FR3110971A1 - Procédé et système pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte (T) susceptible d’être contenu dans un échantillon. Le procédé comprend : (a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon (E) est mis en présence d’au moins une sonde primaire (1), pour former le cas échéant un complexe primaire (C1), (b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2), lequel au moins un réactif de révélation comprend : - au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321), et - un traceur (21) destiné à convertir le complexe secondaire (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3), de sorte que, dans ledit complexe secondaire (C2), certaines au moins des molécules de ladite étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) sont liées avec ledit traceur (21). Figure pour l’abrégé : 3
Description
Domaine technique de l'invention
La présente invention concerne le domaine des techniques pour l’analyse des échantillons liquides.
Elle concerne en particulier le domaine des procédés et systèmes pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Etat de la technique
Les techniques d’analyse s’intéressent à l'identification et la caractérisation de substances chimiques, dits « analytes », dans un échantillon.
L’analyse mise en œuvre peut être qualitative, lorsque la technique permet une recherche de la présence de l’analyte dans l’échantillon ; cette analyse peut être quantitative, lorsque la technique permet en outre une mesure de la quantité d’analyte dans l’échantillon.
De telles techniques d’analyse englobent notamment les analyses biologiques lorsque l’analyte recherché consiste en un analyte biologique.
Pour un tel usage, la technique d’analyse doit assurer un dosage sélectif et sensible de l’analyte susceptible d’être contenu dans l’échantillon analysé.
Par exemple, la recherche de pathogènes peut s’appuyer sur une propagation par culture avant isolement. Ces méthodes sont efficaces et sensibles mais sont généralement laborieuses et sur un temps long (les résultats sont disponibles généralement seulement après plusieurs jours).
Pour une telle analyse biologique, il existe également des méthodes de biologie moléculaire qui se basent sur l’amplification génétique, typiquement la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ; ces méthodes ont l’intérêt d’être spécifiques, sensibles et rapides. Mais, ces techniques ont besoin de matériel génétique isolé, nécessitant un équipement sophistiqué et couteux.
D’autres outils analytiques s’appuient sur les propriétés de liaison moléculaire spécifique qui sont rencontrées chez des molécules biologiques connues génériquement sous le nom de capteurs biologiques ou biocapteurs (dits encore biosenseurs ou « biosensors »).
De tels biocapteurs sont particulièrement intéressants pour la détermination rapide et efficace de marqueurs, typiquement de marqueurs biologiques, en raison de leur simplicité de mise en œuvre, de leur miniaturisation possible et de leur capacité d'analyse en temps réel.
Un biocapteur possède en effet la capacité de reconnaître un marqueur biologique cible (biomarqueur ou « target biomarker »), caractéristique de l’analyte cible (par exemple un agent pathogène d’intérêt).
Le biocapteur porte pour cela un élément de détection appelé couramment « biorécepteur » (dit encore récepteur biologique ou « biorécepteur »).
De tels biorécepteurs, connus en soi, consistent par exemple en des anticorps monoclonaux, ARN, ADN, glycanes, lectines, enzymes, tissus ou cellules entières.
Le biorécepteur joue un rôle déterminant car ses propriétés biochimiques assurent la sensibilité et la sélectivité dans la détection des biomarqueurs et permettent d’éviter les interférences avec d’autres composés de l’échantillon testé.
L'interaction biochimique spécifique entre le biomarqueur et le biorécepteur est ensuite convertie, grâce à un élément traceur (dit encore transducteur ou « transductor »), en un signal mesurable.
L'enregistrement et l'affichage du signal permettent une identification qualitative, voire quantitative, de l’analyte dans l’échantillon analysé.
Dans une détection « directe », le traceur est porté directement par le biocapteur.
Mais un tel système d’analyse risque de ne pas offrir un signal suffisant pour être détectable.
En effet, une molécule d’analyte est généralement apte à coopérer avec un nombre restreint de molécules de biocapteur / traceur, voire avec une seule molécule de biocapteur / traceur.
Or, dans certaines applications, par exemple les essais visant à détecter une infection d’un patient ou une contamination microbiologique d’un produit, il est nécessaire d’offrir une grande sensibilité au regard des agents pathogènes en présence qui risquent de se propager rapidement avant l'apparition de tout symptôme.
Pour amplifier le signal, certains systèmes d’analyse s’appuient sur une détection en cascade dans laquelle le biorécepteur est lié à un composé amplificateur apte à recevoir plusieurs molécules de traceur.
Cette approche « indirecte » permet alors une fixation indirecte d’une pluralité de molécules de traceur pour une molécule d’analyte.
Il est ainsi toujours intéressant de disposer de nouveaux procédés et systèmes adaptés à déterminer, avec une sensibilité accrue, la présence et/ou la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Présentation de l'invention
La présente invention propose ainsi des procédés et systèmes adaptés à déterminer, avec une sensibilité accrue, la présence et/ou la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Plus particulièrement, on propose selon l’invention un procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Le procédé selon l’invention comprend :
(a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon est mis en présence d’au moins une sonde primaire,
laquelle au moins une sonde primaire est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte pour former le cas échéant un complexe primaire et, d’autre part, une première étiquette d’affinité,
(b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire,
lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité, et
- un traceur destiné à convertir le complexe secondaire en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification,
de sorte que, dans ledit complexe secondaire, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification sont liées avec ledit traceur.
Un tel procédé permet ainsi, par une simple adaptation des systèmes de détection en cascade, une amplification significative du signal de détection.
En effet, en présence de l’analyte, le complexe secondaire obtenu comporte la sonde d’amplification qui constitue avantageusement une interface apte à recevoir une pluralité de molécules de traceur.
En d’autres termes, le procédé selon l’invention permet d’obtenir une fixation indirecte / en cascade, dans laquelle une pluralité de molécules de traceur sont liées à une molécule d’analyte.
Cette nouvelle technologie confère une amélioration de la détection de tout type d’analytes, en particulier d’analytes biologiques (microorganismes, marqueurs de virulence, marqueurs de résistance aux antibiotiques, etc.).
Encore en d’autres termes, l’ajout de la sonde d’amplification dans un système de détection en cascade permet une augmentation significative du signal.
Selon un mode de réalisation avantageux, l’étiquette d’affinité de l’enveloppe de ladite au moins une sonde d’amplification consiste en :
- une première étiquette d’affinité, identique à la première étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde primaire, ou
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde primaire.
Dans le cadre de ce mode de réalisation avantageux, au cours de l’étape de révélation, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés :
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité,
au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité se présentant sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur, et
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau-enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité,
de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité : sonde d’amplification : sondes secondaires,
ladite sonde d’amplification dudit complexe secondaire étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire.
Une partie de ladite seconde étiquette d’affinité de l’étape de révélation est avantageusement dépourvue dudit traceur.
Selon une variante de ce mode de réalisation avantageux, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur,
de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : sonde d’amplification.
D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
- la première étiquette d’affinité est choisie parmi la biotine ou homologue, et la seconde étiquette d’affinité est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine ;
- ladite au moins une sonde d’amplification comprend un noyau formé par une nanoparticule ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm ; la nanoparticule est avantageusement choisie parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice, de préférence encore parmi les nanoparticules composées de silice, avantageusement encore parmi les billes de silice ;
- ladite au moins une sonde d’amplification comporte au moins 20 molécules de ladite étiquette d’affinité ;
- l’enveloppe de ladite au moins une sonde d’amplification comprend des espaceurs, reliant le cœur avec une molécule de première étiquette d’affinité ; les espaceurs sont par exemple choisis parmi les espaceurs nucléiques, par exemple les séquences d’ADN ;
- le traceur est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, photoacoustiques, ou photothermiques ; le cas échéant ladite au moins une sonde secondaire est avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs (conjugués colorés, fluorescents, luminescents) ; les conjugués enzymatiques sont avantageusement choisis parmi les conjugués streptavidine-HRP ou streptavidine-PA, et les réactifs de l’étape de révélation comprennent un substrat desdits conjugués enzymatiques pour une réaction de chimiluminescence en présence dudit complexe secondaire ;
- l’étape de révélation est mise en œuvre en deux phases successives avec une première phase au cours de laquelle est ajoutée ladite seconde étiquette d’affinité, éventuellement au moins une partie sous forme de ladite au moins une sonde secondaire, pour former un premier sous-complexe comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité, puis une seconde phase au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification et ladite au moins une sonde secondaire pour former ledit complexe secondaire, ou une phase unique au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire ;
- le site de liaison de ladite au moins une sonde primaire est choisie parmi les biomolécules, par exemple les sondes nucléiques (séquences ARN, ADN, aptamères), les sondes protéiques (anticorps, enzymes, antigènes, peptides) ;
- préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire, ledit au moins un analyte est fixé sur un support, par exemple pour un procédé du type dot blot, ou sur une sonde de capture, portée par exemple par une bille magnétique pour une technique MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich.
La présente invention concerne aussi l’utilisation d’une sonde du type noyau-enveloppe en tant que sonde d’amplification du signal dans un procédé de détection en cascade pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon, ladite sonde d’amplification comportant une enveloppe qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité.
De préférence, la sonde d’amplification comporte une enveloppe qui comprend plusieurs molécules d’une première étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement chacune à une seconde étiquette d’affinité, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité étant destinée à se présenter sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur.
De manière alternative, la sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, comporte une enveloppe qui comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur.
La présente invention concerne encore le système de réactifs, pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
Le système de réactifs comprend :
- au moins une sonde primaire,
laquelle au moins une sonde primaire est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte et, d’autre part, une première étiquette d’affinité, et
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe partant de la sonde primaire,
lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité, et
- un traceur destiné à convertir le complexe en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification,
de sorte que, dans ledit complexe, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification sont liées à au moins une molécule dudit traceur.
