CN115970046B

CN115970046B - 一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用

Info

Publication number: CN115970046B
Application number: CN202211534658.1A
Authority: CN
Inventors: 毛宏理; 顾忠伟; 夏浩
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2042-12-02
Also published as: CN115970046A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用，己二酸二酰肼修饰的透明质酸，醛基修饰的透明质酸和多巴胺封端改性的聚6‑氨基己酸混合制备出具有抗炎抗菌性质的多功能复合水凝胶。本发明的多功能水凝胶能够通过对pH环境的调控促进巨噬细胞极化、促进血管新生或促细胞增殖起到调控血管新生和炎症消退的功能，从而达到治疗糖尿病伤口愈合迟缓及糖尿病相关并发症的目的。发明提出的多功能水凝胶促进糖尿病伤口愈合，对治疗糖尿病患者伤口愈合缓慢及糖尿病所引发的溃疡、糜烂、坏疽以及糖尿病足的治疗具有重大意义。

Description

一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用。

背景技术

糖尿病是全球的高发型疾病，已成为第四大易致人类死亡的疾病之一。糖尿病的并发症是使其患者死亡的主要原因，而诸多并发症中，糖尿病伤口愈合能力受损是最典型的并发症。其导致了患者丧失了末端皮肤组织的保护使其更易受到感染。皮肤是人体抵御外部入侵的第一道防线，糖尿病患者由于血管的神经性退变，其末端皮肤组织有很大可能会出现溃烂性伤口，炎症的过量表达阻碍了皮肤组织愈合，使得皮肤创伤丧失正常修复能力，严重者面临截肢风险。

伤口修复是一个复杂的过程，它通过多种细胞协调作用完成伤口修复，包括炎症细胞，内皮细胞，成纤维细胞等。这些细胞通过止血，炎症，增殖，重塑四个阶段相继发挥作用并且四个阶段没有明显的界限。当皮肤受损时，血小板和纤维蛋白会栓塞伤口止血；炎症细胞会被募集到伤口部位抵御外部细菌的入侵；成纤维细胞和内皮细胞的增殖和重塑恢复了伤口部位的血管及机械性能。然而糖尿病患者由于血管病变及慢性炎症存在，这种多细胞的协同作用受损，导致不愈合。

在这种情况下，临床手段已经无法实现皮肤伤口的修复。pH值是伤口微环境的最重要参数之一。正常的皮肤组织是酸性的，当它被外界因素破坏时，其环境的pH值会从酸性变为碱性，从而导致炎症，延长伤口恢复时间。当伤口环境呈酸性时，会减少微生物的粘附，即减少细菌的粘附。处于酸性环境中的巨噬细胞会增加其ICER的表达，使巨噬细胞极化为非炎症的M2型，有助于减少糖尿病伤口部位的炎症。此外，酸性环境可以促进内皮细胞管化，从而促进血管再生。然而，成纤维细胞的增殖和迁移通常是在碱性环境下实现的。因此，在不同阶段适当调整pH环境将促进伤口组织的愈合。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用，本发明的多功能水凝胶能够直接有效地促进糖尿病伤口愈合，以及预防糖尿病患者坏疽、截肢。

发明思路：本发明中由己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA-ADH)，醛基修饰的透明质酸(OHA)和多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸(PADA)混合制备出具有抗炎抗菌性质的多功能复合水凝胶。在混合过程中HA-ADH、OHA中的醛基和酰肼之间会形成希夫碱键并在室温条件下缔合形成水凝胶，随后在锶离子的作用下，进一步通过PADA中酚羟基和锶离子之间的金属络合反应形成稳定的结构。具有富-COOH的PADA可以在中性条件下释放H⁺，H⁺被酰肼捕获形成季胺结构，这种在动态调节过程中形成的季胺结构不仅保留了其抗菌特性且不会影响水凝胶的生物相容性，并且通过具有优异生物学功能的透明质酸和动态pH环境调节协同抗炎，促进了糖尿病伤口的愈合。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明公开了一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用，

其中，所述的多功能水凝胶按照如下制备方法制备得到：将酰肼修饰的透明质酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第一预聚液；将醛基修饰的透明质酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第二预聚液；将多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第三预聚液；将第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液混合进行预交联反应，反应结束后，将反应体系置于氯化锶水溶液中浸泡稳定结构，即得多功能水凝胶。

