispensação de fármaco (SDF) usando o hidrogel derivado do ácido hialurônico.

[0010] Ainda um outro objetivo da presente invenção é prover um material médico, tal como um arcabouço para engenharia de tecidos, usando o hidrogel derivado do ácido hialurônico.

[0011] Ainda um outro objeto da presente invenção é prover um curativo para ferimento ou barreira de aderência com base no derivado do ácido hialurônico.

[0012] Ainda um outro objetivo da presente invenção é prover uma composição de enchimento compreendendo o hidrogel derivado do ácido hialurônico.

[0013] Ainda um outro objetivo da presente invenção é prover um método para melhorar as rugas da pele, compreendendo uma etapa de injeção da composição de enchimento na ou sob a pele de um indivíduo.

[0014] No entanto, os problemas técnicos a serem resolvidos pela presente invenção não estão limitados aos

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6/71 problemas acima mencionados, e outros problemas não mencionados podem ser claramente entendidos pelos habilitados na técnica a partir do relatório a descritivo seguir.

Solução para o problema [0015] De modo a alcançar os objetivos da presente invenção como descrito acima, a presente invenção provê um método para preparar um hidrogel do ácido hialurônico, o método compreendendo uma etapa de reticulação de derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é modificado com um grupo galol, em que o derivado do ácido hialurônico foi modificado com um grupo galol devido a uma reação entre ácido hialurônico e 5'-hidroxidopamina.

[0016] Em uma forma de realização da presente invenção, o derivado do ácido hialurônico pode ser representado pela seguinte Fórmula 1, em que o derivado do ácido hialurônico pode ter um peso molecular de 10.000 Da a 2.000.000 Da, e pode ter uma taxa de substituição do grupo galol de cerca de 0,1% a cerca de 50%.

[Fórmula 1]

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	(na Fórmula 1	acima, Ri	é um	grupo	hidroxila	ou
	Ç;.. f e n é	um número	inteiro	de 1 a	1000).

[0017] Em outra forma de realização da presente invenção, na etapa de reticulação, a reticulação pode ser realizada adicionando um agente oxidante ou um agente de ajuste de pH, em que o agente oxidante pode ser periodato de sódio, peróxido de hidrogênio, peroxidase de rábano ou tirosinase, e o agente de ajuste de pH pode ser hidróxido de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de potássio, hidróxido de rubídio, hidróxido de césio, hidróxido de magnésio, hidróxido de cálcio, hidróxido de estrôncio ou hidróxido de bário.

[0018] Ainda em outra forma de realização da presente invenção, na etapa de reticulação realizada pela adição do agente oxidante, a reticulação representada pela seguinte Fórmula 2 pode ser formada entre os derivados do ácido

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8/71 hialurônico.

[Fórmula 2]

(na Fórmula 2 acima, HA' representa ácido hialurônico no qual o grupo carboxila é substituído com um grupo amida.) [0019] Ainda em outra forma de realização da presente invenção, na etapa de reticulação realizada pela adição do agente de ajuste de pH, a reticulação representada pela seguinte Fórmula 3 pode ser formada entre os derivados do ácido hialurônico.

[Fórmula 3]

(na Fórmula 3 acima, HA' representa ácido hialurônico no qual um grupo carboxila é substituído com um grupo amida.) [0020] Adicionalmente, a presente invenção provê um

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9/71 hidrogel do ácido hialurônico preparado por reticulação de derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é representado pela Fórmula 1 acima, por exemplo, um hidrogel do ácido hialurônico no qual é formada a reticulação representada pela Fórmula 2 ou Fórmula 3 acima entre os derivados do ácido hialurônico; e um carreador para dispensação de uma substância bioativa, compreendendo o hidrogel do ácido hialurônico. Deste ponto de vista, em uma forma de realização da presente invenção, o carreador inclui, mas não está limitado a, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma proteína, um peptídeo, um polipeptídeo, um composto químico de molécula pequena, DNA e/ou RNA, siRNA, um gene e células estaminais, incluindo células estaminais adultas, células estaminais mesenquimais ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs). Deste ponto de vista, em outra forma de realização da presente invenção, o carreador para dispensação de uma substância bioativa provê liberação prolongada da substância bioativa in vivo e ex vivo.

[0021] Além disso, a presente invenção provê um hidrogel do ácido hialurônico preparado por reticulação de derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é representado pela Fórmula 1 acima, por exemplo, um hidrogel do ácido hialurônico no qual é formada a reticulação representada pela Fórmula 2 ou Fórmula 3 acima entre os

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10/71 derivados do ácido hialurônico; e um arcabouço para engenharia de tecidos, compreendendo o hidrogel do ácido hialurônico.

[0022] Além disso, a presente invenção provê uma composição de enchimento, compreendendo um derivado do ácido hialurônico modificado com um grupo galol ou um hidrogel derivado do ácido hialurônico preparado por reticulação dos derivados do ácido hialurônico.

[0023] Em uma forma de realização da presente invenção de acordo com esta finalidade, o derivado do ácido hialurônico pode ter um peso molecular de 10.000 Da a 2.000.000 Da; e o derivado do ácido hialurônico pode ter uma taxa de substituição do grupo pirogalol de 0,1% a 50%, de preferência, 1% a 30% e, mais de preferência 2% a 20%. Em outra forma de realização da presente invenção, o derivado do ácido hialurônico pode estar contido em uma quantidade de 0,1% (p/v) a 15% (p/v) em relação a toda a composição de enchimento.

[0024] Ainda em outra forma de realização da presente invenção, a composição de enchimento pode estar em um estado líquido ex vivo e pode formar um estado geleificado ín vivo sem um agente de reticulação. Ainda em outra forma de realização da presente invenção, a composição de enchimento pode ser injetada em qualquer local selecionado do grupo que consiste em uma região do canal lacrimal, uma

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11/71 região de linha franzida glabelar, uma região a borda ocular, uma região da testa, uma região da ponte nasal, uma região da linha nasolabial, uma região da linha de marionete e uma região de rugas no pescoço. Ainda em outra forma de realização da presente invenção, a composição de enchimento pode compreender adicionalmente qualquer fator de crescimento celular selecionado do grupo que consiste em fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento celular epitelial (EGF), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator transformador do crescimento alfa (TGF-α), fator transformador do crescimento beta (TGFβ) , fator estimulante de colônias de granulócitos (GCSF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), e fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF). Ainda em outra forma de realização da presente invenção, a composição de enchimento pode compreender adicionalmente qualquer componente selecionado do grupo que consiste em um anestésico local, um antioxidante, uma vitamina e combinações dos mesmos.

[0025] Além disso, a presente invenção provê um método para preparar uma composição de enchimento, compreendendo

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12/71 uma etapa de introdução de um grupo pirogalol em um esqueleto de ácido glucurônico em ácido hialurônico, para preparar um derivado do ácido hialurônico; e uma etapa de adicionar o derivado do ácido hialurônico a um meio aquoso e realizar a mistura.

[0026] Além disso, a presente invenção provê um método para melhorar as rugas da pele, compreendendo uma etapa de injeção da composição de enchimento na ou sob a pele de um indivíduo.

[0027] Além disso, a presente invenção provê um agente de cicatrização de ferimento ou barreira de aderência, compreendendo um derivado do ácido hialurônico modificado com um grupo galol ou um hidrogel derivado do ácido hialurônico preparado por reticulação dos derivados do ácido hialurônico.

Efeitos Vantajosos da Invenção [0028] A técnica para preparar um hidrogel do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção com base em um derivado do ácido hialurônico modificado com um grupo galol, e inclui uma etapa de reticulação dos derivados do ácido hialurônico sob uma condição adequada de oxidação ou pH específico. A presente invenção permite controlar eficazmente as propriedades físicas de um hidrogel, tais como, a taxa de reticulação, a elasticidade e a resistência adesiva, dependendo de cada método de reticulação, enquanto

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13/71 permite que o hidrogel tenha uma excelente biocompatibilidade. Assim, a presente invenção pode ser utilizada para vários campos, tais como o campo médico e o campo de cosméticos.

Breve Descrição dos desenhos [0029] A Fig. 1 ilustra um processo de sintetizar um derivado do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção.

[0030] A Fig. 2 ilustra os resultados obtidos por análise, com (a) TF-IR ou (b) H-RMN, uma estrutura do derivado do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção.

[0031] A Fig. 3 ilustra vistas esquemáticas que mostram aparências de hidrogéis do ácido hialurônico e alterações na reticulação do mesmo, dependendo de diferentes métodos de reticulação.

[0032] A Fig. 4 ilustra (a) um resultado obtido por análise, com UV-vis, de alterações na estrutura química que ocorrem no processo de preparação de um hidrogel do ácido hialurânico usando NaICh, e (b) um mecanismo de reticulação com base no resultado.

[0033] A Fig. 5 ilustra (a) um resultado obtido por análise, com UV-vis, de alterações na estrutura química que ocorrem no processo de preparação de um hidrogel do ácido hialurânico usando NaOH, e (b) um mecanismo de reticulação

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14/71 com base no resultado.

[0034] A Fig. 6 ilustra os resultados obtidos através da identificação de taxas nas quais os hidrogéis do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção são formados, (a) ilustra os resultados obtidos pela identificação visual da formação de hidrogel ao longo do tempo, e (b) ilustra os resultados obtidos pela identificação de alterações no módulo de elasticidade dos hidrogéis ao longo do tempo.

[0035] A Fig. 7 ilustra os resultados obtidos pela identificação da rigidez e da elasticidade dos hidrogéis do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção, (a) ilustra os resultados obtidos pela identificação de alterações no módulo de elasticidade dos hidrogéis em 0,1 a 1 Hz, e (b) ilustra os resultados obtidos comparando o módulo de elasticidade e tanô (G/G') dos hidrogéis.

[0036] A Fig. 8 ilustra os resultados obtidos pela identificação de alterações na rigidez e na elasticidade dos hidrogéis do ácido hialurônico reticulados com NaICh dependendo dos pesos moleculares e concentrações dos derivados do ácido hialurônico. (a) ilustra os resultados obtidos pela identificação de alterações no módulo de elasticidade dos hidrogéis em 0,1 a 1 Hz, e (b) ilustra os resultados obtidos comparando o módulo de elasticidade e tanô(G/G') dos hidrogéis.

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15/71 [0037] A Fig. 9 ilustra resultados obtidos pela identificação da resistência adesiva dos hidrogéis do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção, (a) ilustra um resultado obtido medindo, com um instrumento reológico, as alterações na força aplicadas dependendo da distância entre as placas, e (b) ilustra um resultado obtido pela quantificação e pela avaliação da resistência adesiva.

[0038] A Fig. 10 ilustra os resultados obtidos pela identificação dos padrões de intumescimento e degradação dos hidrogéis do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção, e estes resultados foram obtidos por quantificação e avaliação da razão de intumescimento e razão de degradação dos hidrogéis do ácido hialurônico preparados usando derivados do ácido hialurônico que foram sintetizados adicionando 0,5X (a) ou l,0X (b) de 5hidroxidopamina em relação a uma concentração molar de ácido hialurônico.

[0039] A Fig. 11 ilustra os resultados obtidos identificando se os hidrogéis do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção causam citotoxicidade e resposta inflamatória. (a) e (b) ilustram respectivamente coloração com LIVE/DEAD (barra de escala = 100 μη) (a) e viabilidade (b) de hADSCs nos dias 1, 3 e 7 após o encapsulamento das hADSCs para avaliar a toxicidade de hidrogéis de HA-PG. (c) ilustra um resultado obtido pela

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16/71 realização de um ensaio de imunoadsorção enzimática para quantificação de TNF-α secretado de macrófagos (RAW 264.7) quando cocultivado com hidrogel de HA-PG reticulado com solução de NaICH ou NaOH (n=4, **p<0,01 vs grupo LPS).