Selon un mode de réalisation préféré, les réactifs de révélation comprennent :
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité,
au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité se présentant sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur (enzyme, fluorophore, radio-isotope, molécule rédox, etc.), et
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau-enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité,
lequel système de réactifs est apte à former, en présence dudit analyte, un complexe comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité : sonde d’amplification : sondes secondaires,
ladite sonde d’amplification dudit complexe secondaire étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, possède une enveloppe qui comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur,
de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : sonde d’amplification.
Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.
Description détaillée de l'invention
De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où :
Il est à noter que, sur ces figures, les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références.
La présente invention concerne des procédés et systèmes pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Par « analyte », on entend toute entité chimique, biochimique ou biologique, que l'on souhaite détecter dans un échantillon.
Cette entité chimique consiste avantageusement en une entité issue du monde vivant, de préférence du monde végétal ou du monde animal, voire encore présent chez l’être humain.
Parmi les analytes détectables par les dispositifs et les procédés selon la présente invention, on citera en particulier les analytes biologiques, notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques.
Par « échantillon », on entend tout échantillon dans lequel l'analyte recherché est en solution ou en suspension.
Cet échantillon peut notamment être tout fluide biologique ou corporel.
L'échantillon peut également avoir été obtenu directement ou indirectement à partir d'un fluide biologique ou corporel.
L'échantillon peut également être un extrait liquide d'un échantillon solide ou gazeux.
L’échantillon est par exemple issu de l’eau, l’air, le sol, les matériaux biologiques (tissus, micro-organismes, organites, récepteurs cellulaires, enzymes, anticorps, acides nucléiques, organismes génétiquement modifiés, ou matériels issus d'OGM, etc.).
Le procédé et le système selon l’invention sont intéressants en ce qu’ils peuvent être adaptés aussi bien à la détermination de la présence d’au moins un analyte, qu’à la détermination de sa quantité.
Par « détecter » ou « déterminer », on entend ainsi la détermination qualitative (avantageusement la présence ou l'absence) d’un ou plusieurs analytes dans un échantillon.
Par « détecter » ou « déterminer », on englobe aussi la mesure et la quantification d’un ou plusieurs analytes dans l’échantillon.
Procédé de détermination
De manière générale, le procédé selon l’invention comprend les étapes successives suivantes :
(a) une étape de reconnaissance A (figure 1) au cours de laquelle l’échantillon E (non représenté) est mis en présence d’au moins une sonde primaire 1 apte à se lier spécifiquement avec l’analyte T pour former le cas échéant un complexe primaire C1,
(b) une étape de révélation B (figures 3 et 7 notamment) au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former un complexe secondaire C2 partant dudit complexe primaire C1.
Selon l’invention, ledit au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (figures 2 et 6), et
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable (figures 3 et 6).
Lors de l’étape de révélation, ledit au moins un réactif de révélation mis en œuvre permet d’obtenir, partant du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 dans lequel certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 sont liées (directement ou indirectement) avec au moins une molécule du traceur 21 (figures 3 et 7).
Pour cela, avant formation du complexe secondaire C2, ledit traceur 21 peut avantageusement présenter deux formes différentes :
- le traceur 21 est un réactif distinct par rapport à ladite au moins une sonde d’amplification 3 ; le traceur 21 est destiné à se lier avec l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 (figure 3 notamment), ou
- le traceur 21 et la sonde d’amplification 3 forment un unique réactif ; le traceur 21 est lié avec l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 (figures 6 et 7).
Le traceur 21, dit encore « marqueur », « transducteur » ou « transductor », est destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable.
Par « traceur », on entend ainsi tout entité permettant une détection directe ou indirecte à l'œil nu, ou à l'aide d'un appareil, en raison de l'émission d'un signal.
Le signal est par exemple une fluorescence, une coloration, une présence d'isotope ou un signal magnétique.
Le traceur 21 peut ainsi être choisi parmi les traceurs classiques en soi. De préférence, ce traceur 21 est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, les particules photoacoustiques ou les particules photothermiques.
Par « lier » ou « liaison », on entend avantageusement :
- toute liaison forte, par exemple covalente (en particulier pour un unique réactif), mais aussi
- toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte ou étiquettes d’affinité (en particulier pour des réactifs distincts).
De préférence, l’étiquette d’affinité 321 de l’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 est choisie parmi :
- une première étiquette d’affinité 321, identique à la première étiquette d’affinité 12 de ladite au moins une sonde primaire 1, ou
- une seconde étiquette d’affinité 321 apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité 12 de ladite au moins une sonde primaire 1.
Dans un premier mode général de réalisation, l’étape de révélation B conduit à ajouter au moins les réactifs de révélation suivants :
- une seconde étiquette d’affinité 5 apte à se lier spécifiquement avec ladite sonde primaire 1, dont au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité 5 se présentant sous la forme d’une sonde secondaire 2 munie d’un traceur, et
- au moins une sonde d’amplification 3.
Lors de cette étape de révélation, les réactifs de révélation 2, 3, 5 mis en œuvre permettent l’obtention, partant du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2 est en particulier liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 (portant le traceur) est liée à une molécule d’analyte T.
Cette structure offre alors une amplification significative du signal obtenu pour chaque molécule d’analyte T en présence, grâce à la multiplication des sondes secondaires 2 composant le complexe secondaire C2 (rapportées sur la sonde d’amplification 3).
Dans un second mode général de réalisation, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321 dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21.
Lors de cette étape de révélation, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre permet l’obtention, partant du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de traceur 21 est liée à une molécule d’analyte T.
Cette structure offre alors une amplification significative du signal obtenu pour chaque molécule d’analyte T en présence, grâce à la multiplication des traceurs 21 portés par la sonde d’amplification 3.
Tel que développé ci-après, pour obtenir ce complexe secondaire C2, les réactifs de révélation sont assemblés en cascade par des liaisons moléculaires spécifiques s’appuyant sur des étiquettes d’affinité complémentaires.
Les réactifs mis en œuvre dans le procédé comprennent pour cela avantageusement au moins un couple d’étiquettes d’affinité, voire un unique couple d’étiquettes d’affinité.
De manière générale, par « étiquettes d’affinité », on entend avantageusement un couple d’entités chimiques, biochimiques ou biologiques, qui sont aptes à se lier spécifiquement l’une avec l’autre, pour former un complexe.
De tels « étiquettes d’affinité » englobent notamment les ligands biologiques choisis parmi les peptides et les oligonucléotides.
Par exemple, et tel que développé par la suite, les étiquettes d’affinité sont choisies parmi le couple :
- la biotine (dite encore « biotin » ou « biot » dans les exemples) ou homologue, d’une part, et
- la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine, Captavidine, d’autre part.
Les étapes de ce procédé de détermination, y compris les réactifs mis en œuvre, sont décrits plus en détails ci-après.
Etape de
reconnaissance
A
Au cours de l’étape de reconnaissance A, l’échantillon E est ainsi mis en présence de ladite au moins une sonde primaire 1 formant un biocapteur.
Tel qu’illustré schématiquement sur les figures 1 et 5, ladite au moins une sonde primaire 1 consiste pour cela en un conjugué comprenant :
- un site de liaison 11, formant encore « biorécepteur » ou élément de reconnaissance, apte à se lier spécifiquement avec l’analyte T pour former le cas échéant le complexe primaire C1, et
- une première étiquette d’affinité 12.
Ladite au moins une sonde primaire 1, et en particulier son site de liaison 11, consiste en toute entité chimique, biochimique ou biologique, qui est apte à se lier spécifiquement à l’analyte T pour former le complexe primaire C1 (avantageusement binaire).
Par « lier » ou « liaison », on entend toute liaison forte, par exemple covalente, mais aussi toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte.
Une telle sonde primaire 1, et en particulier son site de liaison 11, est ainsi avantageusement choisie parmi les biomolécules, à savoir par exemple :
- les sondes protéiques (figure 1), englobant les anticorps, les enzymes, les antigènes, les peptides, ou
- les sondes nucléiques (figure 5), englobant les séquences ARN, les séquences ADN, les aptamères.
La sonde primaire 1 (et en particulier son site de liaison 11) est choisie pour ses propriétés de liaison spécifique à l'analyte T, comme par exemple un couple ligand/anti-ligand, un couple antigène/anticorps, un couple ADN/ARN ou un couple ADN/ADN.
Ainsi, si l'analyte est un antigène ou un haptène, le site de liaison 11 est avantageusement un anticorps spécifique de l'analyte.
Par « anticorps spécifique de l'analyte », on entend un anticorps capable de se lier spécifiquement avec l'analyte dans une liaison de type antigène/anticorps.
Il s'agit typiquement d'un anticorps polyclonal ou d’un anticorps monoclonal, ayant une forte affinité pour l'analyte. De préférence, il s'agit d'un anticorps monoclonal.
Si l'analyte est un acide nucléique, le site de liaison 11 est avantageusement une sonde ADN complémentaire.
De manière générale, les paramètres (temps d’incubation, rinçage, etc.) sont ajustés à façon, de sorte à autoriser la formation du complexe primaire C1 en présence de l’analyte T.
Par ailleurs, la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1 est avantageusement choisie parmi la biotine ou homologue.
De manière générale, le site de liaison 11 et la première étiquette d’affinité 12 sont avantageusement liés par des liaisons covalentes.
Préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire 1, ledit au moins un analyte T peut être fixé :
- sur une sonde de capture 6 (figure 4), portée par exemple par une bille magnétique B pour une technique dite MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich, ou
- sur un support S (figure 5), par exemple pour un procédé du type dot blot.
En particulier, la sonde de capture 6 précitée consiste en toute entité chimique, biochimique ou biologique, qui est apte à se lier spécifiquement à l’analyte T.
Par « lier » ou « liaison », on entend toute liaison forte, par exemple covalente, mais aussi toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte.
Une telle sonde de capture 6, et en particulier son site de liaison, est ainsi avantageusement choisie parmi les biomolécules, à savoir par exemple :
- les sondes protéiques, englobant les anticorps, les enzymes, les antigènes, les peptides, ou
- les sondes nucléiques, englobant les séquences ARN, les séquences ADN, les aptamères.
