JP2020506273A - ガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体を基材とするヒドロゲルおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の他の目的は、前記ヒアルロン酸誘導体を架橋(cross-linking)させることを含む、ヒアルロン酸誘導体ヒドロゲルの製造方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ヒアルロン酸誘導体が架橋された構造を有するヒアルロン酸誘導体ヒドロゲルを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、前記ヒアルロン酸誘導体ヒドロゲルを用いた組織工学用支持体などの医療用材料を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、前記ヒアルロン酸誘導体ベースの創傷治療剤(wound dressing)または癒着防止剤(adhesion barrier)を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、前記フィラー組成物を個体の皮内または皮下に注入するステップを含む、皮膚のシワ改善方法を提供することにある。
なお、本発明が達成しようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されず、言及していないまた他の課題は下記の記載によって当業者に明らかに理解できるものである。
[化学式1]
[化学式2]
[化学式3]
なお、本発明は、ガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体またはそれを架橋させて製造したヒアルロン酸誘導体ヒドロゲルを含む、フィラー組成物を提供する。
さらに、本発明は、ガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体またはそれを架橋させて製造したヒアルロン酸誘導体ヒドロゲルを含む、創傷治療剤(wound dressing)または癒着防止剤(adhesion barrier)を提供する。
本発明は、ガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体を架橋させるステップを含み、前記ヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸と5’−ヒドロキシドーパミン間の反応によってガロール基で修飾されている、ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法を提供する。
[化学式4]
一具体例として、前記化学式4の二糖繰り返し単位の末端、具体的には、そのカルボキシ基と5’−ヒドロキシドーパミン間の反応により製造されることができる。前記反応により製造されたヒアルロン酸誘導体は、下記化学式5の繰り返し単位を一つ以上含み、下記化学式1のように表すことができる。
前記「置換率」とは、ヒアルロン酸またはその塩の特定の官能基がガロール基で代替または修飾されることを意味する。ガロール基への置換率は、全体ヒアルロン酸繰り返し単位のうちガロール基が導入された繰り返し単位の割合に定義され、定義上、0超過1以下の数値、または0%超過100%以下の数値、または0モル%超過100モル%以下の数値で表すことができる。
[化学式2]
[化学式3]
本発明の側面において、本発明は、ヒアルロン酸のグルクロン酸の骨格にガロール基を導入してヒアルロン酸誘導体を製造するステップ;および前記ヒアルロン酸誘導体を水性媒質に添加して混合するステップを含む、フィラー組成物の製造方法を提供する。
以下では、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであって、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
製造例1:ガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体の製造
図1に示すように、本発明のガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体を製造した。具体的には、ヒアルロン酸(MW 200K、Lifecore Biomedical, IL, USA)を水(TDW)に完全に溶解させ、1当量のNHS(N-hydroxysuccinimide、Sigma, St.Louis, MO, USA)と1.5当量のEDC(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ehtylcarbodiimide hydrochloride、Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)を添加し、それより30分後、PG部分として1当量の5’−ヒドロキシドーパミン(5-hydroxydopamine、Sigma)を添加してpH4〜4.5で24時間反応させた。