其中，所述的磷酸盐缓冲液，缓冲液中磷酸二氢钾的浓度为1.5mmol/L，缓冲液中磷酸氢二纳的浓度为8mmol/L，缓冲液中NaCl的浓度为0.2mol/L，缓冲液中KCl的浓度为2.7mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH＝7.4。

具体地，所述的第一预聚液中酰肼修饰的透明质酸的浓度为0.5～3％g/mL；所述的第二预聚液中醛基修饰的透明质酸的浓度为1～3％g/mL；所述的第三预聚液中多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的浓度为1～3％g/mL；所述的氯化锶水溶液中氯化锶的浓度为0.005％～0.05％g/mL，优选为0.01％g/mL；所述的第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液的体积比为0.5～1：0.5～1：0.5～1。

其中，将第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液混合进行预交联反应，反应结束后得到成胶的水凝胶，随后需要将成胶的水凝胶浸泡在氯化锶水溶液中浸泡稳定结构，所以氯化锶水溶液的用量为过量，需要将成胶的水凝胶浸没。

具体地，所述的预交联反应，反应温度为室温，反应时间为1～3min，优选为2min；所述的浸泡，浸泡温度为室温，浸泡时间为1～10min。

具体地，所述的多功能水凝胶中，酰肼修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，醛基修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL。

具体地，所述的酰肼修饰的透明质酸的制备方法为：所述的酰肼修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸、缩合剂与己二酸二酰肼反应得到酰肼修饰的透明质酸，在总反应时间的前48h内控制反应体系的pH值在7.5～7.8之间，在总反应时间72h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45。

优选地，所述的酰肼修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水，得到混合液A；向混合液A中加入缩合剂进行活化，得到混合液B；向混合液B中加入己二酸二酰肼进行第一反应，在总反应时间的前48h内控制反应体系的pH值在7.5～7.8之间，在总反应时间72h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45，将反应液透析，冻干，即得。

其中，控制反应体系的pH值，通过向体系中添加1mol/L的氢氧化钠水溶液和1mol/L的盐酸水溶液来调节pH值。

具体地，所述的缩合剂为1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；所述的混合液A中透明质酸的浓度为5～20mg/mL，优选为10mg/mL；所述的透明质酸与1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.2～1.5：1.2～1.5，优选为1：1.2：1.2；所述的透明质酸中羧基与己二酸二酰肼中氨基的摩尔比为1：50～80；所述的活化，活化温度为室温，活化时间为10～30min；所述的第一反应，反应温度为室温。

其中，1-羟基苯并三唑的缩写为HOBT，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的缩写为EDC。

具体地，所述的醛基修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸与高碘酸钠反应，淬灭，即得。

优选地，所述的醛基修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水，得到混合液C；向混合液C中加入高碘酸钠进行第二反应，反应结束后淬灭反应，将反应液透析，冻干，即得。

具体地，所述的透明质酸中羧酸环与高碘酸钠的摩尔比为1：1～2.5，优选为1：1.5；所述的第二反应，避光反应，反应温度为室温，反应时间为4～8h；所述的淬灭反应，通过向反应液中加入乙二醇淬灭反应，透明质酸与乙二醇的质量体积比为1g：1～5mL。

其中，在混合液C中，去离子水的用量为：将混合液中的透明质酸溶解且混合液的粘度适中即可。

具体地，所述的多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的制备方法包括如下步骤：

(1)将6-氨基己酸、氢氧化钠与丙烯酰氯反应，得到6-丙烯酰基氨基己酸；

(2)将β-巯基乙醇、过硫酸铵、四甲基乙二胺、氢氧化钠与步骤(1)得到的6-丙烯酰基氨基己酸反应，得到聚6-氨基己酸；

(3)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、多巴胺盐酸盐与步骤(2)得到的聚6-氨基己酸反应，即得。

优选地，所述的多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的制备方法包括如下步骤：

(1)将6-氨基己酸与氢氧化钠溶于去离子水，得到混合液D；将丙烯酰氯溶于有机溶剂，得到混合液E；将混合液D与混合液E混合进行第三反应，得到6-丙烯酰基氨基己酸；

(2)将步骤(1)得到的6-丙烯酰基氨基己酸与氢氧化钠溶于去离子水，得到混合液F；将β-巯基乙醇、过硫酸铵与四甲基乙二胺溶于去离子水，得到混合液G；将混合液F与混合液G混合进行第四反应，得到聚6-氨基己酸；

