EP4158341A1 - Procédé et système pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d'au moins un analyte susceptible d'être contenu dans un échantillon - Google Patents

Procédé et système pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d'au moins un analyte susceptible d'être contenu dans un échantillon

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Publication number
EP4158341A1
EP4158341A1 EP21728199.7A EP21728199A EP4158341A1 EP 4158341 A1 EP4158341 A1 EP 4158341A1 EP 21728199 A EP21728199 A EP 21728199A EP 4158341 A1 EP4158341 A1 EP 4158341A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
probe
affinity tag
complex
primary
amplification
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP21728199.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jasmina VIDIC
Nalini RAMA RAO
Carole Chaix
Carole FARRE
Marisa Manzano
Priya VIZZINI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Universita degli Studi di Udine
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Universita degli Studi di Udine
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement, Universita degli Studi di Udine filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4158341A1 publication Critical patent/EP4158341A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • GPHYSICS
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    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983Viruses

Definitions

  • the present invention relates to the field of techniques for the analysis of liquid samples.
  • It relates in particular to the field of methods and systems for determining the presence and / or quantity of at least one analyte likely to be contained in a sample.
  • Analytical techniques are concerned with the identification and characterization of chemicals, known as "analytes", in a sample.
  • the analysis carried out can be qualitative, when the technique allows a search for the presence of the analyte in the sample; this analysis can be quantitative, when the technique further allows a measurement of the amount of analyte in the sample.
  • Such analysis techniques include in particular biological analyzes when the desired analyte consists of a biological analyte.
  • the analytical technique must ensure a selective and sensitive assay of the analyte likely to be contained in the sample analyzed.
  • testing for pathogens may be based on propagation by culture before isolation. These methods are effective and sensitive but are generally laborious and over a long period of time (results are usually only available after several days).
  • biosensors Other analytical tools rely on the specific molecular binding properties that are encountered in biological molecules known generically as biological sensors or biosensors (also called biosensors or “biosensors”).
  • biosensors are particularly advantageous for the rapid and efficient determination of markers, typically biological markers, on account of their simplicity of use, their possible miniaturization and their capacity for analysis in real time.
  • a biosensor indeed has the ability to recognize a target biological marker (biomarker or “target biomarker”), characteristic of the target analyte (for example a pathogen of interest).
  • a target biological marker biological marker
  • the biosensor carries a detection element commonly called a “bioreceptor” (also called a biological receptor or “bioreceptor”).
  • bioreceptors consist for example of monoclonal antibodies, RNA, DNA, glycans, lectins, enzymes, tissues or whole cells.
  • the bioreceptor plays a key role because its biochemical properties provide sensitivity and selectivity in the detection of biomarkers and help to avoid interference with other compounds in the test sample.
  • biomarker The specific biochemical interaction between the biomarker and the bioreceptor is then converted, thanks to a tracer element (also called transducer or “transductor”), into a measurable signal.
  • tracer element also called transducer or “transductor”
  • the recording and display of the signal allows a qualitative, even quantitative, identification of the analyte in the analyzed sample.
  • the tracer is carried directly by the biosensor.
  • an analyte molecule is generally able to cooperate with a small number of biosensor / tracer molecules, or even with a single biosensor / tracer molecule.
  • some analysis systems rely on cascade detection in which the bioreceptor is linked to an enhancer compound capable of receiving multiple tracer molecules.
  • the present invention thus provides methods and systems suitable for determining, with increased sensitivity, the presence and / or quantity of at least one analyte likely to be contained in a sample.
  • a method for determining the presence and / or the quantity of at least one analyte capable of being contained in a sample.
  • said at least one analyte is chosen from biological analytes, in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells, infectious agents such as bacteria , viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
  • the method according to the invention comprises:
  • amplification probe of the core-envelope type, in which said envelope comprises several molecules with an affinity tag
  • a tracer intended to convert the secondary complex into a visible and / or measurable signal, said tracer being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe, so that , in said secondary complex, at least some of the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe are linked with said label.
  • Such a method thus allows, by a simple adaptation of the cascade detection systems, a significant amplification of the detection signal.
  • the secondary complex obtained comprises the amplification probe which advantageously constitutes an interface capable of receiving a plurality of tracer molecules.
  • the method according to the invention achieves indirect / cascade binding, in which a plurality of tracer molecules are linked to an analyte molecule.
  • This new technology provides improved detection of all types of analytes, in particular biological analytes (microorganisms, virulence markers, antibiotic resistance markers, etc.).
  • the addition of the amplification probe in a cascade detection system allows a significant increase in the signal.
  • the affinity tag of the envelope of said at least one amplification probe consists of: - a first affinity tag, identical to the first affinity tag of said at least one primary probe, or
  • a second affinity tag capable of binding specifically with said first affinity tag, at least part of said second affinity tag being in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, of a on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer, and
  • amplification probe of the nucleus-envelope type, in which said envelope comprises several molecules of said first affinity tag, so as to obtain, starting from said primary complex, a secondary complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag: amplification probe: secondary probes, said amplification probe of said secondary complex being linked to several molecules of said at least one secondary probe.
  • a part of said second affinity tag of the revealing step is advantageously devoid of said tracer.
  • the first affinity tag is chosen from biotin or homolog
  • the second affinity tag is chosen from streptavidin or homolog, for example avidin, NeutrAvidin or Captavidin
  • said at least one amplification probe comprises a core formed by a nanoparticle preferably having a size ranging from 10 to 100 nm; the nanoparticle is advantageously chosen from nanoparticles having a surface composed of silica, more preferably from nanoparticles composed of silica, advantageously also from silica beads; said at least one amplification probe comprises at least 20 molecules of said affinity tag;
  • the envelope of said at least one amplification probe comprises spacers, connecting the heart with a first affinity tag molecule; the spacers are for example chosen from nucleic spacers, for example DNA sequences;
  • the tracer is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic, photoacoustic or photothermal particles; where appropriate, said at least one secondary probe is advantageously chosen from enzymatic conjugates or photoactive conjugates (colored, fluorescent, luminescent conjugates); the enzymatic conjugates are advantageously chosen from streptavidin-HRP or streptavidin-PA conjugates, and the reagents for the revelation step comprise a substrate of said enzymatic conjugates for a chemiluminescence reaction in the presence of said secondary complex;
  • the revelation step is implemented in two successive phases with a first phase during which is added said second affinity tag, optionally at least a part in the form of said at least one secondary probe, to form a first sub-complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag, then a second phase during which said at least one amplification probe and said at least one secondary probe are added to form said secondary complex, or a single phase during which the reagents are simultaneously added for the formation of the secondary complex;
  • the binding site of said at least one primary probe is chosen from biomolecules, for example nucleic probes (RNA, DNA, aptamers sequences), protein probes (antibodies, enzymes, antigens, peptides);
  • said at least one analyte is fixed on a support, for example for a method of the dot blot type, or on a capture probe, carried for example by a magnetic bead for a MELISA technique or by a support for a sandwich ELISA technique,
  • the amplification step is carried out so as to obtain a secondary complex comprising several amplification probes in cascade / in series (for example two or three amplification probes); the secondary complex advantageously comprises at least two amplification probes linked together by at least a second affinity tag.
  • the present invention also relates to the use of a core-envelope type probe as a signal amplification probe in a cascade detection method for determining the presence and / or the quantity of at least one.
  • analyte capable of being contained in a sample
  • said amplification probe comprising an envelope which comprises several molecules of an affinity tag.
  • the amplification probe comprises an envelope which comprises several molecules of a first affinity tag each capable of specifically binding to a second affinity tag, at least part of said second affinity tag being intended in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer.
  • the nucleus-envelope type amplification probe comprises an envelope which comprises several molecules of said second affinity tag, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer.
  • the present invention also relates to the reagent system, for implementing the method according to the invention.
  • the reagent system includes:
  • At least one primary probe which at least one primary probe is a conjugate comprising, on the one hand, a binding site capable of binding specifically with said analyte and, on the other hand, a first affinity tag, and
  • At least one revelation reagent capable of forming a complex starting from the primary probe which at least one revelation reagent comprises:
  • nucleus-type amplification probe - envelope in which said envelope comprises several molecules with an affinity tag
  • a tracer intended to convert the complex into a visible and / or measurable signal, said tracer being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe, so that, in said complex, at least some of the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe are linked to at least one molecule of said tracer.
  • the revelation reagents comprise:
  • a second affinity tag capable of binding specifically with said first affinity tag, at least part of said second affinity tag being in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, of a on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer (enzyme, fluorophore, radioisotope, redox molecule, etc.), and
  • amplification probe of the nucleus-envelope type, in which said envelope comprises several molecules of said first affinity tag, which reagent system is capable of forming, in the presence of said analyte, a complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag: amplification probe: secondary probes, said amplification probe of said secondary complex being bound to several molecules of said at least one secondary probe.
  • the amplification probe, of the nucleus-envelope type has an envelope which comprises several molecules of said second affinity tag, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer, so in obtaining, starting from said primary complex, a secondary complex comprising analyte: primary probe: amplification probe.
  • FIG. 1 is a schematic view of a primary complex between an analyte and a primary probe (antibody type), which is obtained at the end of the recognition step according to the invention;
  • FIG. 2 is a schematic view of a first amplification probe suitable for the method according to the invention.
  • FIG. 3 is a schematic view of a secondary complex resulting from the revealing step, obtained by the cascade binding of the primary complex with in particular an amplification probe (according to FIG. 2) linked to several molecules of a secondary probe forming a tracer;
  • FIG. 4 is a schematic view of a secondary complex in which the analyte is itself fixed by a magnetic bead during an assay in the form of enzymatic immuno-absorption on a magnetic support bead (also called “magnetic bead-based enzyme -linked immunosorbent assay ”or MELISA);
  • FIG. 5 is a schematic view of a secondary complex, in which the analyte is itself supported on a support by a molecular dot blot hybridization technique
  • FIG. 6 is a schematic view of a second amplification probe suitable for the method according to the invention
  • FIG. 7 is a schematic view of a secondary complex resulting from the revealing step, obtained by the cascade binding of the primary complex with an amplification probe according to FIG. 6 carrying several tracer molecules;
  • FIG. 8 is a figure illustrating the absorbance (450 - 550 mm) by Biot-NP MELISA technique as a function of plaque-forming units (PFU / mL), for whole viruses from different strains (H1 N1, H3N2, PRRSV ) in a buffer containing 10% saliva;
  • FIG. 9 is a view comprising (A) Dot blot detection of Campylobacter DNA sequence with improved reading by biotin-Si-NP. It should be noted that no signal was obtained with a truncated Campylobacter (PR) sequence or with a control sequence of E. Coli (PE). (B) Conventional dot blot detection of the biotin-labeled CampyP3 probe using the dilution of the Campylobacter CP3 complementary sequence ranging from 1 ng / ⁇ l to 78 fg / ⁇ l.
  • PR truncated Campylobacter
  • PE E. Coli
  • FIG. 10 is a view showing the results of the inclusivity and exclusivity tests of the enhanced dot blot sensor in pure cultures
  • FIG. 11 illustrates a dot blot membrane obtained with naturally infected (C * 3 and C10) and uninfected (C4, C5 and C6) chicken samples; the CP3 template sequence (0.1 ng / pL) was used as a positive control.
  • the present invention relates to methods and systems for determining the presence and / or amount of at least one analyte likely to be contained in a sample.
  • analyte is understood to mean any chemical, biochemical or biological entity that it is desired to detect in a sample.
  • This chemical entity advantageously consists of an entity resulting from the living world, preferably from the plant or animal world, or even present in humans.
  • analytes detectable by the devices and methods according to the present invention there may be mentioned in particular biological analytes, in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells. , infectious agents such as bacteria, viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
  • biological analytes in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells.
  • infectious agents such as bacteria, viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
  • sample is meant any sample in which the desired analyte is in solution or in suspension.
  • This sample can in particular be any biological or bodily fluid.
  • the sample may also have been obtained directly or indirectly from a biological or bodily fluid.
  • the sample can also be a liquid extract from a solid or gaseous sample.
  • the sample is for example obtained from water, air, soil, biological materials (tissues, microorganisms, organelles, cell receptors, enzymes, antibodies, nucleic acids, genetically modified organisms, or materials derived from GMOs, etc.).
  • biological materials tissues, microorganisms, organelles, cell receptors, enzymes, antibodies, nucleic acids, genetically modified organisms, or materials derived from GMOs, etc.
  • the method and the system according to the invention are advantageous in that they can be adapted both to the determination of the presence of at least one analyte, as to the determination of its quantity.
  • detecting or “determining” is thus meant the qualitative determination (advantageously the presence or absence) of one or more analytes in a sample.
  • detect or “determine” also includes the measurement and quantification of one or more analytes in the sample.
  • the method according to the invention comprises the following successive steps:
  • a revelation step B (FIGS. 3 and 7 in particular) during which is added at least one revelation reagent suitable for forming a secondary complex C2 starting from the primary probe 1 (and preferably from a first label d affinity 12 of said primary probe 1) of said primary complex C1.
  • said at least one revealing reagent comprises:
  • said at least one revelation reagent is intended to bind, in cascade, from said at least one primary probe 1 (and advantageously from its first affinity tag 12) to form the secondary complex C2.
  • said at least one revelation reagent used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 in which at least some of the molecules of the label d 'affinity 321 of said at least an amplification probe 3 are linked (directly or indirectly) with at least one molecule of the tracer 21 ( Figures 3 and 7).
  • said tracer 21 can advantageously have two different forms:
  • the tracer 21 is a separate reagent compared to said at least one amplification probe 3; the tracer 21 is intended to bind with the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 (FIG. 3 in particular), or
  • the tracer 21 and the amplification probe 3 form a single reagent; the tracer 21 is linked with the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 ( Figures 6 and 7).
  • the tracer 21 also called “marker”, “transducer” or “transductor”, is intended to convert the secondary complex C2 into a visible and / or measurable signal.
  • tracer thus means any entity allowing direct or indirect detection with the naked eye, or with the aid of a device, due to the emission of a signal.
  • the signal is, for example, fluorescence, coloring, the presence of isotope or a magnetic signal.
  • the tracer 21 can thus be chosen from conventional tracers per se.
  • this tracer 21 is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic particles, photoacoustic particles or photothermal particles.
  • any strong bond for example covalent (in particular for a single reagent), but also
  • any weak binding for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type or affinity tags (in particular for separate reagents).
  • the affinity tag 321 of the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 is chosen from:
  • the revealing step B leads to adding at least the following revealing reagents:
  • the revelation reagents 2, 3, 5 used make it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: second label d affinity 5: amplification probe 3: secondary probes 2.
  • the amplification probe 3 of this secondary complex C2 is in particular linked to several molecules of said at least one secondary probe 2.
  • a plurality of molecules of said at least one secondary probe 2 (carrying the tracer) is linked to an analyte T molecule.
  • This structure offers a significant amplification of the signal obtained for each T analyte molecule present, thanks to the multiplication of the secondary probes 2 making up the secondary complex C2 (reported on the amplification probe 3).
  • amplification probe 3 of the core 31-envelope 32 type in which said envelope 32 comprises several molecules of said second label.
  • the amplification probe 3 used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
  • a plurality of tracer molecules 21 are linked to an analyte T molecule.