[0040] A Fig. 12 ilustra os resultados obtidos pela identificação da compatibilidade ín vivo dos hidrogéis do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção, (a) ilustra formas de hidrogéis de HA-PG (DS a 8%) recuperadas de uma região subcutânea de um camundongo nos dias 0, 7, 28 e 84 após serem transplantadas para a região subcutânea. (b) ilustra perfis de biodegradação in vivo dos hidrogéis de HA-PG. (c) e (d) ilustram, respectivamente, a coloração com Η & E (c) e coloração com azul de toluidina (d) dos hidrogéis recuperados em conjunto com tecido adjacente no dia 28 após transplante (barra de escala = 300 μη) .

[0041] A Fig. 13 ilustra os resultados obtidos por identificação dos padrões de degradação in vivo dos hidrogéis do ácido hialurônico de acordo com a presente invenção in vivo. (a) ilustra os resultados obtidos identificando visualmente as alterações no volume dos hidrogéis e (b) ilustra os resultados obtidos pela identificação dos pesos dos hidrogéis restantes, após os hidrogéis serem transplantados subcutaneamente para os camundongos.

[0042] A Fig. 14 ilustra os resultados obtidos

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17/71 identificando uma possibilidade de utilizar, como uma preparação para dispensação de fármaco, um hidrogel preparado usando NaICh. (a) ilustra os resultados obtidos pela identificação da formação e da presença de microparticuias antes ou depois da liofilização, e (b) ilustra um resultado obtido pela identificação de quantidades liberadas de BSA que foram encapsuladas nas microparticuias.

[0043] A Fig. 15 ilustra os resultados obtidos identificando a possibilidade de utilizar, como uma preparação de dispensação de fármaco, um hidrogel preparado usando NaICh. (a) ilustra uma reação de reticulação usando NaIO4, (b) ilustra uma fotografia microscópica mostrando formação de microparticuias de HA-PG (barra de escala = 50 μη) , e (c) ilustra uma quantidade cumulativa de VEGF liberada de um hidrogel de HA-PG ou microparticuias de HAPG a granel (PBS, 37°C) (n=4) .

[0044] A Fig. 16 ilustra a dispensação de VEGF e os efeitos terapêuticos de um hidrogel preparado usando NaICH em um modelo de camundongo isquêmico de membro posterior, (a) ilustra fotografias mostrando resultados obtidos por injeção intramuscular de microparticuias de HA-PG contendo VEGF e fazendo uma observação no dia 0 (dia da injeção do fármaco) e no dia 28, (b) ilustra uma representação numérica dos resultados (n=4 a 5) , (c) ilustra resultados

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18/71 de coloração com Η & E e coloração com MT, usando tecido normal de camundongo como um controle (barra de escala = 100 μη), (d) ilustra um resultado obtido pela quantificação da área fibrótica em uma perna isquêmica (n = 12, **p<0,01 vs grupo PBS, ##p<0,01 vs grupo HA-PG, e @p<0,05 vs grupo VEGF), e (e) ilustra fotografias do músculo isquêmico da perna que foi imunocorado com α-SMA (formação de arteriola) e vWF (formação capilar). Setas pretas indicam formação de arteriola (positivo para α-SMA) e capilar (positivo para vWF) em tecido isquêmico, respectivamente (barra de escala = 100 μη) . (f) ilustra o número de lúmens corados positivamente com α-SMA e capilares positivos com vWF em músculo isquêmico (n = 18,20, *p<0,05 e **p<0,01 versus grupo PBS, ##p<0,01 versus grupo HA-PG, e @p<0,01 vs grupo VEGF) .

[0045] A Fig. 17 ilustra a preparação de um hidrogel de HA-PG adesivo em tecido usando reticulação mediada por NaOH. (a) ilustra a formação de um hidrogel derivado do ácido hialurônico por reticulação mediada por NaOH. (b) ilustra um resultado obtido por comparação da resistência adesiva entre um hidrogel derivado do ácido hialurônico reticulado com NaOH e um hidrogel derivado do ácido hialurônico reticulado com NaIO4. (c) ilustra um resultado obtido por comparação da resistência média de separação

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19/71 entre os respectivos hidrogéis de HA-PG (n = 3, **p<0,01 vs grupo NalCg) .

[0046] Na Fig. 18, (a) ilustra brevemente a química de aderência de um hidrogel de HA-PG induzido com NaOH, e (b) ilustra fotografias que mostram a aderência direta do hidrogel a vários órgãos de camundongo (coração, rim e fígado) .

[0047] Na Fig. 19, (a) ilustra um resultado obtido pela aplicação de um hidrogel de HA-PG induzido com NaOH em uma superfície de fígado de camundongo e realização de coloração com Η & E do hidrogel aderido à superfície do tecido do fígado após 7 dias (barra de escala = 500 μη) . (b) ilustra um resultado obtido através do transplante de células estaminais derivadas do tecido adiposo humano (hADSC) no fígado de camundongo usando HA-PG reticulado com NaOH, e assim representando em conjunto a imunocoloração do tecido hepático original e as hADSCs na estrutura de hidrogel da presente invenção. As células que tinham sido rotuladas com Dil antes do transplante foram detectadas (esquerda) . A imunocoloração foi realizada para CD44 e os núcleos das células foram contracorados com DAPI (direita) (barra de escala = 500 μη).

[0048] A Fig. 20 ilustra a geleificação de uma solução de HA-PG de acordo com a presente invenção por energia de

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20/71 oxidação no corpo, no qual a Fig. 20 (a) ilustra a injeção da solução de HA-PG e a geleificação da mesma por oxidação de energia no corpo; e a Fig. 20 (b) ilustra um resultado obtido identificando visualmente a pele de um camundongo que contém um hidrogel formado no corpo.

[0049] A Fig. 21 ilustra os resultados obtidos por injeção da solução de HA-PG de acordo com a presente invenção na pele e, em seguida, identifica se o hidrogel formado no corpo é mantido no corpo, no qual a Fig. 5 (a) ilustra os resultados obtidos pela identificação visual do hidrogel formado no corpo (semanas 0, 10 e 24); e a Fig. 5 (b) ilustra um resultado obtido medindo alterações no peso do hidrogel formado no corpo durante cerca de 6 meses.

[0050] A Fig. 22 ilustra resultados obtidos por identificação de condições para a formação de um hidrogel de HA-PG da solução de HA-PG de acordo com a presente invenção e para a injeção no corpo, em que a Fig. 22 (a) ilustra uma vista esquemática mostrando um processo de formação do hidrogel de HA-PG; e a Fig. 22 (b) ilustra um resultado obtido por comparação de um tamanho de agulha que é injetável no corpo com produtos de enchimento convencionais (Megafill, Perlane).

[0051] A Fig. 23 ilustra os resultados obtidos por injeção da solução de HA-PG de acordo com a presente invenção na pele e, em seguida, identifica os efeitos de

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21/71 melhora das rugas antes e depois da injeção, em que a Fig. 23 (a) ilustra um resultado obtido fazendo com que a pele enrugada seja transformada em réplicas e fazendo uma comparação; e a Fig. 23(b) ilustra os resultados obtidos pela quantificação da área, do comprimento e da profundidade das rugas e fazendo uma comparação.

[0052] A Fig. 24 ilustra os resultados obtidos fazendo uma comparação com produtos de enchimento convencionais (Megafill, Perlane) em termos de capacidade de manutenção no corpo, em que a Fig. 24(a) ilustra os resultados obtidos por injeção, na pele, das soluções de HA-PG de acordo com a presente invenção (200 KDa, 1 MDa), do produto Megafill e do produto Perlane e, em seguida, identificando visualmente os hidrogéis formados na corpo (dias 0, 14, 28, 56, 84, 168 e 252); e Fig. 24(b) ilustra um resultado obtido medindo alterações no peso dos hidrogéis formados no corpo por cerca de 9 meses.

[0053] A Fig. 25 ilustra os resultados obtidos fazendo uma comparação com produtos de enchimento convencionais (Megafill, Perlane) em termos de capacidade de manutenção no corpo, em que a Fig. 25(a) ilustra os resultados obtidos por injeção, na pele, das soluções de HA-PG de acordo com a presente invenção (200 KDa, 1 MDa), do produto Megafill e do produto Perlane e, em seguida, identificando visualmente os hidrogéis formados na corpo (dias 0, 14, 28, 56, 84 e

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168); e A Fig. 25(b) ilustra um resultado obtido medindo alterações no volume dos hidrogéis formados no corpo por cerca de 9 meses.

[0054] A Fig. 26 ilustra os resultados obtidos pela identificação da resistência adesiva no corpo do hidrogel formado no corpo, em que a Fig. 26(a) ilustra um resultado para o produto Perlane; e a Fig. 26 b) ilustra os resultados para as soluções de HA-PG (200 KDa, 1 MDa).

[0055] A Fig. 27 ilustra os resultados obtidos fazendo uma comparação com produtos de enchimento convencionais (Megafill, Perlane) em termos de injetabilidade, e esses resultados foram obtidos pela identificação de alterações na força de extrusão durante a injeção das soluções de HAPG de acordo com a presente invenção (200 KDa, 1 MDa) , o produto Megafill, e o produto Perlane usando agulhas de injeção de vários tamanhos (21G, 25G, 29G, 30G) .

[0056] A Fig. 28 ilustra os resultados obtidos fazendo uma comparação com produtos de enchimento convencionais (Megafill, Perlane) em termos de injetabilidade, em que a Fig. 28(a) ilustra um resultado obtido por identificação de alterações na força de extrusão ao injetar as soluções de HA-PG de acordo com a presente invenção (200 KDa, 1 MDa), o produto Megafill e o produto Perlane usando uma agulha de injeção de 30G; e a Fig. 28(b) ilustra um resultado obtido por identificação de alterações na força de extrusão ao

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23/71 injetar as soluções de HA-PG de acordo com a presente invenção (200 KDa, 1 MDa), o produto Megafill e o produto Perlane usando uma agulha de injeção de 29G.

[0057] A Fig. 29 ilustra os resultados obtidos fazendo uma comparação com produtos de enchimento convencionais (Megafill, Perlane) em termos de injetabilidade, em que a Fig. 29 (a) ilustra um resultado obtido comparando forças de desprender durante a injeção das soluções de HA-PG de acordo com a presente invenção (200 KDa, 1 MDa), o produto Megafill e o produto Perlane usando agulhas de injeção de vários tamanhos (21G, 25G, 29G, 30G) ; e a Fig. 29 (b) ilustra um resultado obtido em comparação com as forças de deslizamento dinâmicas durante a injeção das soluções HA-PG de acordo com a presente invenção (200 KDa, 1 MDa) , o produto Megafill e o produto Perlane usando agulhas de injeção de vários tamanhos (21G, 25G, 29G, 30G).

[0058] A Fig. 30 ilustra os resultados obtidos por injeção, na pele, das soluções de HA-PG de acordo com a presente invenção em que o fator de crescimento de células epiteliais (20 ng/ml, 1 μρ/ηΐ, 20 μρ/ηΐ) foi encapsulado e em seguida identificando efeitos de melhora de rugas antes e depois da injeção, em que a Fig. 30(a) ilustra os resultados obtidos fazendo com que a pele enrugada seja transformada em réplicas e fazendo uma comparação; e a Fig. 30 (b) ilustra os resultados obtidos pela quantificação da

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24/71 área, do comprimento e da profundidade das rugas e fazendo uma comparação.