(3)将步骤(2)得到的聚6-氨基己酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于去离子水，得到混合液H；将多巴胺盐酸盐溶于去离子水，得到混合液I；将混合液H与混合液I混合进行第五反应，反应结束后，将反应液透析，冻干，即得；

步骤(2)和步骤(3)在惰性气体保护下进行。

具体地，步骤(1)中，所述的有机溶剂为四氢呋喃；所述的混合液D中6-氨基己酸的浓度为0.05～0.25g/mL；所述的6-氨基己酸、氢氧化钠与丙烯酰氯的摩尔比为1：1～1.2：1～1.2，优选为1：1.1：1.1；所述的第三反应，反应温度为-4～4℃，反应时间为8～12h。

其中，在步骤(1)中，混合液E中有机溶剂的用量为：将混合液中的丙烯酰氯固体溶解且混合液粘度适中即可。

具体地，步骤(2)中，所述的6-丙烯酰基氨基己酸、氢氧化钠、β-巯基乙醇、过硫酸铵与四甲基乙二胺的摩尔比为50：50～60：0.1～2：0.1～1：0.1～1，优选为50：50：1.185：0.41：1；所述的第四反应，反应温度为22～27℃，反应时间为8～12h。

其中，在步骤(2)中，去离子水的用量为：将混合液中的固体溶解且混合液粘度适中即可。

具体地，步骤(3)中，所述的聚6-氨基己酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与多巴胺盐酸盐的摩尔比为10：1～3：0.5～2：1～3，优选为10：2：1：2；所述的第五反应，避光反应，反应温度25～35℃，反应时间为8～12h。

其中，N-羟基琥珀酰亚胺的缩写为NHS。

其中，在步骤(3)中，去离子水的用量为：将混合液中的固体溶解且混合液粘度适中即可。

具体地，在多功能水凝胶在治疗糖尿病伤口中的应用中，所述的糖尿病伤口包括糖尿病给药治疗过程中皮肤产生的伤口和糖尿病相关并发症所引发的伤口。

其中，糖尿病给药治疗过程中皮肤产生的伤口，例如糖尿病病人通过注射的方式注射胰岛素时，在皮肤上的注射部位留下的伤口。

其中，所述的糖尿病相关并发症所引发的伤口包括溃疡、糜烂、坏疽或糖尿病足。

有益效果：

(1)实验结果表明，本发明的多功能水凝胶能够通过对pH环境的调控促进巨噬细胞极化、促进血管新生或促细胞增殖起到调控血管新生和炎症消退的功能，从而达到治疗糖尿病伤口愈合迟缓及糖尿病相关并发症的目的。

(2)本发明提出的多功能水凝胶促进糖尿病伤口愈合，对治疗糖尿病患者伤口愈合缓慢及糖尿病所引发的溃疡、糜烂、坏疽以及糖尿病足的治疗具有重大意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为己二酸二酰肼修饰的透明质酸和醛基修饰的透明质酸的核磁氢谱图。

图2为醛基修饰的透明质酸的FTIR外红谱图。

图3为多巴胺封端的聚6-氨基己酸的核磁图谱。

图4是治疗组和对照组造模当天至造模后第14天伤口愈合率统计图；从图中可以看出，在伤口愈合过程中，多功能水凝胶组与对照组比，愈合速度较快。

图5为伤口模型建立第0天、3天、7天、14天治疗组和对照组的伤口愈合情况，图片为各组代表性小鼠皮肤伤口的照片。

图6为治疗组和对照组造模当天至造模后第7天炎症因子染色图。

图7为治疗组和对照组造模当天至造模后第7天巨噬细胞相关蛋白染色图。

图8为治疗组和对照组造模当天至造模后第7天内皮细胞相关蛋白染色图。

图9为治疗组和对照组造模当天至造模后第14天胶原染色图。

图10为水凝胶组和对照组在第1天和第3天时的细胞活/死染色图。

图11为水凝胶组和对照组在第一天和第三天时的CCK8统计图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液(PBS)，缓冲液中磷酸二氢钾的浓度为1.5mmol/L，缓冲液中磷酸氢二纳的浓度为8mmol/L，缓冲液中NaCl的浓度为0.2mol/L，缓冲液中KCl的浓度为2.7mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH＝7.4。