2個の異なるモル比の反応物をHA−PGコンジュゲートの製造に用いた(HA:EDC:NHS:PG=1:1.5:1:1または2:1.5:1:1)。その後、EDC、NHS、5’−ヒドロキシドーパミンをPBSおよび水ベースの透析(Cellu/Sep(商標名)、dialysis membrane(6.8kDa cut-off, Membrane Filtration Products Inc., Seguin, TX, USA))により除去し、凍結乾燥により溶媒を蒸発させて本発明のヒアルロン酸誘導体を製造した。前記ヒアルロン酸誘導体の合成を確認するために、FT−IR(Fourier transform-infrared spectroscopy)(Vertex 70, Bruker, Billerica, MA, USA)およびH−NMR(proton Nuclear magnetic Resonance)(Bruker 400 MHz, Bruker)で分析した結果、図2aに示すように、約1,580cm−1〜1,700cm−1波数領域での強いピークを通じて新しく形成されたアミド結合を確認することができ、図2bに示すように、6.5ppmおよび3ppm付近のピークを通じて各々5’−ヒドロキシドーパミンの芳香族のベンゼン環および−CH2CH2−の構造を確認することができた。前記結果から、本発明のヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸のカルボキシ基と5’−ヒドロキシドーパミンのアミン基間に形成されたアミド結合により5’−ヒドロキシドーパミンが導入されることが分かった。HA骨格に対するガロール基の置換程度を計算するために、HA−PGコンジュゲートをPBS(pH5)に1mg/mLで溶解させ、溶液の吸光度を283nm(UV-visible spectrophotometer(Cary 100 UV-vis, Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)において測定した。PGで置換されたHA内のカルボキシ基の%を5’−ヒドロキシドーパミン溶液(1mg/mL濃度から)の連続希釈により得た標準曲線を用いて計算した。
前記製造例1のヒアルロン酸誘導体を架橋(cross-linking)させてヒアルロン酸ヒドロゲルを製造し、この時、架橋方式は酸化剤である過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)またはpH調節剤(pH8〜9)である水酸化ナトリウム(NaOH)を各々用いた。具体的には、前記ヒアルロン酸誘導体をPBSに溶解させた後(1%(w/v)、2%(w/v))、4.5mg/mlのNaIO4または0.08MのNaOHをヒアルロン酸誘導体溶液の体積に対比して1.5:1〜4:1の割合で混合させながら架橋を進行し、図3に示すように、これらの各々を通じて明るい茶色または青色を帯びるヒアルロン酸ヒドロゲルを製造した。
実施例1.架橋方式に応じたヒアルロン酸ヒドロゲルの物性変化
本実施例においては、前記製造例2の架橋方式の差に応じたヒアルロン酸ヒドロゲルの物性変化を比較した。一方、前記ヒドロゲルの製造ステップにおいて、ヒアルロン酸に対比して5’−ヒドロキシドーパミンのモル濃度比(0.5×(HA:EDC:NHS:5’-hydroxydopamine=2:1.5:1:1)、1×(HA:EDC:NHS:5’-hydroxydopamine=1:1.5:1:1))によってガロール基の置換率を4〜5%(0.5×)、または8〜9%(1×)に調節することができ(示さず)、5’−ヒドロキシドーパミンの置換程度に応じたヒドロゲルの物性変化も比較した。具体的には、時間の経過に応じたヒドロゲルの形成および弾性係数の変化を架橋方式に応じて比較し、架橋方式および5’−ヒドロキシドーパミンの置換程度に応じた弾性、接着力、膨潤、および分解様相を各々比較分析した。
図6aに示すように、NaIO4を用いた場合には、明るい茶色を帯びるヒドロゲルが即刻的な架橋反応により瞬間的な形成されたのに対し、NaOHを用いた場合には、青色を帯びるヒドロゲルが相対的に徐々に形成されるのを確認することができた。また、時間の経過に応じた貯蔵弾性率G’と損失弾性率G’’を測定し、カテコール基が導入されたヒアルロン酸誘導体をNaIO4を用いて架橋させたヒドロゲル(HA−CA(NaIO4))と前記結果を比較した。その結果、図6bに示すように、いずれも酸化が進行するにつれて安定的にヒドロゲルが形成された(G’>G’’)。特に、貯蔵弾性率曲線と損失弾性率曲線が接する時点を通じてヒドロゲルの形成時点を確認した時、NaOHを用いて架橋させた場合には約2〜3分、HA−CA(NaIO4)の場合には約30秒程度がかかったのに対し、NaIO4を用いた場合には測定できないほど速く架橋が進行することが分かった。
