KR20230109577A

KR20230109577A - 근육 재생을 위한 페놀기 수식 탈세포 근육조직 유래 세포외기질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20230109577A
Application number: KR1020230004871A
Authority: KR
Inventors: 조승우; 최수정; 이미정; 최이선; 안수환
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2022-01-13
Filing date: 2023-01-12
Publication date: 2023-07-20
Also published as: WO2023136651A1

Abstract

본 발명은 근육 재생을 위한 페놀기 수식 탈세포 근육조직 유래 세포외기질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 페놀기 수식 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질은 근육 재생을 위한 근육 조직 본래의 단백질 등 성분을 유사하게 포함하고 있으면서, 페놀기 간 이량화 가교 결합을 통해 안정적인 다공성 나노섬유 구조의 하이드로젤 형성이 가능하며, 이러한 하이드로젤은 면역 반응, 간 또는 신장 기능 저하와 같은 부작용 없이 근육 조직 내 투여 또는 이식되어 근육 손상 또는 근육 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 특징이 있다.

Description

근육 재생을 위한 페놀기 수식 탈세포 근육조직 유래 세포외기질 및 이의 제조방법 {Decellularized muscle tissue derived extracellular matrix modified with phenol derivatives for muscle regeneration and preparing method of the same}

본 발명은 근육 재생을 위한 페놀기 수식 탈세포 근육조직 유래 세포외기질, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

근육은 몸의 골격을 이루는 뼈에 부착하여 운동을 가능하게 해주는 기관으로, 몸의 움직임과 조작을 담당하여 자세를 유지시켜주고 관절을 연장시켜주며, 심장과 내장기관을 움직여 생명유지 하는데 중요한 기능을 한다. 근육은 크게 골격근, 심장근, 내장근으로 구분할 수 있으며, 기능에 따라 자신의 의사로 수축을 조절할 수 있는 수의근과 수축을 조절할 수 없는 불수의근, 모양에 따라 가로무늬근과 민무늬근으로 나눌 수 있다.

이러한 근육에는 다른 기관과 마찬가지로 다양한 선천성 또는 후천성 질환이 발생될 수 있으며, 외상에 의한 손상도 발생할 수 있다. 근육 질환의 종류는 매우 다양하나, 예시적으로 근이영양증, 염증성 근육병변(근육염), 근긴장증, 대사성 근육병변, 주기성 마비, 선천성 근육병변 등을 들 수 있다.

근육 질환 또는 근육 손상의 진단, 예방, 치료에 관한 종래 기술로서, 한국공개특허공보 제1020190108417　호에서는 세포 투과능 및 근육 재생능을 가지는 이중 기능성 펩타이드 및 이의 용도를 개시하고 있고, 한국공개특허공보 제1020180138171호에서는 근디스트로피 또는 근감소증 질환 치료제의 스크리닝 방법을 개시하고 있다. 상기와 같은 종래기술 이외에도 다양한 근 질환 치료 기술이 연구, 활용되고 있으나, 실제로 근육 세포, 조직과 유사성이 높은 조성물을 이용한 치료 기술에 대한 요구가 더욱 높아지고 있다.

이러한 배경 하에서 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 페놀기 수식 탈세포 근육조직 유래 세포외기질을 활용함으로써 보다 조직 친화적인 근육 재생 효과를 이끌어 낼 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 카테콜기, 및 파이로갈롤기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 수식된, 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 근육 질환 또는 근육 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로젤 조성물을 투여 또는 이식이 필요한 인간을 제외한 개체에 투여 또는 이식하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 카테콜기, 및 파이로갈롤기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 수식된, 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 근육 질환 또는 근육 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 하이드로젤 조성물을 투여 또는 이식이 필요한 인간을 제외한 개체에 투여 또는 이식하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명의 페놀기 수식 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질은 근육 재생을 위한 근육 조직 본래의 단백질 등 성분을 유사하게 포함하고 있으면서, 페놀기 간 이량화 가교 결합을 통해 안정적인 다공성 나노섬유 구조의 하이드로젤 형성이 가능하며, 이러한 하이드로젤은 면역 반응, 간 또는 신장 기능 저하와 같은 부작용 없이 근육 조직 내 투여 또는 이식되어 근육 손상 또는 근육 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 특징이 있다.