[0059] A Fig. 31 ilustra resultados obtidos por injeção, na pele, das soluções de HA-PG de acordo com a presente invenção em que o fator de crescimento de células epiteliais (20 ng/ml, 1 pg/ml, 20 pg/ml) foi encapsulado, realizando coloração com Η & E de seções congeladas de OCT, e realizando exame histopatológico.

[0060] A Fig. 32 ilustra os resultados obtidos por comparação dos efeitos regeneradores do tecido da pele ao longo do tempo (1 mês) entre um produto convencional de enchimento (Perlane), a solução de HA-PG na qual o fator de crescimento celular epitelial não foi encapsulado, e a solução de HA-PG de acordo com a presente invenção em que o fator de crescimento de células epiteliais (10 pg/ml) foi encapsulado, e tais resultados foram obtidos através da realização de coloração com Η & E das suas seções congeladas de OCT e realização de exame histopatológico.

[0061] A Fig. 33 ilustra os resultados obtidos em comparação com os efeitos de regeneração do tecido da pele ao longo do tempo (1 mês) entre um produto convencional de enchimento (Perlane), a solução de HA-PG na qual o fator de crescimento celular epitelial não foi encapsulado, e a solução de HA-PG de acordo com a presente invenção em que o

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25/71 fator de crescimento de células epiteliais (10 pg/ml) foi encapsulado, e tais resultados foram obtidos através da realização de coloração com tricromo de Masson das seções

congeladas de OCT	dos	mesmos	e realização	de exame
histopatológico.
[0062] A Fig.	34	ilustra	os resultados	obtidos
aplicando a solução	de	HA-PG de	acordo com a	presente

invenção a um local do ferimento e, em seguida, identificando visualmente se um hidrogel é formado no local do ferimento, e assim o hidrogel é aderido ao mesmo.

[0063] A Fig. 35 ilustra uma vista que mostra brevemente um processo de formulação da solução de HA-PG de acordo com a presente invenção em uma forma de pó.

[0064] A Fig. 36 ilustra os resultados obtidos por injeção, na pele, da solução de HA-PG de acordo com a presente invenção que foi novamente solubilizada a partir de uma forma de pó liofilizada da mesma, e depois identificando visualmente um hidrogel formado no corpo.

[0065] A Fig. 37 ilustra os resultados obtidos pela identificação da estabilidade em armazenamento da solução de HA-PG de acordo com a presente invenção, e esses resultados foram obtidos identificando se a solução de HAPG é ou não geleificada em um recipiente de armazenamento enquanto armazena a solução de HA-PG em temperatura ambiente (25°C) ou em um estado refrigerado (4°C).

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26/71 [0066] A Fig. 38 ilustra os resultados obtidos pela identificação da estabilidade em armazenamento da solução de HA-PG de acordo com a presente invenção. O gás nitrogênio foi injetado em um recipiente de armazenamento para bloquear o contato entre a solução de HA-PG e o oxigênio, e então a solução de HA-PG foi armazenada em um estado refrigerado (4°C) por 3 dias; por outro lado, a solução de HA-PG foi armazenada em estado congelado (-80°C) por 10 dias. Então, essas soluções foram injetadas na pele, e os hidrogéis formados no corpo foram visualmente identificados, de modo que os resultados foram obtidos.

Descrição Detalhada da Invenção [0067] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.

[0068] A presente invenção provê um método para preparar um hidrogel do ácido hialurônico, o método compreendendo uma etapa de reticulação de derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é modificado com um grupo galol, em que o derivado do ácido hialurônico foi modificado com um grupo galol devido a uma reação entre o ácido hialurônico e 5'-hidroxidopamina.

[0069] O termo ácido hialurônico (HA), como aqui usado, refere-se a um polissacarideo linear de alto peso molecular que contém, como unidade repetitiva, um

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27/71 dissacarideo no qual o ácido D-glucurônico (GlcA) e o Nacetil-D-glucosamina (GlcNAc) são ligados por ligação β1,3-glicosídica, e inclui o ácido hialurônico e os sais do mesmo. Para os sais, um sal de sódio, um sal de potássio, um sal de magnésio, um sal de cálcio, um sal de alumínio e semelhantes são exemplificados, mas não estão limitados aos mesmos.

[0070] A unidade repetitiva de dissacarideo de ácido hialurônico pode ser representada pela seguinte Fórmula 4, e pode ser de 1 a 1.000, mas não está limitada a isso.

[Fórmula 4]

Γ OH 1 [OH ; S i \..... \ 5 ] OH j [ [0071] O ácido hialurônico é encontrado no humor vítreo ocular, no líquido sinovial das articulações, na crista do galo, e semelhantes, e é conhecido como um biomaterial altamente biocompatível. Apesar da alta aplicabilidade de um hidrogel do ácido hialurônico a biomateriais, propriedades mecânicas limitadas devido a um polímero natural em si tornam difícil a aplicação do hidrogel do ácido hialurônico a biomateriais (por exemplo, carreador de dispensação de fármaco, arcabouço para engenharia de tecidos). Assim, os presentes inventores

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28/71 introduziram um grupo galol tendo uma alta capacidade de oxidação em ácido hialurônico para preparar um derivado do ácido hialurônico (Exemplo de Preparação 1), e reticularam tais derivados do ácido hialurônico sob uma condição de pH adequada de oxidação ou específica (pH 8 a 9) para preparar um hidrogel (Exemplo de Preparação 2) . Por conseguinte, a presente invenção tem significado técnico, na medida em que as propriedades físicas, tais como, a velocidade de reticulação, a elasticidade e a resistência adesiva de um hidrogel, podem ser eficazmente controladas (Exemplos 1 e 3) .

[0072] O termo derivado do ácido hialurônico ou conjugado de ácido hialurônico-pirogalol, como aqui usado, é interpretado como incluindo ácido hialurônico ou um sal do mesmo, em que um grupo galol é introduzido em um esqueleto de ácido glucurônico no ácido hialurônico ou o sal do mesmo.

[0073] Como uma forma de realização, o derivado do ácido hialurônico pode ser preparado por uma reação entre um terminal da unidade repetitiva de dissacarídeo da Fórmula 4 acima, especificamente, um grupo carboxila do mesmo e 5'-hidroxidopamina. O derivado do ácido hialurônico preparado pela reação contém pelo menos uma unidade repetitiva representada pela seguinte fórmula 5, e pode ser representado pela fórmula 1 a seguir.

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29/71 [Fórmula 5]

[Fórmula 1]

(na Fórmula 1 acima, Ri é um grupo hidroxila ou

e n é um número inteiro de 1 a 1.000.) [0074] Além disso, o derivado do ácido hialurônico pode ter um peso molecular de 10.000 Da a 2.000.000 Da, e o derivado do ácido hialurônico pode ter uma taxa de substituição do grupo galol de 0,1% a 50%, mas a taxa de substituição do grupo pirogalol não é limitada.

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30/71 [0075] A taxa de substituição significa que um grupo funcional específico no ácido hialurônico ou seu sal do mesmo é substituído ou modificado com um grupo galol. A taxa de substituição com o grupo galol é definida como uma taxa de unidades repetitivas nas quais o grupo galol foi introduzido em todas as unidades repetitivas de ácido hialurônico, e pode ser representado, por definição, como um valor numérico maior que 0 a igual ou menor que 1, valor numérico maior que 0% e igual ou menor que 100%, ou valor numérico maior que 0%, em mol, igual ou menor que 100% em mol.

[0076] O termo hidrogel, como aqui usado, significa uma estrutura tridimensional de um polímero hidrofílico que retém uma quantidade suficiente de umidade. Para a finalidade da presente invenção, o hidrogel indica um hidrogel formado por derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é modificado com um grupo galol.

[0077] Um processo de preparação do hidrogel do ácido hialurônico pode ser realizado por uma reação de reticulação entre os derivados do ácido hialurônico. Para a reação de reticulação, o processo pode incluir adicionalmente uma etapa de mistura dos derivados do ácido hialurônico com PBS e semelhantes para preparar uma solução precursora de hidrogel do ácido hialurônico. Tal reticulação pode ser realizada por reticulação química

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31/71 causada por irradiação UV, reticulação física ou reticulação biológica, para formar um hidrogel. Aqui, a reticulação química causada por irradiação UV inclui fotorreticulação, reticulação utilizando um reticulador reativo, ou semelhante. A reticulação biológica inclui reticulação utilizando uma força de ligação entre a heparina e o fator de crescimento, reticulação usando ligação complementar de DNA ou semelhantes, e semelhantes. A reticulação física inclui reticulação por ligação de hidrogênio, reticulação por interação hidrofóbica, reticulação utilizando interação eletrostática ou semelhantes. De preferência, a reticulação pode ser realizada adicionando um agente oxidante ou um agente de ajuste de pH. 0 agente oxidante pode ser periodato de sódio, peróxido de hidrogênio, peroxidase de rábano ou tirosinase, e o agente de ajuste do pH pode ser hidróxido de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de potássio, hidróxido de rubídio, hidróxido de césio, hidróxido de magnésio, hidróxido de cálcio, hidróxido de estrôncio ou hidróxido de bário. No entanto, o agente oxidante e o agente de ajuste de pH não estão limitados aos mesmos.

[0078] Em uma forma de realização, em um caso em que o agente oxidante é adicionado e a reticulação é realizada, a reticulação representada pela seguinte Fórmula 2 é formada entre os derivados do ácido hialurônico. Na Fórmula 2, HA'

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32/71 representa ácido hialurônico, em que o grupo carboxila é substituído com um grupo amida.

[Fórmula 2]

[0079] Em outra forma de realização, em um caso em que o agente de ajuste de pH é adicionado e a reticulação é realizada, a reticulação representada pela seguinte Fórmula 3 é formada entre os derivados do ácido hialurônico. Na

Fórmula 3, HA' representa ácido hialurônico, em que o grupo carboxila é substituído com um grupo amida.

[Fórmula 3]

[0080] Em uma forma de realização da presente invenção, na etapa de reticulação de derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é modificado com um grupo galol, um hidrogel do ácido hialurônico foi preparado

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33/71 respectivamente usando periodato de sódio, que é um agente oxidante, ou hidróxido de sódio, que é um agente de ajuste de pH (ver Exemplo de Preparação 2). Como um resultado, foi possível identificar que os hidrogéis do ácido hialurônico preparados de acordo com os respectivos métodos de reticulação exibem diferenças marcantes nas propriedades físicas, tais como, taxa de reticulação, rigidez, elasticidade, resistência adesiva e padrão de degradação, juntamente com excelente biocompatibilidade (ver Exemplos 1 a 3) .

[0081] Em uma forma de realização da presente invenção, é provida uma composição de enchimento compreendendo o derivado do ácido hialurônico ou hidrogel do ácido hialurônico da presente invenção. A composição de enchimento da presente invenção é provida em um estado líquido ou em solução, em que os derivados do ácido hialurânico em cada um dos quais um grupo galol foi introduzido são misturados em um meio aquoso. Em particular, em um caso de ser injetado no corpo, tal solução, embora não contenha um componente de reticulação, pode formar um hidrogel somente com poder oxidante no corpo sem desvio interpessoal, servindo assim para reabastecer o tecido da pele e reter a umidade em a pele. Em uma forma de realização, o meio aquoso é uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o derivado de ácido hialurânico pode

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34/71 estar contido em uma quantidade, de preferência, de 0,1% (p/v) a 20,0% (p/v), e mais de preferência, de 0,3% (w/v) a 10,0% (p/v), em relação a toda a composição de enchimento. Contudo, várias modificações ou alterações podem ser feitas dependendo dos meios aquosos e razões de conteúdo em uma composição de enchimento que são bem conhecidas na técnica.