  • This structure then offers a significant amplification of the signal obtained for each T analyte molecule present, thanks to the multiplication of the tracers 21 carried by the amplification probe 3.
  • the revealing reagents are assembled in cascade by specific molecular bonds based on complementary affinity tags.
  • the reagents used in the process advantageously comprise at least one pair of affinity labels, or even a single pair of affinity labels.
  • affinity tags is advantageously meant a pair of chemical, biochemical or biological entities which are able to bind specifically with one another to form a complex.
  • affinity tags include in particular the biological ligands chosen from peptides and oligonucleotides.
  • affinity tags are chosen from the couple:
  • biotin also called “biotin” or “biot” in the examples
  • biotin also called “biotin” or “biot” in the examples
  • streptavidin or homolog for example avidin, NeutrAvidin, Captavidin
  • sample E is thus brought into contact with said at least one primary probe 1 forming a biosensor.
  • said at least one primary probe 1 therefore consists of a conjugate comprising:
  • binding site 11 still forming a "bioreceptor" or recognition element, capable of binding specifically with the analyte T to form, if necessary, the primary complex C1, and
  • the secondary complex C2 is advantageously formed, in cascade, from the first affinity tag 12.
  • Said at least one primary probe 1, and in particular its binding site 11, consists of any chemical, biochemical or biological entity which is able to bind specifically to the analyte T to form the primary complex C1 (advantageously binary).
  • bind or “binding” is meant any strong bond, for example covalent, but also any weak bond, for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type.
  • Such a primary probe 1, and in particular its binding site 11, is thus advantageously chosen from biomolecules, namely for example:
  • Figure 1 - protein probes ( Figure 1), including antibodies, enzymes, antigens, peptides, or
  • FIG. 5 - nucleic acid probes (FIG. 5), encompassing the RNA sequences, the DNA sequences, the aptamers.
  • the primary probe 1 (and in particular its binding site 11) is chosen for its specific binding properties to the T analyte, such as for example a ligand / anti-ligand pair, an antigen / antibody pair, a DNA / RNA pair. or a DNA / DNA pair.
  • the binding site 11 is advantageously an antibody specific for the analyte.
  • antibody specific for the analyte is meant an antibody capable of binding specifically with the analyte in a binding of the antigen / antibody type.
  • It is typically a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, having a high affinity for the analyte.
  • it is a monoclonal antibody.
  • the binding site 11 is advantageously a complementary DNA probe.
  • the primary probe 1 consists of a probe capable of binding to the DNA of Gram-negative bacteria of the genus Campylobacter, and more preferably DNA probes specific for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter tari or Campylobacter upsaliensis as described. for example in the patent application IT102020000012496.
  • the parameters (incubation time, rinsing, etc.) are adjusted so as to allow the formation of the primary complex C1 in the presence of the analyte T.
  • the first affinity tag 12 of the primary probe 1 is advantageously chosen from biotin or homolog.
  • binding site 11 and the first affinity tag 12 are advantageously linked by covalent bonds.
  • said at least one analyte T Prior to bringing said at least one primary probe 1 together, said at least one analyte T can be fixed:
  • a capture probe 6 carried for example by a magnetic ball B for a so-called MELISA technique or by a support for a sandwich ELISA technique, or
  • the aforementioned capture probe 6 consists of any chemical, biochemical or biological entity which is able to bind specifically to the analyte T.
  • bind or “binding” is meant any strong bond, for example covalent, but also any weak bond, for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type.
  • Such a capture probe 6, and in particular its binding site is thus advantageously chosen from biomolecules, namely for example:
  • - protein probes including antibodies, enzymes, antigens, peptides, or
  • nucleic acid probes encompassing RNA sequences, DNA sequences, aptamers.
  • the capture probe 6 (and in particular its binding site) is chosen for its specific binding properties to the T analyte, such as for example a ligand / anti-ligand cut, an antigen / antibody pair, a DNA / RNA pair. or a DNA / DNA pair.
  • dot blot encompasses techniques for transferring molecules which make it possible to verify the presence of specific molecules in a medium, including the Southern blot for the DNA, the northern blot for the RNAs or the western blot for the proteins.
  • dot blot also encompasses the transfer of nucleic acids (DNA or RNA) from a liquid medium directly onto a membrane, without prior separation (therefore without prior electrophoresis).
  • the transfer can be carried out by simple diffusion, by diffusion in an electric field (electrodiffusion) or by vacuum suction.
  • Revelation step B
  • the revelation step B is carried out so as to detect, by means of at least one revelation reagent, any C1 primary complexes generated during the recognition step A.
  • said at least one revelation reagent comprises:
  • the second affinity tag 5 is adapted to bind specifically with the first affinity tag which is carried by the primary probe 1 or, as developed later, by said at least one amplification probe 3.
  • the second affinity tag 5 is advantageously chosen from streptavidin or homologous, for example avidin or NeutrAvidin or Captavidin.
  • the second affinity tag 5 may appear:
  • the second affinity tag 5 in free form may represent 10 to 50%, more preferably 20 to 50%, of the second affinity tag molecules 5.
  • the aforementioned secondary probe 2 consists of a detection reagent in the form of a conjugate comprising:
  • an affinity tag 22 which consists of the aforementioned second affinity tag 5.
  • this affinity tag of the secondary probe 2 is designated indifferently by the references 5 or 22 and can also be referred to as “second affinity tag”.
  • the tracer 21 can thus be chosen from conventional tracers per se.
  • this tracer 21 is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic particles, photoacoustic particles, or photothermal particles.
  • Said at least one secondary probe 2 is thus advantageously chosen from enzymatic conjugates or photoactive conjugates.
  • enzyme conjugates is understood to mean conjugates with the enzymes H RP (horseradish peroxidase) or PA (alkaline phosphatase).
  • the reagents for development step B advantageously comprise a substrate 4 for the enzymatic conjugates for a chemiluminescence reaction in the presence of the secondary complex C2.
  • the substrate 4 can thus be chosen from, for example, the following compounds:
  • TMB - chromogenic
  • ADHP fluorescent
  • Luminol chemiluminescent
  • pNPP - chromogenic
  • MUP fluorescent
  • FPD chemiluminescent
  • photoactive conjugates includes colored conjugates, fluorescent conjugates and luminescent conjugates.
  • said at least one secondary probe 2 consists of an enzymatic conjugate chosen for example from streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) or streptavidin conjugates.
  • -PA alkaline phosphatase
  • said at least one amplification probe 3 is of the core 31 (also called “heart”) - envelope 32 type.
  • Envelope 32 includes multiple molecules of an affinity tag 321 (also referred to as "first affinity tag 321") which is identical to the first affinity tag 12 of primary probe 1.
  • said at least one amplification probe 3 advantageously comprises at least 20 molecules of said first affinity tag 321.
  • These molecules of said first affinity tag 321 are able to bind specifically with at least one molecule of the second affinity tag 5, 22, namely:
  • the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 also advantageously comprises spacers 322 which connect the nucleus 31 with a first affinity tag molecule 321.
  • Such spacers 322 aim to separate the molecules of the first affinity tag 321 with respect to the nucleus 31 and with respect to each other, thus limiting the problems of steric hindrance during the revealing step B.
  • This structure thus makes it possible to free the environment from the first affinity tags 321, and to increase the number of molecules of said at least one secondary probe 2 which is bound simultaneously with the amplification probe 3.
  • This arrangement also allows a better presentation of the first affinity tags 321, thus promoting the recognition reaction (advantageously increase in the probability of reaction) with said at least one secondary probe 2.
  • the spacers 322 are advantageously chosen from nucleic spacers, for example DNA sequences (for example a dTio-PEG 2 -dTio sequence).
  • the core 31 is for its part advantageously formed by a nanoparticle 31 (also called “NP” in the examples) preferably having a size ranging from 10 to 100 nm.
  • the size of the particles is defined as their largest size and can be measured using a scanning electron microscope or an optical microscope.
  • the size of heterogeneously shaped objects is defined as the length of the larger side of the object.
  • the nanoparticle 31 is advantageously chosen from nanoparticles having a surface composed of silica (including silicate).
  • such nanoparticles are also chosen from nanoparticles composed of silica (or even silicate), advantageously also from silica beads.
  • the nanoparticles can be chosen from silica nanoparticles (also called “Si-NP”), gold, silver, graphite, fluorescent nanocrystals (also called quantum dots), polymer nanoparticles of the type polystyrene, polypropylene or polybutadiene, or metal oxide nanoparticles, in particular of tin oxide, gadolinium, aluminum, titanium, cerium, erbium niobium, ytterbium, terbium, dysprosium , europium, or a mixture of these oxides, optionally coated to allow their functionalization.
  • silica nanoparticles also called “Si-NP”
  • gold silver
  • graphite also called quantum dots
  • polymer nanoparticles of the type polystyrene polypropylene or polybutadiene
  • metal oxide nanoparticles in particular of tin oxide, gadolinium, aluminum, titanium, cerium, erbium niobium, ytterbium,
  • the revelation step B is carried out under conditions suitable for generating the secondary complex C2 ( cascade), starting from the primary probe 1 of said primary complex C1, comprising analyte T: primary probe 1: second affinity tag 5 (free or conjugated): amplification probe 3: secondary probes 2.
  • the amplification probe 3 of this secondary complex C2, carrying a plurality of molecules of first affinity tag 321, is thus advantageously linked to several molecules of said at least one secondary probe 2 (via their second affinity tags 22) .
  • This configuration then allows a significant amplification of the signal, with a plurality of molecules of secondary probe 2 (intended to produce a signal) for one molecule of analyte T.
  • disclosure step B can take two alternative embodiments.
  • the revealing step B is implemented in two successive phases with:
  • the second phase B2 can itself be divided into two successive operations (successive addition of the revelation reagents):
  • this first embodiment comprises a preparation phase during which said at least one amplification probe 3 is linked with the secondary probe 2 (by means of their affinity tags 321, 22), to form an amplification probe 3 / secondary probes 2 complex.
  • the second phase B2 is implemented by directly adding the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex which is intended to bind with the second affinity tags 5 (free or conjugated) of the first sub-complex. .
  • the revelation step B is carried out in a single phase during which the reagents are added simultaneously for the formation of the secondary complex C2.
  • the method advantageously comprises a preparation phase during which said at least one amplification probe 3 is linked with several molecules of secondary probes 2 (by means of their affinity tags 321, 22), to form a Amplification probe 3 / secondary probe complex 2.
  • revelation step B is carried out by directly adding the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex which is intended to bind with the primary probe 1 if it is still present.
  • the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex binds with the first affinity tag 12 of the primary probe 1, this via the second affinity tags 5, 22 (free or conjugated ).
  • the amplification probe 3 used is similar to that described above in relation to FIGS. 1 to 5 in that it is of the core 31 - shell 32 type with a shell 32 which comprises several molecules of an affinity tag 321.
  • This amplification probe 3 is distinguished in that the envelope 32 comprises several molecules of a second affinity tag 321 which is complementary to the first affinity tag 12 of the primary probe 1.
  • At least 50% of the molecules of the second affinity tag 321 are linked to at least one molecule of the tracer 21.
  • bound is understood here advantageously to mean a strong bond, preferably a covalent bond.
  • the second affinity tag 321 / tracer 21 pair is thus advantageously chosen from the enzymatic conjugates or the photoactive conjugates, grafted onto the amplification probe 3.
  • said at least one amplification probe 3 advantageously comprises at least 20 molecules of said second affinity tag 321.
  • the second affinity tag 321 is adapted to bind specifically with the first affinity tag 12 which is carried by the primary probe 1.
  • the second affinity tag 321 is advantageously chosen from streptavidin or homologous, for example avidin or NeutrAvidin or Captavidin.
  • the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 also advantageously comprises spacers 322 which connect the nucleus 31 with a second affinity tag molecule 321.
  • the revelation step B is carried out under conditions suitable for generating the secondary complex C2 (in cascade) comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
  • the amplification probe 3 of this secondary complex C2 carries a plurality of second affinity tag 321 / tracer 21 conjugates.
  • This configuration then allows a significant amplification of the signal, with a plurality of tracer molecules 21 (intended to produce a signal) for an analyte molecule T.
  • the revelation step B is then advantageously carried out in a single phase during which the amplification probe 3 is added for the formation of the secondary complex C2.
  • revelation step B is carried out by directly adding the amplification probe 3 which is intended to bind with the primary probe 1 if it is still present.
  • the amplification probe 3 binds with the first affinity tag 12 of the primary probe 1, through the second affinity tags 321.
  • the amplification step could be implemented so as to obtain a secondary complex C2 comprising several amplification probes 3 in cascade / in series (for example two or three probes d. amplification 3), before adding the tracer 21.
  • the secondary complex C2 then advantageously comprises at least two amplification probes 3 linked together by at least one second affinity tag 5. Such an approach would make it possible to multiply the amplification effect.
  • the revelation step B also advantageously includes a final reading phase during which:
  • the analyte T is detected (presence of the analyte T in the sample E), when a signal is detected due to the formation of the secondary complex C2 comprising the tracer 21, or
  • the present invention also relates to the reagent system, or kit, for implementing the method according to the invention.
  • said at least one primary probe 1 which at least one primary probe 1 is a conjugate comprising, on the one hand, the binding site 11 capable of binding specifically with said analyte T and, on the other hand, the first label affinity 12, and
  • a tracer 21 intended to convert the complex C2 into a visible and / or measurable signal, said tracer 21 being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 , so that, in said complex C2, at least some of the molecules of the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 are linked to at least one molecule of said tracer 21.
  • the revelation reagents comprise:
  • said second affinity tag 5 capable of binding specifically with said first affinity tag 12, at least part of said second affinity tag 5 being in the form of said secondary probe 2 consisting of a conjugate comprising, on the one hand, said second affinity tag 5 and, on the other hand, the tracer 21, and - said at least one amplification probe 3, of the core 31 type - envelope 32, in which said envelope 32 comprises several molecules of said first affinity tag 12.
  • such a system of reagents is capable of forming, in the presence of said analyte T, a C2 complex according to the invention which comprises analyte T: primary probe 1: second affinity tag 5: amplification probe 3: secondary probes 2.
  • Amplification probe 3 of this C2 complex then advantageously carries several molecules of said at least one secondary probe 2.
  • the first affinity tag 12 is chosen from biotin or homolog (for example a silica nanoparticle carrying biotin molecules, also called “biotin-Si-NP” or “biotin-nanoparticle” in the examples).
  • the second affinity tag 5 is selected from streptavidin or homolog, eg, avidin, NeutrAvidin or Captavidin.
  • such a reagent system advantageously comprises:
  • said at least one primary probe 1 which at least one primary probe 1 is a conjugate comprising, on the one hand, the binding site 11 capable of binding specifically with said analyte T and, on the other hand, the first label affinity 12, and
  • the amplification probe 3 used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
  • a plurality of tracer molecules 21 are linked to an analyte T molecule.
  • the first affinity tag 12 is chosen from biotin or homolog.
  • the second affinity tag 321 is selected from streptavidin or homolog, eg, avidin, NeutrAvidin or Captavidin.
  • the detection system according to the invention can very well be adapted to the desired T analyte.
  • the detection system is advantageously in dot blot form for the search for an analyte of the nucleic acid type (see Figure 6).
  • the binding site 11 of the primary probe 1 is advantageously a complementary DNA probe, preferably coupled to biotin.