La sonde de capture 6 (et en particulier son site de liaison) est choisie pour ses propriétés de liaison spécifique à l'analyte T, comme par exemple un coupe ligand/anti-ligand, un couple antigène/anticorps, un couple ADN/ARN ou un couple ADN/ADN.
Par « dot blot », on englobe les techniques de transfert de molécules permettant de vérifier la présence de molécules spécifiques dans un milieu, y compris le southern blot pour l'ADN, le northern blot pour les ARN ou le western blot pour les protéines.
Par « dot blot », on englobe également le transfère les acides nucléiques (ADN ou ARN) depuis un milieu liquide directement sur une membrane, sans séparation préalable (donc sans électrophorèse préalable).
Le transfert peut être réalisé par diffusion simple, par diffusion dans champ électrique (électrodiffusion) ou par aspiration sous vide.
Etape de révélation B
L’étape de révélation B est mise en œuvre de manière à détecter, au moyen d’au moins un réactif de révélation, les éventuels complexes primaires C1 générés au cours de l’étape de reconnaissance A.
Au cours de cette étape de révélation B, ledit au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (figures 2 et 6), et
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable (figures 3 et 6).
Selon un mode de réalisation décrit ci-après en relation avec les figures 1 à 5, au cours de cette étape de révélation B, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés (avantageusement distincts) :
- la seconde étiquette d’affinité 5, dont au moins une partie se présente sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2, et
- ladite au moins une sonde d’amplification 3.
La seconde étiquette d’affinité 5 est apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité qui est portée par la sonde primaire 1 ou, comme développé par la suite, par ladite au moins une sonde d’amplification 3.
Ainsi, dans le cas d’une première étiquette d’affinité du type biotine, la seconde étiquette d’affinité 5 est avantageusement choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine ou NeutrAvidine ou Captavidine.
Dans cette étape de révélation B, la seconde étiquette d’affinité 5 peut se présenter :
- uniquement sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 (c’est-à-dire conjuguée avec un traceur 21), ou
- en partie sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 et en partie sous une forme libre (c’est-à-dire dépourvue du traceur 21).
Par exemple, dans le cas d’une seconde étiquette d’affinité 5 avec un mélange des deux formes, la seconde étiquette d’affinité 5 sous forme libre peut représenter de 10 à 50%, de préférence encore de 20 à 50%, des molécules de seconde étiquette d’affinité 5.
La sonde secondaire 2 précitée consiste en un réactif de détection sous la forme d’un conjugué comprenant :
- un traceur 21, et
- une étiquette d’affinité 22 qui est constituée par la seconde étiquette d’affinité 5 précitée.
Dans un souci de simplicité, cette étiquette d’affinité de la sonde secondaire 2 est désignée indifféremment par les repères 5 ou 22 et peut encore être dénommée « seconde étiquette d’affinité ».
Le traceur 21 peut ainsi être choisi parmi les traceurs classiques en soi. De préférence, ce traceur 21 est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, les particules photoacoustiques, ou les particules photothermiques.
Ladite au moins une sonde secondaire 2 est ainsi avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs.
Par « conjugués enzymatiques », on englobe les conjugués avec les enzymes HRP (peroxydase de raifort) ou PA (phosphatase alcaline).
Dans ce cas, les réactifs de l’étape de révélation B comprennent avantageusement un substrat 4 pour les conjugués enzymatiques en vue d’une réaction de chimiluminescence en présence du complexe secondaire C2.
Le substrat 4, classique en soi, peut ainsi être choisi parmi par exemple les composés suivants :
- les substrats chromogènes (TMB, ABTS, OPD), fluorescents (ADHP) ou chimiluminescents (Luminol) pour la HRP,
- les substrats chromogènes (pNPP), fluorescents (MUP, FPD) ou chimiluminescents (VisiGlo) pour la PA.
Par « conjugués photoactifs », on englobe les conjugués colorés, les conjugués fluorescents, les conjugués luminescents.
Selon un mode de réalisation préféré et dans le cas d’une première étiquette d’affinité du type biotine, ladite au moins une sonde secondaire 2 consiste en un conjugué enzymatique choisi par exemple parmi les conjugués streptavidine-HRP (peroxydase de raifort) ou streptavidine-PA (phosphatase alcaline).
Par ailleurs, tel que représenté schématiquement sur la figure 2, ladite au moins une sonde d’amplification 3 est du type noyau 31 (dit encore « cœur ») - enveloppe 32.
L’enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (désignée également « première étiquette d’affinité 321 ») qui est identique à la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1.
Pour une amplification optimale du signal, ladite au moins une sonde d’amplification 3 comporte avantageusement au moins 20 molécules de ladite première étiquette d’affinité 321.
Ces molécules de ladite première étiquette d’affinité 321 sont aptes à se lier spécifiquement avec au moins une molécule de la seconde étiquette d’affinité 5, 22, à savoir :
- une seconde étiquette d’affinité 22 sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 (c’est-à-dire conjuguée avec un traceur 21), ou
- une seconde étiquette d’affinité 5 libre (c’est-à-dire dépourvue du traceur 21).
L’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 comprend encore avantageusement des espaceurs 322 qui relient le noyau 31 avec une molécule de première étiquette d’affinité 321.
De tels espaceurs 322 visent à écarter les molécules de première étiquette d’affinité 321 par rapport au noyau 31 et les unes par rapport aux autres, limitant ainsi les problèmes d’encombrement stérique lors de l’étape de révélation B.
Cette structure permet ainsi de libérer l’environnement des premières étiquettes d’affinité 321, et d’augmenter le nombre de molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 qui est lié simultanément avec la sonde d’amplification 3. Cet agencement permet aussi une meilleure présentation des premières étiquettes d’affinité 321, favorisant ainsi la réaction de reconnaissance (avantageusement augmentation de la probabilité de réaction) avec ladite au moins une sonde secondaire 2.
Les espaceurs 322 sont avantageusement choisis parmi les espaceurs nucléiques, par exemple les séquences d’ADN (par exemple une séquence dT10-PEG2-dT10).
Le noyau 31 est quant à lui avantageusement formé par une nanoparticule 31 (dite encore « NP » dans les exemples) ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm.
La taille des particules est définie comme leur plus grande taille et pourra être mesurée grâce à un microscope électronique à balayage ou un microscope optique. La taille des objets de forme hétérogène est définie comme la longueur du côté le plus grand de l'objet.
La nanoparticule 31 est choisie avantageusement parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice (y compris le silicate).
De préférence encore, de telles nanoparticules sont encore choisies parmi les nanoparticules composées de silice (voire de silicate), avantageusement encore parmi les billes de silice.
Plus généralement, les nanoparticules peuvent être choisies parmi les nanoparticules de silice (dites encore « Si-NP »), d'or, d'argent, de graphite, des nanocristaux fluorescents (également nommés quantum dots), des nanoparticules de polymère du type polystyrène, polypropylène ou polybutadiène, ou des nanoparticules d'oxyde métallique, notamment d'oxyde d'étain, de gadolinium, d'aluminium, de titane, de cérium, de niobium d'erbium, d'ytterbium, de terbium, de dysprosium, d'europium, ou d'un mélange de ces oxydes, éventuellement enrobées pour permettre leur fonctionnalisation.
Pour la fabrication d’une telle sonde d’amplification 3 conforme à l’invention, l’homme du métier peut s’appuyer par exemple sur le document WO-2013 007944, le document Knopp et al. (Review: Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles ; Analytica Chimica Acta 647 (2009) 14–30) ou le document Sivakumar et al. (Silica-Coated Ln3+- Doped LaF3Nanoparticles as Robust Down- and Upconverting Biolabels ; Chem. Eur. J. 2006, 12, 5878 – 5884).
En présence du complexe primaire C1 (correspondant à la présence de l’analyte T dans l’échantillon E) et au moyen des réactifs précités, l’étape de révélation B est mise en œuvre dans des conditions adaptées à générer le complexe secondaire C2 (en cascade) comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée) : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2, portant une pluralité de molécules de première étiquette d’affinité 321, est ainsi avantageusement liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 (via leurs secondes étiquettes d’affinité 22).
Cette configuration permet alors une amplification significative du signal, avec une pluralité de molécules de la sonde secondaire 2 (destinées à produire un signal) pour une molécule d’analyte T.
En pratique, l’étape de révélation B peut prendre deux formes de réalisation alternatives.
Selon une première forme de réalisation, l’étape de révélation B est mise en œuvre en deux phases successives avec :
- une première phase B1 au cours de laquelle est ajoutée la seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée) pour former un premier sous-complexe (en cascade) comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée),
puis
- une seconde phase B2 au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification 3 et ladite au moins une sonde secondaire 2 pour former ledit complexe secondaire C2 décrit dessus.
La seconde phase B2 peut elle-même être divisée en deux opérations successives (ajout successif des réactifs de révélation) :
- une première opération avec ajout de ladite au moins une sonde d’amplification 3, destinée à se fixer avec les secondes étiquettes d’affinité 5 (libre ou conjuguées) du premier sous-complexe, puis
- une seconde opération avec ajout de ladite au moins une sonde secondaire 2, destinée à se fixer avec ladite au moins une sonde d’amplification 3 pour former ledit complexe secondaire C2.
De manière alternative, cette première forme de réalisation comprend une phase de préparation au cours de laquelle ladite au moins une sonde d’amplification 3 est liée avec la sonde secondaire 2 (au moyen de leurs étiquettes d’affinité 321, 22), pour former un complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2.
Dans ce cas, la seconde phase B2 est mise en œuvre en ajoutant directement le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 qui est destiné à se lier avec les secondes étiquettes d’affinité 5 (libre ou conjuguée) du premier sous-complexe.
Selon une seconde forme de réalisation, l’étape de révélation B est mise en œuvre en une phase unique au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire C2.
Pour cela, le procédé comprend avantageusement une phase de préparation au cours de laquelle ladite au moins une sonde d’amplification 3 est liée avec plusieurs molécules de sondes secondaires 2 (au moyen de leurs étiquettes d’affinité 321, 22), pour former un complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2.