[0082] O termo enchimento, como aqui usado, significa um material injetável que reabastece o tecido da pele, por exemplo, como por injeção de um material biocompativel dentro ou sob a pele, para melhorar as rugas e restaurar o volume cosmético. Atualmente, como materiais para preparar enchimentos que foram aprovados pela FDA ou MFDS, são mencionados colágeno, ácido hialurônico, hidroxiapatite de cálcio, ácido polilático e semelhantes. Entre estes, o ácido hialurônico é um material semelhante ao constituinte do corpo humano e pode ser usado sem teste de reação da pele; e o ácido hialurônico tem uma característica de atrair 214 moléculas de água por molécula, retendo efetivamente a umidade na pele. Assim, o ácido hialurônico atualmente representa cerca de 90% do mercado de enchimento. Devido ao uso de um derivado do ácido hialurônico no qual foi introduzido um grupo galol tendo alto poder oxidante, a composição de enchimento de acordo com a presente invenção pode formar um hidrogel apenas com poder oxidante no corpo sem adição de um agente

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35/71 de reticulação para que a biocompatibilidade seja reforçada, e o hidrogel acima mencionado formado no corpo pode manter sua forma em um estado transparente por um longo período de tempo (pelo menos 6 meses). Assim, a composição de enchimento tem um significado tópico na medida em que mostra um excelente efeito de melhoramento de rugas de acordo com as características do ácido hialurânico como descrito acima, tem excelente resistência adesiva e estabilidade no corpo em comparação com produtos de enchimento convencionais, e pode ser injetada estavelmente em um local alvo, independentemente da força de extrusão (Exemplos 2 e 3).

[0083] Adicionalmente, a composição de enchimento da presente invenção pode ser formulada em uma forma de pó e, mais especificamente, em uma forma de pó liofilizada, para prover facilidade de uso e estabilidade no armazenamento. Por outro lado, a composição de enchimento acima mencionada requer uma etapa de pré-tratamento na qual é dissolvida em um meio aquoso tal como PBS e solubilizada antes de ser injetada na pele. No entanto, também é possível aplicar diretamente uma composição de enchimento, que foi transformada em uma solução, dependendo das suas condições de armazenamento e formulação.

[0084] Em outra forma de realização, de modo a conferir um efeito eficaz de regeneração da pele, a

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36/71 composição de enchimento da presente invenção pode compreender adicionalmente um fator de crescimento celular ou uma vitamina. 0 fator de crescimento celular refere-se coletivamente a um polipeptideo que facilita a divisão celular, crescimento e diferenciação, e pode ser, de preferência, selecionado do grupo que consiste em fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento de células epiteliais (EGF), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator transformador de crescimento alfa (TGF-α), fator transformador do crescimento beta (TGFβ) , fator estimulante de colônias de granulócitos (GCSF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócitos HGF), fator de crescimento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF). 0 fator de crescimento celular pode estar contido em uma quantidade de 20 ng/ml a 20 mg/ml, mas não se limita a isso.

[0085] Ainda em outra forma de realização, a composição de enchimento da presente invenção pode compreender adicionalmente um anestésico local para aliviar a dor durante um processo de injeção. O anestésico local pode ser selecionado do grupo que consiste em ambucaina,

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37/71 amolanona, amilocaína, benoxinato, benzocaína, betoxicaína, bifenamina bupivacaína butacaína butambeno butanilicaína butetamina butoxicaína carticaína cloroprocaína, cocaetileno, cocaína, ciclometicaína, dibucaína dimetisoquina dimetocaína diferodona diciclonina, ecgonidina, ecgonina, cloreto de etila, etidocaína beta-eucaína euprocina fenalcomina fomocaína, hexilcaína, hidroxitetracaína, p-aminobenzoato de isobutila, mesilato de leucinocaína, levoxadrol, lidocaína, mepivacaína, meprilcaína, metabutoxicaína, cloreto de metila, miretaína, naepaína, octacaína, ortocaína, oxetazaína, paretoxicaína, fenacaína, fenol, piperocaína, piridocaína, polidocanol, pramoxina, prilocaína, procaína, propanocaína, proparacaína, propipocaína, propoxicaína, pseudococaína, pirrocaína, ropivacaína, bupivacaína, álcool salicílico, tetracaína, tolicaína, trimecaína, zolamina e sais dos mesmos. 0 anestésico pode estar contido em uma quantidade, de preferência, de 0,1% em peso a 5,0% em peso, e mais de preferência 0,2% em peso de 1,0% em peso, em relação a um peso de toda a composição de enchimento, mas a quantidade não está limitada às mesmas.

[0086] Em outra forma de realização, a composição de enchimento da presente invenção pode compreender adicionalmente um antioxidante de modo a prevenir a

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38/71 oxidação e a degradação de um hidrogel produzido por ser geleifiçado no corpo. 0 antioxidante pode ser selecionado do grupo que consiste em poliol, manitol e sorbitol. 0 antioxidante pode estar contido em uma quantidade de de preferência 0,1% em peso a 5,0% em peso, e mais de preferência 0,2% em peso 1,0% em peso, em relação a um peso de toda a composição de enchimento, mas a quantidade não está limitada às mesmas.

[0087] Em um aspecto da presente invenção, a presente invenção provê um método para preparar uma composição de enchimento, compreendendo uma etapa de introdução de um grupo galol em um esqueleto de ácido glucurônico em ácido hialurônico, para preparar um derivado do ácido hialurônico; e uma etapa de adicionar o derivado do ácido hialurônico a um meio aquoso e realizar a mistura.

[0088] Na presente invenção, a etapa de adicionar o derivado do ácido hialurônico a um meio aquoso e realizar a mistura pode ser realizada, de preferência, em um estado em que o contato com oxigênio e outras fontes de oxidação está bloqueado (por exemplo, por injeção de nitrogênio gasoso) sob uma condição entre cerca de 4°C e 2 8°C e/ou a um pH entre 4 e 8, para impedir a geleificação, antes da injeção, da composição de enchimento que se encontra em um estado liquido.

[0089] Em uma forma de realização, o meio aquoso é uma

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39/71 solução salina tamponada com fosfato (PBS), e o derivado de ácido hialurânico pode ser a Fórmula 1 acima produzida por uma reação entre o ácido hialurânico e 5'-hidroxidopamina. A composição de enchimento da presente invenção pode ser preparada adicionando o fator de crescimento celular acima mencionado, anestésico local, antioxidante, vitamina e combinações dos mesmos.

[0090] Em outro aspecto da presente invenção, é provido um método para melhorar as rugas da pele, compreendendo uma etapa de injeção da composição de enchimento na ou sob a pele de um indivíduo. Na presente invenção, um local alvo ao qual a composição de enchimento é aplicada pode ser qualquer local do corpo, tal como a face, o pescoço, a orelha, o peito, os quadris, os braços e as mãos do indivíduo e pode ser, de preferência, qualquer um local que seja uma região enrugada na pele e é selecionada do grupo que consiste em uma região do canal lacrimal, uma região de linha franzida glabelar, uma região de borda ocular, uma região da testa, uma região da ponte nasal, uma região da linha nasolabial, uma região de linha de marionete, e uma região de rugas no pescoço. No entanto, o local não está limitado às mesmas. Além disso, na presente invenção, o termo indivíduo significa um indivíduo que requer melhora das rugas da pele e, mais especificamente, inclui todos os humanos, primatas não

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40/71 humanos e semelhantes.

[0091] Em particular, a composição de enchimento da presente invenção pode ser facilmente injetada em um local alvo, independentemente da força de extrusão. Na etapa de injeção, a composição de enchimento pode ser injetada na ou sob a pele usando agulhas ou cânulas de vários tamanhos. Como método de injeção do material de enchimento, por exemplo, um método de perfuração em série, em que cada uma de múltiplas injeções é feita com uma pequena quantidade; um método de rosqueamento linear no qual uma agulha é levada para frente em cerca de 10 mm, e então cada uma das injeções é feita em uma pequena quantidade enquanto são retiradas para trás; um método de ventilação em que uma agulha é inserida uma vez e, em seguida, o método de rosqueamento linear é realizado repetidamente da mesma maneira com ângulos levemente torcidos, sem remover a agulha inserida; e semelhantes podem ser usados.

[0092] Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é provido um hidrogel do ácido hialurônico preparado por reticulação de derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é representado pela Fórmula 1 acima, em que a reticulação representada pela Fórmula 2 acima é formada entre os derivados do ácido hialurônico; e um carreador de dispensação de fármaco, um sistema de dispensação de fármaco, ou um arcabouço para engenharia de tecido,

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41/71 compreendendo o hidrogel do ácido hialurônico.

[0093] Adicionalmente, ainda em um outro aspecto da presente invenção, é provido um hidrogel do ácido hialurônico preparado por reticulação de derivados do ácido hialurônico, cada um dos quais é representado pela Fórmula 1 acima, em que a reticulação representada pela Fórmula 3 acima é formada entre os derivados do ácido hialurônico; e um carreador de dispensação de fármaco, um sistema de dispensação de fármaco, ou um arcabouço para engenharia de tecido, compreendendo o hidrogel do ácido hialurônico.

[0094] O hidrogel do ácido hialurânico da presente invenção pode ser usado como uma matriz extracelular artificial que é um esqueleto eficaz para dispensação de fármaco, e tem um significado técnico na medida em que uma forma de microparticula de nano ou microunidade pode ser implementada devido à capacidade de oxidação superior do derivado do ácido hialurônico modificado com um grupo galol. O fármaco não está particularmente limitado e pode, de preferência, incluir, mas não está limitado a, uma substância química, uma molécula pequena, um peptídeo, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico incluindo DNA, RNA ou siRNA, uma proteína, um gene, um vírus, uma bactéria, um agente antibacteriano, um agente antifúngico, um agente anticâncer, um agente antiinflamatório, uma mistura dos mesmos e semelhantes.

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42/71 [0095] Além disso, o hidrogel do ácido hialurônico da presente invenção pode ser usado como um arcabouço para engenharia de tecidos com base na excelente elasticidade e na excelente resistência adesiva. A engenharia de tecidos significa que células ou células estaminais isoladas do tecido do paciente são cultivadas em um arcabouço para preparar um complexo de arcabouço celular, e então o complexo de arcabouço preparado é transplantado novamente para o corpo vivo. O hidrogel do ácido hialurônico pode ser implementado com um arcabouço semelhante a um tecido biológico, a fim de otimizar a regeneração de tecidos e órgãos biológicos. Por conseguinte, o hidrogel do ácido hialurônico pode ser usado para um agente terapêutico de genes ou um agente terapêutico celular.

[0096] Além disso, o hidrogel da presente invenção também pode ser usado como cosméticos e materiais médicos, tais como, um agente de cicatrização de ferimento, um material de cobertura de ferimento, uma barreira de aderência, ou uma matriz dentária. No entanto, os usos do hidrogel da presente invenção não se limitam aos mesmos.

[0097] A seguir, exemplos preferidos serão descritos de modo a facilitar a compreensão da presente invenção. Contudo, os exemplos seguintes são providos apenas para a finalidade de compreensão mais fácil da presente invenção, e o escopo da presente invenção não é limitado pelos

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43/71 seguintes exemplos.