도 1은 탈세포 및 용액화 과정을 거친 근육 조직 유래 세포외기질(muscle extracellular matrix; MEM)에 EDC/NHS를 이용한 화학적 반응을 통해 카테콜기(catechol; CA)와 파이로갈롤기(pyrogallol; PG)를 수식하여 카테콜기/파이로갈롤기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 (MEM-CA, MEM-PG) 유도체를 합성하는 과정을 보여주는 그림이다.
도 2는 돼지 골격근 조직을 이용하여 탈세포 근육조직(MEM)을 만든 후, 그 조직에 대하여 dsDNA, GAG, 콜라겐의 양을 확인하여 완전한 탈세포화와 세포외기질 성분이 잘 보존되었는지 나타낸 결과이다.
도 2a는 조직학 분석을 통해 MEM에서 핵의 제거, 콜라겐 성분의 보존, GAG성분의 보존을 확인한 결과이다.
도 2b, 2c, 2d는 각각 dsDNA, GAG, 콜라겐의 잔존량을 분석한 결과이다.
도 3은 탈세포 근육조직(MEM)에서 유래한 세포외기질의 단백체를 분석한 결과이다.
도 3a는 MEM의 매트리좀 단백질의 구성 성분 비율을 도식화 해놓은 것이다.
도 3b는 MEM에서 가장 많이 검출된 10개의 매트리좀 단백질을 도식화 한 결과이다.
도 3c는 매트리좀 단백질 대상으로 유전자 온톨로지 분석을 진행한 결과이다.
도 3d는 매트리좀 외 단백질에 대한 유전자 온톨로지 분석을 진행한 결과이다.
도 4는 탈세포 근육조직(MEM)에서 유래한 세포외기질의 단백체를 분석한 결과와 MEM과 인간 근육의 단백체를 비교하여 MEM이 근육 미세환경을 제공할 수 있는지 확인한 결과이다.
도 4a는 탈세포 공정 이후에도 MEM에 남아있는 주요 매트리좀 단백질을 정리한 결과이다.
도 4b는 MEM과 인간 근육 내의 근육 특이적 단백질과 매트리좀 단백질의 개수를 비교한 결과이다.
도 5는 주사전자현미경을 통해 MEM, MEM-CA, MEM-PG의 하이드로젤 내부 구조를 확인한 결과이다.
도 6은 MEM, MEM-CA, MEM-PG 용액과 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤의 화학적 구조를 분석한 결과이다.
도 7은 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 각각 1%, 2%의 농도 조건에서 분해 양상을 분석한 결과이다.
도 8은 유변학 분석장비를 이용하여 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 각각 1%, 2%의 농도 조건에서의 기계적 물성을 분석한 결과이다.
도 8a는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤의 농도별 탄성계수를 측정한 결과이다.
도 8b는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 농도별로 평균 탄성계수를 측정한 결과를 비교한 결과이다.
도 9는 PBS, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 각각 1%, 2%의 농도 조건에서 주사를 통한 하이드로젤의 주입력을 알아보기 위한 실험 결과이다.
도 10은 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤, ascorbic acid의 항산화 기능을 확인한 결과이다.
도 10a는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤, ascorbic acid의 항산화 기능을 확인한 결과이다.
도 10b, c는 도 10a에서 측정한 항산화 효과를 비교한 결과이다.
도 11은 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤 각각의 면역원성을 평가한 결과이다.
도 11a는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤과 대식세포를 공배양 하였을 때, 세포로부터 면역반응 인자 TNF-α의 분비량을 확인한 결과이다.
도 11b는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤과 대식세포를 공배양 하였을 때, 세포로부터 면역반응 인자 IL-6의 분비량을 확인한 결과이다.
도 12는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 마우스 다리 근육 조직에 주입 후, 조직학 분석을 통하여 염증 반응이 일어나는지 확인한 결과이다.
도 13는 하이드로젤을 쥐에게 주입한 후의 생체적합성을 확인하기 위하여 면역조직화학 염색을 한 뒤, 다양한 면역세포 마커 발현을 관찰한 결과이다.
도 14는 하이드로젤을 쥐에게 주입한 후의 각 염증성, 항염증성 대식세포의 발현을 확인한 결과이다.
도 15는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 마우스 다리 근육 조직에 주입하였을 때 염증 반응이 일어나는지 확인하기 위해 혈구 검사를 진행한 결과이다.
도 15a ~ h는 각각 백혈구, 림프구, 적혈구, 혈색소, 적혈구 용적률, 평균 적혈구 용적률, 평균 적혈구 혈색소, 평균 적혈구 혈색소 농도를 측정한 것을 그래프화 한 결과이다.
도 16은 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤, PBS를 주입하였을 때 전신 독성이 일어나는지 확인하기 위해 혈청 분석을 진행한 결과이다.
도 16a ~ g는 각각 평균 혈소판 용적, 혈액 요소 질소, 크레아티닌, 아스파테이트아미노 전이 효소, 알라닌아미노 전이 효소, 총 단백질 및 혈당을 측정한 결과이다.
도 17는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입 후, 수거한 주요 장기들의 조직학 분석을 통해 조직 손상 및 면역 반응 여부를 관찰한 결과이다.
도 18은 불용성 골격근 위축 소동물 모델을 이용하여 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤, PBS 주입하였을 때, 근육량의 증진에 대한 효과를 나타내는 결과이다.
도 18a는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤과 PBS 주입 2주 후, 조직학 및 면역조직화학 염색을 통해 다양한 기능적 근육 마커들의 발현을 확인한 결과이다.
도 18b ~ f는 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤, PBS를 투입하였을 때, 근육량의 증진을 의미하는 지표들에 대하여 측정하고, 이를 그래프화 한 결과이다.
도 19는 불용성 골격근 위축 소동물 모델에서 본 발명의 하이드로젤(MEM-CA, MEM-PG) 주입, 선행연구에서 개발된 하이드로젤을 이용한 MEM (HA-CA/MEM, HA-PG/MEM) 주입 및 근육이 아닌 타 조직 유래 하이드로젤 (Skin-CA, Skin-PG) 주입 후 조직학 및 면역조직화학 염색을 통해 기능적인 근육 마커 발현 및 근육 증진에 대한 효과를 비교한 결과이다.
도 20은 선행연구에서 개발된 다양한 하이드로젤과 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤의 근육량 증진에 대한 효과를 정량하여 비교한 결과이다.
도 20a ~ g는 근육량 증진을 확인할 수 있는 지표들을 다양한 하이드로젤을 주입하였을 때, 이를 그래프화 한 결과이다.
도 21은 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM)과 탈세포 피부 조직 유래 세포외기질(SkEM)의 단백체를 분석 비교한 것이다.
도 21a는 MEM과 SkEM의 단백체를 비교했을 때 매트리좀 단백질의 구성 성분 비율을 비교 분석한 결과이다.
도 21b는 MEM과 SkEM을 구성하는 단백질의 종류 및 양을 비교 분석한 결과이다.
도 21c는 SkEM에서 가장 많이 발현하는 10개의 매트리좀 단백질을 비교 분석한 결과이다.
도 22는 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM)과 탈세포 피부 조직 유래 세포외기질(SkEM)의 단백체를 분석 비교하고, 근육 기능과 관련된 단백질을 비교한 결과이다.
도 22a는 MEM, SkEM 각각의 전체 단백질을 대상으로 주성분 분석을 진행한 결과이다.
도 22b는 MEM, SkEM을 각각 유전자 온톨로지를 통해 근육조직발달과 관련된 단백질을 대상으로 비교한 결과이다.
도 23는 MEM, SkEM의 단백체 분석을 실시하여 MEM에서만 발현하는 단백질을 대상으로 유전자 온톨로지 분석한 결과이다.
도 24은 근감소증 동물모델에서의 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤 주입시 유도될 수 있는 근육량 증진 효과에 대한 결과이다.
도 25는 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤 주입 후, 근육 증진과 관련돤 각 인자들을 비교한 결과이다.
도 26은 근감소증 동물모델에서 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤, PBS를 주입 후, 주요 장기들에 대한 조직학 분석 및 혈액 분석을 통하여 생체적합성을 확인한 결과이다.
도 26a는 근감소증 동물모델에서 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입 후, 주요 장기들에 대한 조직학 분석을 통해 면역 반응 및 조직 괴사 여부를 확인한 결과이다.
도 26b는 근감소증 동물모델에서 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입 후, 신장 기능, 간 기능, 총 단백질, 혈당에 대한 분석을 실시하여 전신 독성 여부를 확인한 결과이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고 저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태로서, 카테콜기, 및 파이로갈롤기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 수식된, 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 조성물을 제공한다.

상기 “세포외기질(extracellular matrix)”은 포유류 및 다세포 생물(multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.

상기 세포외기질은 콜라겐(collagens), 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글리칸(proteoglycans), 화학유인물질 (chemoattractants), 사이토카인 (cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자 (biomolecules)의 혼합물일 수 있다.

상기 탈세포화된 근육 조직은 실제 근육 조직 특이적 세포외기질 성분을 포함하므로 해당 조직의 물리적, 기계적, 생화학적 환경을 제공할 수 있으며, 근육 조직 세포로의 분화 및 조직 특이적 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.