  • the detection system is advantageously in ELISA or MELISA form for the search for an analyte of the antigen or hapten type (see FIGS. 1 and 4).
  • the binding site 11 of the primary probe 1 is advantageously an antibody specific for the analyte, preferably coupled to biotin.
  • the system also advantageously comprises a above-mentioned capture probe 6, carried for example by a magnetic ball B.
  • Example 1 Manufacturing process of an amplification probe
  • Si-NPs silicon nanoparticles
  • Si-NPs silicon nanoparticles
  • an innovative solid-phase synthesis technology that allows the functionalization of nanometric-sized particles with DNA fragments, as previously reported (Bonnet et al, Analyst 2018, Issue 10, 2018; De Crozals et al, RSC Advances, 2012, 2, 11858-11866).
  • CPG Controlled Pore Glass
  • the linker which allows better accessibility of the functions of interest, has been synthesized.
  • biotin incorporation was monitored at 498 nm using quantitation of dimethoxytrityl by a UV-visible spectrophotometer.
  • the biotin-Si-NP were released from the CPG by incubating the support in 1mL of 0.1% (w / v) DBU in a 1/1 (v / v) water-acetonitrile mixture.
  • the DBU solution was stirred in a thermomixer at 22 ° C for 1 hour before being collected.
  • NP nanoparticles
  • the release kinetics were followed by quantifying the concentration of NP (nanoparticles) in each DBU solution by measuring the U V-visible at 560 nm.
  • the released nanoparticles were washed with milli-Q water (1x 4mL then 3x2 mL) and concentrated on a 30K Amicon Ultra filter (5000g, 10 min).
  • the amount of dT10-PEG2-dT10-10% Biotin strands per NP was estimated using a Varian Cary 100 Bio UV-visible spectrophotometer (Agilent Technologies) using a quartz cuvette with 1 cm optical path.
  • the nanoparticles were released from the CPG by incubating the support in 1mL of a 0.1% (w / v) solution of DBU (1,8-Diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene) in a mixture. water- acetonitrile 1/1 (v / v).
  • the DBU solution was stirred in a thermomixer at 22 ° C for 1 hour before being collected.
  • a fresh solution of DBU was added to the CPG suspension every hour.
  • the release kinetics were followed by quantifying the nanoparticle concentration of each DBU solution by measuring the UV-visible at 560 nm.
  • the released nanoparticles were washed with water (1x 4mL then 3x2 mL) and concentrated on a 30K Amicon Ultra filter (5000g, 10 min).
  • the amount of strands per NP was estimated using a Varian Cary 100 Bio UV-visible spectrophotometer (Agilent Technologies) using a quartz cuvette with 1 cm optical path.
  • the amount of linker grafted onto the nanoparticles was quantified by measuring the absorbance in water (200pL) at 260nm and 560nm using a microplate reader (Perkin Elmer).
  • the concentration of nanoparticles was estimated as described previously by Bonnet et al. (Analyst 2018). To correspond to this estimate, we established an approximate molar extinction coefficient at 163,200 M-1 cm-1 which takes into account the epsilons of the different parts of the sequence corrected by their corresponding coupling efficiency.
  • the functionalized NPs were observed under a transmission electron microscope (TEM) using a Philips CM120 device operating at an acceleration voltage of 120kV (Center Technonova des Microstructures, Lyon).
  • TEM transmission electron microscope
  • Philips CM120 device operating at an acceleration voltage of 120kV (Center Technonova des Microstructures, Lyon).
  • the Si-NPs were observed after depositing 5 ⁇ l of dilute solution on a copper grid covered with Formvar-carbon and evaporation to dryness.
  • Biotin-Si-NP were prepared using an innovative solid phase synthesis technology which allowed very high functionalization (Crozals et al., RSC Adv. 2012, 2, 11858-11866).
  • a hydroxyl group was attached to the surface of Si-NPs by silanization as previously reported (Farre et al., Langmuir, 2010; Bonnet et al, Analyst 2018).
  • the hydroxyl functions served as a support for the synthesis of an oligonucleotide linker on the surface of the NPs.
  • biotin groups were grafted to the linker as explained in Materials and Methods. MET observations showed that the NP morphology remained stable during synthesis.
  • Functionalized biotin-Si-NP had an average size of 50 ⁇ 3 nm, as estimated from TEM images. According to the absorbance measurements, the amount of linker was about 500 per NP. Furthermore, quantification of dimethoxytrityl established the coupling efficiency of biotin at 10%, which allowed biotin to be quantified at about 50 by N P. A relatively narrow particle size distribution of the functionalized NPs was confirmed by DLS measurements.
  • the Si-NPs formed monodisperse aqueous solutions of particles having a hydrodynamic diameter (RH) of about 90 nm. The conjugation of biotin + linker groups shifted the RH to about 120 nm. This increase is probably related to the hydration layer around the biotin units bound to the arms bearing negatively charged groups. Biotin-Si-NP solutions were stable at 4 ° C for at least two months.
  • Example 2 Double recognition strategy for sensitive detection of influenza A virus using nanoparticles coated with biotin and immunomagnetic beads
  • Bovine Serum Albumin (BSA), Bradford Serum, TMB ELISA Colorimetric Reagent (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine), Tween 20, HRP-Streptavidin, 5X ELISA Assay Buffer B / Sample Thinner and high quality chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) was provided by Andrea Dutscher (Brumath, France). Sodium chloride was purchased from Laurylab (Brindas, France). The buffers were prepared with deionized water and sterilized by 0.22 ⁇ m filtration.
  • the Dynabeads® M-280 Tosylactivated and DSB-XTM Biotin Protein Labeling Kit (D-20655) are respectively from Invitrogen and Molecular Probes (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Influenza A (9G8) and (5D8) anti-NuP antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz, CA, USA). The rhodamine coated silica nanoparticles were supplied by Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Oligonucleotides were synthesized using an Applied Biosystems 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • the phosphoramidite synthons Biotin-TEG-phosphoramidite (1-dimethoxytrityloxy-3-0- (N-biotinyl-3-aminopropyl) - triethylene glycolyl-glyceryl-2-0- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) -phosphoramidite); Phosphoramidite spacer 9 (9-0-dimethoxytrityl-triethylene glycol, 1 - [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite); dT-CE phosphoramidite (5'-dimethoxytrityl-2'-deoxythymidine, 3 '- [(2 cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite) and all synthesis reagents were purchased from Glen Research (Sterling , Virginia).
  • nucleoprotein (NuP) gene of H1N1 influenza virus strain A / WSN / 33
  • strain A / WSN / 33 The full length nucleoprotein (NuP) gene of H1N1 influenza virus (strain A / WSN / 33) with a 6-His tag at its C-terminus was cloned into Escherichia coli expression vector pET22 (Novagen) and expressed in E. coli BL-21 Rosetta DE3 (Stratagene).
  • Transformed cells were grown at 37 ° C in 100 ml of Luria-Bertani medium containing ampicillin up to the mid-exponential phase, then induced for 4 hours by addition of 1 mM isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside at 37 ° C. with stirring. NuP was purified.
  • RNAse A 0.15 mg / ml at 35 ° C for 20 min in the presence of 10 mM Mg 2+ ions.
  • the protein was purified by affinity chromatography using magnetic Ni beads (PureProteome, Millipore), following the procedure recommended by the manufacturer. NuP was then dialyzed against Tris buffer (20mM Tris, 300mM NaCl, pH 7.5). After dialysis, the protein concentration was determined using an extinction coefficient e of 56200 M 1 cm -1 at 280 nm.
  • influenza A / WSN / 33 (H1N1) virus was obtained by reverse genetics and amplified on MDCK cells. Viruses were titrated by the plaque method. Purified viruses were inactivated by UV light for 38 min. The inactivation efficiency was verified by re-infection of MDCK cells. Inactivated influenza A / H1 samples were stored at -80 ° C. Influenza A / UDORN / 72 (H3N2) was spread on an embryonic chicken egg and applied to MDCK cells. Viruses were titrated by the plaque method. Purified viruses were inactivated using binary ethyleneimine (BEI) and stored at -80 ° C.
  • BEI binary ethyleneimine
  • the Flanders13 (13V09) porcine respiratory reproductive syndrome virus (VSDRP) used in this study was kindly provided by Dr. Nicolas Bertho (INRA, France) and Dr. Fanny Blanc (INRA, France).
  • viral concentrations were determined in terms of MDCK cell infection.
  • the initial virus titers were 10 8 PFU / mL for H1N1 sample 1, 1.5 10 8 PFU / mL for H1N1 sample 2, 10 8 PFU / mL for H2N3.
  • Control VSDRP virus was titrated at 10 7 PFU / mL.
  • tosyl activated magnetic beads (Dynabeads TM M-280, Invitrogen, US) were coated with 10 ⁇ g of anti-NuP Influenza A antibody (9G8) per mg of beads for 1 hour. with moderate agitation, according to the protocol recommended by the manufacturer. Then, after 15 minutes of passivation in BSA buffer (0.1M sodium phosphate, 150mM sodium chloride, 0.5% (w / v) BSA, pH 7.6), the magnetic beads were washed. three times in 0.01 M sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, 0.1% (w / v) BSA, pH 7.4 and stored at 4 ° C until testing.
  • BSA buffer 0.1M sodium phosphate, 150mM sodium chloride, 0.5% (w / v) BSA, pH 7.6
  • MELISA protocol for the detection of disabled viruses 1.10 6 magnetic beads previously coated with anti-NuP antibodies for Influenza A (9G8) were first of all washed three times with PBS buffer. Solutions of deactivated virus (PBS, 10% saliva) were incubated with the beads with moderate agitation at room temperature for 1 hour. The beads were concentrated by means of a magnet and washed three times with Wash Buffer 0.1. Conjugated anti-biotin antibody (0.5 ⁇ g / ml) in Capture Buffer (PBS, 0.1% tween, 0.1% BSA) was added to the suspension before gentle stirring for 1 hour. .
  • Streptavidin / HRP developing solution 100 ⁇ L, 1 ⁇ g / mL was added and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes at 1000rpm in a thermomixer. The beads were washed three times with Washing Buffer 0.1 before adding 100 ⁇ L of TMB and incubating in the dark for 30 minutes at room temperature. Finally, the supernatant was diluted with 100 ⁇ l of 2M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was read in a microplate reader (Perkin Elmer). A450 nm - Asso nm gave the correct value after removing the background signal.
  • biotin-NP (1.10 11 NP / mL in PBS, Tween 20 at 0.1% (v / v)) were added to the suspension of magnetic beads before a incubation for 30 minutes at 1000 rpm in a thermomixer.
  • a streptavidin / HRP developing solution 100 ⁇ L, 1 ⁇ g / mL was added before the suspension was incubated at room temperature for 30 minutes at 1000 rpm in a thermomixer.
  • the beads were washed three times with Washing Buffer 0.1 before adding 100 ⁇ L of TMB and incubating in the dark for 5 minutes at room temperature. Finally, the supernatant was diluted with 100 ⁇ l of 2M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was read in a microplate reader (Perkin Elmer). A450 nm - Asso nm gave the correct value after removing the background signal.
  • biotin-NPs to amplify the positive signal in the detection step.
  • Silica nanoparticles 50 nm in diameter were surface functionalized with an oligonucleotide strand carrying a biotin group at its end.
  • the NPs were first immobilized on a controlled porosity glass support (CPG).
  • CPG controlled porosity glass support
  • NOM Nano-on-Micro
  • SEM Sccanning Electron Microscopy
  • the NOM material was used in a DNA / RNA synthesizer to perform NP functionalization via phosphoramidite chemistry. This strategy has made it possible to obtain highly functionalized nanoparticles.
  • a spacer oligonucleotide (ODN sequence: dTio-PEG2-dTio) was synthesized on the NPs in order to remove the biotins from the surface of the NPs.
  • ODN per NP About 500 ODN per NP were estimated by measuring UV absorbance at 260 nm and 560 nm and quantifying the ODN per NP ratio in the suspension, a protocol described by Bonnet et al. (Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: Application to the sensitive detection of bacteria in human platelet concentrates. Analyst. 143 (10), 2293-2303 (2016)). Then the biotin group was incorporated. We decided to control the synthesis program on the device to obtain a coupling efficiency of 10% for the incorporation of biotin. Using this strategy, we incorporated about 50 biotins per N P. This amount was optimized to achieve efficient binding of the biotin group during the MELISA assay.
  • the number of NPs in the suspension obtained was estimated from the fluorescent NP quantification curve.
  • the structure of NPs after release was checked by TEM. This observation showed that the morphology of the NPs remained stable during the synthesis.
  • the assay based on biotin-nanoparticles and immunomagnetic beads was studied for the detection of the H1N1 viruses (samples 1 and 2), H3N2 and VSDRP (Fig. 8).
  • the viral solutions were diluted in lysis buffer supplemented with 10% saliva.
  • the detection step was performed using highly biotinylated nanoparticles to increase the anchoring efficiency of streptavidin-HRP. This strategy allowed an increase in the signal in the event of a positive response (Fig. 8). This improved sensitivity proved the effectiveness of the amplification strategy.
  • Detection limits of 3x10 3 PFU / mL, 6x10 4 PFU / mL and 4x10 4 PFU / mL were calculated for sample 1 and sample 2 of H1N1, and H3N2, respectively.
  • biotin-NP in the detection step improved the sensitivity of the MELISA assay by a factor of 65 to 75.
  • Si-NP silica nanoparticles
  • Biotin-decorated Si-NPs were used to improve the readout of the streptavidin chemiluminescent signal - HRP.
  • An improvement in signal intensity compared to the conventional test was obtained due to the conjugate effect of biotin-Si-NP compared to biotin alone.
  • Our study illustrates the invention that the conjugate effect of biotin-Si-NP could become an effective way to increase the sensitivity of the cost-effective, specific and easy to perform dot blot technique.
  • Streptavidin-HRP Proclin, acetonitrile, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU), controlled porosity glass (120-200 Mesh, CPG-3000 ⁇ ). .were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Fluorescent rhodamine B silica NPs (Si-NP, diameter ⁇ 50 nm) were supplied by Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Phosphoramidite DNA building blocks and all DNA synthesis reagents were purchased from Glen Research (Sterling, Virginia, USA). Phosphate buffered saline (PBS) was purchased from Andrea Dutscher (Brumath, France).
  • Triton, SDS, NaCl, Trizma base, phenol, chloroform, bacteriological peptone and isoamyl alcohol were purchased from SIGMA (Milan, Italy).
  • SIGMA Tinucleotide
  • Campylobacter from C. jejuni, C. edi, C. lari, C. upsaliensis and C. fétus (base localization: 72-108) was used as a recognition element (probe called CampyP3). CampyP3 has been labeled at its 5 ′ end with biotin for the development of a chemiluminescent dot blot assay. The probe was tested using the OligoAnalyzer3.1
  • PR was designed by mismatching nucleic acid positions of the CP3 sequence, while PE corresponded to the E. coli sequence which shows some similarities to Campylobacter.
  • Campylobacter strains were grown under microaerophilic conditions (5% C> 2, 10% CO2 and 80% N2) in anaerobic gas jars.
  • Microaerophilic conditions were generated using an Oxoid TM CampyGen TM 2.5 I Sachet (Oxoid, Italy) at 37 ° C for 48h.