Dans ce cas, l’étape de révélation B est mise en œuvre en ajoutant directement le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 qui est destiné à se lier avec la sonde primaire 1 si elle est toujours présente.
En l’espèce, le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 se lie avec la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1, cela par l’intermédiaire des secondes étiquettes d’affinité 5, 22 (libre ou conjugué).
Dans cette approche, la première phase B1 précitée ne serait plus nécessaire.
Selon une variante de réalisation décrite ci-après en relation avec les figures 6 et 7, au cours de cette étape de révélation B, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre est similaire à celle décrite ci-dessus en relation avec les figures 1 à 5 en ce qu’elle est du type noyau 31 - enveloppe 32 avec une enveloppe 32 qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321.
Cette sonde d’amplification 3 se distingue en ce que l’enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une seconde étiquette d’affinité 321 qui est complémentaire de la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1.
Et certaines au moins des molécules de seconde étiquette d’affinité 321 sont liées à au moins une molécule du traceur 21 (figure 6).
Par exemple et sans être limitatif, au moins 50% des molécules de seconde étiquette d’affinité 321 sont liées à au moins une molécule du traceur 21.
Par « lié », on entend ici avantageusement une liaison fort, de préférence une liaison covalente.
Le couple seconde étiquette d’affinité 321 / traceur 21 est ainsi avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs, greffés sur la sonde d’amplification 3.
Par « conjugués enzymatiques », on englobe les conjugués avec les enzymes HRP (peroxydase de raifort) ou PA (phosphatase alcaline).
Pour une amplification optimale du signal, ladite au moins une sonde d’amplification 3 comporte avantageusement au moins 20 molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321.
La seconde étiquette d’affinité 321 est apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité 12 qui est portée par la sonde primaire 1.
Ainsi, dans le cas d’une première étiquette d’affinité 12 du type biotine, la seconde étiquette d’affinité 321 est avantageusement choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine ou NeutrAvidine ou Captavidine.
Les autres caractéristiques techniques générales de la sonde d’amplification 3 (notamment espaceurs 322, noyau 31, procédé de fabrication), développés ci-dessus en relation avec les figures 1 à 5, s’appliquent dans le présent mode de réalisation.
En particulier, l’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 comprend encore avantageusement des espaceurs 322 qui relient le noyau 31 avec une molécule de seconde étiquette d’affinité 321.
En présence du complexe primaire C1 (correspondant à la présence de l’analyte T dans l’échantillon E) et au moyen du réactif de révélation précité, l’étape de révélation B est mise en œuvre dans des conditions adaptées à générer le complexe secondaire C2 (en cascade) comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2 porte une pluralité de conjugués seconde étiquette d’affinité 321 / traceur 21.
Cette configuration permet alors une amplification significative du signal, avec une pluralité de molécules de traceur 21 (destinées à produire un signal) pour une molécule d’analyte T.
L’étape de révélation B est alors avantageusement mise en œuvre en une phase unique au cours de laquelle est ajoutée la sonde d’amplification 3 pour la formation du complexe secondaire C2.
Dans ce cas, l’étape de révélation B est mise en œuvre en ajoutant directement la sonde d’amplification 3 qui est destiné à se lier avec la sonde primaire 1 si elle est toujours présente.
En l’espèce, la sonde d’amplification 3 se lie avec la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1, cela par l’intermédiaire des secondes étiquettes d’affinité 321.
De manière générale, tout au long de l’étape de révélation B, les conditions et paramètres (temps d’incubation, rinçage, etc.) sont ajustés de sorte à assurer la formation des différents complexes attendus.
Pour être complet, l’étape de révélation B comprend encore avantageusement une phase finale de lecture au cours de laquelle :
- l’analyte T est détecté (présence de l’analyte T dans l’échantillon E), lorsqu’un signal est détecté du fait de la formation du complexe secondaire C2 comprenant le traceur 21, ou
- l’analyte T n’est pas détecté (absence de l’analyte T dans l’échantillon E), lorsque le signal n’est pas détecté du fait de l’absence de formation du complexe secondaire C2 et de l’élimination du traceur 21.
Système de réactifs
La présente invention concerne encore le système de réactifs, ou kit, pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
Un tel système de réactifs comprend avantageusement :
- ladite au moins une sonde primaire 1,
laquelle au moins une sonde primaire 1 est un conjugué comprenant, d’une part, le site de liaison 11 apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte T et, d’autre part, la première étiquette d’affinité 12,
et
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe C2 partant de la sonde primaire 1,
lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321, et
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe C2 en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur 21 étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3,
de sorte que, dans ledit complexe C2, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21.
Selon un mode de réalisation préféré, les réactifs de révélation comprennent :
- ladite seconde étiquette d’affinité 5 apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité 12,
au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité 5 se présentant sous la forme de ladite sonde secondaire 2 consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité 5 et, d’autre part, le traceur 21, et
- ladite au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité 12.
Tel que développé dessus, un tel système de réactifs est apte à former, en présence dudit analyte T, un complexe C2 selon l’invention qui comprend analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe C2 porte alors avantageusement plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2.
Selon un mode de réalisation avantageux précité, la première étiquette d’affinité 12 est choisie parmi la biotine ou homologue (par exemple une nanoparticule de silice portant des molécules de biotine, dit encore « biotin-Si-NP » ou « biotin-nanoparticle » dans les exemples). Et la seconde étiquette d’affinité 5 est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine.
De manière alternative, un tel système de réactifs comprend avantageusement :
- ladite au moins une sonde primaire 1,
laquelle au moins une sonde primaire 1 est un conjugué comprenant, d’une part, le site de liaison 11 apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte T et, d’autre part, la première étiquette d’affinité 12,
et
- une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321 dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21.
Lors de cette étape de révélation, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre permet l’obtention, partant du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de traceur 21 est liée à une molécule d’analyte T.
Selon un mode de réalisation avantageux précité, la première étiquette d’affinité 12 est choisie parmi la biotine ou homologue. Et la seconde étiquette d’affinité 321 est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine.
De manière générale, le système de détection selon l’invention peut tout-à-fait être adapté à l’analyte T recherché.
Par exemple, le système de détection est avantageusement sous forme dot blot pour la recherche d’un analyte du genre acide nucléique (voir figure 6).
Dans ce cas, le site de liaison 11 de la sonde primaire 1 est avantageusement une sonde ADN complémentaire, de préférence couplé à la biotine.
Le système de détection est avantageusement sous forme ELISA ou MELISA pour la recherche d’un analyte du genre antigène ou haptène (voir figures 1 et 4).
Dans ce cas, le site de liaison 11 de la sonde primaire 1 est avantageusement un anticorps spécifique de l'analyte, de préférence couplé à la biotine.
Pour une technique MELISA, le système comprend encore avantageusement une sonde de capture 6 précitée, portée par exemple par une bille magnétique B.
Bien entendu, diverses autres modifications peuvent être apportées à l’invention dans le cadre des revendications annexées.
Exemples
1. Exemple 1 : Procédé de fabrication d’une sonde d’amplification
1.1. Matériel et Méthode
Des Si-NP (nanoparticules de silice) ont été fonctionnalisées à l’aide d’une technologie innovante de synthèse en phase solide qui permet la fonctionnalisation de particules de taille nanométrique avec des fragments d’DNA, comme rapporté précédemment (Bonnet et al, Analyst 2018, Issue 10, 2018; De Crozals et al, RSC Advances, 2012, 2, 11858-11866).
En bref, l’immobilisation des nanoparticules sur du verre à porosité contrôlée (CPG, Controlled Pore Glass) permet une fonctionnalisation très élevée avec un lieur à base d’oligonucléotide modifié. Le lieur (séquence: dT10-PEG2-dT10) a été synthétisé en utilisant un synthétiseur d’ARN/ADN Applied Biosystems 394 (Applied Biosystems).
Après la greffe des nanoparticules sur le support de CPG, elles ont été fonctionnalisées par synthèse automatisée en utilisant la chimie des phosphoramidites.
Premièrement, le lieur, qui permet une meilleure accessibilité des fonctions d’intérêt, a été synthétisé.
Deuxièmement, le groupe biotine a été incorporé.
Nous avons contrôlé l’incorporation de biotine pour atteindre un rendement de couplage de 10%. Pour cela, on a utilisé des solutions diluées de biotine phosphoramidite (10 mM) et de tétrazole dans l’acétonitrile (45 mM) et on a réduit le temps de couplage à 10 s. L’incorporation de biotine a été contrôlée à 498 nm à l’aide de la quantification du diméthoxytrityle par un spectrophotomètre UV-visible.
Troisièmement, les biotine-Si-NP ont été libérées du CPG par incubation du support dans 1mL de DBU à 0,1% (m/v) dans un mélange eau-acétonitrile 1/1 (v/v). La solution de DBU a été agitée dans un thermomélangeur à 22°C pendant 1 heure avant d’être récupérée.
On a ajouté toutes les heures une solution fraîche de DBU à la suspension de CPG. La cinétique de libération a été suivie en quantifiant la concentration en NP (nanoparticules) de chaque solution de DBU par une mesure de l’UV-visible à 560 nm. Les nanoparticules libérées ont été lavées avec de l’eau milli-Q (1x 4mL puis 3x2 mL) et concentrées sur un filtre 30K Amicon Ultra (5000g, 10 min). Enfin, la quantité de brins dT10-PEG2-dT10-10% Biotine par NP a été estimée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible Varian Cary 100 Bio (Agilent Technologies) en utilisant une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique.
Les nanoparticules ont été libérées du CPG en faisant incuber le support dans 1mL d’une solution à 0,1% (m/v) de DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène) dans un mélange eau-acétonitrile 1/1 (v/v). La solution de DBU a été agitée dans un thermomélangeur à 22°C pendant 1 heure avant d’être récupérée. On a ajouté toutes les heures une solution fraîche de DBU à la suspension de CPG. La cinétique de libération a été suivie en quantifiant la concentration en nanoparticules de chaque solution de DBU par une mesure de l’UV-visible à 560 nm. Les nanoparticules libérées ont été lavées avec de l’eau (1x 4mL puis 3x2 mL) et concentrées sur un filtre 30K Amicon Ultra (5000g, 10 min).