図7aに示すように、架橋方式または5’−ヒドロキシドーパミンの置換程度の差にもかかわらず、いずれも貯蔵弾性率G’が損失弾性率G’’に比して一定のレベルに高く測定されたところ、安定的にヒドロゲルが形成されるのを確認することができた。また、ヒドロゲルの強度を表す弾性係数(Elastic modulus)と弾性程度を表すtanδ(G’’/G’)を算出した結果、図7bに示すように、NaIO4を用いる場合には、ヒドロゲルの強度がさらに優れ、低い置換率でも全て優れた弾性力を有していたのに対し、NaOHを用いる場合には、置換率の増加に応じて優れた弾性力を得た。また、同一の架橋方式である場合には、5’−ヒドロキシドーパミンの置換率が増加するに伴い、このようなそれぞれの優れた物性も向上することが分かった(0.5×<1×)。また、前記結果に基づいて、ヒアルロン酸誘導体の分子量(40、200、500kDa)および濃度(1%(w/v)、2%(w/v))に応じたNaIO4で架橋されたヒドロゲルの物性差を確認した結果、図8に示すように、全て貯蔵弾性率G’が損失弾性率G’’に比して一定のレベルに高く測定されたところ、安定的にヒドロゲルが形成されるのを確認することができ(図8a)、ヒアルロン酸の分子量の大きさが大きくなるほど、濃度が高くなるほど、ヒドロゲルの強度および弾性力が向上することが分かった(図8b)。また、ヒドロゲルの接着力を評価するために、レオロジー機器(Bohlin Advanced Rheometer, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)の各プレートの間でヒドロゲルを架橋させ、前記プレートの間隔を増加させながら機器に加えられる力を測定し、カテコール基が導入されたヒアルロン酸誘導体をNaIO4を用いて架橋させたヒドロゲル(HA−CA(NaIO4))と前記結果を比較した。その結果、図9に示すように、NaOHにより形成されたヒドロゲル、およびHA−CA(NaIO4)は優れた接着力を示したのに対し、NaIO4により形成されたヒドロゲルは接着力がほぼ観察されなかった。
図10に示すように、架橋方式および5’−ヒドロキシドーパミンの置換程度に応じて多少相異した膨潤および分解様相を示した。膨潤特性は、特定の時点(0、1、2、3、5、7、14および28日目)に残存するヒドロゲルの重さを測定して評価した。具体的には、HA−PGをPBS、37℃でインキュベーションし、膨潤率を次の式で計算した:(Wt−Wi)/Wi×100、ここで、Wtは各時点でのヒドロゲルの重さであり、Wiは初期時点でのヒドロゲルの重さである(n=4〜5)。分解プロファイルを調査するために、3日間膨潤したHA−PGヒドロゲルをヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)(5units/mL、Sigma)で処理し、残存するヒアルロン酸の重さを各時点ごとに測定した(n=4〜7、0、2、5、12、24、48および72時間)。NaOHよりNaIO4を用いた場合に、膨潤率は低く、分解はより速く進行し、同一の架橋方式である場合には、5’−ヒドロキシドーパミンの置換率が増加した場合に、このような膨潤率および分解速度は減少する傾向を示した。このような結果を総合してみると、同一構造のヒアルロン酸誘導体を用いた場合であっても、架橋方式に応じてヒドロゲルは相異した結合形態で架橋され(製造例2)、これは、強度、弾性、接着力、膨潤および分解のような固有な物理的特性の変化につながることを示す。また、これとは逆に、同一の架橋方式を採択したとしても、ヒアルロン酸誘導体の構造に応じて上記の物理的特性も変化することが分かった。
本実施例においては、前記製造例2のヒアルロン酸ヒドロゲルの細胞毒性および生体適合性を評価した。先ず、3D細胞培養での毒性および炎症反応の誘発有無を確認するために、ヒドロゲルに幹細胞(human adipose-derived stem cell、hADSC)(100μLのヒドロゲルあたり1.0×106細胞)を培養し、LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を製造会社の指示に従って各時点(time point)(1、3および7日目)にLive/Dead染色を行った。染色された細胞を共焦点顕微鏡(confocal microscope)(LSM 880, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)で観察し、生存率は蛍光イメージから生存細胞と死滅細胞を計数して定量化した(n=4〜5)。hADSCはATCC(ATCC, Manassas, VA, USA)から入手し、Growth Kit-low serum(ATCC)および1% ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)が補充された間葉幹細胞培地Mesenchymal Stem Cell Basal Medium(ATCC)で培養した。