  • DNA was extracted from Campylobacter isolates from Columbia blood agar plates (both pure strains and isolates were from chicken samples) after Gram staining and light microscopic observations of morphology and mobility. cells (Brucella broth, Thermofisher, Italy) after oxidase and catalase tests.
  • DNA extraction from pure cultures and enrichment broths DNA was extracted from pure strains and isolates of chicken samples according to Manzano et al (2015). 2 ml of Bolton Enrichment Broth was harvested by centrifugation at 13,000 g and 4 ° C for 10 min. The bacterial pellets were washed three times with PBS, before being subjected to DNA extraction as previously reported (Manzano 2015). The extracted DNAs were rehydrated using 50 ⁇ l of sterile distilled water and treated with RNase enzyme at 37 ° C for 1 h. Finally, DNA was quantified using Nanodrop TM 2000C (ThermoFisher Scientific, Italy). The DNA concentration was adjusted to 100 ng / mL using sterile distilled water.
  • the extracted DNA samples were denatured at 95 ° C for 10 min, immediately placed on ice and deposited as a fraction of 1 ⁇ l on the positively charged nylon membrane (Amersham Hybon TM -XL, GE Healthcare, France).
  • the membrane which received the deposits was exposed to UV at 254 nm for 10 minutes to fix the DNA.
  • the membrane was soaked in preheated hybridization buffer ( 0.5 M Na 2 HP0 4, 0.5 M NaH 2 PO 4, 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 7.5) at 65 ° C for 30 min. with moderate agitation.
  • the membrane was transferred to a new petri dish and incubated with 10 6 biotin-Si-NP / mL, PBS, pH 7 , 4 for 30 min, at room temperature, with moderate stirring. 0.7 mM streptavidin-HRP in blocking solution was added after washing and incubated for 30 min with shaking. The signal was then revealed using the improved chemiluminescent substrate luminol for HPR detection (Thermo Scientific, France). The membrane was removed from solution and observed using an imaging system.
  • ChemiDoc MP Biorad, France. Detection signals were quantified using Image LabTM software (Biorad). The normalized value of the dot intensity was calculated using the equation (RI0 -Pln) / PI0, where RI0 and Pin represent the pixel intensity obtained for the detection of 0.1 ng / pL of CP3 probe (standard) and experimental sample, respectively.
  • the target DNA was first immobilized on a porous nylon membrane by UV irradiation to allow DNA crosslinking to the positively charged surface.
  • the biotin-labeled CampyloP3 complementary DNA probe was allowed to hybridize with the target DNA. Hybridization was detected using a streptavidin-HRP conjugate in combination with a chemiluminogenic luminol substrate in the presence of the H2O2 activator.
  • the streptavidin-biotin sandwich made it possible to bind biotin-Si-NP to the DNA probe, and therefore, to amplify the detection signal compared to biotin alone.
  • Standard curves were established using a CP3 DNA target in both dot blot configurations (without and with biotin-Si-NP) under optimized conditions.
  • the calibration curves were obtained from the quantification of the intensity of the chemiluminescent light for each concentration of CP3, from at least three independent spots per concentration.
  • biotin-Si-NP resulted in an almost 30-fold increase in the intensity of the chemiluminescent signal.
  • the calculated LODs were similar or lower than those obtained with the sensors reported previously for the detection of Campylobacter, such as for example 0.5 ng / pL in Fontanot et al. (2014), 0.37 ng / pL in Manzano et al. (B & B2015) and 0.09 nM in Morant-Minana et al. (B&B, 2015).
  • the reproducibility of the dot blot enhanced by biotin-Si-NP was estimated at 5% according to the signal obtained for the detection of the same concentration of CP3.
  • the proposed biotin-Si-NP-enhanced dot blot method succeeded in detecting low levels of Campylobacter naturally present after enrichment, and could be considered for the determination and detection of Campylobacter spp. present in contaminated poultry meat.
  • This work describes a simple dot blot method, improved with biotin-Si-NP, for rapid and reliable detection of Campylobacter spp. present in contaminated poultry meat.
  • the dot blot test is widely used in molecular biology and genetics to detect a target DNA / RNA sequence.
  • biotin-Si-NPs resist well to temperature of use and are stable over time.
  • the LOD obtained was 0.006 ng / ⁇ l (0.2 nM). Such low concentrations of DNA detected are close to those that can be detected by qPCR (Manzano et al. 2018; Vidic et al., 2019).
  • the developed system is a promising tool for rapid and inexpensive screening of poultry samples for the presence of Campylobacter because detection is performed on bacterial DNA without a prior amplification step.
  • our dot blot can be applied to DNA extracted by different extraction methods and from various food matrices, since it is not sensitive to DNA polymerase inhibitors.
  • the proposed multiplex, miniaturized and sensitive paper test is simple to design and could be used by the food industry and regulatory agencies for the detection of other pathogens to monitor food quality. We believe that in the future it could be integrated with a lab-based biosensor on a chip that includes an automated DNA extraction protocol, or even a cell phone.
  • DNA was extracted from pure strains and isolates of chicken samples according to Manzano et al (2015). The concentration of total DNA was adjusted to 100 ng / mL using sterile distilled water. Before immobilization, the extracted DNA samples were denatured at 95 ° C for 10 min, immediately placed on ice and deposited as a fraction of 1 ⁇ l on the positively charged nylon membrane (Amersham Hybon TM -XL, GE Healthcare, France).
  • the membrane which received the deposits was exposed to UV at 254 nm for 10 minutes to fix the DNA.
  • the membrane was soaked in preheated hybridization buffer ( 0.5 M Na 2 HP0 4, 0.5 M NaH 2 P0 4 , 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 7.5) at 65 ° C. for 30 min with moderate stirring. 4 ng / pL of the CampyP3 probe labeled with denatured biotin (100 ng / pL) was added to the hybridization buffer and left overnight at 65 ° C. with moderate stirring to allow hybridization. The membrane was washed twice with 0.1 SDS, SSC (sodium citrate saline,
  • the signal was then revealed using the improved chemiluminescent substrate for HPR detection (Thermo Scientific, France).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d'au moins un analyte (T) susceptible d'être contenu dans un échantillon. Le procédé comprend : (a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon (E) est mis en présence d'au moins une sonde primaire (1), pour former le cas échéant un complexe primaire (C1), (b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant de la sonde primaire (1) dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2), lequel au moins un réactif de révélation comprend : - au moins une sonde d'amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d'une étiquette d'affinité (321), et - un traceur (21) destiné à convertir le complexe secondaire (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec l'étiquette d'affinité (321) de ladite au moins une sonde d'amplification (3), de sorte que, dans ledit complexe secondaire (C2), certaines au moins des molécules de ladite étiquette d'affinité (321) de ladite au moins une sonde d'amplification (3) sont liées avec ledit

Description

Procédé et système pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon
Domaine technique de l'invention
La présente invention concerne le domaine des techniques pour l’analyse des échantillons liquides.
Elle concerne en particulier le domaine des procédés et systèmes pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Etat de la technique
Les techniques d’analyse s’intéressent à l'identification et la caractérisation de substances chimiques, dits « analytes », dans un échantillon.
L’analyse mise en œuvre peut être qualitative, lorsque la technique permet une recherche de la présence de l’analyte dans l’échantillon ; cette analyse peut être quantitative, lorsque la technique permet en outre une mesure de la quantité d’analyte dans l’échantillon.
De telles techniques d’analyse englobent notamment les analyses biologiques lorsque l’analyte recherché consiste en un analyte biologique.
Pour un tel usage, la technique d’analyse doit assurer un dosage sélectif et sensible de l’analyte susceptible d’être contenu dans l’échantillon analysé.
Par exemple, la recherche de pathogènes peut s’appuyer sur une propagation par culture avant isolement. Ces méthodes sont efficaces et sensibles mais sont généralement laborieuses et sur un temps long (les résultats sont disponibles généralement seulement après plusieurs jours).
Pour une telle analyse biologique, il existe également des méthodes de biologie moléculaire qui se basent sur l’amplification génétique, typiquement la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ; ces méthodes ont l’intérêt d’être spécifiques, sensibles et rapides. Mais, ces techniques ont besoin de matériel génétique isolé, nécessitant un équipement sophistiqué et coûteux.
D’autres outils analytiques s’appuient sur les propriétés de liaison moléculaire spécifique qui sont rencontrées chez des molécules biologiques connues génériquement sous le nom de capteurs biologiques ou biocapteurs (dits encore biosenseurs ou « biosensors »).
De tels biocapteurs sont particulièrement intéressants pour la détermination rapide et efficace de marqueurs, typiquement de marqueurs biologiques, en raison de leur simplicité de mise en œuvre, de leur miniaturisation possible et de leur capacité d'analyse en temps réel.
Un biocapteur possède en effet la capacité de reconnaître un marqueur biologique cible (biomarqueur ou « target biomarker »), caractéristique de l’analyte cible (par exemple un agent pathogène d’intérêt). Le biocapteur porte pour cela un élément de détection appelé couramment « biorécepteur » (dit encore récepteur biologique ou « biorécepteur »).
De tels biorécepteurs, connus en soi, consistent par exemple en des anticorps monoclonaux, ARN, ADN, glycanes, lectines, enzymes, tissus ou cellules entières.
Le biorécepteur joue un rôle déterminant car ses propriétés biochimiques assurent la sensibilité et la sélectivité dans la détection des biomarqueurs et permettent d’éviter les interférences avec d’autres composés de l’échantillon testé.
L'interaction biochimique spécifique entre le biomarqueur et le biorécepteur est ensuite convertie, grâce à un élément traceur (dit encore transducteur ou « transductor »), en un signal mesurable.
L'enregistrement et l'affichage du signal permettent une identification qualitative, voire quantitative, de l’analyte dans l’échantillon analysé.
Dans une détection « directe », le traceur est porté directement par le biocapteur.
Mais un tel système d’analyse risque de ne pas offrir un signal suffisant pour être détectable.
En effet, une molécule d’analyte est généralement apte à coopérer avec un nombre restreint de molécules de biocapteur / traceur, voire avec une seule molécule de biocapteur / traceur.
Or, dans certaines applications, par exemple les essais visant à détecter une infection d’un patient ou une contamination microbiologique d’un produit, il est nécessaire d’offrir une grande sensibilité au regard des agents pathogènes en présence qui risquent de se propager rapidement avant l'apparition de tout symptôme.
Pour amplifier le signal, certains systèmes d’analyse s’appuient sur une détection en cascade dans laquelle le biorécepteur est lié à un composé amplificateur apte à recevoir plusieurs molécules de traceur.
Cette approche « indirecte » permet alors une fixation indirecte d’une pluralité de molécules de traceur pour une molécule d’analyte.
Il est ainsi toujours intéressant de disposer de nouveaux procédés et systèmes adaptés à déterminer, avec une sensibilité accrue, la présence et/ou la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Présentation de l'invention
La présente invention propose ainsi des procédés et systèmes adaptés à déterminer, avec une sensibilité accrue, la présence et/ou la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Plus particulièrement, on propose selon l’invention un procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon. De préférence, ledit au moins un analyte est choisi parmi les analytes biologiques, notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques.
Le procédé selon l’invention comprend :
(a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon est mis en présence d’au moins une sonde primaire, laquelle au moins une sonde primaire est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte pour former le cas échéant un complexe primaire et, d’autre part, une première étiquette d’affinité,
(b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant de la sonde primaire (et de préférence d’une première étiquette d’affinité de ladite sonde primaire) dudit complexe primaire, un complexe secondaire, lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité, et
- un traceur destiné à convertir le complexe secondaire en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification, de sorte que, dans ledit complexe secondaire, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification sont liées avec ledit traceur.
Un tel procédé permet ainsi, par une simple adaptation des systèmes de détection en cascade, une amplification significative du signal de détection.
En effet, en présence de l’analyte, le complexe secondaire obtenu comporte la sonde d’amplification qui constitue avantageusement une interface apte à recevoir une pluralité de molécules de traceur.
En d’autres termes, le procédé selon l’invention permet d’obtenir une fixation indirecte / en cascade, dans laquelle une pluralité de molécules de traceur sont liées à une molécule d’analyte.
Cette nouvelle technologie confère une amélioration de la détection de tout type d’analytes, en particulier d’analytes biologiques (microorganismes, marqueurs de virulence, marqueurs de résistance aux antibiotiques, etc.).
Encore en d’autres termes, l’ajout de la sonde d’amplification dans un système de détection en cascade permet une augmentation significative du signal.
Selon un mode de réalisation avantageux, l’étiquette d’affinité de l’enveloppe de ladite au moins une sonde d’amplification consiste en : - une première étiquette d’affinité, identique à la première étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde primaire, ou
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde primaire.
Dans le cadre de ce mode de réalisation avantageux, au cours de l’étape de révélation, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés :
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité se présentant sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur, et
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau-enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité, de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité : sonde d’amplification : sondes secondaires, ladite sonde d’amplification dudit complexe secondaire étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire.
Une partie de ladite seconde étiquette d’affinité de l’étape de révélation est avantageusement dépourvue dudit traceur.
Selon une variante de ce mode de réalisation avantageux, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur, de sorte à obtenir, partant de la sonde primaire dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : sonde d’amplification.
D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes :
- la première étiquette d’affinité est choisie parmi la biotine ou homologue, et la seconde étiquette d’affinité est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine ;
- ladite au moins une sonde d’amplification comprend un noyau formé par une nanoparticule ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm ; la nanoparticule est avantageusement choisie parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice, de préférence encore parmi les nanoparticules composées de silice, avantageusement encore parmi les billes de silice ; - ladite au moins une sonde d’amplification comporte au moins 20 molécules de ladite étiquette d’affinité ;
- l’enveloppe de ladite au moins une sonde d’amplification comprend des espaceurs, reliant le cœur avec une molécule de première étiquette d’affinité ; les espaceurs sont par exemple choisis parmi les espaceurs nucléiques, par exemple les séquences d’ADN ;
- le traceur est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, photoacoustiques, ou photothermiques ; le cas échéant ladite au moins une sonde secondaire est avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs (conjugués colorés, fluorescents, luminescents) ; les conjugués enzymatiques sont avantageusement choisis parmi les conjugués streptavidine-HRP ou streptavidine-PA, et les réactifs de l’étape de révélation comprennent un substrat desdits conjugués enzymatiques pour une réaction de chimiluminescence en présence dudit complexe secondaire ;
- l’étape de révélation est mise en œuvre en deux phases successives avec une première phase au cours de laquelle est ajoutée ladite seconde étiquette d’affinité, éventuellement au moins une partie sous forme de ladite au moins une sonde secondaire, pour former un premier sous-complexe comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité, puis une seconde phase au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification et ladite au moins une sonde secondaire pour former ledit complexe secondaire, ou une phase unique au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire ;
- le site de liaison de ladite au moins une sonde primaire est choisie parmi les biomolécules, par exemple les sondes nucléiques (séquences ARN, ADN, aptamères), les sondes protéiques (anticorps, enzymes, antigènes, peptides) ;
- préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire, ledit au moins un analyte est fixé sur un support, par exemple pour un procédé du type dot blot, ou sur une sonde de capture, portée par exemple par une bille magnétique pour une technique MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich,
- l’étape d’amplification est mise en œuvre de sorte à obtenir un complexe secondaire comportant plusieurs sondes d’amplification en cascade / en série (par exemple deux ou trois sondes d’amplification) ; le complexe secondaire comprend avantageusement au moins deux sondes d’amplification reliées, entre elles, par au moins une seconde étiquette d’affinité.