La quantité de brins par NP a été estimée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible Varian Cary 100 Bio (Agilent Technologies) en utilisant une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique. La quantité de lieur greffé sur les nanoparticules a été quantifiée en mesurant l’absorbance dans l’eau (200µL) à 260 nm et 560 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque (Perkin Elmer). La concentration en nanoparticules a été estimée de la manière décrite précédemment par Bonnet et al. (Analyst 2018). Pour correspondre à cette estimation, nous avons établi un coefficient d’extinction molaire approximatif à 163200 M-1 cm-1 qui tient compte des epsilons des différentes parties de la séquence corrigés par leur rendement de couplage correspondant.
Les NP fonctionnalisées ont été observées au microscope électronique à transmission (MET) en utilisant un appareil Philips CM120 fonctionnant à une tension d’accélération de 120kV (Centre Technologique des microstructures, Lyon). Les Si-NP ont été observées après dépôt de 5µL de solution diluée sur une grille de cuivre recouverte de Formvar-carbone et évaporation à sec.
1.2. Résultats
Les Biotine-Si-NP ont été préparées grâce à une technologie innovante de synthèse en phase solide qui a permis une fonctionnalisation très élevée (Crozals et al., RSC Adv. 2012, 2, 11858-11866). Un groupe hydroxyle a été fixé à la surface des Si-NP par silanisation comme rapporté précédemment (Farre et al., Langmuir, 2010; Bonnet et al, Analyst 2018). Les fonctions hydroxyle ont servi de support à la synthèse de lieur oligonucléotidique à la surface des NP. Dans l’étape finale, des groups biotine ont été greffés au lieur comme expliqué dans Matériel et Méthodes. Les observations au MET ont montré que la morphologie des NP restait stable durant la synthèse. Les biotine-Si-NP fonctionnalisées avaient une dimension moyenne de 50 ± 3 nm, telle qu’estimée à partir des images de MET. Selon les mesures d’absorbance, la quantité de lieur était d’environ 500 par NP. Par ailleurs, la quantification du diméthoxytrityle a établi le rendement de couplage de la biotine à 10%, ce qui a permis de quantifier la biotine à environ 50 par NP.
Une distribution granulométrique relativement étroite des NP fonctionnalisées a été confirmée par des mesures de DLS. Les Si-NP formaient des solutions aqueuses monodispersées de particules ayant un diamètre hydrodynamique (RH) de 90 nm environ. La conjugaison de la biotine + groupements lieurs a décalé le RH à environ 120 nm. Cette augmentation est probablement liée à la couche d’hydratation autour des unités de biotine liées aux bras portant des groupes chargés négativement. Les solutions de biotine-Si-NP restaient stables à 4°C pendant au moins deux mois.
2. Exemple 2 : Stratégie de double reconnaissance pour une détection sensible du virus de la grippe A en utilisant des nanoparticules enrobées de biotine et des billes
immunomagnétiques
2.1 Matériel et Méthodes
2.1.1. Réactifs
La sérumalbumine bovine (SAB), le sérum de Bradford, le réactif colorimétrique pour dosage ELISA TMB (3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine), le Tween 20, la HRP-Streptavidine, le tampon B de Dosage ELISA 5X/Diluant d’Echantillon et les produits chimiques de haute qualité ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). La solution saline tamponnée au phosphate (STP) 10x a été fournie par Dominique Dutscher (Brumath, France). Le chlorure de sodium a été acheté chez Laurylab (Brindas, France). Les tampons ont été préparés avec de l’eau déminéralisée et stérilisés par filtration 0,22µm.
Les Dynabeads® M-280 Tosylactivated et DSB-XTM Biotin Protein Labelling Kit (D-20655) proviennent respectivement de chez Invitrogen et Molecular Probes, (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les anticorps anti- NuP d’Influenza A(9G8) et (5D8) proviennent de chez Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz, CA, USA). Les nanoparticules de silice recouvertes de rhodamine ont été fournies par Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Les oligonucléotides ont été synthétisés en utilisant un synthétiseur d’ADN/ARN Applied Biosystems 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les synthons au phosphoramidite: Biotine-TEG-phosphoramidite (1-diméthoxytrityloxy-3-O-(N-biotinyl-3-aminopropyl)-triéthylèneglycolyl-glycéryl-2-O-(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite); Espaceur phosphoramidite 9 (9-O-diméthoxytrityl-triéthylèneglycol,1-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite); dT-CE phosphoramidite (5'-diméthoxytrityl-2'-désoxythymidine,3'-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite) et tous les réactifs de synthèse ont été achetés chez Glen Research (Sterling, Virginie).
2.1.2. Expression et production de nucléoprotéine
Le gène de nucléoprotéine (NuP) de pleine longueur du virus de la grippe H1N1 (souche A/WSN/33) avec une étiquette 6-His à son extrémité C-terminale a été cloné dans le vecteur d’expression pET22 d’Escherichia coli(Novagen) et exprimé dans les cellules d’E. coliBL-21 Rosetta DE3 (Stratagene). Les cellules transformées ont été cultivées à 37°C dans 100 ml de milieu de Luria-Bertani contenant de l’ampicilline jusqu’à la phase exponentielle médiane, puis induites pendant 4 heures par addition d’isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1 mM à 37°C sous agitation. On a procédé à la purification de la NuP. En bref, après centrifugation, le culot bactérien a été remis en suspension dans un tampon de lyse (Tris 20 mM à pH 7,4 avec du NaCl (50 mM ou 300 mM), imidazole 5 mM, Triton à 1% et 1 mg/ml de lysozyme), soumis à des ultrasons et traité avec de la RNAse A à 0,15 mg/ml à 35 °C pendant 20 min en présence d’ions Mg2+10 mM. La protéine a été purifiée par chromatographie d’affinité en utilisant des billes magnétiques de Ni (PureProteome, Millipore), en suivant le mode opératoire recommandé par le fabricant. La NuP a ensuite été dialysée contre du tampon Tris (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,5). Après dialyse, la concentration en protéine a été déterminée en utilisant un coefficient d’extinction ε de 56 200 M−1cm−1à 280 nm.
2.1.3. Souches virales
Le virus de la grippe A/WSN/33 (H1N1) a été obtenu par génétique inverse et amplifié sur des cellules MDCK. Les virus ont été titrés par la méthode des plages. Les virus purifiés ont été inactivés à la lumière UV pendant 38 min. L’efficacité d’inactivation a été vérifiée par une nouvelle infection des cellules MDCK. Des échantillons d’Influenza A/H1 inactivés ont été conservés à -80°C. De l’Influenza A/UDORN/72 (H3N2) a été propagé sur un œuf de poulet embryonnaire et appliqué à des cellules MDCK. Les virus ont été titrés par la méthode des plages. Les virus purifiés ont été inactivés en utilisant de l’éthylèneimine binaire (BEI) et conservés à −80 °C.
Le virus du syndrome dysgénésique respiratoire porcin (VSDRP) Flanders13 (13V09) utilisé dans cette étude a été gracieusement fourni par le Dr. Nicolas Bertho (INRA, France) et le Dr. Fanny Blanc (INRA, France).
Avant l’inactivation, les concentrations virales ont été déterminées en termes d’infection des cellules MDCK. Les titres initiaux des virus étaient de 108PFU/mL pour l’échantillon 1 de H1N1, 1,5 108PFU/mL pour l’échantillon 2 de H1N1, 108PFU/mL pour H2N3. Le virus VSDRP témoin a été titré à 107PFU/mL.
2.1.4. Fonctionnalisation des billes magnétiques
Des billes magnétiques activées au tosyle de 2,8 µm de diamètre (Dynabeads™ M-280, Invitrogen, US) ont été recouvertes de 10 µg d’anticorps anti- NuP d’Influenza A(9G8) par mg de billes pendant 1 heure sous agitation modérée, selon le protocole recommandé par le fabricant. Ensuite, après 15 minutes de passivation dans du tampon à la SAB (phosphate de sodium 0,1M, chlorure de sodium 150mM, SAB à 0,5% (p/v), pH 7,6), les billes magnétiques ont été lavées trois fois dans du phosphate de sodium 0,01 M, du chlorure de sodium 150 mM, de la SAB à 0,1% (p/v), pH 7,4 et stockées à 4°C jusqu’aux essais.
2.1.5. Protocole MELISA pour la détection de virus désactivés
1.106billes magnétiques préalablement recouvertes d’anticorps anti-NuP d’Influenza A(9G8) ont été tout d’abord lavées trois fois avec du tampon STP. Des solutions de virus désactivés (STP, 10% de salive) ont été mises à incuber avec les billes sous agitation modérée à température ambiante pendant 1 heure. Les billes ont été concentrées au moyen d’un aimant et lavées trois fois avec du Tampon de lavage 0.1. On a ajouté à la suspension, de l’anticorps anti-biotine conjugué (0,5 µg/ml) dans un Tampon de capture (STP, tween 0,1%, SAB 0,1%) avant une agitation modérée pendant 1 heure. Après trois étapes de lavage, on a ajouté une solution de révélation de Streptavidine/HRP (100µL, 1µg/mL) et on a agité le mélange à température ambiante pendant 30 minutes à 1000rpm dans un thermomélangeur. Les billes ont été lavées trois fois avec le Tampon de lavage 0.1 avant l’ajout de 100µL de TMB et une incubation dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Enfin, on a dilué le surnageant avec 100 µL d’acide sulfurique 2M et on a lu l’absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques (Perkin Elmer). A450nm- A550nma donné la bonne valeur après suppression du signal de fond.