상기 “하이드로겔”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물에서 상기 하이드로젤은 세포외기질에 수식된 카테콜기, 파이로갈롤기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 상호간 가교되어 형성된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물에서 상기 세포외기질에 카테콜기가 수식된 경우, 상기 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 카테콜기 수식된 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM-CA 유도체)은 0.1 내지 4, 또는 1 내지 2중량%으로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물에서 상기 세포외기질에 파이로갈롤기가 수식된 경우, 상기 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 파이로갈롤기가 수식된 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM-PG 유도체)은 0.1 내지 4, 또는 1 내지 2중량%으로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 가교제를 추가로 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질은 10 ng/mg 이하 농도의 DNA를 포함하는 것일 수 있고, 6 내지 8 μg/mg 농도의 GAG를 포함하는 것일 수 있고, 28 내지 30 μg/mg 농도의 콜라겐을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질은 62 내지 63중량%의 콜라겐, 3 내지 4 중량%의 ECM 글라이코프로틴, 및/또는 34 내지 35 중량%의 프로티오글라이칸을 포함하는 것일 수 있다. 상기 콜라겐은 COL1A1, COL6A2, COL6A1, 및/또는 COL6A3를 주로 포함하고 있을 수 있다. 상기 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질은 도 3 또는 도 4에 기재된 물질을 구성으로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 다공성 구조를 갖는 나노섬유 구조로 이루어지는 것일 수 있고, 상기 세포외기질에 수식된 카테콜기 또는 파이로갈롤기의 이량화(dimerization)으로 인해 상호간 가교되어 안정적인 하이드로젤 구조를 형성하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 G'' (손실 탄성률) 보다 높은 G' (저장 탄성률) 을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 카테콜기가 수식된 탈세포 근육 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 조성물은, 상기 세포외기질이 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 0.1 내지 4 중량%로 포함된 경우 400 내지 2000 Pa의 탄성계수를 가질 수 있다. 또한, 파이로갈롤기가 수식된 탈세포 근육 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 조성물은, 상기 세포외기질이 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 0.1 내지 4 중량%로 포함된 경우 1200 내지 2800 Pa의 탄성계수를 가질 수 있다. 상기 하이드로젤 조성물은 카테콜기 또는 파이로갈롤기로 수식된 세포외기질을 포함함에 따라, 수식되지 않은 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 대비, 더 높은 탄성 계수를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 파이로갈롤기가 수식된 세포외기질을 포함하는 경우, 카테콜기가 수식된 세포외기질을 포함하는 경우에 비해 더 높은 탄성 계수를 갖는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 활성산소종 및 라디칼 제거능, 항산화능을 갖는 것일 수 있고, 카테콜기 또는 파이로갈롤기가 수식되지 않은 세포외기질-포함 하이드로젤 조성물에 비해 향상된 활성산소종 및 라디칼 제거능, 항산화능을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 하이드로젤은 면역반응 유발, 조직 손상 가능성이 낮고 우수한 생체적합성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 근육 조직으로의 이식용 조성물; 근육 질환 또는 근육 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물;을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 근육 질환은 근이영양증, 근위축증, 불용성 골격근 위축, 근감소증, 근손실, 근육통, 근무력증, 근육 경직, 인대 파열, 신경섬유종증, 건막염, 다발성근염, 근육긴장이상, 염증성 근육병변(근육염), 근긴장증, 대사성 근육병변, 주기성 마비, 및 선천성 근육병변으로부터 선택된 하나 이상의 근육 질환인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤 조성물은 오가노이드 형성을 위한 조성물인 것일 수 있고, 구체적으로 근육 조직 오가노이드 형성(배양)을 위한 조성물일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤 조성물을 포함하는, 근육 세포의 이식이 필요한 개체 내 근육 조직으로의 이식을 위한 조성물을 제공한다.

상기 “오가노이드(organoid)”는 조직 또는 전분화능 줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.

상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.

상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤 조성물을 투여 또는 이식이 필요한 개체에 투여 또는 이식하는 단계를 포함하는, 근육 무게 증가 방법; 근육 질환의 예방 또는 치료방법; 또는 근육 조직으로의 하이드로젤 이식 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "예방 및 개선"은 상기 조성물의 투여 또는 이식에 의해 근육 질환의 진행을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여 또는 이식에 의해 근육 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤, 세포외기질, 근육질환은 상술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 개체는 인간을 포함하거나, 포함하지 않는 동물을 의미할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 근육 질환의 예방 또는 치료방법; 또는 근육 조직으로의 하이드로젤 이식 방법은 하이드로젤 투여 또는 이식 후 M1 대식세포의 발현량보다 M2 대식세포의 발현량을 증가시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉, 항염증성 M2 대식세포로의 분극화를 촉진할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤은 용혈 빈혈을 유발하지 않는 것일 수 있고, 또는 염증성 장질환, 약물 세포 독성, 재생불량성 빈혈을 유발하지 않는 것일 수 있다. 또한 신장 손상 또는 신장 기능 저하, 간 손상 또는 간 기능 저하, 혈당의 급격한 증감을 유발하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 하이드로젤의 근육 조직으로의 이식 용도; 근육 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 근육 조직으로의 이식용 조성물, 또는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 하이드로젤의 용도를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 용도와 관련하여 세포외기질, 하이드로젤, 근육 질환 등에 대한 내용이 동일하게 적용된다.

근육 조직을 근육 결에 따라 절단하는 단계; 상기 절단된 근육 조직을 0.1 내지 0.3% trypsin/EDTA에서 2 내지 4시간, 0.1 내지 1.0% Triton X-100에서 10 내지 14시간, 및 0.5 내지 1.5% Triton X-100와 0.1 내지 0.3% 디옥시콜산나트륨 혼합 용액에 20 내지 24시간 처리하여 탈세포화 하는 단계; 상기 탈세포화된 근육 조직 유래 세포외기질에 카테콜기, 및 파이로갈롤기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 수식하는 단계; 및 상기 수식된 세포외기질 간의 가교 결합이 이루어지는 단계를 포함하는, 하이드로젤 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 근육 재생을 위한 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 기반 하이드로젤 개발

탈세포 및 용액화 과정을 거친 근육 조직 유래 세포외기질(muscle extracellular matrix; MEM)에 EDC/NHS를 이용한 화학적 반응을 통해 카테콜기(catechol; CA)와 파이로갈롤기(pyrogallol; PG)를 수식하여 카테콜기/파이로갈롤기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 (MEM-CA, MEM-PG) 유도체를 합성하였다.

합성한 MEM-CA/PG 유도체는 체내 산소가 존재하는 환경에서 자연 산화되며 세포외기질 유도체 간 가교가 유도되어 하이드로젤을 형성할 수 있었다.

따라서, 생체 내로 MEM-CA/PG 용액을 주입하면 추가적인 가교제 없이도 체내 산소와 반응하여 하이드로젤 형성이 가능함을 확인하였다(도 1).

실시예 2. 탈세포 근육 조직(MEM)의 분석 준비

돼지 골격근 조직을 근육 결에 따라 작게 잘라서 0.2% trypsin/EDTA 3시간, 0.5% Triton X-100 12시간, 그리고 1% Triton X-100와 0.2% 디옥시콜산나트륨(sodium deoxycholate) 혼합 용액에 22시간 처리하여 탈세포화 한 후 조직학 염색과 DNA, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan - GAG), 콜라겐(collagen) 정량 분석을 통해 탈세포 여부 및 세포외기질 보존 여부를 확인하였다.

Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 통해 MEM에서 세포 성분 (핵)이 효과적으로 제거되어 있음을 확인하였고, Masson's trichrome (MT) 조직학 염색을 통해 콜라겐 성분이 잘 보존되어 있는 것을 확인하였다. Toluidine blue (TB) 염색 분석을 적용하여 GAG 성분이 잘 보존되어 있는 것을 확인하였다(도 2의 a).

탈세포 공정이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위해 MEM 내 잔여 dsDNA을 정량 분석하였다. MEM에는 8.53 ng/mg 조직 DNA가 잔존해 있음을 확인하였다. 이는 임상 적용 가능한 탈세포 조직의 기준인 50 ng/mg 미만 수준으로 MEM 내 dsDNA가 존재하며 기존 근육 조직 (1544.18 ng/mg) 대비 99.4% 핵이 제거 되어서 성공적으로 탈세포화가 된 것을 확인하였다(도 2 - b).

탈세포 과정 후 주요 세포외기질 성분인 GAG와 collagen 성분이 손상 없이 잘 보존되었는지 확인하기 위해 정량 분석을 진행하였다. 탈세포 과정 이후 세포 성분이 제거되면서 세포외기질 성분만 남게 되므로 탈세포 전 근육 조직과 비교하였을 때 GAG 및 collagen 함량이 MEM 내에서 증가하였음을 확인하였다. MEM에서는 GAG와 collagen 성분이 각각 7.08 μg/mg, 29.4261 μg/mg 검출되어 기존 돼지 근육 조직 (각 6.10 μg/mg 및 5.21 μg/mg) 보다 많이 함유되어 있으며 따라서 세포외기질 성분들이 잘 보존됨을 확인하였다(도 2 - c, d).

이러한 결과들을 통해 본 발명에서의 탈세포 공정을 통해 근육 조직 내에 성공적으로 세포가 제거되었으며 세포외기질 성분은 잘 보존되어 있음을 확인하였다.