La présente invention concerne aussi l’utilisation d’une sonde du type noyau-enveloppe en tant que sonde d’amplification du signal dans un procédé de détection en cascade pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon, ladite sonde d’amplification comportant une enveloppe qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité. De préférence, la sonde d’amplification comporte une enveloppe qui comprend plusieurs molécules d’une première étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement chacune à une seconde étiquette d’affinité, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité étant destinée à se présenter sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur.
De manière alternative, la sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, comporte une enveloppe qui comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur.
La présente invention concerne encore le système de réactifs, pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
Le système de réactifs comprend :
- au moins une sonde primaire, laquelle au moins une sonde primaire est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte et, d’autre part, une première étiquette d’affinité, et
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe partant de la sonde primaire, lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité, et
- un traceur destiné à convertir le complexe en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification, de sorte que, dans ledit complexe, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification sont liées à au moins une molécule dudit traceur.
Selon un mode de réalisation préféré, les réactifs de révélation comprennent :
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité se présentant sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur (enzyme, fluorophore, radio-isotope, molécule rédox, etc.), et
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau-enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité, lequel système de réactifs est apte à former, en présence dudit analyte, un complexe comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité : sonde d’amplification : sondes secondaires, ladite sonde d’amplification dudit complexe secondaire étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, possède une enveloppe qui comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur, de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : sonde d’amplification.
Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.
Description détaillée de l'invention
De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où :
[Fig. 1] est une vue schématique d’un complexe primaire entre un analyte et une sonde primaire (du type anticorps), qui est obtenu à l’issue de l’étape de reconnaissance selon l’invention ;
[Fig. 2] est une vue schématique d’une première sonde d’amplification adaptée au procédé selon l’invention ;
[Fig. 3] est une vue schématique d’un complexe secondaire issu de l’étape de révélation, obtenu par la liaison en cascade du complexe primaire avec notamment une sonde d’amplification (selon la figure 2) liée à plusieurs molécules d’une sonde secondaire formant traceur ;
[Fig. 4] est une vue schématique d’un complexe secondaire dans lequel l’analyte est lui- même fixé par une bille magnétique lors d’un essai sous la forme immuno-absorption enzymatique sur bille support magnétique (dit encore « magnetic bead-based enzyme-linked immunosorbent assay » ou MELISA) ;
[Fig. 5] est une vue une vue schématique d’un complexe secondaire, dans lequel l’analyte est lui-même fixé sur un support dans le cadre d’une technique d'hybridation moléculaire dot blot ;
[Fig. 6] est une vue schématique d’une seconde sonde d’amplification adaptée au procédé selon l’invention ; [Fig. 7] est une vue schématique d’un complexe secondaire issu de l’étape de révélation, obtenu par la liaison en cascade du complexe primaire avec une sonde d’amplification selon la figure 6 portant plusieurs molécules de traceur ;
[Fig. 8] est une figure illustrant l’absorbance (450 - 550 mm) par technique Biot-NP MELISA en fonction d’unités formant des plaques (PFU/mL), pour des virus entiers provenant de différentes souches (H1 N1, H3N2, PRRSV) dans un tampon contenant 10% de salive ;
[Fig. 9] est une vue comprenant (A) Détection par dot blot de la séquence d'ADN de Campylobacter avec lecture améliorée par biotine-Si-NP. Il est à noter qu'aucun signal n'a été obtenu avec une séquence de Campylobacter tronquée (PR) ni avec une séquence de contrôle d'E. Coli (PE). (B) Détection conventionnelle par dot blot de la sonde CampyP3 marquée à la biotine en utilisant la dilution de la séquence complémentaire Campylobacter CP3 allant de 1 ng / pl_ à 78 fg / pl_. (C) Détection dot blot améliorée de CP3 (0,1 ng / mI_ - 78 fg / mI_) en utilisant la sonde CampyP3. (D-E) Les courbes d'étalonnage correspondantes ont été obtenues en traçant l'intensité du signal chimiluminescent des points en fonction des concentrations du modèle CP3 sans et avec la lecture améliorée par biotine-Si-NP.
[Fig. 10] est une vue montrant les résultats des tests d'inclusivité et d'exclusivité du capteur dot blot amélioré dans les cultures pures ;
[Fig. 11] illustre une membrane dot blot obtenue avec des échantillons de poulet naturellement infectés (C*3 et C10) et non infectés (C4, C5 et C6) ; la séquence de matrice CP3 (0,1 ng / pL) a été utilisée comme contrôle positif.
Il est à noter que, sur ces figures, les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références.
La présente invention concerne des procédés et systèmes pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon.
Par « analyte », on entend toute entité chimique, biochimique ou biologique, que l'on souhaite détecter dans un échantillon.
Cette entité chimique consiste avantageusement en une entité issue du monde vivant, de préférence du monde végétal ou du monde animal, voire encore présent chez l’être humain.
Parmi les analytes détectables par les dispositifs et les procédés selon la présente invention, on citera en particulier les analytes biologiques, notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques.
Par « échantillon », on entend tout échantillon dans lequel l'analyte recherché est en solution ou en suspension. Cet échantillon peut notamment être tout fluide biologique ou corporel.
L'échantillon peut également avoir été obtenu directement ou indirectement à partir d'un fluide biologique ou corporel.
L'échantillon peut également être un extrait liquide d'un échantillon solide ou gazeux.
L’échantillon est par exemple issu de l’eau, l’air, le sol, les matériaux biologiques (tissus, micro-organismes, organites, récepteurs cellulaires, enzymes, anticorps, acides nucléiques, organismes génétiquement modifiés, ou matériels issus d'OGM, etc.).
Le procédé et le système selon l’invention sont intéressants en ce qu’ils peuvent être adaptés aussi bien à la détermination de la présence d’au moins un analyte, qu’à la détermination de sa quantité.
Par « détecter » ou « déterminer », on entend ainsi la détermination qualitative (avantageusement la présence ou l'absence) d’un ou plusieurs analytes dans un échantillon.
Par « détecter » ou « déterminer », on englobe aussi la mesure et la quantification d’un ou plusieurs analytes dans l’échantillon.
Procédé de détermination
De manière générale, le procédé selon l’invention comprend les étapes successives suivantes :
(a) une étape de reconnaissance A (figure 1) au cours de laquelle l’échantillon E (non représenté) est mis en présence d’au moins une sonde primaire 1 apte à se lier spécifiquement avec l’analyte T pour former le cas échéant un complexe primaire C1 ,
(b) une étape de révélation B (figures 3 et 7 notamment) au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former un complexe secondaire C2 partant de la sonde primaire 1 (et de préférence d’une première étiquette d’affinité 12 de ladite sonde primaire 1) dudit complexe primaire C1.
Selon l’invention, ledit au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (figures 2 et 6), et
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable (figures 3 et 6).
De manière générale, ledit au moins un réactif de révélation est destiné à se lier, en cascade, depuis ladite au moins une sonde primaire 1 (et avantageusement depuis sa première étiquette d’affinité 12) pour former le complexe secondaire C2.
Lors de l’étape de révélation, ledit au moins un réactif de révélation mis en œuvre permet d’obtenir, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 dans lequel certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 sont liées (directement ou indirectement) avec au moins une molécule du traceur 21 (figures 3 et 7).
Pour cela, avant formation du complexe secondaire C2, ledit traceur 21 peut avantageusement présenter deux formes différentes :
- le traceur 21 est un réactif distinct par rapport à ladite au moins une sonde d’amplification 3 ; le traceur 21 est destiné à se lier avec l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 (figure 3 notamment), ou
- le traceur 21 et la sonde d’amplification 3 forment un unique réactif ; le traceur 21 est lié avec l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 (figures 6 et 7).
Le traceur 21, dit encore « marqueur », « transducteur » ou « transductor », est destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable.
Par « traceur », on entend ainsi tout entité permettant une détection directe ou indirecte à l'œil nu, ou à l'aide d'un appareil, en raison de l'émission d'un signal.
Le signal est par exemple une fluorescence, une coloration, une présence d'isotope ou un signal magnétique.
Le traceur 21 peut ainsi être choisi parmi les traceurs classiques en soi. De préférence, ce traceur 21 est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, les particules photoacoustiques ou les particules photothermiques.
Par « lier » ou « liaison », on entend avantageusement :
- toute liaison forte, par exemple covalente (en particulier pour un unique réactif), mais aussi
- toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte ou étiquettes d’affinité (en particulier pour des réactifs distincts).
De préférence, l’étiquette d’affinité 321 de l’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 est choisie parmi :
- une première étiquette d’affinité 321, identique à la première étiquette d’affinité 12 de ladite au moins une sonde primaire 1, ou
- une seconde étiquette d’affinité 321 apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité 12 de ladite au moins une sonde primaire 1.
Dans un premier mode général de réalisation, l’étape de révélation B conduit à ajouter au moins les réactifs de révélation suivants :
- une seconde étiquette d’affinité 5 apte à se lier spécifiquement avec ladite sonde primaire 1, dont au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité 5 se présentant sous la forme d’une sonde secondaire 2 munie d’un traceur, et
- au moins une sonde d’amplification 3. Lors de cette étape de révélation, les réactifs de révélation 2, 3, 5 mis en œuvre permettent l’obtention, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2 est en particulier liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 (portant le traceur) est liée à une molécule d’analyte T.
Cette structure offre alors une amplification significative du signal obtenu pour chaque molécule d’analyte T en présence, grâce à la multiplication des sondes secondaires 2 composant le complexe secondaire C2 (rapportées sur la sonde d’amplification 3).
Dans un second mode général de réalisation, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321 dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21.
Lors de cette étape de révélation, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre permet l’obtention, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de traceur 21 est liée à une molécule d’analyte T.
Cette structure offre alors une amplification significative du signal obtenu pour chaque molécule d’analyte T en présence, grâce à la multiplication des traceurs 21 portés par la sonde d’amplification 3.
Tel que développé ci-après, pour obtenir ce complexe secondaire C2, les réactifs de révélation sont assemblés en cascade par des liaisons moléculaires spécifiques s’appuyant sur des étiquettes d’affinité complémentaires.
Les réactifs mis en œuvre dans le procédé comprennent pour cela avantageusement au moins un couple d’étiquettes d’affinité, voire un unique couple d’étiquettes d’affinité.
De manière générale, par « étiquettes d’affinité », on entend avantageusement un couple d’entités chimiques, biochimiques ou biologiques, qui sont aptes à se lier spécifiquement l’une avec l’autre, pour former un complexe.
De tels « étiquettes d’affinité » englobent notamment les ligands biologiques choisis parmi les peptides et les oligonucléotides.
Par exemple, et tel que développé par la suite, les étiquettes d’affinité sont choisies parmi le couple :
- la biotine (dite encore « biotin » ou « biot » dans les exemples) ou homologue, d’une part, et - la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine, Captavidine, d’autre part.
Les étapes de ce procédé de détermination, y compris les réactifs mis en œuvre, sont décrits plus en détails ci-après.
Etape de reconnaissance A
Au cours de l’étape de reconnaissance A, l’échantillon E est ainsi mis en présence de ladite au moins une sonde primaire 1 formant un biocapteur.
Tel qu’illustré schématiquement sur les figures 1 et 5, ladite au moins une sonde primaire 1 consiste pour cela en un conjugué comprenant :
- un site de liaison 11 , formant encore « biorécepteur » ou élément de reconnaissance, apte à se lier spécifiquement avec l’analyte T pour former le cas échéant le complexe primaire C1, et
- une première étiquette d’affinité 12.
De manière générale, le complexe secondaire C2 est avantageusement formé, en cascade, à partir de la première étiquette d’affinité 12.
Ladite au moins une sonde primaire 1, et en particulier son site de liaison 11, consiste en toute entité chimique, biochimique ou biologique, qui est apte à se lier spécifiquement à l’analyte T pour former le complexe primaire C1 (avantageusement binaire).
Par « lier » ou « liaison », on entend toute liaison forte, par exemple covalente, mais aussi toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte.
Une telle sonde primaire 1, et en particulier son site de liaison 11, est ainsi avantageusement choisie parmi les biomolécules, à savoir par exemple :
- les sondes protéiques (figure 1), englobant les anticorps, les enzymes, les antigènes, les peptides, ou
- les sondes nucléiques (figure 5), englobant les séquences ARN, les séquences ADN, les aptamères.
La sonde primaire 1 (et en particulier son site de liaison 11) est choisie pour ses propriétés de liaison spécifique à l'analyte T, comme par exemple un couple ligand/anti-ligand, un couple antigène/anticorps, un couple ADN/ARN ou un couple ADN/ADN.
Ainsi, si l'analyte est un antigène ou un haptène, le site de liaison 11 est avantageusement un anticorps spécifique de l'analyte.
Par « anticorps spécifique de l'analyte », on entend un anticorps capable de se lier spécifiquement avec l'analyte dans une liaison de type antigène/anticorps.
Il s'agit typiquement d'un anticorps polyclonal ou d’un anticorps monoclonal, ayant une forte affinité pour l'analyte. De préférence, il s'agit d'un anticorps monoclonal.
Si l'analyte est un acide nucléique, le site de liaison 11 est avantageusement une sonde ADN complémentaire. Par exemple, la sonde primaire 1 consiste en une sonde apte à se lier à l’ADN de bactérie Gram négative du genre Campylobacter, et plus préférentiellement des sondes ADN spécifiques de Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter tari ou de Campylobacter upsaliensis telles que décrites par exemple dans la demande de brevet IT102020000012496.
De manière générale, les paramètres (temps d’incubation, rinçage, etc.) sont ajustés à façon, de sorte à autoriser la formation du complexe primaire C1 en présence de l’analyte T.
Par ailleurs, la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1 est avantageusement choisie parmi la biotine ou homologue.
De manière générale, le site de liaison 11 et la première étiquette d’affinité 12 sont avantageusement liés par des liaisons covalentes.
Préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire 1, ledit au moins un analyte T peut être fixé :
- sur une sonde de capture 6 (figure 4), portée par exemple par une bille magnétique B pour une technique dite MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich, ou
- sur un support S (figure 5), par exemple pour un procédé du type dot blot.
En particulier, la sonde de capture 6 précitée consiste en toute entité chimique, biochimique ou biologique, qui est apte à se lier spécifiquement à l’analyte T.
Par « lier » ou « liaison », on entend toute liaison forte, par exemple covalente, mais aussi toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte.
Une telle sonde de capture 6, et en particulier son site de liaison, est ainsi avantageusement choisie parmi les biomolécules, à savoir par exemple :
- les sondes protéiques, englobant les anticorps, les enzymes, les antigènes, les peptides, ou
- les sondes nucléiques, englobant les séquences ARN, les séquences ADN, les aptamères.
La sonde de capture 6 (et en particulier son site de liaison) est choisie pour ses propriétés de liaison spécifique à l'analyte T, comme par exemple un coupe ligand/anti-ligand, un couple antigène/anticorps, un couple ADN/ARN ou un couple ADN/ADN.
Par « dot blot », on englobe les techniques de transfert de molécules permettant de vérifier la présence de molécules spécifiques dans un milieu, y compris le Southern blot pour l'ADN, le northern blot pour les ARN ou le western blot pour les protéines.