本実施例においては、架橋方式(NaIO4/NaOH)および反応させた5’−ヒドロキシドーパミンのモル比(0.5×、1×)に差があるヒアルロン酸ヒドロゲルをマウスの皮下に移植した。移植した当日、それより1週、4週および12週後にマウスを犠死させ、それぞれのヒドロゲルを採取して、それらの膨潤程度を肉眼で確認し、in vivoでの残存量を算出することによって、in vivoでの分解様相などを分析した。
4−1.HA−PGヒドロゲル極微粒子を用いたタンパク質の徐放(sustained release)
本実施例においては、NaIO4により形成されたヒドロゲルの一態様として、ナノまたはマイクロ単位の直径を有する極微粒子形態の薬物送達用製剤を製造し、その効能を確認した。先ず、水中油エマルション(Oil/water emulsion)方式を用いて製造例2のヒアルロン酸誘導体溶液(HA−PG)のエマルションの形成を誘導し、前記溶液に酸化剤(NaIO4)を添加した後、凍結乾燥前および後の極微粒子の形成および存在を確認した。また、HA−PG溶液とタンパク質(ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin)、BSA)を混合しエマルション形態に作った後、酸化剤(NaIO4)を添加して架橋させることによってBSAが封入された極微粒子を製造し、14日にかけて極微粒子のタンパク質の放出様相を確認した。その結果、図14に示すように、前記製造過程を通じてヒアルロン酸ヒドロゲルを成分とする極微粒子が生成され、凍結乾燥過程を経ても相変わらず保持された(図14a)。また、バルクに製造されたヒドロゲル(HA-PG bulk hydrogel)においては封入されたタンパク質がほぼ放出されなかったのに対し、前記極微粒子(HA-PG particle)においてはタンパク質が一定の速度で放出されるのを確認することができたところ(図14b)、極微粒子形態のNaIO4により形成されたヒドロゲルは薬物送達製剤として活用することができるであろう。
先ず、治療的適用を成長因子の徐放および調節送達のための方法として、HA−PGヒドロゲル極微粒子をNaIO4−媒介架橋の超高速ゲル−形成を用い、水中油エマルション方法で製造した(図15(a))。HA−PG極微粒子は、HAPG溶液の油中水(water-in-oil)エマルションに単に加えることによって製造できる。オイル上でNaIO4によるHAPGエマルションの迅速な化学的架橋は数分内にマイクロ以下のHA粒子を多量生成させた。生成されたHA−PG極微粒子は、平均直径8.8μm(±3.9μm)の球状を示した(図15(b))。興味深くにも、HA−PG極微粒子により封入されたVEGF(血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor))は60日間徐々に放出されたのに対し、バルク形態のHA−PGはヒドロゲル構造物からほぼ放出されなかった(図15(c))。本発明者らの先行研究において、本発明者らは、カテコール−修飾されたアルギネートヒドロゲル内に封入された成長因子が、ゲル化過程でタンパク質が酸化されたカテコールに強く結合することにより、ほぼ放出されないのを確認したことがある。PG基もカテコール基と同様に、成長因子のヒドロゲル構造物への強力な結合を誘導することができるであろう。しかし、微粒子で形成されたHA−PGが顕著に増加した成長因子の放出のための表面積によりVEGFを放出できると見られる。
5−1.体内酸化力を用いたヒドロゲルの形成および保持
製造例1で製造されたHA−PG溶液をマウスの皮下に注入し、その後、前記注入されたHA−PG溶液が架橋剤の添加がなくても体内でゲル化が進行するか否かを確認した。また、体内条件で、形成されたHA−PGヒドロゲルの重さ変化を約6ヶ月間測定することによって、形成されたHA−PGヒドロゲルが体内で長期間保持できるか否かを確認した。
前記実施例5−1の結果に基づいて、HA−PG溶液のシワ改善効果を確認しようとした。具体的には、無毛マウスにカルシトリオール(Calcitriol)を0.2μg/dayずつ1週間に5回、総6週間投与して皮膚のシワを誘発させた。その後、HA−PG溶液を皮膚の皮下に注射し、注射前と後のシワが誘発された皮膚をレプリカとしてレプリケートし、シワ分析機器を用いてシワの面積、長さ、および深さを測定して比較した。その結果、図23に示すように、HA−PG溶液の注射前のシワの面積、長さ、および深さは各々約6mm2、約36mm、約90μmであったのに対し、HA−PG溶液の注射後には各々約2mm2、約19mm、約68μmとしてシワの面積、長さ、および深さの全てが顕著に減少するのを確認することができた。この結果は、皮膚のシワ改善のためのフィラー用組成物として本発明のHA−PG溶液が活用できることを示すものである。
(1)体内接着力および固定性の比較