本发明实施例中所用的链脲佐菌素溶液配制过程如下：链脲佐菌素需溶解在柠檬酸钠缓冲溶液中，且具有活性的链脲佐菌素在缓冲溶液中的最终浓度10mg/mL，于-4℃下避光保存；由于链脲佐菌素生物半衰期很短，需现用现配，同时短时间内快速注射。

本发明实施例中所用的柠檬酸钠缓冲溶液配制：将2.1g柠檬酸溶于100mL无菌注射用水配成柠檬酸溶液，2.94g柠檬酸钠溶于100mL无菌注射用水配成柠檬酸钠溶液，柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液按体积比1：1比例混合，pH值在4.2～4.4之间。

实施例1：己二酸二酰肼修饰的透明质酸的制备

(1)称取4g透明质酸(HA，Mw：1100kDa)溶于400mL去离子水中，待充分溶解形成混合液A(混合液A中透明质酸的浓度为10mg/mL)。向混合液A中加入1.62g HOBT和2.3g EDC，在室温下活化30min，得到混合液B。向混合液B中加入43.55g己二酸二酰肼(ADH)，在室温下反应，反应过程中向反应液中添加1mol/L的氢氧化钠水溶液和1mol/L的盐酸水溶液调节反应液的pH，在总反应时间的前48h内控制反应体系的pH值在7.5～7.8之间，在总反应时间72h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45，将反应液置于透析袋(8000～14000Da)中透析3天，前两天每4h换一次水，后几天每天换三次水。将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状样品，即己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA-ADH)，保存至干燥器中备用。

(2)将10.00mg HA和10.00mg HA-ADH分别溶解在D₂O(1000μL)中，用核磁共振波谱仪记录样品的¹H NMR谱图。

(3)在透明质酸(HA)和HA-ADH的核磁谱图(图1)中可以看出经ADH接枝后的HA会在δ＝1.65ppm(b)和2.39ppm(a)左右出现两个新的信号峰，分别是己二酸二酰肼上亚甲基的核磁峰，这证明透明质酸已被成功己二酸二酰肼化。

实施例2：醛基修饰的透明质酸的制备

(1)称取3g透明质酸(HA，Mw：1100kDa)溶于300mL去离子水中，待充分溶解形成混合液C；向混合液C中加入2.53g高碘酸钠(NaIO₄)，在室温下避光反应6h；反应结束后，向反应液中加入15mL乙二醇淬灭反应，随后将反应溶液置于透析袋(8000～14000Da)中透析3天，前两天每4h换一次水，后几天每天换三次水。将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状样品，即醛基修饰的透明质酸(OHA)，避光保存至干燥器中。

(2)OHA的红外表征采用溴化钾压片法，取适量产物与溴化钾研磨成细粉压片，Thermo Scientific Nicolet iS5 500～4000cm^-1范围内扫描。通过FT-IR分析证实了所得产物的化学结构，OHA的红外谱图如图2所示，1725cm^-1处出现了C＝O双键的振动峰表明醛基基团的成功接枝。同时，通过¹H NMR分析证实了所得产物的化学结构，OHA的核磁谱图如图1所示，5.0ppm附近的三重峰(a、b和c峰)表明醛基基团的成功接枝，表明醛基修饰的透明质酸的成功制备。

实施例3：多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的制备

(1)称取13.17g 6-氨基己酸(AA)和4.4g氢氧化钠(NaOH)将其放入茄型烧瓶中，在0℃冰浴环境下加入80mL去离子水，充分搅拌均匀，得到混合液D；另称取10g丙烯酰氯(AC)溶解在15mL四氢呋喃中，得到混合液E。将混合液E加入到50mL恒压滴液漏斗中，缓慢滴加到混合液D中，在0℃下反应8h，待反应结束后，向反应液中加入50mL乙酸乙酯萃取反应液，在分液漏斗中静至分层，收集有机相，水相用1M盐酸调节pH＝2～3，再用乙酸乙酯萃取水相，将有机相合并用无水硫酸钠干燥过夜、砂芯漏斗进行抽滤、抽滤得到的有机相进行旋蒸，旋至粘稠状态即可，用石油醚/乙酸乙酯体系进行柱层析色谱提纯，得到白色粉末6-丙烯酰氨基己酸(AACA)，将AACA放入真空干燥箱干燥过夜，随后放入干燥器保存备用。