Pour le protocole MELISA utilisant une amplification de biotine-NP, le même protocole a été utilisé pour la capture d’antigène. Ensuite, les deux étapes suivantes ont été ajoutées pour la détection: des biotine-NP (1.1011NP/mL dans STP, Tween 20 à 0,1% (v/v)) ont été ajoutées à la suspension de billes magnétiques avant une incubation pendant 30 minutes à 1000 rpm dans un thermomélangeur. Après trois étapes de lavage, on a ajouté une solution de révélation de streptavidine/HRP (100µL, 1µg/mL) avant l’incubation de la suspension à température ambiante pendant 30 minutes à 1000 rpm dans un thermomélangeur. Les billes ont été lavées trois fois avec le Tampon de lavage 0.1 avant l’ajout de 100µL de TMB et une incubation dans l’obscurité pendant 5 minutes à température ambiante. Enfin, on a dilué le surnageant avec 100 µL d’acide sulfurique 2M et on a lu l’absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques (Perkin Elmer). A450nm- A550nma donné la bonne valeur après suppression du signal de fond.
2.2. Résultats et discussion
2.2.1. MELISA aux Biotine-NP pour une détection sensible du virus de la grippe A
Pour améliorer les performances du dosage MELISA et pousser les limites de détection encore plus loin, nous avons développé les biotine-NP pour amplifier le signal positif dans l’étape de détection.
Des nanoparticules de silice de 50 nm de diamètre ont été fonctionnalisées en surface avec un brin oligonucléotidique portant un groupe biotine à son extrémité.
Les NP ont d’abord été immobilisées sur un support de verre à porosité contrôlée (CPG). Le support Nano-on-Micro (NOM) assemblé résultant a été caractérisé par MEB (Microscopie Electronique à Balayage). Ensuite, le matériau NOM a été utilisé dans un synthétiseur d’ADN/ARN pour réaliser la fonctionnalisation des NPviachimie des phosphoramidites. Cette stratégie a permis d’obtenir des nanoparticules hautement fonctionnalisées. Un espaceur oligonucléotidique (séquence ODN: dT10-PEG2-dT10) a été synthétisé sur les NP afin d’éloigner les biotines de la surface des NP. Environ 500 ODN par NP ont été estimées en mesurant l’absorbance UV à 260 nm et 560 nm et en quantifiant le ratio ODN par NP dans la suspension, un protocole décrit par Bonnet et al. (Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: Application to the sensitive detection of bacteria in human platelet concentrates. Analyst. 143(10), 2293-2303 (2018)). Ensuite, le groupe biotine a été incorporé. Nous avons décidé de contrôler le programme de synthèse sur l’appareil pour obtenir un rendement de couplage de 10% pour l’incorporation de biotine. En utilisant cette stratégie, nous avons incorporé environ 50 biotines par NP. Cette quantité a été optimisée pour obtenir une liaison efficace du groupe biotine lors du dosage MELISA. Après la libération des NP à partir du support de CPG par traitement au DBU et lavage à l’eau, le nombre de NP dans la suspension obtenue a été estimé à partir de la courbe de quantification des NP fluorescentes. La structure des NP après la libération a été contrôlée par MET. Cette observation a montré que la morphologie des NP restait stable durant la synthèse.
Nous avons également confirmé l’accessibilité et la réactivité des biotines greffées à la surface des NP par RPS (résonance plasmonique de surface), via l’interaction biotine/avidine. Après immobilisation de l’avidine sur une puce à RPS recouverte d’une multicouche de polyélectrolyte, nous avons réussi à observer la capture spécifique des nanoparticules biotinylées.
2.2.2.
Détection du virus de la grippe A en milieu clinique
Le dosage à base de biotine-nanoparticules et de billes immunomagnétiques (Biot-NP MELISA) a été étudié pour la détection des virus H1N1 (échantillons 1 et 2), H3N2 et VSDRP (Fig. 8).
Pour reproduire les échantillons cliniques, les solutions virales ont été diluées dans du tampon de lyse supplémenté avec de la salive à 10%. Après la partie sandwich de l’essai avec les virus, l’étape de détection a été réalisée en utilisant des nanoparticules hautement biotinylées pour augmenter l’efficacité d’ancrage de la streptavidine-HRP. Cette stratégie a permis une augmentation du signal dans le cas d’une réponse positive (Fig. 8). Cette sensibilité améliorée prouvait l’efficacité de la stratégie d’amplification.
Des limites de détection de 3x103PFU/mL, 6x104PFU/mL et 4x104PFU/mL ont été respectivement calculées pour l’échantillon 1 et l’échantillon 2 de H1N1, et H3N2.
L’utilisation des biotine-NP lors de l’étape de détection améliorait la sensibilité du dosage MELISA d’un facteur de 65 à 75.
Des limites de détection en dessous de 104PFU/mL et de 105PFU/mL ont été respectivement obtenues pour les souches H1N1 et H3N2, en présence de 10% de salive pour reproduire un contexte clinique. Une bonne sélectivité des souches a été également confirmée par les réponses négatives observées à différentes concentrations de VSDRP (Fig. 8).
3. Exemple 3 : Détection hautement sensible de
Campylobacter
spp
.
dans des échantillons de volailles en utilisant un biocapteur à ADN de Dot Blot amélioré par des nanoparticules de silice
Nous avons couplé des nanoparticules de silice fonctionnalisées (Si-NP) à un test dot blot (buvardage en taches) d’ADN sur papier pour permettre une détection sensible d’acide nucléique deCampylobactersans étape de préamplification.
On a utilisé dans le test une sonde d’ADN hautement spécifique qui reconnaît le gène de l’ARNr 16S desCampylobacterspp. les plus répandus provoquant des infections (C. jejuni,C. coli,C. lari, etC. upsaliensis). On a employé des Si-NP décorées de biotine (biotine-Si-NP) pour améliorer la lecture du signal chimioluminescent de streptavidine – HRP. Une amélioration de l’intensité du signal par comparaison avec le test classique a été obtenue grâce à l’effet conjugué des biotine-Si-NP par rapport à la biotine seule. Nous avons démontré que le nouveau test dot blot couplé aux biotine-Si-NP a réussi à détecter leCampylobacteren utilisant de l’ADN extrait de carcasse de poulet contaminée sans avoir besoin de passer par une étape de PCR. Notre étude illustre l’invention selon laquelle l’effet conjugué des biotine-Si-NP pourrait devenir un moyen efficace pour augmenter la sensibilité de la technique rentable, spécifique et facile à mettre en œuvre de dot blot.
3.1. Matériel et Méthodes
3.1.1. Matériels et réactifs
La Streptavidine-HRP, le Proclin, l’acétonitrile, le 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène (DBU), le verre à porosité contrôlée (120-200 Mesh, CPG-3000 Å)…ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Les NP de silice à la rhodamine B fluorescente (Si-NP, diamètre~50 nm) ont été fournies par Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Les synthons d’ADN au phosphoramidite et tous les réactifs de synthèse d’ADN ont été achetés chez Glen Research (Sterling, Virginie, USA). La solution saline tamponnée au phosphate (STP) a été achetée auprès de Dominique Dutscher (Brumath, France).
Tous les milieux bactériens et les suppléments utilisés provenaient de chez Oxoid (Italie), à l’exception de la gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (Violet red Bile glucose (VRBG)) et du milieu Coli ID qui ont été achetés chez Biomérieux (Italie).
Le Triton, le SDS, le NaCl, la base Trizma, le phénol, le chloroforme, la peptone bactériologique et l’alcool isoamylique ont été achetés chez SIGMA (Milan, Italie). Un oligonucléotide 36-mère associé au gène 16S codant pour l’ARN ribosomique deCampylobacterdeC. jejuni,C. coli,C. lari,C. upsaliensisetC. fetus(localisation des bases: 72-108) a été utilisé comme élément de reconnaissance (sonde appelée CampyP3). CampyP3 a été marquée à son extrémité 5’ avec de la biotine pour la mise au point d’un dosage dot blot chimioluminescent. La sonde a été testée à l’aide de l’OligoAnalyzer3.1 (https://eu.idtdna.com/calc/analyzer), du logiciel Amplifix, Fast PCR 6.1 et Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Une séquence d’ADN simple brin complémentaire à la sonde CampyP3, appelée CP3, et deux séquences d’ADN simples brins non spécifiques, appelées respectivement PR et PE, ont été conçues pour étudier la sélectivité du capteur par le biais de leur hybridation avec la sonde. PR a été conçue par mésappariement de positions d’acides nucléiques de la séquence CP3, tandis que PE correspondait à la séquence deE. coliqui présente quelques similarités avecCampylobacter.
3.1.2. Souches bactériennes
Les souches deCampylobacteront été cultivées dans des conditions microaérophiles (5% d’O2, 10 % de CO2et 80% de N2) dans des jarres anaérobies de gaz.
Les conditions microaérophiles ont été générées à l’aide d’un Sachet Oxoid™ CampyGen™ 2,5 l (Oxoid, Italie) à 37°C pendant 48h. L’ADN a été extrait des isolats deCampylobacterà partir de boîtes de gélose Columbia au sang (les souches pures et les isolats proviennent tous deux d’échantillons de poulet) après coloration Gram et observations au microscope optique de la morphologie et de la mobilité des cellules (bouillon Brucella, Thermofisher, Italie) après des tests d’oxydase et de catalase.
Toutes les souches témoins négatifs ont été cultivées sur les milieux spécifiques dans des conditions optimales et soumises aux mêmes tests réalisés pour lesCampylobacteravant les extractions d’ADN.