[Exemplos de preparação]

Exemplo de Preparação 1: Preparação do derivado do ácido hialurônico modificado com o grupo galol [0098] Como ilustrado na Fig. 1, um derivado do ácido hialurônico modificado com um grupo galol de acordo com a presente invenção foi preparado. Especificamente, o ácido hialurônico (PM 200K, Lifecore Biomedical, LLC, IL, EUA) foi completamente dissolvido em água (TDW), e 1 equivalente de N-hidroxissuccinimida (NHS, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, EUA) e 1,5 equivalentes de cloridrato de l—(3 — dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC, Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) foram adicionados aos mesmos. Após 30 minutos, 1 equivalente de 5'hidroxidopamina (Sigma-Aldrich, Inc.) foi adicionado como uma porção PG e o resultante foi deixado reagir a pH 4 a 4,5 durante 24 horas. Os reagentes tendo duas razões molares diferentes foram usados na preparação de conjugados de HA-PG (HA:EDC:NHS: PG = 1:1,5:1:1 ou 2:1,5:1:1). Em seguida, EDC, NHS e 5'-hidroxidopamina foram removidos por diálise com base em PBS e água (Cellu/Sep (nome comercial), membrana de diálise (limite de corte de 6,8 kDa, Membrane Filtration Products Inc., Seguin, TX, EUA)) e o solvente foi evaporado através de liofilização para preparar o derivado do ácido hialurônico da presente invenção. De modo

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44/71 a identificar a síntese do derivado do ácido hialurônico, a análise foi realizada com espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (TF-IR) (Vertex 70, Bruker, Billerica, MA, EUA) e ressonância magnética nuclear de prótons (H-RMN) (Bruker 400 MHz, Bruker). Como resultado, como ilustrado na Fig. 2(a), foi possível identificar uma ligação de amida recentemente formada através de um pico forte em uma região de número de ondas de cerca de 1.580 cnr¹ a 1.700 cnr¹, e como ilustrado na Fig. 2(b), foi possível identificar estruturas do anel benzeno aromático e -CH2CH2- em 5'-hidroxidopamina, através de picos na vizinhança de 6,5 ppm e 3 ppm, respectivamente. Dos resultados acima, verificou-se que 5'-hidroxidopamina é introduzido no derivado do ácido hialurônico da presente invenção devido a uma ligação amida formada entre o grupo carboxila do ácido hialurônico e o grupo amina de 5'hidroxidopamina. De modo a calcular um grau de substituição do grupo galol em relação ao esqueleto de HA, o conjugado de HA-PG foi dissolvido em PBS (pH 5) a 1 mg/ml e a absorbância da solução foi medida a 283 nm (espectrofotômetro UV-visível) (Gary 100 UV-vis, Varian Inc., Paio Alto, Califórnia, EUA)). A percentagem de grupos carboxi substituídos com PG no HA foi calculada usando uma curva padrão obtida através de diluição em série de uma solução de 5-hidroxidopamina (a partir de 1 mg/mL de

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45/71 concentração).

Exemplo de Preparação 2: Preparação de hidrogel do ácido hialurônico [0099] Os derivados do ácido hialurônico do Exemplo de Preparação 1 foram reticulados para preparar um hidrogel do ácido hialurônico, em que cada método de reticulação usando periodato de sio (NaIOb como um agente oxidante ou hidróxido de sódio (NaOH) como um agente de ajuste de pH (pH 8 a 9) foi empregado. Especificamente, os derivados do ácido hialurônico foram dissolvidos em PBS (1% (p/v), 2% (p/v)) e depois a reticulação foi deixada prosseguir enquanto se realizava a mistura com 4,5 mg/ml de NaICh ou NaOH 0,08 M a uma razão volumétrica de 1,5:1 a 4:1 em relação à solução derivada do ácido hialurônico. Como ilustrado na Fig. 3, através de cada um destes métodos de reticulação, foi preparado um hidrogel do ácido hialurônico de cor castanha clara ou um hidrogel do ácido hialurônico de cor azul.

[00100] De modo a identificar especificamente a reticulação do hidrogel do ácido hialurônico, uma análise com espectroscopia ultravioleta-visível (UV-vis) foi realizada. Em um caso de usar NaIOo como ilustrado na Fig. 4, foi possível identificar que uma região de comprimento de onda de 350 a 400 nm muda ao longo do tempo (Fig. 4(a)), o que significa a formação instantânea e a diminuição de

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46/71 radicais, que são produtos intermediários, em um processo de oxidação; e verificou-se que o bifenol é então formado por polimerização radicalar (Fig. 4 (b)). Além disso, em um caso de usar NaOH, como ilustrado na Fig. 5, foi possível identificar que uma região de comprimento de onda de 600 nm muda com o tempo (Figura 5(a)); deste resultado, verificouse que um complexo de transferência de enchimento e benzotropolona são formados por tautomerização [5 + 2] em um processo de oxidação (Fig. 5(b)).

[Exemplos]

Exemplo 1. Alterações nas propriedades físicas do hidrogel do ácido hialurônico dependendo do método de reticulação [00101] No presente exemplo, as alterações nas propriedades físicas dos hidrogéis do ácido hialurônico, dependendo da diferença no método de reticulação no Exemplo de Preparação 2, foram comparadas. Por outro lado, na etapa de preparação de hidrogel, uma razão de concentração molar de ácido hialurônico para 5'-hidroxidopamina (0,5X (HA:EDC:NHS:5'-hidroxidopamina = 2:1,5:1:1), IX (HA:EDC:NHS:5'-hidroxidopamina = 1:1,5:1:1)) pode ser usada para ajustar uma taxa de substituição com um grupo galol para 4% a 5% (0,5X) ou 8% a 9% (IX) (não mostrado), e as alterações nas propriedades físicas dos hidrogéis, dependendo de um grau de substituição de 5'

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47/71 hidroxidopamina, foram também comparadas. Especificamente, a formação de hidrogel e as alterações no módulo de elasticidade ao longo do tempo foram comparadas dependendo dos métodos de reticulação; e a elasticidade, a resistência adesiva, o intumescimento e os padrões de degradação, dependendo do método de reticulação e do grau de substituição de 5'-hidroxidopamina, foram respectivamente comparados e analisados.

1-1. Comparação da taxa de formação de hidrogel do ácido hialurônico [00102] Como ilustrado na Fig. 6 (a), foi possível identificar que, em um caso de uso de NaIOo um hidrogel de cor castanho claro é formado instantaneamente através de uma reação de reticulação imediata; por outro lado, em um caso de usar NaOH, um hidrogel de cor azul é formado de forma relativamente lenta. Além disso, os módulos de armazenamento (G') e os módulos de perda (G) foram medidos ao longo do tempo, e os resultados medidos foram comparados com os do hidrogel (HA-CA(NaIO4) ) obtidos pela reticulação de derivados do ácido hialurônico, em cada um dos quais foi introduzido um grupo catecol, usando NaIO4. Como um resultado, como ilustrado na figura 6 (b), todos os hidrogéis foram estavelmente formados à medida que a oxidação prosseguiu (G'> G) . Em particular, quando um momento no qual o hidrogel é formado é identificado através

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48/71 de um ponto no tempo no qual uma curva de módulo de armazenamento e uma curva de módulo de perda entram em contato um com o outro, foi encontrado que cerca de 2 a 3 minutos é necessário em um caso de ser reticulado usando NaOH, e cerca de 30 segundos é necessário para HA-CA (NaICg) ; por outro lado, a reticulação prossegue tão rapidamente que a medição não pode ser feita, no caso de ser reticulado usando NaICd.

[00103] Um coeficiente viscoelástico de ácido hialurônico foi analisado medindo-se o módulo de armazenamento (G' ) e o módulo de perda (G) dentro de um modo de varredura de frequência em uma faixa de frequência de 0,1 a 1 Hz. A elasticidade do ácido hialurônico foi calculada dividindo um coeficiente de armazenamento por um coeficiente de perda a 1 Hz (n = 45) . As cinéticas de geleificação do HA-PG foram medidas com um reômetro (MCR 102, Anton Paar, VA, EUA) em um modo de varredura de tempo em uma deformação controlada com frequência e a frequência de 10% e 1 Hz, respectivamente. Dois agentes oxidantes (NaIO4 e NaOH) foram adicionados 30 minutos após a medição inicial de G1 e G. A adesividade do hidrogel foi medida registrando a tensão de separação do hidrogel completamente reticulado entre uma sonda e uma placa de substrato em um reômetro (MCR 102, Anton Paar) (η = 3) . Uma velocidade de tracionamento para a sonda foi de 5 μη/s.

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1-2. Comparação de elasticidade e resistência adesiva [00104] Como ilustrado na Fig. 7 (a), apesar das diferenças no método de reticulação ou do grau de substituição da 5'-hidroxidopamina, em todos os casos, o módulo de armazenamento (G') foi medido como sendo maior a um certo nível do que o módulo de perda (G) , que tornou possível identificar que os hidrogéis foram formados de forma estável, além disso, o módulo de elasticidade representando a rigidez do hidrogel e tanô(G/G') representando um grau de elasticidade foi calculado. Como um resultado, como ilustrado na Fig. (b) , em caso de uso de NaIO4, melhor rigidez do hidrogel foi exibida e todos os hidrogéis apresentaram excelente força elástica mesmo em baixas taxas de substituição, por outro lado, em caso de uso de NaOH, melhor força elástica foi obtida como uma taxa de substituição aumentada. Além disso, verificou-se que, em um caso do mesmo método de reticulação, essas excelentes propriedades físicas também são melhoradas à medida que aumenta a taxa de substituição de 5'-hidroxidopamina (0,5X

<1X). Além	disso, com base	nos	resultados	acima, as
diferenças	em	propriedades	físicas	dos	hidrogéis
reticulados	com	NaIO4, dependendo	dos	pesos	moleculares

(40, 200, 500 kDa) e concentrações (1% (p/v), 2% (p/v)) dos derivados do ácido hialurônico, foram identificadas. Como resultado, como ilustrado na Fig. 8, em todos os casos, o

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50/71 módulo de armazenamento (G' ) foi medido para ser maior em um determinado nível do que o módulo de perda (G) , que tornou possível identificar que os hidrogéis foram formados de forma estável (Fig. 8 (a)); e verificou-se que o hidrogel apresenta adicionalmente rigidez melhorada e força elástica, uma vez que o ácido hialurônico tem um peso molecular aumentado e tem uma concentração maior (Fig. 8 (b) ) . Além disso, de modo a avaliar a resistência adesiva dos hidrogéis, cada um dos hidrogéis foi ligado em ponte entre as respectivas placas de um instrumento reológico (Bohlin Advanced Rheometer, Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) e a força aplicada ao instrumento foi medida aumentando o espaçamento entre as placas. Os resultados acima foram comparados com os do hidrogel (HA-CA(NaIO4) ) obtido através da reticulação de derivados do ácido hialurônico, em cada um dos quais foi introduzido um grupo catecol, usando NaIO4. Como resultado, como ilustrado na figura 9, o hidrogel formado usando NaOH e HA -CA (NaIO4) apresentou resistência adesiva superior, enquanto quase nenhuma resistência adesiva foi observada no hidrogel formado pelo uso de NaIO4.