(2)称取2g AACA放入两口烧瓶中，抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入含有0.432g氢氧化钠的去离子水溶液15mL，充分搅拌均匀，得到混合液F；另称取0.02gβ-巯基乙醇、0.02g过硫酸铵、0.025g四甲基乙二胺(TEMED)溶于1mL去离子水中，充分搅拌均匀，得到混合液G。将混合液G加入到混合液F中，在25℃下反应12h。反应结束后，将反应液进行透析，三天后将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状产物(PACA)，即聚6-氨基己酸，避光保存至干燥器中。

(3)称取0.5g PACA放入两口烧瓶中，抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入含有0.1035g EDC和0.031g NHS的去离子水溶液50mL，充分搅拌均匀，得到混合液H；另称取0.1024g多巴胺盐酸盐溶于1mL去离子水中，充分搅拌均匀，得到混合液I。将混合液I加入到混合液H中，在25℃下避光反应12h。反应结束后，将反应液进行透析，三天后将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状产物(PADA)，即多巴胺封端的聚6-氨基己酸，避光保存至干燥器中。

(3)取10.00mg AA、10.00mg PACA和10.00mg PADA分别溶解在CDCl₃、D₂O、D₂O(1000μL)中。用核磁共振波谱仪记录样品的¹H NMR谱图。

从图3可知，AACA的核磁谱图中在δ＝5.9-6.5ppm左右出现多个新的信号峰，是丙烯上-CH₂-的核磁峰。在PADA的核磁图中，δ＝6-7ppm处则是多巴胺上苯环的核磁峰，这证明了PADA的成功合成。

实施例4

(1)将实施例1中制备的HA-ADH溶于PBS中，得到第一预聚液(HA-ADH的浓度为2％g/mL)；将实施例2中制备的OHA溶于PBS中，得到第二预聚液(OHA的浓度为2％g/mL)；将第一预聚液和第二预聚液按照体积比1：1进行混合静至成胶，得到OHA/HA-ADH水凝胶，即HASNGel；水凝胶中HA-ADH的最终浓度为1％g/mL，OHA的最终浓度为1％g/mL。

(2)将实施例3制备得到的PADA和SrCl₂溶于PBS中静至成胶，得到PADA/Sr水凝胶，即PASN Gel；水凝胶中PADA的浓度为1％g/mL，氯化锶的浓度为0.01％g/mL。

(3)将实施例1中制备的HA-ADH溶于PBS中配成含有HA-ADH的预聚液，得到第一预聚液，HA-ADH在第一预聚液中的浓度为3％g/mL；将实施例2中制备的OHA溶于PBS中配成含有OHA的预聚液，得到第二预聚液，OHA在第二预聚液中的浓度为3％g/mL。将实施例3中制备的PADA溶于PBS中配成含有PADA的预聚液，得到第三预聚液，PADA在第三预聚液中的浓度为3％g/mL。将上述预聚液按照1：1：1的体积进行混合后加入到玻璃瓶中进行预交联反应，反应温度为室温，静至交联2min，随后将交联成胶的水凝胶置于含有0.01％g/mL Sr离子的氯化锶水溶液中，在室温下浸泡5min，浸泡结束后取出水凝胶并用PBS清洗，得到PADA/OHA/HA-ADH水凝胶，即HPADN Gel；PADA/OHA/HA-ADH水凝胶中HA-ADH的最终浓度为1％g/mL，OHA的最终浓度为1％g/mL，PADA的最终浓度为1％g/mL。

(4)将实施例1中制备的HA-ADH溶于PBS中配成含有HA-ADH的预聚液，得到第一预聚液，HA-ADH在第一预聚液中的浓度为3％g/mL；将实施例2中制备的OHA溶于PBS中配成含有OHA的预聚液，得到第二预聚液，OHA在第二预聚液中的浓度为3％g/mL。将实施例3中制备的PADA溶于PBS中配成含有PADA的预聚液，得到第三预聚液，PADA在第三预聚液中的浓度为3％g/mL。