Par « dot blot », on englobe également le transfère les acides nucléiques (ADN ou ARN) depuis un milieu liquide directement sur une membrane, sans séparation préalable (donc sans électrophorèse préalable).
Le transfert peut être réalisé par diffusion simple, par diffusion dans champ électrique (électrodiffusion) ou par aspiration sous vide. Etape de révélation B
L’étape de révélation B est mise en œuvre de manière à détecter, au moyen d’au moins un réactif de révélation, les éventuels complexes primaires C1 générés au cours de l’étape de reconnaissance A.
Au cours de cette étape de révélation B, ledit au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (figures 2 et 6), et
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable (figures 3 et 6).
Selon un mode de réalisation décrit ci-après en relation avec les figures 1 à 5, au cours de cette étape de révélation B, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés (avantageusement distincts) :
- la seconde étiquette d’affinité 5, dont au moins une partie se présente sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2, et
- ladite au moins une sonde d’amplification 3.
La seconde étiquette d’affinité 5 est apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité qui est portée par la sonde primaire 1 ou, comme développé par la suite, par ladite au moins une sonde d’amplification 3.
Ainsi, dans le cas d’une première étiquette d’affinité du type biotine, la seconde étiquette d’affinité 5 est avantageusement choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine ou NeutrAvidine ou Captavidine.
Dans cette étape de révélation B, la seconde étiquette d’affinité 5 peut se présenter :
- uniquement sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 (c’est-à-dire conjuguée avec un traceur 21), ou
- en partie sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 et en partie sous une forme libre (c’est-à-dire dépourvue du traceur 21).
Par exemple, dans le cas d’une seconde étiquette d’affinité 5 avec un mélange des deux formes, la seconde étiquette d’affinité 5 sous forme libre peut représenter de 10 à 50%, de préférence encore de 20 à 50%, des molécules de seconde étiquette d’affinité 5.
La sonde secondaire 2 précitée consiste en un réactif de détection sous la forme d’un conjugué comprenant :
- un traceur 21, et
- une étiquette d’affinité 22 qui est constituée par la seconde étiquette d’affinité 5 précitée.
Dans un souci de simplicité, cette étiquette d’affinité de la sonde secondaire 2 est désignée indifféremment par les repères 5 ou 22 et peut encore être dénommée « seconde étiquette d’affinité ». Le traceur 21 peut ainsi être choisi parmi les traceurs classiques en soi. De préférence, ce traceur 21 est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, les particules photoacoustiques, ou les particules photothermiques.
Ladite au moins une sonde secondaire 2 est ainsi avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs.
Par « conjugués enzymatiques », on englobe les conjugués avec les enzymes H RP (peroxydase de raifort) ou PA (phosphatase alcaline).
Dans ce cas, les réactifs de l’étape de révélation B comprennent avantageusement un substrat 4 pour les conjugués enzymatiques en vue d’une réaction de chimiluminescence en présence du complexe secondaire C2.
Le substrat 4, classique en soi, peut ainsi être choisi parmi par exemple les composés suivants :
- les substrats chromogènes (TMB, ABTS, OPD), fluorescents (ADHP) ou chimiluminescents (Luminol) pour la HRP,
- les substrats chromogènes (pNPP), fluorescents (MUP, FPD) ou chimiluminescents (VisiGIo) pour la PA.
Par « conjugués photoactifs », on englobe les conjugués colorés, les conjugués fluorescents, les conjugués luminescents.
Selon un mode de réalisation préféré et dans le cas d’une première étiquette d’affinité du type biotine, ladite au moins une sonde secondaire 2 consiste en un conjugué enzymatique choisi par exemple parmi les conjugués streptavidine-HRP (peroxydase de raifort) ou streptavidine-PA (phosphatase alcaline).
Par ailleurs, tel que représenté schématiquement sur la figure 2, ladite au moins une sonde d’amplification 3 est du type noyau 31 (dit encore « cœur ») - enveloppe 32.
L’enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (désignée également « première étiquette d’affinité 321 ») qui est identique à la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1.
Pour une amplification optimale du signal, ladite au moins une sonde d’amplification 3 comporte avantageusement au moins 20 molécules de ladite première étiquette d’affinité 321.
Ces molécules de ladite première étiquette d’affinité 321 sont aptes à se lier spécifiquement avec au moins une molécule de la seconde étiquette d’affinité 5, 22, à savoir :
- une seconde étiquette d’affinité 22 sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 (c’est-à-dire conjuguée avec un traceur 21), ou
- une seconde étiquette d’affinité 5 libre (c’est-à-dire dépourvue du traceur 21). L’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 comprend encore avantageusement des espaceurs 322 qui relient le noyau 31 avec une molécule de première étiquette d’affinité 321.
De tels espaceurs 322 visent à écarter les molécules de première étiquette d’affinité 321 par rapport au noyau 31 et les unes par rapport aux autres, limitant ainsi les problèmes d’encombrement stérique lors de l’étape de révélation B.
Cette structure permet ainsi de libérer l’environnement des premières étiquettes d’affinité 321, et d’augmenter le nombre de molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 qui est lié simultanément avec la sonde d’amplification 3. Cet agencement permet aussi une meilleure présentation des premières étiquettes d’affinité 321, favorisant ainsi la réaction de reconnaissance (avantageusement augmentation de la probabilité de réaction) avec ladite au moins une sonde secondaire 2.
Les espaceurs 322 sont avantageusement choisis parmi les espaceurs nucléiques, par exemple les séquences d’ADN (par exemple une séquence dTio-PEG2-dTio).
Le noyau 31 est quant à lui avantageusement formé par une nanoparticule 31 (dite encore « NP » dans les exemples) ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm.
La taille des particules est définie comme leur plus grande taille et pourra être mesurée grâce à un microscope électronique à balayage ou un microscope optique. La taille des objets de forme hétérogène est définie comme la longueur du côté le plus grand de l'objet.
La nanoparticule 31 est choisie avantageusement parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice (y compris le silicate).
De préférence encore, de telles nanoparticules sont encore choisies parmi les nanoparticules composées de silice (voire de silicate), avantageusement encore parmi les billes de silice.
Plus généralement, les nanoparticules peuvent être choisies parmi les nanoparticules de silice (dites encore « Si-NP »), d'or, d'argent, de graphite, des nanocristaux fluorescents (également nommés quantum dots), des nanoparticules de polymère du type polystyrène, polypropylène ou polybutadiène, ou des nanoparticules d'oxyde métallique, notamment d'oxyde d'étain, de gadolinium, d'aluminium, de titane, de cérium, de niobium d'erbium, d'ytterbium, de terbium, de dysprosium, d'europium, ou d'un mélange de ces oxydes, éventuellement enrobées pour permettre leur fonctionnalisation.
Pour la fabrication d’une telle sonde d’amplification 3 conforme à l’invention, l’homme du métier peut s’appuyer par exemple sur le document WO-2013 007944, le document Knopp et al. (Review: Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles ; Analytica Chimica Acta 647 (2009) 14-30) ou le document Sivakumar et al. (Silica-Coated Ln3+- Doped LaF3 Nanoparticles as Robust Down- and Upconverting Biolabels ; Chem. Eur. J. 2006, 12, 5878 - 5884). En présence du complexe primaire C1 (correspondant à la présence de l’analyte T dans l’échantillon E) et au moyen des réactifs précités, l’étape de révélation B est mise en œuvre dans des conditions adaptées à générer le complexe secondaire C2 (en cascade), partant de la sonde primaire 1 dudit complexe primaire C1, comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée) : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2, portant une pluralité de molécules de première étiquette d’affinité 321, est ainsi avantageusement liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 (via leurs secondes étiquettes d’affinité 22).
Cette configuration permet alors une amplification significative du signal, avec une pluralité de molécules de la sonde secondaire 2 (destinées à produire un signal) pour une molécule d’analyte T.
En pratique, l’étape de révélation B peut prendre deux formes de réalisation alternatives.
Selon une première forme de réalisation, l’étape de révélation B est mise en œuvre en deux phases successives avec :
- une première phase B1 au cours de laquelle est ajoutée la seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée) pour former un premier sous-complexe (en cascade), depuis la sonde primaire 1 dudit complexe primaire C1, comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée), puis
- une seconde phase B2 au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification 3 et ladite au moins une sonde secondaire 2 pour former ledit complexe secondaire C2 décrit dessus.
La seconde phase B2 peut elle-même être divisée en deux opérations successives (ajout successif des réactifs de révélation) :
- une première opération avec ajout de ladite au moins une sonde d’amplification 3, destinée à se fixer avec les secondes étiquettes d’affinité 5 (libre ou conjuguées) du premier sous-complexe, puis
- une seconde opération avec ajout de ladite au moins une sonde secondaire 2, destinée à se fixer avec ladite au moins une sonde d’amplification 3 pour former ledit complexe secondaire C2.
De manière alternative, cette première forme de réalisation comprend une phase de préparation au cours de laquelle ladite au moins une sonde d’amplification 3 est liée avec la sonde secondaire 2 (au moyen de leurs étiquettes d’affinité 321, 22), pour former un complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2. Dans ce cas, la seconde phase B2 est mise en œuvre en ajoutant directement le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 qui est destiné à se lier avec les secondes étiquettes d’affinité 5 (libre ou conjuguée) du premier sous-complexe.
Selon une seconde forme de réalisation, l’étape de révélation B est mise en œuvre en une phase unique au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire C2.
Pour cela, le procédé comprend avantageusement une phase de préparation au cours de laquelle ladite au moins une sonde d’amplification 3 est liée avec plusieurs molécules de sondes secondaires 2 (au moyen de leurs étiquettes d’affinité 321, 22), pour former un complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2.
Dans ce cas, l’étape de révélation B est mise en œuvre en ajoutant directement le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 qui est destiné à se lier avec la sonde primaire 1 si elle est toujours présente.
En l’espèce, le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 se lie avec la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1, cela par l’intermédiaire des secondes étiquettes d’affinité 5, 22 (libre ou conjugué).
Dans cette approche, la première phase B1 précitée ne serait plus nécessaire.
Selon une variante de réalisation décrite ci-après en relation avec les figures 6 et 7, au cours de cette étape de révélation B, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre est similaire à celle décrite ci-dessus en relation avec les figures 1 à 5 en ce qu’elle est du type noyau 31 - enveloppe 32 avec une enveloppe 32 qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321.
Cette sonde d’amplification 3 se distingue en ce que l’enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une seconde étiquette d’affinité 321 qui est complémentaire de la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1.
Et certaines au moins des molécules de seconde étiquette d’affinité 321 sont liées à au moins une molécule du traceur 21 (figure 6).
Par exemple et sans être limitatif, au moins 50% des molécules de seconde étiquette d’affinité 321 sont liées à au moins une molécule du traceur 21.
Par « lié », on entend ici avantageusement une liaison fort, de préférence une liaison covalente.
Le couple seconde étiquette d’affinité 321 / traceur 21 est ainsi avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs, greffés sur la sonde d’amplification 3.
Par « conjugués enzymatiques », on englobe les conjugués avec les enzymes H RP (peroxydase de raifort) ou PA (phosphatase alcaline). Pour une amplification optimale du signal, ladite au moins une sonde d’amplification 3 comporte avantageusement au moins 20 molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321.
La seconde étiquette d’affinité 321 est apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité 12 qui est portée par la sonde primaire 1.
Ainsi, dans le cas d’une première étiquette d’affinité 12 du type biotine, la seconde étiquette d’affinité 321 est avantageusement choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine ou NeutrAvidine ou Captavidine.
Les autres caractéristiques techniques générales de la sonde d’amplification 3 (notamment espaceurs 322, noyau 31, procédé de fabrication), développés ci-dessus en relation avec les figures 1 à 5, s’appliquent dans le présent mode de réalisation.
En particulier, l’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 comprend encore avantageusement des espaceurs 322 qui relient le noyau 31 avec une molécule de seconde étiquette d’affinité 321.
En présence du complexe primaire C1 (correspondant à la présence de l’analyte T dans l’échantillon E) et au moyen du réactif de révélation précité, l’étape de révélation B est mise en œuvre dans des conditions adaptées à générer le complexe secondaire C2 (en cascade) comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2 porte une pluralité de conjugués seconde étiquette d’affinité 321 / traceur 21.
Cette configuration permet alors une amplification significative du signal, avec une pluralité de molécules de traceur 21 (destinées à produire un signal) pour une molécule d’analyte T.
L’étape de révélation B est alors avantageusement mise en œuvre en une phase unique au cours de laquelle est ajoutée la sonde d’amplification 3 pour la formation du complexe secondaire C2.
Dans ce cas, l’étape de révélation B est mise en œuvre en ajoutant directement la sonde d’amplification 3 qui est destiné à se lier avec la sonde primaire 1 si elle est toujours présente.
En l’espèce, la sonde d’amplification 3 se lie avec la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1, cela par l’intermédiaire des secondes étiquettes d’affinité 321.
De manière générale et selon encore une alternative de réalisation, l’étape d’amplification pourrait être mise en œuvre de sorte à obtenir un complexe secondaire C2 comportant plusieurs sondes d’amplification 3 en cascade / en série (par exemple deux ou trois sondes d’amplification 3), avant l’ajout du traceur 21.
Ces sondes d’amplification 3 peuvent encore être reliées par le biais desdites étiquettes d’affinité.
Le complexe secondaire C2 comprend alors avantageusement au moins deux sondes d’amplification 3 reliées, entre elles, par au moins une seconde étiquette d’affinité 5. Une telle approche permettrait de démultiplier l’effet d’amplification.
De manière générale, tout au long de l’étape de révélation B, les conditions et paramètres (temps d’incubation, rinçage, etc.) sont ajustés de sorte à assurer la formation des différents complexes attendus.
Pour être complet, l’étape de révélation B comprend encore avantageusement une phase finale de lecture au cours de laquelle :
- l’analyte T est détecté (présence de l’analyte T dans l’échantillon E), lorsqu’un signal est détecté du fait de la formation du complexe secondaire C2 comprenant le traceur 21 , ou
- l’analyte T n’est pas détecté (absence de l’analyte T dans l’échantillon E), lorsque le signal n’est pas détecté du fait de l’absence de formation du complexe secondaire C2 et de l’élimination du traceur 21.
Système de réactifs
La présente invention concerne encore le système de réactifs, ou kit, pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
Un tel système de réactifs comprend avantageusement :
- ladite au moins une sonde primaire 1, laquelle au moins une sonde primaire 1 est un conjugué comprenant, d’une part, le site de liaison 11 apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte T et, d’autre part, la première étiquette d’affinité 12, et
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe C2 partant de la sonde primaire 1 de la sonde primaire 1, lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321, et
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe C2 en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur 21 étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3, de sorte que, dans ledit complexe C2, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21.
Selon un mode de réalisation préféré, les réactifs de révélation comprennent :
- ladite seconde étiquette d’affinité 5 apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité 12, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité 5 se présentant sous la forme de ladite sonde secondaire 2 consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité 5 et, d’autre part, le traceur 21, et - ladite au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité 12.
Tel que développé dessus, un tel système de réactifs est apte à former, en présence dudit analyte T, un complexe C2 selon l’invention qui comprend analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe C2 porte alors avantageusement plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2.