3.1.3. Collecte d’échantillons alimentaires et isolement des bactéries
Cinq échantillons de poulet ont été achetés dans les supermarchés locaux en Italie. 10 g de peau de poulet ont été transférés dans un sac Stomacher, stérile par filtration, avec 40 mL d’eau peptonée salée (8 g/L de NaCl, 1 g/L de peptone bactériologique) et homogénéisés dans un Stomacher (PBI, Milan, Italie) pendant 90 s. Des fractions aliquotes de 0,1 mL ont été utilisées pour le comptage aérobie mésophile sur de la gélose tryptone soja à 30°C pendant 48h, et de la levure/moisissures sur 48h pour l’Agar Malt tétracycline à 30°C pendant 48h. Des fractions aliquotes de 1 mL ont été utilisées pour l’énumération des Enterobacteriaceae sur de la gélose VRBG (37°C pendant 24h), et des coliformes et deE. colisur milieu Coli ID (37°C pendant 24h). La détection desCampylobactera été réalisée selon la méthode classique ISO 10272-1:2006. Pour l’isolement sélectif des bactéries, 10 µl du bouillon Bolton ont été ensemencés par stries sur des boîtes de gélose Skirrow, et des boîtes mCCDA (charbon-céfopérazone-désoxycholate) et incubés à 41,5 °C pendant 48h, dans des conditions microaérophiles. Une colonie sélectionnée à partir de la gélose mCCDA et purifiée sur deux boîtes de gélose Columbia au sang a été obtenue par ensemencement par stries. Une boîte a été incubée à 41,5°C pendant 48h et l’autre à 25°C pendant 48h. La croissance sur Skirrow a servi de confirmation pour procéder aux étapes d’identification.
3.1.4. Extraction d’ADN à partir de cultures pures et de bouillons d’enrichissement
L’ADN a été extrait à partir de souches pures et d’isolats d’échantillons de poulet selon Manzano et al (2015). 2 mL de bouillon d’enrichissement Bolton ont été récoltés par centrifugation à 13.000 g et à 4°C pendant 10 min. Les culots bactériens ont été lavés trois fois avec de la STP, avant de faire l’objet d’une extraction d’ADN comme rapporté précédemment (Manzano 2015). Les ADN extraits ont été réhydratés en utilisant 50 μL d’eau distillée stérile et traités avec de l’enzyme RNase à 37°C pendant 1 h. Enfin, l’ADN a été quantifié en utilisant Nanodrop™ 2000C (ThermoFisher Scientific, Italie). La concentration d’ADN a été ajustée à 100 ng/mL en utilisant de l’eau distillée stérile.
3.1.5. Immobilisation des échantillons et mode opératoire de détection
Avant l’immobilisation, les échantillons d’ADN extrait ont été dénaturés à 95 °C pendant 10 min, placés immédiatement sur de la glace et déposés en fraction de 1 µl sur la membrane de nylon chargée positivement (Amersham HybonTM-XL, GE Healthcare, France). La membrane ayant reçu les dépôts a été exposée aux UV à 254 nm pendant 10 minutes pour fixer l’ADN. On a fait tremper la membrane dans du tampon d’hybridation préchauffé (Na2HPO40,5 M, NaH2PO40,5 M, EDTA 10 mM, SDS à 1 %, pH 7,5) à 65°C pendant 30 min sous agitation modérée. 4 ng/µL de la sonde CampyP3 marquée à la biotine dénaturée (100 ng/µL) ont été ajoutés au tampon d’hybridation et laissés une nuit à 65°C sous agitation modérée pour permettre l’hybridation. La membrane a été lavée deux fois avec du SDS 0,1, SSC (Citrate de sodium salin, Meraudex, France) 300 mM pendant 5 min et avec du SSC 75 mM pendant 15 min. La membrane a été transférée dans le tampon de blocage (Tween 0,1 %, SAB 0,1 %, Proclin 0,03%, STP, pH 7,4) à température ambiante pendant 15 minutes pour saturer la surface. Enfin, la membrane a été incubée avec la solution de blocage contenant de la streptavidine-HRP 0,7 µM pendant 15 minutes à température ambiante.
Après lavage avec du SDS à 0,1 %, du SSC 150 mM pendant 5 min à température ambiante, la membrane a été transférée dans une nouvelle boîte de Petri et incubée avec 106biotine-Si-NP/mL, STP, pH 7,4 pendant 30 min, à température ambiante, sous agitation modérée. Une streptavidine-HRP 0,7 µM dans une solution de blocage a été ajoutée après le lavage et incubée pendant 30 min sous agitation. Le signal a ensuite été révélé en utilisant le substrat chimioluminescent amélioré luminol pour la détection HPR (Thermo Scientific, France). La membrane a été retirée de la solution et observée à l’aide d’un système d’imagerie ChemiDoc MP (Biorad, France). Les signaux de détection ont été quantifiés en utilisant le logiciel Image LabTM (Biorad). La valeur normalisée de l’intensité des points a été calculée à l’aide de l’équation (PI0 –PIn)/PI0, où PI0 et PIn représentent l’intensité de pixel obtenue pour la détection de 0,1 ng/µL de sonde CP3 (étalon) et de l’échantillon expérimental, respectivement.
3.1.6. Détection de Campylobacter dans des échantillons de poulet contaminés naturellement
Cinq carcasses de poulets choisies de manière aléatoire, achetées au marché avec une quantité inconnue deCampylobacterspp. calls ont été testées le capteur dot blot. Les peaux de volaille de chaque carcasse ont été échantillonnées et enrichies comme expliqué au paragraphe2.3. Pour la validation des résultats, les carcasses de poulet ont été testées pour déterminer la présence deCampylobacterspp. par la méthode de culture sur gélose sélective selon la norme ISO 10272-1: 2006.
3.2. Résultats et discussion
3.2.1. Concept de dot blot d’ADN à base de biotine-Si-NP
L’ADN cible a d’abord été immobilisé sur une membrane de nylon poreuse par irradiation aux UV pour permettre la réticulation de l’ADN à la surface chargée positivement. Ensuite, on a laissé la sonde d’ADN complémentaire CampyloP3 marquée à la biotine s’hybrider avec l’ADN cible. L’hybridation a été détectée à l’aide d’un conjugué streptavidine-HRP en combinaison avec un substrat luminol chimioluminogène en présence de l’activateur H2O2. Le sandwich streptavidine-biotine a permis de fixer les biotine-Si-NP à la sonde d’ADN, et par conséquent, d’amplifier le signal de détection par rapport à la biotine seule.
Une sensibilité améliorée a été obtenue à cause de l’augmentation de la quantité de marquage à la biotine par sonde d’ADN.
3.2.2. Optimisation des paramètres clés et des performances analytiques du capteur de dot blot d’ADN
La détection de 1 ng/µL de CP3 dans les conditions optimisées en utilisant différentes concentrations de streptavidine-HRP et de biotine-Si-NP a permis de sélectionner 25 ng/µL de streptavidine-HRP et 106nanoparticules/mL pour la réaction chimioluminométrique. Il convient de noter que la réaction chimioluminométrique proprement dite ne contribue pas significativement au bruit de fond étant donné que l’émission de lumière provient de la réaction enzymatique sans aucune excitation photonique (Laios et al., 2011,RSC Cambridge).
3.2.3. Courbe d’étalonnage
Les courbes d’étalonnage ont été établies en utilisant une cible d’ADN de CP3 dans les deux configurations de dot blot (sans et avec des biotine-Si-NP) dans des conditions optimisées. Les courbes d’étalonnage ont été obtenues à partir de la quantification de l’intensité de la lumière chimioluminescente pour chaque concentration de CP3, provenant d’au moins trois taches indépendantes par concentration. L’intervalle linéaire pour la cible de CP3 était respectivement de 1 ng/µL à 0,1 ng/µL (avec un coefficient de corrélation R2=0,98684), et de 6 pg/µL à 0,1 ng/µl (avec un coefficient de corrélation R2=0,98935), pour la technique de dot blot classique et celle améliorée par des Biotine-Si-NP (Fig. 9 B et C). Les limites de détection (LOD) de 0,08 ng/µL et de 0,003 ng/µl pour respectivement le dot blot classique et le dot blot amélioré, ont été calculées en utilisant la formule 3 s/m, où ‘s’ est un écart-type de la solution à blanc et ‘m’ est une pente de la courbe d’étalonnage linéaire. En tenant compte du poids moléculaire de la CP3 qui est de 14395,5, la LOD calculée était de 5,5 nM et de 0,2 nM, pour respectivement le dot blot classique et le dot blot amélioré (figure 9).
Par conséquent, les biotine-Si-NP ont permis d’avoir une augmentation de presque 30 fois de l’intensité du signal chimioluminescent. Les LOD calculées étaient similaires ou inférieures à celles obtenues avec les capteurs rapportés précédemment pour la détection deCampylobacter, comme par exemple 0,5 ng/µL dans Fontanot et al. (2014), 0,37 ng/µL dans Manzano et al. (B&B2015) et 0,09 nM dans Morant-Minana et al. (B&B, 2015). La reproductibilité du dot blot amélioré par des biotine-Si-NP était estimée à 5% selon le signal obtenu pour la détection de la même concentration de CP3.
3.2.4. Spécificité et sélectivité de la détection
Pour examiner la sélectivité et la sensibilité du dot blot aux biotine-Si-NP, nous avons testé différentes souches deCampylobacterspp. pour l’inclusivité, et 17 autres espèces bactériennes et 1 une souche de levure pour l’exclusivité (Fig. 10). Toutes les souches ont été cultivées sous forme de monoculture et les ADN génomiques ont été extraits comme expliqué auparavant. Les analyses dot blot ont été réalisées en utilisant 10 ng/µL d’ADN extrait non amplifié. Avant l’immobilisation, tous les ADN génomiques ont été dénaturés pendant 5 min à 95°C pour permettre une ouverture des doubles brins. De la CP3 à 0,1 ng/µL a été utilisée comme témoin interne pour les intensités de signal normalisées. Les ratios des signaux pourC. jejuni,C. coli,C. larietC. upsaliensisétaient supérieurs à 1,0, les images de membrane présentant des taches évidentes, alors que le ratio le plus élevé parmi les solutions d’ADN témoins n’était que de 0,6 pourS. enterica(figure 10).
De plus, l’intensité obtenue pourC. jejunietC. coliétait environ 4 fois supérieure à celle du témoin positif. Ceci indique que la sonde CampylC3 utilisée pour la détection a réagi plus efficacement avec l’ADN deC. jejuniet deC. coliqu’avec les autresCampylobacterspp. testés dans les conditions de dot blot optimisées dans cette étude. Nos résultats ont démontré que la plate-forme de dot blot améliorée par des biotine-Si-NP est suffisamment sensible pour détecter l’ADN entier extrait desCampylobacterspp. les plus fréquents sans amplification PCR, et pourrait permettre de faire la distinction entre un ADN deCampylobacteret d’autres bactéries.