실시예 3. 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질 단백체 (proteomics) 분석

탈세포 근육 조직 유래 세포외기질 (MEM)에 대한 고해상도 질량분석기를 통해 단백체 정량 분석을 실시하였다.

MEM은 62.36% collagen으로 이루어져 있으며 그 외에도 3.28% ECM 글라이코프로틴(glycoproteins), 34.24% 프로티오글라이칸(proteoglycans), 0.11% ECM 조절인자(regulators)와 같은 다양한 매트리좀 (matrisome) 단백질을 포함하고 있었다(도 3 - a).

Collagen은 실제 근육에서 가장 많은 부분을 차지하는 세포외기질 단백질로 MEM에서 가장 많이 함유되어 있는 10개 매트리좀 단백질을 조사했을 때 4종류의 collagen type이 존재함을 확인하였다. 특히, 그 중 collagen type 6는 근육 기능 유지에 있어 중요한 역할을 하는 단백질 중 하나로 알려져 있다(도 3 - b).

MEM에 있는 매트리좀 (matrisome) 단백질 대상으로 유전자 온톨로지 (gene ontology: GO) 분석을 진행하였을 때, MEM에서 세포외기질 구성 및 구조, 콜라겐 구성, 세포 부착, 그리고 조직 발달과 관련된 단백질들이 주로 확인되었으며, 따라서 MEM은 근육 구조 구성, 발달 등을 통해 근육 재생에 기여할 수 있을 것으로 예상이 되었다(도 3 - c).

MEM에 있는 매트리좀외 (non-matrisome) 단백질에 대한 유전자 온톨로지 (GO) 분석을 진행하였을 때, 마찬가지로 근육 구조 발달, 근육 수축 기능, 그리고 대사기능과 관련된 단백질들이 다수 확인되었다(도 3 - d).

탈세포 공정 이후에도 MEM에는 다양한 collagens, glycoproteins, proteoglycans 단백질이 보존되어 있음을 확인하였다(도 4 - a).

돼지 유래 MEM과 실제 인간 근육의 단백질을 비교하였다. MEM의 전체 28개의 매트리좀 단백질과 전체 51개의 근육 조직 특이적 단백질 (다른 조직에 비해 4배 이상 발현하는 단백질) 모두 인간 근육 조직을 구성하는 단백질 내에 포함되어 있음을 확인하였다. 따라서, MEM 성분이 실제 인간 근육 조직과 유사하기 때문에 실제 근육 미세환경을 제공할 수 있음을 확인하였다(도 4 - b).

따라서, 이러한 GO 분석 및 돼지 유래 MEM과 실제 인간 근육의 단백질 비교를 통해 MEM은 근육 발달 및 기능, 대사기능에 기여하며 근육 특이적 미세환경을 제공할 수 있어 근육 조직 재생을 증진하는데 기여할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 내부 구조 분석

주사전자현미경 (scanning electron microscopy) 분석을 통해 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤의 내부 구조를 분석하였다.

MEM 하이드로젤이 콜라겐 하이드로젤 내부에서 관찰되는 나노섬유와 유사한 구조를 가지는 것이 관찰되었고, MEM-CA 과 MEM-PG 하이드로젤의 경우에는 이러한 나노섬유 구조와 마이크로 스케일의 조밀한 다공성 구조가 함께 공존하고 있는 것이 확인되었다(도 5).

실시예 5. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 화학적 구조 분석

Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) 분석을 통하여 MEM, MEM-CA, MEM-PG 용액과 각각의 하이드로젤의 화학적 구조를 분석하였다.

-OH 그룹을 나타내는 ~3300 cm^-1 피크(yellow bar)가 모든 그룹에서 관찰되었고, 각 하이드로젤에서 해당 피크가 더 증가한 것을 확인하였다.

세포외기질 단백질에서 주로 관찰되는 amide I, amide II, amide III 피크가 모든 그룹에서 각각 ~1650 cm^-1 (pink bar), ~1550 cm^-1 (orange bar), ~1260 cm^-1(green bar)에서 관찰되었고, 하이드로젤 그룹에서만 amide II 피크는 감소하고 amide III 피크가 1240 cm^-1에서 1260 cm^-1로 shift 된 것을 관찰함으로써 하이드로젤이 되면서 뼈대(backbone)의 구조적 변화를 확인하였다.

Aromatic -OH stretching을 나타내는 ~1450 cm^-1 피크 (brown bar)와 biphenol기를 나타내는 ~800 cm^-1 피크 (purple bar)가 모두 관찰되었고, 하이드로젤에서 페놀기가 산화되며 이합체(dimerization)을 이루기 때문에 피크 세기가 더 증가한 것이 확인되었다.

따라서, 근육 조직 유래 세포외기질에 카테콜기와 파이로갈롤기가 수식된 것을 확인하였고, 산화되는 동안 카테콜기 또는 파이로갈롤기의 이량화가(dimerization) 일어나며 가교가 되는 것을 확인하였다(도 6).

실시예 6. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 분해 양상 분석

1% 및 2% (w/v) 두 가지 농도 조건에서의 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤의 분해 양상을 비교하기 위하여 콜라겐 분해 효소 (50 μg/ml)를 처리하였을 때 페놀기가 수식되지 않은 MEM 하이드로젤과 비교하여 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤은 카테콜기 또는 파이로갈롤기 간 가교 결합 반응으로 인해 분해가 늦게 진행됨을 확인하였다(도 7).

따라서, MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤은 생체 내 분해 조건에서도 MEM 하이드로젤 보다 안정적으로 유지될 수 있을 것으로 예측된다.

실시예 7. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 기계적 특성 분석

유변학 분석 장비를 이용하여 1% 및 2% (w/v) 두 가지 농도 조건에서의 MEM, MEM-CA, MEM-PG 각각의 하이드로젤의 탄성계수를 측정하였다(도8 - a, b). 모든 하이드로젤에서 G' (저장 탄성률) 수치가 G'' (손실 탄성률) 수치보다 높게 관찰됨을 확인하여 모든 하이드로젤의 내부에서 안정적인 고분자 네트워크 구조가 형성됨을 확인하였다.

1% MEM, 2% MEM 하이드로젤의 평균 탄성계수는 각각 약 92 Pa, 약 172 Pa로 측정되었고 1% MEM-CA, 2% MEM-CA 하이드로젤의 평균 탄성계수는 각각 약 468 Pa, 약 1800 Pa로 측정되었으며 1% MEM-PG, 2% MEM-PG 하이드로젤의 평균 탄성계수는 각각 약 1240 Pa, 약 2628 Pa로 측정되어, 각 하이드로젤의 농도와 비례하여 증가한 탄성 계수를 가지며, 카테콜기 또는 파이로갈롤기로 수식된 MEM 하이드로젤이 MEM 하이드로젤과 비교하여 훨씬 증가한 탄성 계수를 가지는 것을 확인하였다(도 8 - b). 따라서, 같은 농도에서는 MEM-PG 하이드로젤의 탄성 계수가 MEM-CA 하이드로젤 보다 더 높게 측정되었음을 알 수 있었다.

이러한 분석들을 통해 MEM 하이드로젤의 기계적 물성은 농도 변화 및 화학적 수식을 통해 조절할 수 있음을 확인하였고, 결과적으로 페놀기가 수식된 MEM 하이드로젤이 향상된 물리적 특성 및 기계적 물성을 바탕으로 근육 조직 미세 환경을 제공하며 근육 재생을 촉진시킬 수 있을 것으로 예측되었다.