将上述预聚液按照1：1：1的体积进行混合，再向混合液中加入胰岛素，随后将体系加入到玻璃瓶中进行预交联反应，反应温度为室温，静至交联2min，随后将交联成胶的水凝胶置于含有0.01％g/mL Sr离子的氯化锶水溶液中，在室温下浸泡5min，浸泡结束后取出水凝胶并用PBS清洗，得到负载胰岛素的PADA/OHA/HA-ADH水凝胶，即HPADN@INS；HPADN@INS中HA-ADH的最终浓度为1％g/mL，OHA的最终浓度为1％g/mL，PADA的最终浓度为1％g/mL，胰岛素的浓度为40U/mL。

实施例5：多功能水凝胶的生物相容性

L929细胞来自中科院细胞库；

胎牛血清(FBS)购买于讯贝生物科技有限公司，品牌：ExCell Bio，货号：FSP500；

DMEM高糖培养基购买于讯贝生物科技有限公司，品牌：gibco。

(1)L929细胞在培养瓶中通过含有体积分数为10％FBS的DMEM高糖培养基扩增，取对数增殖期的细胞，备用。

(2)将实施例4制备得到的水凝胶以每孔100μL的体积加入96孔板中，加入DMEM高糖培养基静至12h，待其充分溶胀，备用。

(3)将处于对数增殖期的L929细胞以每孔5000个细胞的密度接种在(2)中的水凝胶上。

(4)L929细胞和水凝胶共培养1天和3天时，分别对其进行CCK8测试以评估水凝胶对细胞的损伤。并以无水凝胶组作为对照组，在酶标仪450nm下进行测量并通过一下公式计算：细胞存活率＝(ODn-ODc)/(ODs-ODc)*100％，其中ODn为样品(水凝胶)组的紫外吸光度，ODc为空白组的紫外吸光度，ODs为对照组的紫外吸光度；其中，空白组为CCK8和无血清的DMEM高糖培养基；对照组为无水凝胶对数增殖期的L929细胞。

(5)为了更直观的观察细胞状态，对和水凝胶共培养的L929细胞进行活/死染色实验。分别在第1天和第3天时对期进行AM(钙黄绿素)/PI(碘化丙啶)的双染。将5μL的AM和5μL的PI加入到10mL的无血清培养基中，得到稀释染料；以每孔100μL稀释染料的量加入到细胞中，孵育40min后，用PBS对其清洗2～3次。将染好的样品置于倒置荧光显微镜下进行观察。从图10可知，HPADN水凝胶没有细胞毒性，对细胞增殖不会起到负面作用。如图11所示，负载细胞的水凝胶各组与对照组进行比较，均表现出良好的生长趋势，各组水凝胶均表现出优秀的生物相容性。

实施例6：多功能水凝胶在促进糖尿病小鼠伤口愈合中的作用

(1)糖尿病小鼠造模：购买20～22g SPF级别的ICR雄鼠，饲养至体重为35～38g左右时禁食16～18h，随后每日腹腔注射链脲佐菌素，剂量为1.8mg/10g，每天监测血糖，7d后测量小鼠空腹血糖进行筛选。

(2)制备糖尿病小鼠伤口损伤模型：取造模成功(以禁食后血糖高于16.7mmol/L为造模成功)的糖尿病小鼠，用体积分数为2％阿佛丁(200mg/kg)腹腔注射麻醉，背部创造直径5mm的圆形全层皮肤伤口。

(3)给药方法：将实施例4的水凝胶前体材料溶解于无菌注射用水中，注射到伤口部位静至成胶，给药剂量为每只小鼠200μL。给予水凝胶治疗后每天对小鼠伤口进行拍照观察。应用Image-Pro Plus软件测量伤口面积。其中，Ctl组分为DM阳性对照组和Normal阴性对照组，DM阳性对照组单独糖尿病小鼠，Normal阴性对照组为正常小鼠。

(4)给药约两周后，伤口基本愈合。愈合率＝愈合/(愈合+未愈合)×100％。结果表明，多功能水凝胶可以明显促进糖尿病伤口愈合率(详细数据请见图4，图5为各组代表性小鼠皮肤伤口愈合情况图)。

(5)在所有治疗组中均观察到伤口面积的缩小，从图4、图5可知，经过3天治疗后，HPADN@INS水凝胶表现出2倍于DM对照组的伤口愈合速度分别为68％和29％，与其余各组均有统计学差异(p＜0.01)。在治疗14天后，HPADN@INS水凝胶组伤口闭合率为100％并基本实现了毛发覆盖，和对照组形成对比，这表明了它对伤口愈合具有促进作用。