Selon un mode de réalisation avantageux précité, la première étiquette d’affinité 12 est choisie parmi la biotine ou homologue (par exemple une nanoparticule de silice portant des molécules de biotine, dit encore « biotin-Si-NP » ou « biotin-nanoparticle » dans les exemples). Et la seconde étiquette d’affinité 5 est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine.
De manière alternative, un tel système de réactifs comprend avantageusement :
- ladite au moins une sonde primaire 1, laquelle au moins une sonde primaire 1 est un conjugué comprenant, d’une part, le site de liaison 11 apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte T et, d’autre part, la première étiquette d’affinité 12, et
- une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321 dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21.
Lors de cette étape de révélation, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre permet l’obtention, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de traceur 21 est liée à une molécule d’analyte T.
Selon un mode de réalisation avantageux précité, la première étiquette d’affinité 12 est choisie parmi la biotine ou homologue. Et la seconde étiquette d’affinité 321 est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine.
De manière générale, le système de détection selon l’invention peut tout-à-fait être adapté à l’analyte T recherché.
Par exemple, le système de détection est avantageusement sous forme dot blot pour la recherche d’un analyte du genre acide nucléique (voir figure 6).
Dans ce cas, le site de liaison 11 de la sonde primaire 1 est avantageusement une sonde ADN complémentaire, de préférence couplé à la biotine. Le système de détection est avantageusement sous forme ELISA ou MELISA pour la recherche d’un analyte du genre antigène ou haptène (voir figures 1 et 4).
Dans ce cas, le site de liaison 11 de la sonde primaire 1 est avantageusement un anticorps spécifique de l'analyte, de préférence couplé à la biotine.
Pour une technique MELISA, le système comprend encore avantageusement une sonde de capture 6 précitée, portée par exemple par une bille magnétique B.
Bien entendu, diverses autres modifications peuvent être apportées à l’invention dans le cadre des revendications annexées.
Exemples
1. Exemple 1 : Procédé de fabrication d’une sonde d’amplification
1.1. Matériel et Méthode
Des Si-NP (nanoparticules de silice) ont été fonctionnalisées à l’aide d’une technologie innovante de synthèse en phase solide qui permet la fonctionnalisation de particules de taille nanométrique avec des fragments d’DNA, comme rapporté précédemment (Bonnet et al, Analyst 2018, Issue 10, 2018; De Crozals et al, RSC Advances, 2012, 2, 11858-11866).
En bref, l’immobilisation des nanoparticules sur du verre à porosité contrôlée (CPG, Controlled Pore Glass) permet une fonctionnalisation très élevée avec un lieur à base d’oligonucléotide modifié. Le lieur (séquence: dT10-PEG2-dT10) a été synthétisé en utilisant un synthétiseur d’ARN/ADN Applied Biosystems 394 (Applied Biosystems).
Après la greffe des nanoparticules sur le support de CPG, elles ont été fonctionnalisées par synthèse automatisée en utilisant la chimie des phosphoramidites.
Premièrement, le lieur, qui permet une meilleure accessibilité des fonctions d’intérêt, a été synthétisé.
Deuxièmement, le groupe biotine a été incorporé.
Nous avons contrôlé l’incorporation de biotine pour atteindre un rendement de couplage de 10%. Pour cela, on a utilisé des solutions diluées de biotine phosphoramidite (10 mM) et de tétrazole dans l’acétonitrile (45 mM) et on a réduit le temps de couplage à 10 s. L’incorporation de biotine a été contrôlée à 498 nm à l’aide de la quantification du diméthoxytrityle par un spectrophotomètre UV-visible.
Troisièmement, les biotine-Si-NP ont été libérées du CPG par incubation du support dans 1mL de DBU à 0,1% (m/v) dans un mélange eau-acétonitrile 1/1 (v/v). La solution de DBU a été agitée dans un thermomélangeur à 22°C pendant 1 heure avant d’être récupérée.
On a ajouté toutes les heures une solution fraîche de DBU à la suspension de CPG. La cinétique de libération a été suivie en quantifiant la concentration en N P (nanoparticules) de chaque solution de DBU par une mesure de l’U V-visible à 560 nm. Les nanoparticules libérées ont été lavées avec de l’eau milli-Q (1x 4mL puis 3x2 mL) et concentrées sur un filtre 30K Amicon Ultra (5000g, 10 min). Enfin, la quantité de brins dT10-PEG2-dT10-10% Biotine par NP a été estimée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible Varian Cary 100 Bio (Agilent Technologies) en utilisant une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique.
Les nanoparticules ont été libérées du CPG en faisant incuber le support dans 1mL d’une solution à 0,1% (m/v) de DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène) dans un mélange eau- acétonitrile 1/1 (v/v). La solution de DBU a été agitée dans un thermomélangeur à 22°C pendant 1 heure avant d’être récupérée. On a ajouté toutes les heures une solution fraîche de DBU à la suspension de CPG. La cinétique de libération a été suivie en quantifiant la concentration en nanoparticules de chaque solution de DBU par une mesure de l’UV-visible à 560 nm. Les nanoparticules libérées ont été lavées avec de l’eau (1x 4mL puis 3x2 mL) et concentrées sur un filtre 30K Amicon Ultra (5000g, 10 min).
La quantité de brins par NP a été estimée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible Varian Cary 100 Bio (Agilent Technologies) en utilisant une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique. La quantité de lieur greffé sur les nanoparticules a été quantifiée en mesurant l’absorbance dans l’eau (200pL) à 260 nm et 560 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque (Perkin Elmer). La concentration en nanoparticules a été estimée de la manière décrite précédemment par Bonnet et al. (Analyst 2018). Pour correspondre à cette estimation, nous avons établi un coefficient d’extinction molaire approximatif à 163200 M-1 cm-1 qui tient compte des epsilons des différentes parties de la séquence corrigés par leur rendement de couplage correspondant.
Les NP fonctionnalisées ont été observées au microscope électronique à transmission (MET) en utilisant un appareil Philips CM120 fonctionnant à une tension d’accélération de 120kV (Centre Technologique des microstructures, Lyon). Les Si-NP ont été observées après dépôt de 5pL de solution diluée sur une grille de cuivre recouverte de Formvar-carbone et évaporation à sec.
1.2. Résultats
Les Biotine-Si-NP ont été préparées grâce à une technologie innovante de synthèse en phase solide qui a permis une fonctionnalisation très élevée (Crozals et al., RSC Adv. 2012, 2, 11858-11866). Un groupe hydroxyle a été fixé à la surface des Si-NP par silanisation comme rapporté précédemment (Farre et al., Langmuir, 2010; Bonnet et al, Analyst 2018). Les fonctions hydroxyle ont servi de support à la synthèse de lieur oligonucléotidique à la surface des N P. Dans l’étape finale, des groups biotine ont été greffés au lieur comme expliqué dans Matériel et Méthodes. Les observations au MET ont montré que la morphologie des N P restait stable durant la synthèse. Les biotine-Si-NP fonctionnalisées avaient une dimension moyenne de 50 ± 3 nm, telle qu’estimée à partir des images de MET. Selon les mesures d’absorbance, la quantité de lieur était d’environ 500 par NP. Par ailleurs, la quantification du diméthoxytrityle a établi le rendement de couplage de la biotine à 10%, ce qui a permis de quantifier la biotine à environ 50 par N P. Une distribution granulométrique relativement étroite des NP fonctionnalisées a été confirmée par des mesures de DLS. Les Si-NP formaient des solutions aqueuses monodispersées de particules ayant un diamètre hydrodynamique (RH) de 90 nm environ. La conjugaison de la biotine + groupements lieurs a décalé le RH à environ 120 nm. Cette augmentation est probablement liée à la couche d’hydratation autour des unités de biotine liées aux bras portant des groupes chargés négativement. Les solutions de biotine-Si-NP restaient stables à 4°C pendant au moins deux mois.
2. Exemple 2 : Stratégie de double reconnaissance pour une détection sensible du virus de la grippe A en utilisant des nanoparticules enrobées de biotine et des billes immunomagnétiques
2.1 Matériel et Méthodes
2.1.1. Réactifs
La sérumalbumine bovine (SAB), le sérum de Bradford, le réactif colorimétrique pour dosage ELISA TMB (3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine), le Tween 20, la HRP-Streptavidine, le tampon B de Dosage ELISA 5X/Diluant d’Echantillon et les produits chimiques de haute qualité ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). La solution saline tamponnée au phosphate (STP) 10x a été fournie par Dominique Dutscher (Brumath, France). Le chlorure de sodium a été acheté chez Laurylab (Brindas, France). Les tampons ont été préparés avec de l’eau déminéralisée et stérilisés par filtration 0,22pm.
Les Dynabeads® M-280 Tosylactivated et DSB-XTM Biotin Protein Labelling Kit (D- 20655) proviennent respectivement de chez Invitrogen et Molecular Probes, (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les anticorps anti- NuP d’Influenza A (9G8) et (5D8) proviennent de chez Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz, CA, USA). Les nanoparticules de silice recouvertes de rhodamine ont été fournies par Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Les oligonucléotides ont été synthétisés en utilisant un synthétiseur d’ADN/ARN Applied Biosystems 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les synthons au phosphoramidite: Biotine-TEG-phosphoramidite (1-diméthoxytrityloxy-3-0-(N-biotinyl-3-aminopropyl)- triéthylèneglycolyl-glycéryl-2-0-(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite); Espaceur phosphoramidite 9 (9-0-diméthoxytrityl-triéthylèneglycol,1-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)]- phosphoramidite); dT-CE phosphoramidite (5'-diméthoxytrityl-2'-désoxythymidine,3'-[(2- cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite) et tous les réactifs de synthèse ont été achetés chez Glen Research (Sterling, Virginie).
2.1.2. Expression et production de nucléoprotéine
Le gène de nucléoprotéine (NuP) de pleine longueur du virus de la grippe H1N1 (souche A/WSN/33) avec une étiquette 6-His à son extrémité C-terminale a été cloné dans le vecteur d’expression pET22 d’Escherichia coli (Novagen) et exprimé dans les cellules d’E. coli BL-21 Rosetta DE3 (Stratagene). Les cellules transformées ont été cultivées à 37°C dans 100 ml de milieu de Luria-Bertani contenant de l’ampicilline jusqu’à la phase exponentielle médiane, puis induites pendant 4 heures par addition d’isopropyl^-D-thiogalactopyranoside 1 mM à 37°C sous agitation. On a procédé à la purification de la NuP. En bref, après centrifugation, le culot bactérien a été remis en suspension dans un tampon de lyse (Tris 20 mM à pH 7,4 avec du NaCI (50 mM ou 300 mM), imidazole 5 mM, Triton à 1% et 1 mg/ml de lysozyme), soumis à des ultrasons et traité avec de la RNAse A à 0,15 mg/ml à 35 °C pendant 20 min en présence d’ions Mg2+ 10 mM. La protéine a été purifiée par chromatographie d’affinité en utilisant des billes magnétiques de Ni (PureProteome, Millipore), en suivant le mode opératoire recommandé par le fabricant. La NuP a ensuite été dialysée contre du tampon Tris (Tris 20 mM, NaCI 300 mM, pH 7,5). Après dialyse, la concentration en protéine a été déterminée en utilisant un coefficient d’extinction e de 56200 M 1 cm-1 à 280 nm.
2.1.3. Souches virales
Le virus de la grippe A/WSN/33 (H1N1) a été obtenu par génétique inverse et amplifié sur des cellules MDCK. Les virus ont été titrés par la méthode des plages. Les virus purifiés ont été inactivés à la lumière UV pendant 38 min. L’efficacité d’inactivation a été vérifiée par une nouvelle infection des cellules MDCK. Des échantillons d’Influenza A/H1 inactivés ont été conservés à -80°C. De l’Influenza A/UDORN/72 (H3N2) a été propagé sur un œuf de poulet embryonnaire et appliqué à des cellules MDCK. Les virus ont été titrés par la méthode des plages. Les virus purifiés ont été inactivés en utilisant de l’éthylèneimine binaire (BEI) et conservés à -80 °C.
Le virus du syndrome dysgénésique respiratoire porcin (VSDRP) Flanders13 (13V09) utilisé dans cette étude a été gracieusement fourni par le Dr. Nicolas Bertho (INRA, France) et le Dr. Fanny Blanc (INRA, France).
Avant l’inactivation, les concentrations virales ont été déterminées en termes d’infection des cellules MDCK. Les titres initiaux des virus étaient de 108 PFU/mL pour l’échantillon 1 de H1N1, 1,5 108 PFU/mL pour l’échantillon 2 de H1N1, 108 PFU/mL pour H2N3. Le virus VSDRP témoin a été titré à 107 PFU/mL.
2.1.4. Fonctionnalisation des billes magnétiques
Des billes magnétiques activées au tosyle de 2,8 pm de diamètre (Dynabeads™ M-280, Invitrogen, US) ont été recouvertes de 10 pg d’anticorps anti- NuP d’Influenza A (9G8) par mg de billes pendant 1 heure sous agitation modérée, selon le protocole recommandé par le fabricant. Ensuite, après 15 minutes de passivation dans du tampon à la SAB (phosphate de sodium 0,1M, chlorure de sodium 150mM, SAB à 0,5% (p/v), pH 7,6), les billes magnétiques ont été lavées trois fois dans du phosphate de sodium 0,01 M, du chlorure de sodium 150 mM, de la SAB à 0,1% (p/v), pH 7,4 et stockées à 4°C jusqu’aux essais.
2.1.5. Protocole MELISA pour la détection de virus désactivés 1.106 billes magnétiques préalablement recouvertes d’anticorps anti-NuP d’Influenza A (9G8) ont été tout d’abord lavées trois fois avec du tampon STP. Des solutions de virus désactivés (STP, 10% de salive) ont été mises à incuber avec les billes sous agitation modérée à température ambiante pendant 1 heure. Les billes ont été concentrées au moyen d’un aimant et lavées trois fois avec du Tampon de lavage 0.1. On a ajouté à la suspension, de l’anticorps anti-biotine conjugué (0,5 pg/ml) dans un Tampon de capture (STP, tween 0,1%, SAB 0,1%) avant une agitation modérée pendant 1 heure. Après trois étapes de lavage, on a ajouté une solution de révélation de Streptavidine/HRP (100pL, 1pg/mL) et on a agité le mélange à température ambiante pendant 30 minutes à 1000rpm dans un thermomélangeur. Les billes ont été lavées trois fois avec le Tampon de lavage 0.1 avant l’ajout de 100pL de TMB et une incubation dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Enfin, on a dilué le surnageant avec 100 pL d’acide sulfurique 2M et on a lu l’absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques (Perkin Elmer). A450nm - Assonm a donné la bonne valeur après suppression du signal de fond.
Pour le protocole MELISA utilisant une amplification de biotine-NP, le même protocole a été utilisé pour la capture d’antigène. Ensuite, les deux étapes suivantes ont été ajoutées pour la détection: des biotine-NP (1.1011 NP/mL dans STP, Tween 20 à 0,1% (v/v)) ont été ajoutées à la suspension de billes magnétiques avant une incubation pendant 30 minutes à 1000 rpm dans un thermomélangeur. Après trois étapes de lavage, on a ajouté une solution de révélation de streptavidine/HRP (100pL, 1pg/mL) avant l’incubation de la suspension à température ambiante pendant 30 minutes à 1000 rpm dans un thermomélangeur. Les billes ont été lavées trois fois avec le Tampon de lavage 0.1 avant l’ajout de 100pL de TMB et une incubation dans l’obscurité pendant 5 minutes à température ambiante. Enfin, on a dilué le surnageant avec 100 pL d’acide sulfurique 2M et on a lu l’absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques (Perkin Elmer). A450nm - Assonm a donné la bonne valeur après suppression du signal de fond.