실시예 8. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 주입력 분석

1% 및 2% (w/v) 두 가지 농도 조건에서의 MEM, MEM-CA, MEM-PG 각각의 하이드로젤의 주입력을 비교하기 위해서 26-gauge (1 ml) syringe에 각각의 용액 상태의 MEM, MEM-CA, MEM-PG을 넣고, 피스톨을 30 mm/min 속도로 누르면서 주사하는데 필요한 힘을 측정하였다.

Phosphate buffered saline (PBS)를 주입할 때 드는 힘과 비교하였을 때, 모든 그룹에서 유의미한 차이가 없는 것을 확인함으로써 MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤은 주사기를 통해 쉽게 주입이 가능하며 실제 사용하기에 매우 용이한 것을 확인하였다(도 9).

실시예 9. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 항산화 기능 분석

MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤은 수식된 페놀기의 산화된 유도체로 인해 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS) 및 각종 라디칼을 제거 (scavenging) 할 수 있는 능력을 가지고 있을 것으로 예측되었다.

따라서, 하이드록시 라디칼 (hydroxyl radical) 소거능과 ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) radical 소거능을 측정하여 MEM, MEM-CA, MEM-PG 각각의 하이드로젤의 항산화 효과를 비교하였다. 대조군으로는 항산화 기능이 뛰어난 비타민 C로 알려진 ascorbic acid를 사용하였다.

H₂O₂와 Fe²⁺ 이온이 반응하여 Fe³⁺이온과 DNA 손상 및 세포 사멸을 유도하는 활성산소족 (hydroxyl radical)이 생성되는 Fenton reaction 시약을 이용해서 MEM-CA과 MEM-PG에 의해 해당 반응이 저해되는지 확인하였다. 또한, 가장 많이 쓰이는 항산화 시험법 중 하나인 ABTS 용액을 이용하여, 항산화 기능을 가진 샘플과 반응하면 청록색의 ABTS 용액이 투명해지는 정도를 비교하였다.

2% (w/v) MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 Fenton reaction을 이용하여 만들어진 용액과, ABTS 용액에 넣고 30분간 incubation한 후에 용액의 색을 UV-vis spectroscopy로 측정하여 각각 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical)과 ABTS radical이 소거되었는지 확인하였다. 그 결과 카테콜기와 파이로갈롤기가 수식된 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤이 양성 대조군인 ascorbic acid에 근접한 수준의 항산화 기능을 가지는 것을 확인함으로써 ROS 및 자유라디칼(free radical)에 의해 촉진되는 노화성 근감소증 및 근육 손상 치료에 있어 이러한 유해 물질들을 효과적으로 제거할 수 있어 단순 MEM 하이드로젤과 비교하여 보다 효과적인 근육 재생을 증진시킬 수 있는 것으로 예측되었다(도 10).

실시예 10. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 면역원성 평가

대식세포(macrophage)와 하이드로젤을 24시간 동안 공배양 하면서 대식세포에서 분비되는 전염증성 사이토카인인 TNF-α (tumor necrosis factor-α)와 IL-6 (interleukin-6)의 양을 효소결합면역흡착 분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통해 측정함으로써 하이드로젤의 면역원성 수준을 평가하였다.

2% (w/v) 농도의 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤과 공배양시 대식세포로부터의 TNF-α의 분비량은 각각 101 pg/ml, 97 pg/ml, 92 pg/ml로 어떠한 처리도 하지 않은 대조군 (no treatment)에서의 TNF-α 분비량인 96 pg/ml과 비교하여 거의 차이가 없음을 확인하였다. 반면, 면역반응을 유발하는 물질인 LPS (liposaccharide)를 처리한 양성 대조군에서는 TNF-α의 분비량이 711 pg/ml로 TNF-α의 발현 및 분비가 크게 증가된 것을 확인하였다(도 11 - a).

2% (w/v) 농도의 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤과 공배양시 대식세포로부터의 IL-6의 분비량은 각각 3.7 pg/ml, 1.8 pg/ml, 1.7 pg/ml로 어떠한 처리도 하지 않은 대조군 (no treatment)에서의 IL-6 분비량인 1.5 pg/ml과 비교하여 거의 차이가 없음을 확인하였다.

반면, LPS를 처리한 양성 대조군에서는 IL-6의 분비량이 19918.1 pg/ml로 IL-6의 발현 및 분비가 크게 증가된 것을 확인하였다(도 11 - b).

따라서, MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤은 면역반응 유발 가능성이 매우 낮으며 우수한 생체적합성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 11. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 생체적합성 평가

PBS와 2% (w/v) MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 마우스의 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근)에 50 μl 부피로 주사 후 3, 7, 14일 차에 TA muscle 조직을 적출하여 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 Toluidine blue (TB) 염색을 통해 조직학 분석을 진행하였다. 상기와 같은 실험은 조직에 하이드로젤이 들어갔을 경우 나타날 수 있는 조직 손상 및 면역반응을 확인하기 위해 진행되었다.

또한, MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤의 생체적합성을 평가하기 위해 2% (w/v) 하이드로젤을 마우스의 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근)에 50 μl 부피로 근육 주사한 뒤 3, 7, 14일 차에 TA muscle 조직을 적출하여 면역조직화학 염색을 진행하였다.

MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤의 생체적합성을 평가하기 위해 2% (w/v) 하이드로젤을 마우스의 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근)에 50 μl 부피로 근육 주사한 뒤 3, 7, 14일 차에 혈액을 추출하여 분석을 진행하였다. 이는 조직 내에 하이드로젤이 투입 되었을 경우 몸 속에서 일어나는 염증반응을 확인하기 위한 것으로서 염증 마커인 M1대식세포 마커(iNOS)와 항염증 마커인 M2 대식세포 마커(CD206)를 통해 하이드로젤에 대한 대식세포의 발현 정도를 확인하기 위해 진행되었다.

하이드로젤 주입에 따른 염증 반응을 확인하기 위해 백혈구 (WBC, white blood cell), 림프구 (lymphocytes) 수치를 확인하였고, 독성 물질, 약물 및 감염, 신장 이상, 간장 이상으로 생길 수 있는 용혈 빈혈 (hemolytic anemia)을 유발하는지 확인하기 위해 적혈구 (RBC, red blood cell), 혈색소 (HGB, hemoglobin), 적혈구용적률 (HCT, hematocrit), 평균 적혈구 용적 (MCV, mean corpuscular volume), 평균적혈구혈색소 (MCH, mean corpuscular hemoglobin), 평균적혈구혈색소농도 (MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration) 수치를 확인하였다.

또한, 평균혈소판용적 (MPV, mean platelet volume)의 수치는 다양한 질병의 지표로서, 높은 수치는 심장질환, 고혈압, 갑상선 기능 항진증을 나타내며 낮은 수치는 염증성 장질환, 약물 세포 독성, 재생불량성 빈혈을 나타낸다.

신장 기능에 영향이 있는지 확인하기 위해 혈청 샘플을 이용한 신장 기능 검사를 진행하였다. 신장 기능 지표로서 혈액요소질소 (BUN, blood urea nitrogen)와 크레아티닌 (CRE, Creatinine) 농도를 확인하였고, 간 손상 정도와 기능 검사를 위해 아스파테이트아미노전이효소 (AST, Aspartate transaminase)와 알라닌아미노전이효소 (ALT, Alanine transaminase), 총 단백질 (TP, total protein)을 지표로 사용하였다. 상기 실험은 생체 외의 물질이 조직 내 주입되었을 경우 나타날 수 있는 염증성 변화들로서 하이드로젤의 안전성을 확인하기 위하여 진행되었다.