1-3. Comparação de padrões de intumescimento e degradação [00105] Como ilustrado na Fig. 10, padrões de intumescimento e degradação ligeiramente diferentes foram

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51/71 exibidos dependendo do método de reticulação e do grau de substituição de 5'-hidroxidopamina. As características de intumescimento foram avaliadas medindo-se um peso do hidrogel remanescente em momentos específicos (dias 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14 e 28). Especificamente, o HA-PG foi incubado a 37°C em PBS e uma taxa de intumescimento foi calculada pela seguinte expressão: (Wt - Wi)/Wi x 100, onde Wt é um peso do hidrogel em cada momento, e Wi é um peso do hidrogel em um momento inicial (n = 4 a 5) . De modo a investigar um perfil de degradação, o hidrogel de HA-PG que havia sido intumescido por 3 dias foi tratado com hialuronidase (5 unidades/mL, Sigma) e um peso de ácido hialurônico remanescente foi medido nos respectivos momentos (n = 4 a 7, 0, 2, 5, 12, 24, 48 e 72 horas). Em um caso de usar NaICH em vez de NaOH, uma baixa taxa de intumescimento foi exibida e a degradação prosseguiu mais rapidamente. Para o mesmo método de reticulação, em um caso em que a taxa de substituição de 5'-hidroxidopamina aumenta, tal taxa de intumescimento e taxa de degradação tenderam a diminuir. Estes resultados, tomados em conjunto, indicam que embora os derivados do ácido hialurônico tendo a mesma estrutura sejam usados, os hidrogéis são reticulados em diferentes formas de ligação dependendo do método de reticulação (Exemplo de Preparação 2), o que leva

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52/71 a alterações nas propriedades físicas inerentes, tais como, rigidez, elasticidade, resistência adesiva, intumescimento e degradação. Além disso, pelo contrário, verificou-se que, embora o mesmo método de reticulação seja adotado, as

propriedades	físicas acima	também	foram	alteradas
dependendo	de uma estrutura	do derivado	do ácido
hialurônico.
Exemplo	2. Análise	para	citotoxi	cidade e

biocompatibilidade [00106] No presente exemplo, a citotoxicidade e a biocompatibilidade do hidrogel do ácido hialurônico do Exemplo de Preparação 2 foram avaliadas. Primeiro, a fim de identificar se o hidrogel causa toxicidade e resposta inflamatória na cultura de células 3D, células estaminais humanas derivadas de tecido adiposo (hADSCs) (1,0 χ 10⁶ células por 100 pL de hidrogel) foram cultivadas no hidrogel, e o kit de viabilidade/citotoxicidade LIVE/DEAD (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) foi usado para realizar coloração com LIVE/DEAD nos respectivos momentos (dias 1, 3 e 7) de acordo com as instruções do fabricante. As células coradas foram observadas com um microscópio confocal (LSM 880, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), e a viabilidade foi quantificada por contagem de células viáveis e mortas a partir de uma imagem de fluorescência (n = 4 a 5) . As hADSCs foram obtidas da ATCC (ATCC, Manassas, VA, EUA) e

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53/71 foram cultivadas no meio basal de células estaminais mesenquimais (ATCC) suplementado com kit de crescimentobaixo teor de soro (ATCC) e penicilina a 1%/estreptomicina (Invitrogen).

[00107] Além disso, as células imunológicas (Raw 264.7) foram cocultivadas em hidrogel usando um sistema Transwell (suportes permeáveis com poros de 3,0 μη, Corning, Nova Iorque, NY, EUA) e, em seguida, uma quantidade de fator de necrose tumoral (ΤΝΕ-α) secretada pela resposta inflamatória foi medida usando ensaio imunoenzimático (ELISA). 264,7 células foram incubadas durante a noite, e então semeadas em uma placa de 96 poços (2,0 x 10⁴ células por poço). Em seguida, 50 μΐ de hidrogel foram carregados através de uma porção de inserção superior do Transwell, e, em seguida, a incubação adicional foi realizada por 24 horas. Uma quantidade de TNF-α no meio coletado da cocultura foi quantificada usando um kit de ensaio de imunossorvente ligado a enzima TNF-α (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA).

[00108] De modo a avaliar a biocompatibilidade ín vivo do hidrogel de HA-PG, 100 μΐ do hidrogel de HA-PG (concentração final de 2% [p/v]) formados usando NaIO4 ou NaOH foram transplantados subcutaneamente para camundongos ICR. Antes do transplante, os camundongos (machos de 5

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54/71 semanas de idade, OrientBio, Seongnam, Coréia) foram anestesiados com cetamina (100 mg/kg, Yuhan, Seul, Coréia) e xilazina (20 mg/kg, Bayer Korea, Ansan, Coréia). Para análise de tecidos, estruturas de ácido hialurônico foram recuperadas com tecidos adjacentes em momentos predeterminados (dias 0, 7, 14, 28 e 84) . O ácido hialurônico recuperado foi fixado em paraformaldeído a 4% (Sigma) durante 2 dias, incorporado em composto de OCT (Leica Biosystems, Wetzlar, Hesse, Alemanha), e depois cortado em espessura de 6 pm. As amostras cortadas do experimento ín vivo foram coradas com H&E para avaliar a manutenção do hidrogel. A coloração com azul de toluidina foi realizada para investigar uma resposta imune após o transplante do hidrogel de HA-PG. A degradação in vivo do hidrogel de HA-PG foi avaliada medindo um peso remanescente da estrutura de hidrogel recuperado em cada momento (n = 3 a 5) .

[00109] Como resultado, como ilustrado nas Figs. 11 e 12, nenhum dos dois tipos de hidrogéis, dependendo do método de reticulação, exibiu citotoxicidade até 7 dias após a cultura (figuras 11(a) e 11(b)). O TNF-α que foi aumentado devido a LPS foi detectado apenas em pequena quantidade em um caso em que o tratamento com as duas formas acima mencionadas de hidrogel é realizado, e isso

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55/71 não foi muito diferente do controle (NT) no qual nenhum tratamento teve foi realizada (Fig. 11(c)). Além disso, como ilustrado na Fig. 12, mesmo em um caso em que o hidrogel é transplantado em camundongos, não foram observadas descobertas inflamatórias específicas, e foi possível identificar que uma estrutura do mesmo é bem mantida, sem proliferação de células relacionadas à inflamação, como macrófagos nas proximidades do hidrogel transplantado (Figs. 12(c) e 12(d)).

Exemplo 3. Análise para padrão de degradação ín vivo [00110] No presente exemplo, os hidrogéis do ácido hialurânico com uma diferença no método de reticulação (NaICh/NaOH) e a razão molar (0,5X, IX) da 5'hidroxidopamina reagida foram transplantados subcutaneamente para camundongos. No dia do transplante, e nas semanas 1, 4 e 12 após o transplante, os camundongos foram sacrificados e os respectivos hidrogéis foram coletados. Para estes hidrogéis, um grau de intumescimento foi visualmente identificado, e uma quantidade remanescente ín vivo foi calculada, analisando assim o padrão de degradação ín vivo e semelhantes.

[00111] Como resultado, como ilustrado na Fig. 13, foi possível identificar que o hidrogel obtido pela realização de reticulação usando NaICh tem um grau menor de intumescimento, e foi verificado que tal hidrogel apresenta

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56/71 uma degradação mais rápida in vivo. Além disso, para o mesmo método de reticulação, em um caso em que a taxa de substituição de 5'-hidroxidopamina (grupo galol) aumenta, a taxa de degradação tende a diminuir.

[00112] Os resultados dos Exemplos 2 e 3 sugerem que o hidrogel do ácido hialurânico de acordo com a presente invenção pode ser usado, por exemplo, no campo do biomaterial, tal como um carreador de dispensação de fármaco e um arcabouço para a engenharia de tecidos. Em particular, considerando as propriedades físicas inerentes do Exemplo 1 e semelhantes, o hidrogel formado usando NaICh que exibe rápida taxa de reticulação e padrão de degradação in vivo pode ser utilizado como um carreador de dispensação de fármaco na forma de partículas finas, e o hidrogel formado usando NaOH que exibe excelente resistência adesiva e um lento padrão de degradação in vivo pode ser utilizado como um arcabouço para engenharia de tecidos e semelhantes.

Exemplo 4. Utilização como sistema de dispensação de fármaco através da formação de micropartícuias

4-1. Liberação prolongada de proteína usando micropartícuias de hidrogel de HA-PG [00113] No presente exemplo, como uma forma de realização do hidrogel formado usando NaICh, uma preparação de dispensação de fármaco na forma de micropartícuias tendo um diâmetro de nano ou microunidade foi preparada e a

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57/71 eficácia do mesmo foi identificada. Primeiro, um método de emulsão de óleo/água foi usado para induzir a formação de uma emulsão da solução de derivado do ácido hialurônico (HA-PG) do Exemplo de Preparação 2, e um agente oxidante (NaICH) foi adicionado à solução. Em seguida, a formação e a presença de microparticuias foram identificadas antes e após a liofilização. Além disso, a solução de HA-PG foi misturada com uma proteína (albumina de soro bovino, BSA) , e a mistura foi preparada em uma forma de emulsão. Em seguida, um agente oxidante (NaICh) foi adicionado e a reticulação foi realizada, preparando assim microparticuias nas quais BSA foi encapsulada. Um padrão de liberação de proteína das microparticuias foi identificado ao longo de 14 dias. Como resultado, como ilustrado na Fig. 14, as microparticuias contendo, como um componente, um hidrogel do ácido hialurônico foram produzidas através do processo de preparação acima mencionado, e foram mantidas inalteradas mesmo depois de sofrerem o processo de liofilização (Fig. 14(a)). Além disso, foi possível identificar que as proteínas encapsuladas são dificilmente liberadas em um hidrogel a granel de HA-PG, enquanto as proteínas são liberadas a uma taxa constante na partícula de HA-PG (Fig. 14(b)). Assim, o hidrogel formado usando NaI04 na forma de microparticuias pode ser utilizado como uma preparação para dispensação de fármaco.

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4-2. Liberação prolongada de anticorpos usando microparticulas de hidrogel de HA-PG [00114] Primeiro, como um método para dispensação prolongada e controlada de fatores de crescimento para aplicação terapêutica, as microparticulas de hidrogel de HA-PG foram preparadas por um método de emulsão óleo/água usando formação de gel ultrarrápida com reticulação mediada por NaICú (Fig. 15(a)) . As microparticulas de HA-PG podem ser preparadas por adição simples da solução de HA-PG a uma emulsão de água em óleo. A reticulação química rápida da emulsão de HA-PG por NaICú em uma fase oleosa resultou na produção de um grande número de partículas submicrométricas de HA em poucos minutos. As microparticulas de HA-PG produzidas exibiram uma forma esférica com um diâmetro médio de 8,8 μη (±3,9 μη) (Figura 15(b)). De modo interessante, os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs) encapsulados nas microparticulas de HA-PG foram liberados lentamente durante 60 dias, enquanto os VEGFs foram dificilmente liberados da estrutura de hidrogel para o HA-PG a granel (Fig. 15(c)) . Em um estudo anterior conduzido pelos presentes inventores, verificou-se que os fatores de crescimento encapsulados em um hidrogel de alginato modificado por catecol são dificilmente liberados devido à forte ligação das proteínas ao catecol oxidado durante um processo de geleificação. Como o grupo catecol,

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59/71 um grupo PG também pode induzir forte ligação dos fatores de crescimento à estrutura do hidrogel. No entanto, parece que, devido a uma área superficial notavelmente aumentada de fatores de crescimento para liberação, o HA-PG formado como partículas finas pode liberar VEGFs.