HA−PG溶液のフィラーとしての活用可能性をさらに具体的に確認するために、様々な分子量を有するヒアルロン酸誘導体(200KDa、1MDa)ベースのHA−PGヒドロゲルと既存に市販中のフィラー製品(Megafill、Perlane)間の体内保持および分解様相を約9ヶ月間測定して比較した。これと共に、本発明のHA−PG溶液とPerlane製品により生成されたヒドロゲルの体内接着力または固定性を比較した。その結果、図24および図25に示すように、Megafill、Perlane製品は注射した日から約1ヵ月目から体内のヒドロゲルの重量および体積が減少する傾向を示したのに対し、HA−PGヒドロゲルは9ヶ月間重量および体積の大きな変化なしにその模様が保持されるのを確認できたところ、HA−PGヒドロゲルの体内保持能に優れることが分かった。また、ヒドロゲルの体内接着力を確認した結果、図26に示すように、Perlane製品は皮膚に固定されず特定の部位に偏る現象を示したのに対し、HA−PG溶液によるヒドロゲルは注射部位に接着および固定されて生体内でよく保持されるのを確認することができ、このような優れた体内接着力は、アミン基、チオール基(thiol group)などのように皮膚に存在する官能基と本発明のヒアルロン酸誘導体間の反応から起こった結果である(図22a)。すなわち、本発明のHA−PG溶液は、既存のフィラー製品に比べてさらに優れた体内安定性および接着性を有することを示すものである。
HA−PG溶液の優れた注射可能性(injectability)を具体的に確認するために、様々な分子量を有するヒアルロン酸誘導体(200KDa、1MDa)ベースのHA−PGヒドロゲルと既存に市販中のフィラー製品(Megafill、Perlane)間の注射針の大きさ(21G、25G、29G、30G)に応じた押出力の変化を万能試験機(Universal testing machine)(UTM)を用いて測定しただけでなく、最初に注射器を移動させるのに必要な力である摺動降伏応力(Break Loose Force)と移動中の注射器の運動性を保持するのに必要な力である動的な衡応力(Dynamic Glide Force)を定量して比較した。その結果、図27および28に示すように、Megafillは、粒子の大きな大きさにより、小さい大きさの注射針では押出されることができず、21G以下においてのみ押出可能であり、Perlaneの場合も、粒子の大きさにより、29Gおよび30Gでは不規則な形態の押出力を示したのに対し、本発明のHA−PG溶液(200KDa、1MDa)の場合は、29Gおよび30Gを含む全ての大きさの注射針で小さい力でも効果的に押出されるのを確認することができた。また、摺動降伏応力および動的な衡応力を比較した結果、図29に示すように、押出が円滑でなく測定が不可能なMegafill、および高い力値(force value)を示したPerlaneに比べて、本発明のHA−PG溶液(200K、1M)は顕著に低い力値を示して、注射の押出力、すなわち、注射針の大きさに拘らず容易に注射できることが分かった。この結果は、本発明のHA−PG溶液は、対象部位に直接注射することができ、より安定的に注射可能であることを示すものである。
機能性フィラーとしての応用を確認するために、前記実施例5−2の方法でシワを誘発させた無毛マウスの皮膚に上皮細胞成長因子(EGF;20ng/mL、1μg/mL、20μg/mL)が封入されたHA−PG溶液を注射し、注射前と後のシワが誘発された皮膚をレプリカとしてレプリケートし、シワ分析機器を用いてシワの面積、長さ、および深さを測定して比較し、前記EGFが封入されたHA−PG溶液を注射してから1ヶ月目に、前記皮膚組織を採取してOCT凍結切片を製作した後、それをH&E(ヘマトキシリン&エオジン(Hematoxylin & eosin))染色を通じて病理組織検査を実施した。また、前記無毛マウスにEGF(10μg/mL)が封入されたHA−PG溶液、HA−PG溶液、および既存の製品Perlaneを注射してから1ヶ月目に、前記と同様の方法でH&EおよびMT(マッソントリクローム(Masson’s trichrome))を通じて皮膚組織再生の差を比較した。
その結果、図30に示すように、注射前に比べて、EGFが封入されたHA−PG溶液を注射した場合、形成されたシワの大きさに関係なくシワの面積、長さ、および深さの全てが顕著に減少するのを確認することができた。また、図31に示すように、皮膚の真皮層内の膠原線維が破壊されて密度が粗くて配列が不規則であったのに対し、封入された上皮細胞成長因子の濃度が増加するほど膠原線維が規則的に配列される傾向を示したところ、有意な皮膚再生およびシワ改善効果を確認することができた。さらに、図32および図33に示すように、EGFが封入されたHA−PG溶液を注射した場合、他の比較群(フィラーなし、Perlane、HA−PG)に比べて、シワ誘発によって厚くなった表皮層が顕著に薄くなり、真皮層のコラーゲン密度が大幅に高くなるのを確認することができた。この結果は、皮膚のシワ改善のための細胞成長因子を本発明のHA−PG溶液に適用することによって、機能性フィラーとしても活用できることを示すものである。
傷治療用ドレッシング製剤としての応用を確認するために、マウスの背中皮膚を1cm×1cm大きさに切開した傷誘発動物モデルにHA−PG溶液を塗布した後、周辺の活性酸素を用いて架橋させた後、傷部位のヒドロゲルの形成およびそれに応じた接着有無を確認した。その結果、図34に示すように、HA−PG溶液を傷部位に塗布してから10分以内にヒドロゲル膜が形成され、それにより安定的に接着されるのを確認することができた。この結果は、HA−PG溶液は、優れた酸化能を持って別途の添加剤なしに傷に均一に塗布できる、新しい形態の傷ドレッシング材料として活用できることを示すものである。