PBS와 2% (w/v) MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 마우스의 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근)에 50 μl 부피로 주사 후 3, 7, 14일 차에 마우스의 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장)들을 적출하여 H&E 염색을 통해 조직학 분석을 진행하였다. 상기 실험은 이식한 하이드로젤의 주요 장기들에 대한 안전성을 확인하기 위하여 진행되었다.

실시예 12. 불용성 근위축 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤에 의한 근육량 증진 효과 검증

불용성 골격근 위축 소동물모델 (mouse model of disuse muscle atrophy)에 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 적용하여 근육량 증진 효과를 평가하였다. Surgical staple로 3주간 마우스의 다리를 사용하지 못하게 고정하여 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근) 무게를 약 25% 감소시키는 불용성 골격근 위축 유발 후 각 2% (w/v) 하이드로젤을 TA muscle에 50 μl 씩 근육 주사한 뒤, 2주차에 TA muscle 조직을 적출하여 정상 조직 (같은 개체에서 손상을 유발하지 않은 반대쪽 다리 근육 사용)과 무게를 비교하였다.

실시예 13. 불용성 근위축 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤과 선행 연구에서 개발된 다양한 하이드로젤에 의한 근육량 증진 효과 비교

불용성 골격근 위축 소동물모델 (mouse model of disuse muscle atrophy)에 페놀기 수식 근육 조직 세포외기질 하이드로젤인 MEM-CA, MEM-PG와 페놀기 수식 피부 조직 세포외기질 하이드로젤인 Skin-CA, Skin-PG 및 선행 연구를 통해 개발된 페놀기 수식 히알루론산에 근육 조직 세포외기질을 혼합한 HA-CA/MEM, HA-PG/MEM 하이드로젤을 적용하여 근육량 증진 효과를 비교하였다. Surgical staple로 3주간 마우스의 다리를 사용하지 못하게 고정하여 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근) 무게를 약 25% 감소시키는 불용성 골격근 위축 유발 후 각 2% (w/v) 하이드로젤을 TA muscle에 50 μl 씩 근육 주사한 뒤, 2주차에 TA muscle 조직을 적출하여 정상 조직과 무게를 비교하였다.

실시예 14. 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질과 탈세포 피부 조직 유래 세포외기질 단백체 (proteomics) 분석 비교

탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM)이 조직 특이적으로 근육 재생을 촉진시키는 것을 확인하기 위해 MEM과 탈세포 피부 조직 유래 세포외기질(SkEM)의 단백체를 비교하였다.

실시예 15. 근감소증 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤에 의한 근육량 증진 효과 검증

근감소증 소동물모델 (mouse model of sarcopenia)에 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입하고 근육량 증진 효과를 평가하였다. 18개월령 노령 마우스의 TA muscle에 2% (w/v) 하이드로젤 각 50 μl 씩 근육 주사한 뒤, 8주차에 TA muscle 조직을 적출하여 마우스 무게 대비 근육 무게를 비교하였다.

실시예 16. 근감소증 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 생체적합성 평가

근감소증 소동물모델 (mouse model of sarcopenia)에 PBS와 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 적용하고 생체적합성을 평가하였다. 18개월령 노령 마우스의 TA muscle에 2% (w/v) 하이드로젤 50 μl 씩 근육 주사한 뒤, 8주 차에 마우스의 주요 장기(심장, 간, 비장, 신장, 폐)들을 적출하여 H&E 염색을 통해 조직학 분석을 진행하였다.

실험예 1. 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 생체적합성 평가 결과

생체적합성을 확인하기 위한 실험의 결과로서 PBS와 2% (w/v) MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 마우스의 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근)에 50 μl 부피로 주사 후 3, 7, 14일 차에 TA muscle 조직을 적출하여 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 Toluidine blue (TB) 염색을 통해 조직학 분석을 진행한 결과. 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)에 비해 주사 후 3일 차에 phosphate buffered saline (PBS)과 각 하이드로젤을 주사한 그룹에서 외부 물질이 주입된 부위로 세포들이 이동하여 분포하고 있으나 주사 후 14일 차에는 이러한 세포들이 거의 사라진 것을 확인하였다. TB 염색을 통해 주입된 하이드로젤 주변에서 관찰되는 세포에서 백혈구의 일종인 비만세포(mast cell)가 존재하는지 확인했을 때 이러한 세포들은 거의 없는 것을 확인하였다. 따라서, 하이드로젤 주입에 의한 조직 손상이나 면역 반응이 거의 일어나지 않음을 확인하였다(도 12).

MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤의 생체적합성을 평가하기 위해 2% (w/v) 하이드로젤을 마우스의 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근)에 50 μl 부피로 근육 주사한 뒤 3, 7, 14일 차에 TA muscle 조직을 적출하여 면역조직화학 염색을 진행하였다.

그 후, 염증 마커인 M1 대식세포 마커(iNOS)와 항염증 마커인 M2 대식세포 마커(CD206)를 염색하였다. 그 결과 하이드로젤 주입 3일 차에 M1 대식세포의 발현이 증가하였다가 7, 14일 차에는 서서히 감소하는 것을 확인하였다. 이와는 반대로 M2 대식세포의 발현은 3일 차에는 낮은 수준이었다가 7, 14일 차에는 증가하는 것을 확인하였다. PBS를 주입한 그룹에서도 3일차에 M1 대식세포의 발현이 증가하였다가 7일차에 줄어들었고, M2 대식세포의 발현이 3일차 보다는 7일차에 더 높은 것을 확인하였다.

발현된 M1/M2 대식세포의 비율을 분석했을 때 하이드로젤 주입 후 3일 차에는 M1 대식세포의 비율이 더 높았으나 14일 차에는 M2 대식세포의 비율이 훨씬 높아지는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤 주입 후 M1 대식세포보다 M2 대식세포의 발현이 더 많아지면서 염증성 반응보다는 항염증성 반응이 유도될 수 있음을 보여주었다(도 13, 14).

또한 염증 반응을 확인하기 위해 백혈구 (WBC, white blood cell), 림프구 (lymphocytes)의 수치를 확인하였다. 3일, 7일, 14일 차에 하이드로젤을 주사한 모든 그룹에서 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)과 비슷한 수치가 나오며 염증 반응이 없는 것을 확인하였다(도 15 - a, b).

주사한 하이드로젤이 독성 물질 ,약물 및 감염, 신장 이상, 간장 이상으로 생길 수 있는 용혈 빈혈 (hemolytic anemia)을 유발하는지 확인하기 위해 적혈구 (RBC, red blood cell), 혈색소 (HGB, hemoglobin), 적혈구용적률 (HCT, hematocrit), 평균 적혈구 용적 (MCV, mean corpuscular volume), 평균적혈구혈색소 (MCH, mean corpuscular hemoglobin), 평균적혈구혈색소농도 (MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration) 수치를 확인하였다. 그 결과, 3, 7, 14일 차에 하이드로젤을 주사한 모든 그룹이 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)과 비슷한 수치를 가지는 것을 확인하였다(도 15 - c ~ h).

평균혈소판용적 (MPV, mean platelet volume)의 수치는 다양한 질병의 지표로서, 높은 수치는 심장질환, 고혈압, 갑상선 기능 항진증을 나타내며 낮은 수치는 염증성 장질환, 약물 세포 독성, 재생불량성 빈혈을 나타내었다. MPV 수치를 3, 7, 14일 차 비교하였을 때 하이드로젤을 주사한 모든 그룹들이 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)과 비슷하며 하이드로젤 주입이 질병 및 독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다(도 16 - a).