实施例7：多功能水凝胶在促进糖尿病小鼠伤口中对巨噬细胞的作用及抗炎效果

(1)通过将水凝胶(实施例4制备得到)注射到伤口表明形成涂层，在第7天对老鼠进行处死，取全层皮肤组织通过体积分数为4％的多聚甲醛固定保存。

(2)对固定好的组织进行石蜡包埋切片，将切片进行CD86和CD206的免疫荧光染色及IL-6，IL-1β，TNF-α进行免疫组化染色。

(3)通过imageJ软件对其进行统计学分析。

(4)CD86和CD206的免疫荧光染色被用于观察伤口愈合时巨噬细胞的表达形态，如图7所示，经过治疗7天后，HPADN水凝胶组表现出更多的CD206和更少的CD86，而糖尿病DM阳性对照组几乎全部CD86表达。结果表明，经过HPADN水凝胶治疗后巨噬细胞有效的被极化为M2抗炎型，有效的限制了炎症表达，这主要是由于酸性环境影响了ICER蛋白的分泌从而对巨噬细胞产生影响。

(5)TNF-α，IL-6，IL-1β的免疫组化染色更加直观的观察伤口愈合时的炎症表达情况，如图6所示，HPADN水凝胶组治疗7天后，几乎无炎症因子的表达，而糖尿病DM阳性对照组依旧处于炎症状态下，这也进一步证实了巨噬细胞极化为M2型。表明了HPADN水凝胶能够有效的促进巨噬细胞转化为M2型从而抑制炎症的表达。

实施例8：多功能水凝胶在促进糖尿病小鼠伤口中对内皮细胞的作用及血管再生效果

(2)对固定好的组织进行石蜡包埋切片，将切片进行α-SMA的免疫荧光染色及CD31进行免疫组化染色。

(3)通过imageJ软件对其进行统计学分析。

(4)CD31和α-SMA的免疫染色用于评估伤口愈合阶段的血管再生情况，如图8所示，免疫荧光结果显示HPADN水凝胶组在第7天时内皮细胞已经具有成管表现，而其余各组均未能表达出管状形态，DM阳性对照组几乎没有表达。这可能是由于酸性环境影响了VWF多糖的多聚程度，从而促进了血管化进程。这些结果表明HPADN水凝胶能够有效的促进血管再生。

实施例9：多功能水凝胶对于糖尿病小鼠伤口胶原沉积的效果

(2)对固定好的组织进行石蜡包埋切片，进行马松染色。

(3)马松染色被用于观察伤口愈合时的胶原蛋白沉积，如图9所示，治疗7天后，各组均出现不同量的胶原蛋白沉积，而HPADN水凝胶组胶原蛋白沉积量进一步增加。经14天的治疗后，HPADN水凝胶组的胶原蛋白沉积表现得更加致密与健康皮肤相似。定量数据分析显示，HPADN@INS水凝胶组处理的伤口具有最高的胶原密度约为91.09％，而糖尿病DM阳性对照组仅为50.1％。HPADN水凝胶组相比于对照组好的伤口修复效果可能是由于透明质酸和碱性微环境在伤口愈合中起到的作用。表明了HPADN水凝胶能够有效的促进胶原沉积。

数值均以均值±标准差表示，应用SPSS统计学软件分析，采用单因素方差分析和t检验比较各项指标在实验组与对照组之间的差异。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和发明优点。但本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

本发明提供了一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一种多功能水凝胶在制备治疗糖尿病伤口药物中的应用，

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的第一预聚液中酰肼修饰的透明质酸的浓度为0.5～3％g/mL；所述的第二预聚液中醛基修饰的透明质酸的浓度为1～3％g/mL；所述的第三预聚液中多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的浓度为1～3％g/mL；所述的氯化锶水溶液中氯化锶的浓度为0.005％～0.05％g/mL；所述的第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液的体积比为0.5～1：0.5～1：0.5～1。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预交联反应，反应温度为室温，反应时间为1～3min；所述的浸泡，浸泡温度为室温，浸泡时间为1～10min。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多功能水凝胶中，酰肼修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，醛基修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病伤口包括糖尿病给药治疗过程中皮肤产生的伤口和糖尿病相关并发症所引发的伤口。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病相关并发症所引发的伤口包括溃疡、糜烂、坏疽或糖尿病足。