[00115] As micropartícuias de HA-PG nas quais os VEGFs (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EUA) são incorporados foram aplicadas para facilitar a angiogênese terapêutica em doenças vasculares periféricas. A injeção intramuscular de VEGFs contidos em micropartícuias de HA-PG (dose de carregamento de VEGF: 6 μg por camundongo) mostrou um efeito terapêutico notavelmente melhorado em um modelo de camundongo isquêmico de membro preparado por ressecção e ligação da artéria femoral. Os camundongos (balb/c, fêmea de 6 semanas de idade) foram obtidos na OrientBio Inc. Após 4 semanas de injeção, não houve corte de perna ou necrose de tecido no grupo tratado com as micropartícuias de HA-PG contendo VEGF. Por outro lado, apenas 20% do grupo tratado com PBS ou apenas HA-PG sem VEGFs exibiram melhora nas pernas isquêmicas (Fig. 16(a)). Administração em bolus única de VEGFs na mesma dose (6 μg por camundongo) mostrou leve melhora nas pernas isquêmicas; entretanto, 50% dos camundongos isquêmicos dos membros ainda exibiram perda de perna ou necrose de tecido (Fig. 16(b)). Além disso, a

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60/71 análise histológica identificada por coloração com Η & E e com tricromo de Masson (MT) mostrou dano muscular mínimo e a formação de fibrose em um grupo de HA-PG/VEGF do modelo de camundongo isquêmico (Figs. 16(c) e 16(d)). Além disso, a análise imuno-histoquímica usando actina de músculo liso α (α-SMA) e fator von Willebrand (vWF) para coloração de arteríolas e coloração capilar, respectivamente, mostraram que arteríolas e capilares estão notavelmente aumentados no grupo de HA-PG/VEGF com controles (PBS, HA-PG e VEGF) (Figs. 16(e) e 16(f)). Estes resultados mostram uma melhora substancial na angiogênese. A reticulação mediada por NaOH foi usada para preparar um arcabouço de hidrogel adesivo para o transplante de células não invasivas sem injeção (Fig. 17(a)). A partir de estudos anteriores, identificouse que os polímeros modificados por catecol exibem forte resistência adesiva de tecido através de alta afinidade de ligação a vários nucleófilos de catecol oxidado em proteínas.

Exemplo 5. Identificação da geleificação da composição de enchimento de ácido hialurânico usando o poder de oxidação no corpo e efeito de melhora de rugas com a mesma 5-1. Formação e manutenção de hidrogéis usando poder oxidante no corpo [00116] A solução de HA-PG preparada no Exemplo de Preparação 1 foi injetada subcutaneamente nos camundongos.

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Em seguida, identificou-se se a geleificação da solução de HA-PG injetada pode ou não prosseguir no corpo sem a adição de um agente de reticulação. Além disso, alterações no peso do hidrogel de HA-PG formado foram medidas, sob uma condição no corpo, durante cerca de 6 meses, para identificar se o hidrogel de HA-PG formado pode ser mantido no corpo durante um longo período de tempo.

[00117] Como resultado, como ilustrado nas FIGS. 20 e 21, verificou-se que a solução de HA-PG, que foi injetada subcutaneamente em um estado líquido, é geleificada em 5 minutos para formar um hidrogel de HA-PG no corpo e que o hidrogel de HA-PG formado é mantido bem no corpo em um estado transparente por 6 meses sem qualquer grande diferença no peso. Além disso, como ilustrado na Fig. 22, no caso em que a solução de HA-PG é exposta a uma condição oxidante no corpo, as quinonas são facilmente formadas entre grupos galol tendo uma forte capacidade de autooxidação, de modo que o ácido hialurônico seja polimerizado e um hidrogel de HA-PG seja formado. Consequentemente, verificou-se que, ao contrário dos produtos de enchimento (Megafill, Perlane) que são compostos por formulações em uma forma polimerizada, a composição de enchimento da presente invenção pode ser usada como uma formulação em um estado de solução, o que permite uma injeção mais fácil na pele e permite que uma variedade de ingredientes adicionais

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62/71 seja contida. Ou seja, a solução de HA-PG da presente invenção formou um hidrogel no corpo sem adição de um agente de reticulação e pode ser mantido de forma estável no mesmo. A partir disso, foi possível identificar a possibilidade de utilizar a solução de HA-PG como uma composição de enchimento.

5-2. Identificação do efeito de melhora de rugas [00118] Com base nos resultados do Exemplo 5-1, um efeito de melhora das rugas da solução de HA-PG foi identificado. Especificamente, camundongos sem pelos receberam Calcitriol a 0,2 μρ/άΐ3, cada um por 5 vezes por semana durante um total de 6 semanas, de modo que as rugas da pele foram induzidas. Em seguida, a solução de HA-PG foi injetada subcutaneamente na pele, e a pele enrugada antes e após a injeção foi transformada em réplicas. A área, o comprimento e a profundidade das rugas foram medidos usando uma máquina de análise de rugas e comparados. Como resultado, como ilustrado na Fig. 23, a área, o comprimento e a profundidade das rugas antes da injeção da solução de HA-PG eram de cerca de 6 mm², cerca de 36 mm e cerca de 90 μη, respectivamente, enquanto que após a injeção da solução de HA-PG eram cerca de 2 mm², cerca de 19 mm, e cerca de 68 mm, respectivamente. A partir disso, foi possível identificar que a área, o comprimento e a profundidade das

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63/71 rugas são notavelmente diminuídos. Estes resultados indicam que a solução de HA-PG da presente invenção pode ser utilizada como uma composição de enchimento para melhorar as rugas da pele.

5-3. Comparação com produtos de enchimento existentes (1) Comparação em termos de resistência adesiva e fixabilidade no corpo [00119] De modo a identificar mais especificamente uma possibilidade de utilizar a solução de HA-PG como um enchimento, para hidrogéis de HA-PG com base em derivados do ácido hialurônico tendo vários pesos moleculares (200 KDa, 1 MDa) e produtos de enchimento convencionais disponíveis comercialmente (Megafill, Perlane), os padrões de manutenção e degradação dos mesmos no corpo foram medidos durante cerca de 9 meses e comparados. Além disso, para os hidrogéis produzidos pela solução de HA-PG da presente invenção e pelo produto Perlane, a resistência adesiva ou a fixabilidade no corpo foram comparadas. Como resultado, como ilustrado nas FIGS. 24 e 25, foi possível identificar que para os produtos Megafill e Perlane, o peso e o volume do hidrogel no corpo tendem a diminuir cerca de um mês após o dia da injeção, enquanto que para os hidrogéis de HA-PG, os formatos dos mesmos são mantidos por 9 meses sem grandes alterações de peso e volume. Verificouse que os hidrogéis de HA-PG possuem uma excelente

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64/71 capacidade de manutenção no corpo. Além disso, para os hidrogéis, a resistência adesiva no corpo foi identificada. Como resultado, como ilustrado na Fig. 26, foi possível identificar que o produto Perlane apresenta um fenômeno em que o hidrogel produzido por este meio não é fixado à pele e se inclina para um local específico, enquanto que o hidrogel produzido pela solução de HA-PG é bem mantido no corpo aderindo e sendo fixado no local da injeção. Esta excelente resistência adesiva no corpo é um resultado da reação entre um grupo funcional, tal como um grupo amina e um grupo tiol, existente na pele e o derivado do ácido hialurônico da presente invenção (Fig. 22(a)) . Ou seja, a solução de HA-PG da presente invenção exibe melhores estabilidade e adesividade no corpo do que os produtos de enchimento existentes.

(2 )Comparação da inj etabilidade(teste de inj etabilidade) [00120] A fim de identificar especificamente excelente injetabilidade da solução de HA-PG, para os hidrogéis de HA-PG com base em derivados do ácido hialurônico com vários pesos moleculares (200 KDa, 1 MDa) e produtos de enchimento convencionais disponíveis comercialmente (Megafill, Perlane), alterações na força de extrusão, dependendo dos tamanhos das agulhas de injeção (21G, 25G, 29G, 30G), não foram medidas apenas usando a

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Máquina de Teste Universal (MTU), mas também com a força de desprender, que é uma força necessária para mover inicialmente uma seringa, e a força de deslizamento dinâmica, que é uma força necessária para manter a motilidade de uma seringa em movimento, foi quantificada e comparada. Como resultado, como ilustrado nas FIGS. 27 e

28, o Megafill não foi extrusado em uma agulha de injeção de tamanho pequeno devido a um tamanho de partícula grande, e a extrusão foi possível somente em 21G ou menos. Mesmo em um caso de Perlane, a força de extrusão de forma irregular foi exibida em 29G e 30G devido a um tamanho de partícula. Por outro lado, em um caso das soluções de HA-PG (200 KDa, 1 MDa) da presente invenção, foi possível identificar que a extrusão eficaz é conseguida mesmo com uma pequena força em todos os tamanhos de agulhas, incluindo 29G e 30G. Além disso, forças de ruptura e forças de deslizamento dinâmicas foram comparadas. Como resultado, como ilustrado na Fig.

29, em comparação com Megafill, para o qual a medição não foi possível devido à fraca extrusão, e o Perlane apresentando um valor de força alta, as soluções de HA-PG da presente invenção (200K, 1M) exibiram um valor de força notavelmente baixo. Assim, verificou-se que a solução de HA-PG da presente invenção pode ser facilmente injetada independentemente da força de extrusão para injeção, isto é, um tamanho de agulha de injeção. Estes resultados

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66/71 indicam que as soluções de HA-PG da presente invenção podem ser injetadas diretamente em um local alvo e podem ser injetadas de forma mais estável.

5-4. Composição de enchimento funcional contendo fator de crescimento celular [00121] De modo a identificar a aplicação como um enchimento funcional, uma solução de HA-PG na qual os fatores de crescimento de células epiteliais (EGFs; 20 ng/ml, 1 pm/ml, 20 μg/ml) são encapsulados foi injetada na pele de camundongo sem pelo, nos quais as rugas foram induzidas pelo método do Exemplo 5-2; a pele enrugada antes e depois da injeção foi transformada em réplicas; e a área, o comprimento e a profundidade das rugas foram medidos usando uma máquina de análise de rugas e comparados. Um mês após a injeção da solução de HA-PG, na qual os EGFs são encapsulados, o tecido da pele foi coletado e seções congeladas de OCT do mesmo foram construídas. Então, através da coloração com hematoxilina e eosina (Η & E) das seções congeladas de OCT, foi realizado exame histopatológico. Além disso, um mês após a injeção, nos camundongos sem pelo, uma solução de HA-PG na qual os EGF (10 μρ/πιΐ) são encapsulados, uma solução de HA-PG e Perlane, que é um produto existente, diferenças na regeneração do tecido cutâneo foram comparados através de H

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67/71 & E e tricromo de Masson (MT) da mesma maneira como acima.

[00122] Como resultado, como ilustrado na Fig. 30, foi possível identificar que em um caso onde a solução de HA-PG na qual os EGFs são encapsulados é injetada, independente do tamanho das rugas formadas, a área, o comprimento e a profundidade das rugas são todos notavelmente diminuídos em comparação com antes da injeção. Além disso, como ilustrado na Fig. 31, fibras de colágeno na camada dérmica da pele foram destruídas para mostrar baixa densidade e arranjo irregular; por outro lado, à medida que a concentração dos fatores de crescimento das células epiteliais encapsuladas aumentava, as fibras de colágeno tendiam a ser arranjadas regularmente. A partir disso, foi possível identificar efeitos significativos de regeneração da pele e melhora das rugas. Além disso, como ilustrado nas FIGS. 32 e 33, em um caso onde a solução de HA-PG na qual os EGFs são encapsulados é injetada, foi possível identificar que a camada epidérmica espessada devido à indução de rugas é notavelmente espessada em comparação com os outros grupos comparativos (Sem enchimento, Perlane, HA-PG) e que a densidade de colágeno da camada dérmica é largamente aumentada. Estes resultados indicam que um fator de crescimento celular para melhorar as rugas da pele é aplicado à solução de HA-PG da presente invenção, e assim o resultante pode ser usado como um

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68/71 enchimento funcional.