신장 기능에 영향이 있는지 확인하기 위해 혈청 샘플을 이용한 신장 기능 검사를 진행하였다. 신장 기능 지표로서 혈액요소질소 (BUN, blood urea nitrogen)와 크레아티닌 (CRE, Creatinine) 농도를 3, 7, 14일 차에 확인하였을 때, 모든 하이드로젤 그룹에서 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)과 비교하여 유의미한 차이가 없으며 따라서 신장 기능에 영향이 없음을 확인하였다(도 16 - b, c).

간 손상 정도와 기능 검사를 위해 아스파테이트아미노전이효소 (AST, Aspartate transaminase)와 알라닌아미노전이효소 (ALT, Alanine transaminase), 총 단백질 (TP, total protein)을 지표로 사용하였다. 간 손상 시 ALT와 AST 수치가 증가하며 TP 수치는 감소하는데, 하이드로젤 주사 3, 7, 14일 차에 모든 그룹에서 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)의 수치와 비슷한 것을 확인하였다. 따라서, 하이드로젤 주입에 의한 간 손상이 없으며 간 기능에도 영향이 없는 것을 확인하였다(도 16 - d, e, f).

염증 발생시 혈액 내 포도당이 증가하기 때문에 혈당 (GLU, glucose)을 측정하였다. 혈당 수치 또한 모든 하이드로젤 그룹에서 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)의 수치와 비슷하며 따라서 염증이 발생하지 않는 것을 확인하였다(도 16 - g).

상기의 실험 결과에 따르면 본 발명에서 제작한 하이드로젤을 주입하였을 때, 초반에 경미한 면역 반응이 일어났다가 서서히 감소하는 것을 확인함으로써 MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤은 심각한 염증 반응 유발 가능성이 매우 낮음을 알 수 있었다. 또한, 조직 재생에 도움이 되는 항염증성 대식세포로의 분극화를 촉진함으로써 근육 재생 치료 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대되었다.

따라서, 종합적으로 일련의 실험을 통해 MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤이 매우 우수한 생체적합성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

마지막으로 PBS와 2% (w/v) MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 마우스의 tibialis anterior 근육 (TA; 전경골근)에 50 μl 부피로 주사 후 3, 7, 14일 차에 마우스의 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장)들을 적출하여 H&E 염색을 통해 조직학적 분석을 하였다. 그 결과, PBS 또는 각 하이드로젤을 주사한 그룹에서 어떠한 처리도 하지 않은 Normal 그룹 (정상 조직)에서와 같이 조직 손상이나 면역 반응이 일어나지 않음을 확인하였다(도 17).

따라서 상기와 같은 결과들은 본 발명의 하이드로젤이 근육재생을 위한 세포외기질이 될 수 있음을 보여준다.

실험예 2. 불용성 근위축 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤에 의한 근육량 증진 효과 검증결과

Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색과 면역조직화학 염색을 통하여 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입한 그룹에서 myofiber의 크기가 증가된 것을 확인하였다(도 18 - a, c).

MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주사한 그룹에서 정상 조직 수준으로 근육량 증진 효과가 관찰되었고, PBS를 근육 주사한 비 치료군과 비교하여 통계적으로 유의미한 다리 근육 무게 증진 효과가 있음을 확인하였다(도 18 - b).

또한, MEM 하이드로젤을 주입한 경우와 비교하여 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입한 경우 myosin heavy chain (MyHC)+ myofiber 면적과 골격근 수축 기능을 유도하는 아세틸콜린 수용체의 발현이 증가하였고, correct laminin deposition의 증가를 확인함으로써 기능적인 근육량 증진이 성공적으로 유도된 것을 확인하였다(도 18 - d, e, f).

실험예 3. 불용성 근위축 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤과 선행 연구에서 개발된 다양한 하이드로젤에 의한 근육량 증진 효과 비교 결과

MEM-PG와 HA-PG/MEM을 각각 주사한 그룹에서 실제로 근육량 증진 효과가 관찰되었고, PBS를 근육 주사한 비 치료군과 비교하여 통계적으로 유의미한 다리 근육 무게 증진 효과가 있음을 확인하였다(도 20 - a).

Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색과 면역조직화학 염색을 통하여 HA-PG/MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입한 그룹에서 myofiber의 크기가 증가된 것을 확인하였다.(도 19, 도 20 - b)

Masson's trichrome (MT) 염색을 통해 MEM-CA, MEM-PG 각각의 하이드로젤을 주입한 경우 PBS를 주입한 경우와 비교하여 근섬유화 면적이 가장 유의미하게 적은 것을 확인하였다(도 19, 도 20 - c).

PBS, Skin-CA, Skin-PG, HA-CA/MEM을 각각 주입한 그룹과 비교하여 HA-PG/MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 각각 주입한 그룹에서 Myosin heavy chain (MyHC)+ myofiber 면적과 correct laminin (LM) deposition의 증가를 확인하였다(도 20 - d, e). 또한, 골격근 수축 기능을 유도하는 신경근접합부 (Neuromuscular junction; NMJ) 마커 (SV2 (synaptic vesicle)/2H3 (neurofilament)) 발현 증가와 신경근접합부 (NMJ) 의 nicotinic acetylcholine receptor (AchR)의 α-subunit에 잘 결합하는 것으로 알려진 α-bungarotoxin (BTX) 처리 후 검출을 통해 기능적인 근육량 증진이 성공적으로 유도된 것을 확인하였다(도 20 - f, g).

따라서, 근육 조직 유래 세포외기질 기반의 하이드로젤이 조직 특이적으로 근육 재생을 증진시키는 것을 확인하였다. 또한, 근육 조직 유래 세포외기질 (MEM)을 기존 선행연구를 통해 개발된 하이드로젤(HA-PG)에 단순 혼합하여 적용하는 것보다는 본 발명에서와 같이 직접적으로 페놀기를 MEM에 수식한 하이드로젤을 적용하는 것이 더욱 효과적임을 확인하였다.

실험예 4. 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질과 탈세포 피부 조직 유래 세포외기질 단백체 (proteomics) 분석 비교 결과

MEM과 SkEM의 단백체 비교했을 때 구성하고 있는 단백질 성분이 전반적으로 다르다는 것을 확인하였다(도 21 - a).

MEM과 SkEM의 매트리좀 단백질 분석 결과 MEM에는 27개, SkEM에는 16개가 각각 검출되었으며 종류별 (collagen, ECM glycoproteins, proteoglycans, ECM regulators) 개수를 비교한 결과 MEM이 더 다양한 매트리좀 단백질들로 구성되어 있음을 확인하였다(도 21 - b). 특히, MEM이 SkEM 보다 다양한 collagen과 ECM glycoprotein 단백질을 포함하고 있음이 확인되었다.

그리고 MEM에서는 평균적으로 47개의 근육 조직 특이적 단백질(다른 조직 대비 근육 조직에서 4배 이상 발현되는 것으로 보고된 단백질)이 검출된 반면 SkEM에서는 근육 조직 특이적 단백질 검출이 전혀 안되었다. 따라서, MEM이 SkEM과 비교하여 실제 근육 조직 내 세포외기질 미세환경을 더 잘 구현할 수 있음을 확인하였다(도 21 - b).

MEM과 SkEM에서 각각 가장 많이 검출된 주요 10개 매트리좀 단백질을 비교하였을 때, 4개의 단백질만 같았으며 나머지 6개는 다른 단백질들로 이루어진 것을 확인하였다(도 21 - c).

MEM과 SkEM의 전체 단백질을 대상으로 주성분 분석 (PCA)을 진행한 결과 MEM과 SkEM의 분포에 있어 상당한 거리가 있는 것으로 보아 두 매트릭스 간 뚜렷한 성분 차이를 알 수 있다 (도 22 - a).