3.2.5. La détection de Campylobacter
spp
. dans la peau d’une carcasse de poulet contaminée naturellement
Les peaux provenant de cinq échantillons de volaille, qui ont été enrichis, ont été conservées pour la méthode de comptage sur boîte ISO 10272-1:2006 et l’analyse dot blot couplée aux biotine-Si-NP (Fig. 11). La CP3 (0,1 ng/µL) a été utilisée comme témoin positif dans l’analyse dot blot. Toutes les mesures ont été effectuées trois fois. Deux échantillons ont été contaminés avec duCampylobacter jejuni(figure 11). Le dot blot amélioré par des biotine-Si-NP a réussi à détecter deux échantillons contaminés (Fig. 11). Le test a atteint une spécificité relative de 100 % grâce à la spécificité élevée de la sonde CampylP3 utilisée. Dans l’ensemble, la méthode dot blot améliorée par des biotine-Si-NP proposée a réussi à détecter des niveaux faibles deCampylobacternaturellement présents après enrichissement, et pourrait être envisagée pour la détermination et la détection desCampylobacterspp. présents dans une viande de volaille contaminée.
3.3. Conclusion
Ces travaux décrivent une méthode dot blot simple, améliorée avec des biotine-Si-NP, pour une détection rapide et fiable desCampylobacterspp. présents dans une viande de volaille contaminée.
Le test dot blot est largement utilisé en biologie moléculaire et en génétique pour détecter une séquence d’ADN/ARN cible.
Cette hybridation sur papier permet d’analyser facilement des échantillons multiples à moindre coût avec un rendement élevé, mais a ses limites en faible sensibilité.
Nous avons démontré que l’association de biotine-Si-NP hautement fonctionnalisées avec la lecture chimioluminescente du dot blot amplifiait le signal de 30 fois.
Par ailleurs, les biotine-Si-NP résistent bien à la température d’utilisation et sont stables dans le temps.
La LOD obtenue était de 0,006 ng/µl (0,2 nM). De telles faibles concentrations d’ADN détecté sont proches de celles que l’on peut détecter par qPCR (Manzano et al. 2018; Vidic et al., 2019).
L’hybridation de l’ADN génomique immobilisé avec la sonde CampylP3 a induit des signaux positifs pour tous lesCampylobacterspp. responsables de la gastro-entérite humaine, alors qu’aucun bruit de fond n’a été observé avec les échantillons témoins.
Le système mis au point est un outil prometteur pour un criblage rapide et bon marché d’échantillons de volaille pour détecter la présence deCampylobactercar la détection est réalisée sur l’ADN bactérien sans étape d’amplification préalable.
Par ailleurs, notre dot blot peut s’appliquer à de l’ADN extrait par différentes méthodes d’extraction et provenant de diverses matrices alimentaires, étant donné qu’il n’est pas sensible aux inhibiteurs d’ADN polymérase.
Le test sur papier multiplex, miniaturisé et sensible proposé est simple à concevoir et pourrait être utilisé par l’industrie alimentaire et les agences de régulation pour la détection d’autres agents pathogènes afin de surveiller la qualité des aliments. Nous pensons que dans le futur, il pourrait être intégrable à un biocapteur à base de laboratoire sur puce qui comprend un protocole d’extraction d’ADN automatisé, voire même un téléphone portable.
4. Exemple 4 : Procédé alternatif en une étape
L’ADN a été extrait à partir de souches pures et d’isolats d’échantillons de poulet selon Manzano et al (2015). La concentration d’ADN total a été ajustée à 100 ng/mL en utilisant de l’eau distillée stérile.
Avant l’immobilisation, les échantillons d’ADN extrait ont été dénaturés à 95 °C pendant 10 min, placés immédiatement sur de la glace et déposés en fraction de 1 µl sur la membrane de nylon chargée positivement (Amersham HybonTM-XL, GE Healthcare, France).
La membrane ayant reçu les dépôts a été exposée aux UV à 254 nm pendant 10 minutes pour fixer l’ADN. On a fait tremper la membrane dans du tampon d’hybridation préchauffé (Na2HPO40,5 M, NaH2PO40,5 M, EDTA 10 mM, SDS à 1 %, pH 7,5) à 65°C pendant 30 min sous agitation modérée. 4 ng/µL de la sonde CampyP3 marquée à la biotine dénaturée (100 ng/µL) ont été ajoutés au tampon d’hybridation et laissés une nuit à 65°C sous agitation modérée pour permettre l’hybridation.
La membrane a été lavée deux fois avec du SDS 0,1, SSC (Citrate de sodium salin, Meraudex, France) 300 mM pendant 5 min et avec du SSC 75 mM pendant 15 min. La membrane a été transférée dans le tampon de blocage (Tween 0,1 %, SAB 0,1 %, Proclin 0,03%, STP, pH 7,4) contenant 106HRP-Streptavidine-Si-NP/mL, STP, pH 7,4 pendant 30 min, à température ambiante, sous agitation modérée. Après lavage avec du SDS 0,1 %, SSC 150 mM pendant 5 min à température ambiante, la membrane a été transférée dans une nouvelle boîte de Petri et incubée dans la solution de blocage.
Le signal a ensuite été révélé en utilisant le substrat chimioluminescent amélioré pour la détection HPR (Thermo Scientific, France).
Claims (17)
- Procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte (T) susceptible d’être contenu dans un échantillon,
lequel procédé comprend :
(a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon (E) est mis en présence d’au moins une sonde primaire (1),
laquelle au moins une sonde primaire (1) est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison (11) apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte (T) pour former le cas échéant un complexe primaire (C1) et, d’autre part, une première étiquette d’affinité (12),
(b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2),
lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321), et
- un traceur (21) destiné à convertir le complexe secondaire (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3),
de sorte que, dans ledit complexe secondaire (C2), certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) sont liées avec ledit traceur (21). - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étiquette d’affinité (321) de l’enveloppe (32) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) consiste en :
- une première étiquette d’affinité (321), identique à la première étiquette d’affinité (12) de ladite au moins une sonde primaire (1), ou
- une seconde étiquette d’affinité (321) apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité (12) de ladite au moins une sonde primaire (1). - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, au cours de l’étape de révélation, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés :
- une seconde étiquette d’affinité (5) apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité (12),
au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité (5) se présentant sous la forme d’une sonde secondaire (2) consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité (5, 22) et, d’autre part, le traceur (21), et
- ladite au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité (321),
de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2) comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : seconde étiquette d’affinité (5) : sonde d’amplification (3) : sondes secondaires (2),
ladite sonde d’amplification (3) dudit complexe secondaire (C2) étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire (2). - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu’une partie de ladite seconde étiquette d’affinité (5) de l’étape de révélation est dépourvue dudit traceur (21).
- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité (321) dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur (21),
de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2) comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : sonde d’amplification (3). - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la première étiquette d’affinité (12, 321) est choisie parmi la biotine ou homologue, et
en ce que la seconde étiquette d’affinité (5, 22) est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine. - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite au moins une sonde d’amplification (3) comprend un noyau (31) formé par une nanoparticule ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm.
- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la nanoparticule est choisie parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice, de préférence encore parmi les nanoparticules composées de silice, avantageusement encore parmi les billes de silice.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite au moins une sonde d’amplification (3) comporte au moins 20 molécules de ladite étiquette d’affinité (321).
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’enveloppe (32) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) comprend des espaceurs (322), reliant le cœur (31) avec une molécule d’étiquette d’affinité (321).
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le traceur (21) est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, photoacoustiques ou photothermiques,
le cas échéant ladite au moins une sonde secondaire (2) étant choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs. - Procédé selon la revendication 11, en combinaison avec la revendication 3, caractérisé en ce que les conjugués enzymatiques sont choisis parmi les conjugués streptavidine-HRP ou streptavidine-PA,
et en ce que les réactifs de révélation de l’étape de révélation comprennent un substrat desdits conjugués enzymatiques pour une réaction de chimiluminescence en présence dudit complexe secondaire (C2). - Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 ou 5, caractérisé en ce que l’étape de révélation est mise en œuvre en :
- deux phases successives, dans le cadre de la revendication 3, avec :
-- une première phase au cours de laquelle est ajoutée ladite seconde étiquette d’affinité (5), éventuellement au moins une partie sous forme de ladite au moins une sonde secondaire (2), pour former un premier sous-complexe comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : seconde étiquette d’affinité (5),
puis
-- une seconde phase au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification (3) et ladite au moins une sonde secondaire (2) pour former ledit complexe secondaire (C2),
ou
- une phase unique, dans le cadre de la revendication 3, au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire (C2),
ou
- une phase unique, dans le cadre de la revendication 5, au cours de laquelle est ajoutée ladite au moins une sonde d’amplification (3) pour la formation du complexe secondaire (C2). - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le site de liaison (11) de ladite au moins une sonde primaire (1) est choisie parmi les biomolécules, par exemple les sondes nucléiques ou les sondes protéiques.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire (1), ledit au moins un analyte (T) est fixé :
- sur un support (S), par exemple pour un procédé du type dot blot, ou
- sur une sonde de capture (6), portée par exemple par une bille magnétique (B) pour une technique MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich. - Utilisation d’une sonde du type noyau-enveloppe en tant que sonde d’amplification du signal dans un procédé de détection en cascade pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte (T) susceptible d’être contenu dans un échantillon (E), ladite sonde d’amplification (3) comportant une enveloppe (32) qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321).
- Système de réactifs, pour la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15,
lequel système de réactifs comprend :
- au moins une sonde primaire (1),
laquelle au moins une sonde primaire (1) est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison (11) apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte (T) et, d’autre part, une première étiquette d’affinité (12), et
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe (C2) partant de la sonde primaire (1),
lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321), et
- un traceur (21) destiné à convertir le complexe (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3),
de sorte que, dans ledit complexe (C2), certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) sont liées à au moins une molécule dudit traceur (21).
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