7−1.粉末剤形化
フィラー組成物の粉末(パウダー)剤形化の可能性を確認するために、図35に示すように、製造例1のHA−PG溶液を凍結乾燥してパウダー形態のフィラー組成物を製造した。その後、前記パウダー形態のフィラー組成物をPBS(pH7)に溶解させて再可溶化(Resolubilization)した後、それをマウスの皮下に注入してヒドロゲルの形成有無を観察した。その結果、図36に示すように、凍結乾燥パウダー状態から再可溶化された、本発明のフィラー組成物は、従来と同様に体内酸化力により架橋されてヒドロゲルを形成するのを確認することができた。この結果は、パウダー剤形化が可能な本発明のフィラー組成物は、使用者に使用便宜性および保管容易性を提供できることを示すものである。
フィラー組成物の具体的な保管安定性を確認するために、先ず、製造例1のHA−PG溶液を常温(25℃)または冷蔵(4℃)状態で保管しつつ保管容器内でのゲル化有無を確認した。また、保管容器に窒素気体を注入してHA−PG溶液と酸素間の接触を遮断した後、冷蔵(4℃)状態で3日間保管し、他方ではHA−PG溶液を冷凍(−80℃)状態で10日間保管し、その後、これらの溶液をマウスの皮下に注射してヒドロゲルの形成有無を観察した。その結果、図37に示すように、本発明のフィラー組成物は、高い酸化力により、常温では1日、冷蔵状態では3日以内にゲル化が進行した。その反面、図38に示すように、酸素を遮断した条件で、冷蔵状態の場合、3日が経過した時にもゲル化が進行せず、HA−PG溶液を冷凍状態で保管してから10日後に解凍させた場合、溶液の性質を保持していただけでなく、それをマウスの皮膚に注射した場合にも従来と同様に体内酸化力により架橋されてヒドロゲルが形成されるのを確認することができた。この結果は、本発明のフィラー組成物は、酸素を遮断した条件または冷凍状態でより長期間保管できることを示すものである。
Claims (29)
- ピロガロール基(pyrogallol group)で修飾されたヒアルロン酸誘導体を架橋(cross-linking)させることを含み、前記ヒアルロン酸誘導体はヒアルロン酸がピロガロール基で修飾されたものである、ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法。
- 前記ヒアルロン酸誘導体は、下記化学式1:
[化学式1]
であることを特徴とする、請求項1に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法。 - 前記架橋させるステップは、酸化剤またはpH調節剤を添加して架橋させることを特徴とする、請求項1または2に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法。
- 前記酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウム(sodium periodate)、過酸化水素(hydrogen peroxide)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)、およびチロシナーゼ(tyrosinase)からなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項3に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法。
- 前記酸化剤を添加して架橋させるステップは、下記化学式2:
[化学式2]
の架橋結合を形成することを特徴とする、請求項3に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法。 - 前記pH調節剤は、水酸化ナトリウム(sodium hydroxide)、水酸化リチウム(lithium hydroxide)、水酸化カリウム(potassium hydroxide)、水酸化ルビジウム(rubidium hydroxide)、水酸化セシウム(cesium hydroxide)、水酸化マグネシウム(magnesium hydroxide)、水酸化カルシウム(calcium hydroxide)、水酸化ストロンチウム(strontium hydroxide)、および水酸化バリウム(barium hydroxide)からなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項3に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法。
- 前記pH調節剤を添加して架橋させるステップは、下記化学式3:
[化学式3]
の架橋結合を形成することを特徴とする、請求項3に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルの製造方法。 - 下記化学式1:
[化学式1]
のヒアルロン酸誘導体を架橋させて製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルであって、下記化学式2:
[化学式2]
の架橋結合が形成されている、ヒアルロン酸ヒドロゲル。 - 前記ヒアルロン酸誘導体の分子量は、10,000Da〜2,000,000Daであることを特徴とする、請求項8に記載のヒアルロン酸ヒドロゲル。
- 前記ヒアルロン酸誘導体は、0.1%〜50%のガロール基置換率を有することを特徴とする、請求項8に記載のヒアルロン酸ヒドロゲル。
- 下記化学式1:
[化学式1]
のヒアルロン酸誘導体を架橋させて製造されたヒアルロン酸ヒドロゲルであって、下記化学式3:
[化学式3]
の架橋結合が形成されている、ヒアルロン酸ヒドロゲル。 - 前記ヒアルロン酸誘導体の分子量は、10,000Da〜2,000,000Daであることを特徴とする、請求項11に記載のヒアルロン酸ヒドロゲル。
- 前記ヒアルロン酸誘導体は、0.1%〜50%のガロール基置換率を有することを特徴とする、請求項11に記載のヒアルロン酸ヒドロゲル。
- 請求項8〜13のいずれか1項に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルを含む、組織工学用支持体。
- 請求項8〜13のいずれか1項に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルを含む、薬物送達用担体。
- 前記薬物は、抗体、抗体断片、DNA、RNAまたはSiRNAを含む核酸、ペプチド、遺伝子、タンパク質、幹細胞または化合物(chemical compound)であることを特徴とする、請求項5に記載の薬物送達用担体。
- 請求項8〜13のいずれか1項に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルを含む、フィラー組成物。
- 請求項8〜13のいずれか1項に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルを含む、癒着防止用組成物。
- 請求項8〜13のいずれか1項に記載のヒアルロン酸ヒドロゲルを含む、傷ドレッシング用組成物。
- ピロガロール基(pyrogallol group)で修飾された下記化学式1:
[化学式1]
を有するヒアルロン酸誘導体。 - ピロガロール基で修飾されたヒアルロン酸誘導体を含む、フィラー組成物。
- 前記ヒアルロン酸誘導体は下記化学式1:
[化学式1]
であることを特徴とする、請求項21に記載のフィラー組成物。 - 前記ヒアルロン酸誘導体の分子量は、10,000Da〜2,000,000Daであることを特徴とする、請求項22に記載のフィラー組成物。
- 前記ヒアルロン酸誘導体は、1%〜20%のガロール基置換率を有することを特徴とする、請求項22に記載のフィラー組成物。
- 前記ヒアルロン酸誘導体は、全体フィラー組成物に対して0.1%(w/v)〜10%(w/v)で含まれることを特徴とする、請求項22に記載のフィラー組成物。
- 前記組成物は、ex vivoでは液体状態であり、in vivoでは架橋剤なしにゲル化状態を形成することを特徴とする、請求項21に記載のフィラー組成物。
- 前記組成物は、目下の窪み領域、眉間のシワ領域、目尻領域、額領域、鼻面領域、鼻横のシワ領域、口横のシワ領域、および首のシワ領域からなる群より選択されるいずれか一つの部位に注入されることを特徴とする、請求項21または26に記載のフィラー組成物。
- 前記組成物は、線維芽細胞成長因子(FGF)、上皮細胞成長因子(EGF)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、形質転換成長因子−α(TGF−α)、形質転換成長因子−β(TGF−β)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、インスリン様成長因子(IGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、肝細胞成長因子(HGF)、血小板由来成長因子−BB(PDGF−BB)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、およびグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)からなる群より選択されるいずれか一つの細胞成長因子をさらに含むことを特徴とする、請求項21または26に記載のフィラー組成物。
- 前記組成物は、局所麻酔剤、抗酸化剤、ビタミンからなる群より選択されるいずれか一つの成分、またはこれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項21または26に記載のフィラー組成物。
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