유전자 온톨로지 (Gene Ontology) 분석에서 근육 조직 발달과 관련된 단백질을 대상으로 MEM과 SkEM을 비교한 결과, MEM에서는 근육 발달과 관련된 단백질 개수도 많으면서 발현량도 높은 반면 SkEM에서는 거의 존재하지 않거나 발현량이 현저히 적은 것을 확인하였다(도 22 - b).

MEM과 SkEM의 전체 단백질 성분을 비교한 결과 18개의 단백질들이 공통적으로 두 조직 유래 매트릭스에 포함되어 있는 것을 확인하였다. 18개 공통 단백질의 발현량을 비교한 결과, 14개의 단백질이 다른 발현 패턴을 보였다. 그 중 4개의 단백질이 SkEM 보다 비교적 높게 발현하였고 10개의 단백질이 비교적 발현량이 낮았다. 이는 동일한 단백질을 포함하고 있어도 MEM과 SkEM의 단백질 발현 패턴이 차이가 있는 것을 보여준다. 따라서, 각 매트릭스의 단백체를 구성하는 성분 종류 및 그 함량이 다른 것을 확인하였다. 또한, 근육에서만 발현하는 단백질을 대상으로 유전자 온톨로지를 분석한 결과 MEM은 근육 기능 및 발달과 관련된 단백질로 이루어진 것을 확인하였다. 이러한 차이가 MEM의 근육 발달 및 재생 효과에 기여하는 것으로 예상할 수 있다(도 23).

실험예 5. 근감소증 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤에 의한 근육량 증진 효과 검증 결과

근육량 증진 효과를 검증한 결과 MEM-PG를 주사한 그룹에서 정상 조직 수준으로 근육량 증진 효과가 관찰되었고, 생리식염수 (saline)를 근육 주사한 비 치료군과 비교하여 통계적으로 유의미한 다리 근육 무게 증진 효과가 있음을 확인하였다.(도 24, 도 25 - a) 또한, MEM-CA, MEM-PG 각 하이드로젤을 주입한 그룹에서 근육 다발 중앙에 위치하는 다핵을 가진 근섬유의 개수가 줄어든 것을 확인하였는데, 이는 근감소증 근육 다발에서 일반적으로 관찰되는 질환 양상이 감소됨을 보여주는 결과로서 따라서 주사한 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤이 치료 효과가 있음을 보여주었다(도 24, 도 25 - b).

Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색과 Masson's trichrome (MT) 염색, 면역조직화학 염색을 통하여 MEM-CA, MEM-PG 각각의 하이드로젤을 주입한 그룹에서 myofiber의 크기가 증가된 것을 확인하였다(도 24, 도 25c,d). 또한, MEM-CA 및 MEM-PG 하이드로젤을 주입한 경우 MEM 하이드로젤을 주입한 경우와 비교하여 myosin heavy chain (MyHC)+ myofiber 면적, correct laminin deposition 면적, Desmin+ 면적 및 골격근 수축 기능을 담당하는 아세틸콜린 수용체 (AchR) 발현의 증가를 확인함으로써 기능적인 근육량 증진이 성공적으로 유도된 것을 확인하였다(도 24, 도 25 - e, f, g, h).

실험예 6. 근감소증 동물모델에서 페놀기 수식 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤의 생체적합성 평가 결과

18개월령 노령 마우스의 TA muscle에 에 PBS와 MEM, MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 적용하였다, 하이드로젤 50 μl 씩 근육 주사한 뒤, 8주 차에 마우스의 주요 장기(심장, 간, 비장, 신장, 폐)들을 적출하여 H&E 염색을 통해 조직학 분석을 진행하였다.

그 결과, PBS 또는 하이드로젤을 주사한 그룹에서 Normal 그룹 (정상 조직)과 같이 주요 장기에서 조직 손상이나 면역 반응이 일어나지 않음을 확인하였다(도 26 - a).

또한, 마우스의 혈액을 추출하여 분석 진행하였다. 신장 기능 지표인 혈액요소질소 (BUN, blood urea nitrogen), 간 기능 지표인 아스파테이트아미노전이효소 (AST, aspartate transaminase), 총 단백질 (TP, total protein), 혈당 (GLU, glucose) 농도를 확인하였을 때, PBS를 주입한 그룹과 비교하여 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤을 주입한 그룹들에서 유의미한 차이가 없음을 확인하였다(도 26 - b).

따라서, 하이드로젤 주입 후 8주가 지나도 독성 및 면역 반응이 일어나지 않은 것을 확인함으로써 MEM-CA, MEM-PG 하이드로젤이 장기간 체내 적용에도 전혀 문제가 없으며 우수한 생체적합성을 가지고 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

카테콜기, 및 파이로갈롤기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 수식된, 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 하이드로젤은 세포외기질에 수식된 카테콜기, 파이로갈롤기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 상호간 가교되어 형성된 것인, 하이드로젤 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물에서 상기 세포외기질에 카테콜기가 수식된 경우, 상기 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 카테콜기 수식된 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM-CA 유도체)은 0.1 내지 4중량%으로 포함되는 것인, 하이드로젤 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물에서 상기 세포외기질에 파이로갈롤기가 수식된 경우, 상기 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 파이로갈롤기가 수식된 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM-PG 유도체)은 0.1 내지 4중량%으로 포함되는 것인, 하이드로젤 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤 조성물은 G'' (손실 탄성률) 보다 높은 G' (저장 탄성률) 을 갖는 것인, 하이드로젤 조성물.
제1항에 있어서, 상기 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질이 카테콜기가 수식된 것으로서 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 0.1 내지 4 중량%로 포함된 경우, 하이드로젤 조성물은 400 내지 2000 Pa의 탄성계수를 갖는 것인, 하이드로젤 조성물.
제1항에 있어서, 상기 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질이 파이로갈롤기가 수식된 것으로서 하이드로젤 조성물 전체 부피 대비, 0.1 내지 4 중량%로 포함된 경우, 하이드로젤 조성물은 경우 1200 내지 2800 Pa의 탄성계수를 갖는 것인, 하이드로젤 조성물.
제1항의 하이드로젤 조성물을 포함하는, 근육 질환 또는 근육 손상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 근육 질환은 근이영양증, 근위축증, 불용성 골격근 위축, 근감소증, 근손실, 근육통, 근무력증, 근육 경직, 인대 파열, 신경섬유종증, 건막염, 다발성근염, 근육긴장이상, 염증성 근육병변(근육염), 근긴장증, 대사성 근육병변, 주기성 마비, 및 선천성 근육병변으로부터 선택된 하나 이상의 근육 질환인 것인, 약학 조성물.
제1항의 상기 하이드로젤 조성물을 투여 또는 이식이 필요한 인간을 제외한 개체에 투여 또는 이식하는 단계를 포함하는, 근육 질환의 예방 또는 치료방법.
제10항에 있어서, 상기 근육 질환은 근이영양증, 근위축증, 불용성 골격근 위축, 근감소증, 근손실, 근육통, 근무력증, 근육 경직, 인대 파열, 신경섬유종증, 건막염, 다발성근염, 근육긴장이상, 염증성 근육병변(근육염), 근긴장증, 대사성 근육병변, 주기성 마비, 및 선천성 근육병변으로부터 선택된 하나 이상의 근육 질환인 것인, 근육 질환의 예방 또는 치료방법.
제1항의 하이드로젤 조성물을 포함하는, 근육 오가노이드 배양을 위한 조성물.
제1항의 하이드로젤 조성물을 포함하는, 근육 세포의 이식이 필요한 개체 내 근육 조직으로의 이식을 위한 조성물.