Exemplo 6. Preparações para curativos de ferimento, agente de cicatrização de ferimento e barreira de aderência [00123] De modo a identificar a aplicação como uma preparação de curativos para a cicatrização de ferimento, aplicou-se uma solução de HA-PG a um modelo animal induzido por ferimento no qual a pele dorsal de camundongos foi incisada em um tamanho de 1 cm ± 1 cm, e depois a reticulação foi realizada com oxigênio ativo circundante. Em seguida, a formação de um hidrogel no local do ferimento e, assim, a aderência da solução de HA-PG ao local do ferimento foi identificada. Como resultado, como ilustrado na Fig. 34, foi possível identificar que uma película de hidrogel é formada dentro de 10 minutos após a solução de HA-PG ter sido aplicada ao local do ferimento, a partir do qual a solução de HA-PG adere ao local do ferimento. Estes resultados indicam que a solução de HA-PG pode ser utilizada como um novo tipo de material de curativo de ferimento que tem uma excelente capacidade de oxidação e pode ser aplicado uniformemente a um ferimento sem qualquer aditivo adicional.

Exemplo 7. Formulação em pós e análise de estabilidade de armazenamento

7-1. Formulação em pós [00124] De modo a identificar uma possibilidade de

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formular	uma	composição	de enchimento	em	pós, como
ilustrado	na	Fig. 35, a	solução de HA-PG	do	Exemplo de
Preparação	1	foi liofilizada para preparar	uma	composição

de enchimento em uma forma de pó. Posteriormente, a composição de enchimento em uma forma de pó foi dissolvida em PBS (pH 7) para ser ressolubilizada, e depois injetada subcutaneamente em camundongos para observar se um hidrogel foi formado. Como resultado, como ilustrado na Fig. 36, foi possível identificar que a composição de enchimento da presente invenção, que foi ressolubilizada em um estado de pó liofilizado, é reticulada por poder oxidante no corpo para formar um hidrogel como anteriormente. Estes resultados indicam que a composição de enchimento da presente invenção, que pode ser formulada em pós, pode prover aos usuários facilidade de uso e facilidade de armazenamento.

7-2. Análise de estabilidade de armazenamento [00125] De modo a identificar a estabilidade de armazenamento específica da composição de enchimento, foi primeiro identificado se a solução de HA-PG do Exemplo de Preparação 1 geleificada em um recipiente de armazenamento armazenando a mesma em estado de temperatura ambiente (25°C) ou refrigerado (4°C) . Além disso, gás nitrogênio foi injetado no recipiente de armazenamento para bloquear o contato entre a solução de HA-PG e o oxigênio, e então

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70/71 armazenado em um estado refrigerado (4°C) por 3 dias; por outro lado, a solução de HA-PG foi armazenada como um estado congelado (-80°C) por 10 dias. Então, essas soluções foram injetadas subcutaneamente em camundongos para observar se os hidrogéis eram formados. Como resultado, como ilustrado na Fig. 37, devido ao alto poder de oxidação, a geleificação da composição de enchimento da presente invenção prosseguiu dentro de um dia em temperatura ambiente e dentro de três dias em um estado refrigerado. Por outro lado, como ilustrado na Fig. 38, foi possível identificar que sob uma condição em que o oxigênio é bloqueado, em um caso de estar refrigerado, a geleificação não prossegue mesmo após transcorrer 3 dias; em um caso em que a solução de HA-PG é armazenada em um estado congelado e depois descongelada após 10 dias, a solução de HA-PG mantém as propriedades de uma solução, e mesmo em um caso em que esta solução de HA-PG é injetada na pele de camundongos, tal como solução de HA-PG é reticulada devido ao poder de oxidação no corpo para formar um hidrogel como anteriormente. Estes resultados indicam que a composição de enchimento da presente invenção pode ser armazenada durante um período de tempo mais longo sob uma condição em que o oxigênio é bloqueado ou em um estado congelado.

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71/71 [00126] Será entendido pelos habilitados na técnica à qual pertence a presente invenção que o relatório descritivo anterior da presente invenção é para fins ilustrativos e que várias alterações e modificações podem ser prontamente feitas sem afastamento do espirito técnico ou das características essenciais da presente invenção. Portanto, é para ser entendido que os exemplos acima descritos são ilustrativos em todos os aspectos e não restritivos.

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para preparar um hidrogel de ácido hialurônico caracterizado pelo fato de que compreende:

   uma etapa de reticulação de derivados de ácido hialurônico, cada um dos quais é modificado com um grupo pirogalol, em que no derivado de ácido hialurônico, o ácido hialurônico foi modificado com um grupo pirogalol.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é representado pela Fórmula 1 a seguir:

   [Fórmula 1]

   HN

   

   (na Fórmula acima, Ri é um grupo hidroxila ou

   I ΌΗ

   HO um número inteiro de 1 a 1.000).
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de que na etapa de reticulação, a

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   2/10 reticulação é realizada adicionando um agente oxidante ou um agente de ajuste de pH.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agente oxidante é qualquer um selecionado do grupo que consiste em periodato de sódio, peróxido de hidrogênio, peroxidase de rábano e tirosinase.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que na etapa de reticulação realizada por adição do agente oxidante, a reticulação representada pela Fórmula 2 a seguir é formada:

   [Fórmula 2]

   

   (na Fórmula 2 acima, HA' representa ácido hialurônico, em que o grupo carboxila é substituído com um grupo amida).
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o agente de ajuste de pH é qualquer um selecionado do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de potássio, hidróxido de rubídio, hidróxido de césio, hidróxido de magnésio, hidróxido de cálcio, hidróxido de estrôncio e

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   3/10 hidróxido de bário.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que na etapa de reticulação realizada por adição do agente de ajuste de pH, a reticulação representada pela Fórmula 3 a seguir é formada: [Fórmula 3]

   Q o ho a // 'z HA' HA^,Z (na Fórmula 3 acima, HA' representa ácido hialurônico em que o grupo carboxila é substituído com um grupo amida).
8. 8. Hidrogel de ácido hialurônico caracterizado pelo fato de que é preparado por reticulação de derivados de ácido hialurônico, cada um dos quais é representado pela Fórmula 1 a seguir, em que a reticulação representada pela Fórmula 2 a seguir é formada:

   [Fórmula 1]

   

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   4/10 (na Fórmula 1 acima, Ri é um grupo hidroxila

   HN

   ...-OH ou

   HÒ 'OH n é um número inteiro de 1 a 1.000) [Fórmula 2] (na

   Fórmula

   

   2 acima, HA' representa ácido hialurônico em que o grupo carboxila é substituído com um grupo amida).
9. 9. Hidrogel de ácido hialurônico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico tem um peso molecular de 10.000 Da a 2.000.000 Da.
10. 10. Hidrogel de ácido hialurônico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico tem uma taxa de substituição do grupo galol de 0,1% a 50%.
11. 11. Hidrogel de ácido hialurônico caracterizado pelo fato de que é preparado por reticulação de derivados de ácido hialurônico, cada um dos quais é representado pela Fórmula 1 a seguir,

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    5/10 em que a reticulação representada pela Fórmula 3 a seguir é formada:

    [Fórmula 1]

    

    Ri é um grupo hidroxila ou (na Fórmula 1 acima

    

    (na Fórmula 3 acima, HA' representa ácido hialurônico em que o grupo carboxila é substituído com um grupo amida).
12. 12. Hidrogel de ácido hialurônico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o derivado

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    6/10 de ácido hialurônico tem um peso molecular de 10.000 Da a 2.000.000 Da.
13. 13. Hidrogel de ácido hialurônico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico tem uma taxa de substituição do grupo galol de 0,1% a 50%.
14. 14. Plataforma para manipulação de tecidos caracterizada pelo fato de que compreende:

    o hidrogel de ácido hialurônico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13.
15. 15. Portador de dispensação de fármacos caracterizado pelo fato de que compreende:

    o hidrogel de ácido hialurônico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13.
16. 16. Portador de dispensação de fármacos, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fármaco é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um ácido nucleico incluindo DNA, RNA ou siRNA, um peptídeo, um gene, uma proteína, uma célula estaminal ou um composto químico.
17. 17. Composição de enchimento caracterizada pelo fato de que compreende:

    o hidrogel de ácido hialurônico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13.
18. 18. Composição de barreira de aderência caracterizada pelo fato de que compreende:

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    7/10 o hidrogel de ácido hialurônico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13.
19. 19. Composição de curativo para ferimento caracterizada pelo fato de que compreende:

    o hidrogel de ácido hialurônico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13.
20. 20. Derivado de ácido hialurônico caracterizado pelo fato de que tem a Fórmula 1 a seguir e é modificado com um grupo pirogalol:

    [Fórmula 1]

    

    (na Fórmula 1 acima, Ri é um grupo hidroxila ou

    V

    M / ^{V * * * * X}OH

    HÓ , e n é um número inteiro de 1 a 1.000) .
21. 21. Composição de enchimento caracterizada pelo fato de que compreende:

    um derivado de ácido hialurônico modificado com um grupo pirogalol.
22. 22. Composição de enchimento, de acordo com a

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    8/10 reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico é representado pela Fórmula 1 a seguir:

    [Fórmula 1]

    

    (na Fórmula 1 acima

    Ri é um grupo hidroxila ou,

    V ν^'ν-,ΟΗ

    M / ^XOH

    HO , e n é um número inteiro de 1 a 1.000) .
23. 23. Composição de enchimento, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico tem um peso molecular de 10.000 Da a 2.000.000 Da.
24. 24. Composição de enchimento, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido hialurônico tem uma taxa de substituição do grupo galol de 1% a 20%.
25. 25. Composição de enchimento, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o derivado

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    9/10

    de ácido hialurônico está contido em uma quantidade de 0, 1% (p/v) a 10% (p/v) em relação a toda a composição de enchimento. 26. Composição de enchimento, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a composição está em um estado líquido ex vivo, e forma um

    estado geleificado in vivo sem um agente de reticulação.
26. 27. Composição de enchimento, de acordo com a reivindicação 21 ou 26, caracterizada pelo fato de que a composição é injetada em qualquer sítio selecionado do grupo que consiste em uma região de canal lacrimal, em uma região glabelar de ruga horizontal, em uma região da linha interior do olho, em uma região da testa, em uma região da ponte nasal, em uma região da linha nasolabial, uma região da linha de marioneta e uma região de rugas no pescoço.

    28. Composição de enchimento, de acordo com a reivindicação 21 ou 26, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente: qualquer fator de crescimento de uma célula

    selecionado do grupo consistindo em fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento celular epitelial (EGF), fator de crescimento de queratinócitos (KGF) , fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), fator de crescimento transformante beta (TGF-β) , fator estimulante

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    10/10 de colônias de granulócitos (GCSF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF) e fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF).
27. 29. Composição de enchimento, de acordo com a reivindicação 21 ou 26, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente:

    qualquer componente selecionado do grupo consistindo em um anestésico local, um antioxidante, uma vitamina e combinações dos mesmos.