2.2. Résultats et discussion
2.2.1. MELISA aux Biotine-NP pour une détection sensible du virus de la grippe A
Pour améliorer les performances du dosage MELISA et pousser les limites de détection encore plus loin, nous avons développé les biotine-NP pour amplifier le signal positif dans l’étape de détection.
Des nanoparticules de silice de 50 nm de diamètre ont été fonctionnalisées en surface avec un brin oligonucléotidique portant un groupe biotine à son extrémité.
Les N P ont d’abord été immobilisées sur un support de verre à porosité contrôlée (CPG). Le support Nano-on-Micro (NOM) assemblé résultant a été caractérisé par MEB (Microscopie Electronique à Balayage). Ensuite, le matériau NOM a été utilisé dans un synthétiseur d’ADN/ARN pour réaliser la fonctionnalisation des NP via chimie des phosphoramidites. Cette stratégie a permis d’obtenir des nanoparticules hautement fonctionnalisées. Un espaceur oligonucléotidique (séquence ODN: dTio-PEG2-dTio) a été synthétisé sur les NP afin d’éloigner les biotines de la surface des NP. Environ 500 ODN par NP ont été estimées en mesurant l’absorbance UV à 260 nm et 560 nm et en quantifiant le ratio ODN par N P dans la suspension, un protocole décrit par Bonnet et al. (Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: Application to the sensitive détection of bacteria in human platelet concentrâtes. Analyst. 143(10), 2293-2303 (2018)). Ensuite, le groupe biotine a été incorporé. Nous avons décidé de contrôler le programme de synthèse sur l’appareil pour obtenir un rendement de couplage de 10% pour l’incorporation de biotine. En utilisant cette stratégie, nous avons incorporé environ 50 biotines par N P. Cette quantité a été optimisée pour obtenir une liaison efficace du groupe biotine lors du dosage MELISA. Après la libération des NP à partir du support de CPG par traitement au DBU et lavage à l’eau, le nombre de NP dans la suspension obtenue a été estimé à partir de la courbe de quantification des N P fluorescentes. La structure des N P après la libération a été contrôlée par MET. Cette observation a montré que la morphologie des N P restait stable durant la synthèse.
Nous avons également confirmé l’accessibilité et la réactivité des biotines greffées à la surface des NP par RPS (résonance plasmonique de surface), via l’interaction biotine/avidine. Après immobilisation de l’avidine sur une puce à RPS recouverte d’une multicouche de polyélectrolyte, nous avons réussi à observer la capture spécifique des nanoparticules biotinylées.
2.2.2. Détection du virus de la grippe A en milieu clinique
Le dosage à base de biotine-nanoparticules et de billes immunomagnétiques (Biot-NP MELISA) a été étudié pour la détection des virus H1N1 (échantillons 1 et 2), H3N2 et VSDRP (Fig. 8).
Pour reproduire les échantillons cliniques, les solutions virales ont été diluées dans du tampon de lyse supplémenté avec de la salive à 10%. Après la partie sandwich de l’essai avec les virus, l’étape de détection a été réalisée en utilisant des nanoparticules hautement biotinylées pour augmenter l’efficacité d’ancrage de la streptavidine-HRP. Cette stratégie a permis une augmentation du signal dans le cas d’une réponse positive (Fig. 8). Cette sensibilité améliorée prouvait l’efficacité de la stratégie d’amplification.
Des limites de détection de 3x103 PFU/mL, 6x104 PFU/mL et 4x104 PFU/mL ont été respectivement calculées pour l’échantillon 1 et l’échantillon 2 de H1N1, et H3N2.
L’utilisation des biotine-NP lors de l’étape de détection améliorait la sensibilité du dosage MELISA d’un facteur de 65 à 75.
Des limites de détection en dessous de 104 PFU/mL et de 105 PFU/mL ont été respectivement obtenues pour les souches H1N1 et H3N2, en présence de 10% de salive pour reproduire un contexte clinique. Une bonne sélectivité des souches a été également confirmée par les réponses négatives observées à différentes concentrations de VSDRP (Fig. 8). 3. Exemple 3 : Détection hautement sensible de Campylobacter spp. dans des échantillons de volailles en utilisant un biocapteur à ADN de Dot Blot amélioré par des nanoparticules de silice
Nous avons couplé des nanoparticules de silice fonctionnalisées (Si-NP) à un test dot blot (buvardage en taches) d’ADN sur papier pour permettre une détection sensible d’acide nucléique de Campylobacter sans étape de préamplification.
On a utilisé dans le test une sonde d’ADN hautement spécifique qui reconnaît le gène de l’ARNr 16S des Campylobacter spp. les plus répandus provoquant des infections (C. jejuni , C. edi, C. lari, et C. upsaliensis). On a employé des Si-NP décorées de biotine (biotine-Si-NP) pour améliorer la lecture du signal chimioluminescent de streptavidine - HRP. Une amélioration de l’intensité du signal par comparaison avec le test classique a été obtenue grâce à l’effet conjugué des biotine-Si-NP par rapport à la biotine seule. Nous avons démontré que le nouveau test dot blot couplé aux biotine-Si-NP a réussi à détecter le Campylobacter en utilisant de l’ADN extrait de carcasse de poulet contaminée sans avoir besoin de passer par une étape de PCR. Notre étude illustre l’invention selon laquelle l’effet conjugué des biotine-Si-NP pourrait devenir un moyen efficace pour augmenter la sensibilité de la technique rentable, spécifique et facile à mettre en œuvre de dot blot.
3.1. Matériel et Méthodes
3.1.1. Matériels et réactifs
La Streptavidine-HRP, le Proclin, l’acétonitrile, le 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène (DBU), le verre à porosité contrôlée (120-200 Mesh, CPG-3000 Â)...ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Les NP de silice à la rhodamine B fluorescente (Si-NP, diamètre~50 nm) ont été fournies par Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Les synthons d’ADN au phosphoramidite et tous les réactifs de synthèse d’ADN ont été achetés chez Glen Research (Sterling, Virginie, USA). La solution saline tamponnée au phosphate (STP) a été achetée auprès de Dominique Dutscher (Brumath, France).
Tous les milieux bactériens et les suppléments utilisés provenaient de chez Oxoid (Italie), à l’exception de la gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (Violet red Bile glucose (VRBG)) et du milieu Coli ID qui ont été achetés chez Biomérieux (Italie).
Le Triton, le SDS, le NaCI, la base Trizma, le phénol, le chloroforme, la peptone bactériologique et l’alcool isoamylique ont été achetés chez SIGMA (Milan, Italie). Un oligonucléotide 36-mère associé au gène 16S codant pour l’ARN ribosomique de
Campylobacter de C. jejuni, C. edi, C. lari, C. upsaliensis et C. fétus (localisation des bases: 72- 108) a été utilisé comme élément de reconnaissance (sonde appelée CampyP3). CampyP3 a été marquée à son extrémité 5’ avec de la biotine pour la mise au point d’un dosage dot blot chimioluminescent. La sonde a été testée à l’aide de l’OligoAnalyzer3.1
(https://eu.idtdna.com/calc/analyzer), du logiciel Amplifix, Fast PCR 6.1 et Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Une séquence d’ADN simple brin complémentaire à la sonde CampyP3, appelée CP3, et deux séquences d’ADN simples brins non spécifiques, appelées respectivement PR et PE, ont été conçues pour étudier la sélectivité du capteur par le biais de leur hybridation avec la sonde. PR a été conçue par mésappariement de positions d’acides nucléiques de la séquence CP3, tandis que PE correspondait à la séquence de E. coli qui présente quelques similarités avec Campylobacter.
3.1.2. Souches bactériennes
Les souches de Campylobacter ont été cultivées dans des conditions microaérophiles (5% d’C>2, 10 % de CO2 et 80% de N2) dans des jarres anaérobies de gaz.
Les conditions microaérophiles ont été générées à l’aide d’un Sachet Oxoid™ CampyGen™ 2,5 I (Oxoid, Italie) à 37°C pendant 48h. L’ADN a été extrait des isolats de Campylobacter à partir de boîtes de gélose Columbia au sang (les souches pures et les isolats proviennent tous deux d’échantillons de poulet) après coloration Gram et observations au microscope optique de la morphologie et de la mobilité des cellules (bouillon Brucella, Thermofisher, Italie) après des tests d’oxydase et de catalase.
Toutes les souches témoins négatifs ont été cultivées sur les milieux spécifiques dans des conditions optimales et soumises aux mêmes tests réalisés pour les Campylobacter avant les extractions d’ADN.
3.1.3. Collecte d’échantillons alimentaires et isolement des bactéries
Cinq échantillons de poulet ont été achetés dans les supermarchés locaux en Italie. 10 g de peau de poulet ont été transférés dans un sac Stomacher, stérile par filtration, avec 40 mL d’eau peptonée salée (8 g/L de NaCI, 1 g/L de peptone bactériologique) et homogénéisés dans un Stomacher (PBI, Milan, Italie) pendant 90 s. Des fractions aliquotes de 0,1 mL ont été utilisées pour le comptage aérobie mésophile sur de la gélose tryptone soja à 30°C pendant 48h, et de la levure/moisissures sur 48h pour l’Agar Malt tétracycline à 30°C pendant 48h. Des fractions aliquotes de 1 mL ont été utilisées pour l’énumération des Enterobacteriaceae sur de la gélose VRBG (37°C pendant 24h), et des coliformes et de E. coli sur milieu Coli ID (37°C pendant 24h). La détection des Campylobacter a été réalisée selon la méthode classique ISO 10272-1:2006. Pour l’isolement sélectif des bactéries, 10 pi du bouillon Bolton ont été ensemencés par stries sur des boîtes de gélose Skirrow, et des boîtes mCCDA (charbon- céfopérazone-désoxycholate) et incubés à 41,5 °C pendant 48h, dans des conditions microaérophiles. Une colonie sélectionnée à partir de la gélose mCCDA et purifiée sur deux boîtes de gélose Columbia au sang a été obtenue par ensemencement par stries. Une boîte a été incubée à 41,5°C pendant 48h et l’autre à 25°C pendant 48h. La croissance sur Skirrow a servi de confirmation pour procéder aux étapes d’identification.
3.1.4. Extraction d’ADN à partir de cultures pures et de bouillons d’enrichissement L’ADN a été extrait à partir de souches pures et d’isolats d’échantillons de poulet selon Manzano et al (2015). 2 ml_ de bouillon d’enrichissement Bolton ont été récoltés par centrifugation à 13.000 g et à 4°C pendant 10 min. Les culots bactériens ont été lavés trois fois avec de la STP, avant de faire l’objet d’une extraction d’ADN comme rapporté précédemment (Manzano 2015). Les ADN extraits ont été réhydratés en utilisant 50 pL d’eau distillée stérile et traités avec de l’enzyme RNase à 37°C pendant 1 h. Enfin, l’ADN a été quantifié en utilisant Nanodrop™ 2000C (ThermoFisher Scientific, Italie). La concentration d’ADN a été ajustée à 100 ng/mL en utilisant de l’eau distillée stérile.
3.1.5. Immobilisation des échantillons et mode opératoire de détection
Avant l’immobilisation, les échantillons d’ADN extrait ont été dénaturés à 95 °C pendant 10 min, placés immédiatement sur de la glace et déposés en fraction de 1 pl sur la membrane de nylon chargée positivement (Amersham Hybon™-XL, GE Healthcare, France). La membrane ayant reçu les dépôts a été exposée aux UV à 254 nm pendant 10 minutes pour fixer l’ADN. On a fait tremper la membrane dans du tampon d’hybridation préchauffé (Na2HP04 0,5 M, NaH2PÜ4 0,5 M, EDTA 10 mM, SDS à 1 %, pH 7,5) à 65°C pendant 30 min sous agitation modérée. 4 ng/pL de la sonde CampyP3 marquée à la biotine dénaturée (100 ng/pL) ont été ajoutés au tampon d’hybridation et laissés une nuit à 65°C sous agitation modérée pour permettre l’hybridation. La membrane a été lavée deux fois avec du SDS 0,1, SSC (Citrate de sodium salin, Meraudex, France) 300 mM pendant 5 min et avec du SSC 75 mM pendant 15 min. La membrane a été transférée dans le tampon de blocage (Tween 0,1 %, SAB 0,1 %, Proclin 0,03%, STP, pH 7,4) à température ambiante pendant 15 minutes pour saturer la surface. Enfin, la membrane a été incubée avec la solution de blocage contenant de la streptavidine-HRP 0,7 mM pendant 15 minutes à température ambiante.
Après lavage avec du SDS à 0,1 %, du SSC 150 mM pendant 5 min à température ambiante, la membrane a été transférée dans une nouvelle boîte de Pétri et incubée avec 106 biotine-Si-NP/mL, STP, pH 7,4 pendant 30 min, à température ambiante, sous agitation modérée. Une streptavidine-HRP 0,7 mM dans une solution de blocage a été ajoutée après le lavage et incubée pendant 30 min sous agitation. Le signal a ensuite été révélé en utilisant le substrat chimioluminescent amélioré luminol pour la détection HPR (Thermo Scientific, France). La membrane a été retirée de la solution et observée à l’aide d’un système d’imagerie
ChemiDoc MP (Biorad, France). Les signaux de détection ont été quantifiés en utilisant le logiciel Image LabTM (Biorad). La valeur normalisée de l’intensité des points a été calculée à l’aide de l’équation (RI0 -Pln)/PI0, où RI0 et Pin représentent l’intensité de pixel obtenue pour la détection de 0,1 ng/pL de sonde CP3 (étalon) et de l’échantillon expérimental, respectivement.
3.1.6. Détection de Campylobacter dans des échantillons de poulet contaminés naturellement Cinq carcasses de poulets choisies de manière aléatoire, achetées au marché avec une quantité inconnue de Campylobacter spp. calls ont été testées le capteur dot blot. Les peaux de volaille de chaque carcasse ont été échantillonnées et enrichies comme expliqué au paragraphe 2.3. Pour la validation des résultats, les carcasses de poulet ont été testées pour déterminer la présence de Campylobacter spp. par la méthode de culture sur gélose sélective selon la norme ISO 10272-1: 2006.
3.2. Résultats et discussion
3.2.1. Concept de dot blot d’ADN à base de biotine-Si-NP
L’ADN cible a d’abord été immobilisé sur une membrane de nylon poreuse par irradiation aux UV pour permettre la réticulation de l’ADN à la surface chargée positivement. Ensuite, on a laissé la sonde d’ADN complémentaire CampyloP3 marquée à la biotine s’hybrider avec l’ADN cible. L’hybridation a été détectée à l’aide d’un conjugué streptavidine-HRP en combinaison avec un substrat luminol chimioluminogène en présence de l’activateur H2O2. Le sandwich streptavidine-biotine a permis de fixer les biotine-Si-NP à la sonde d’ADN, et par conséquent, d’amplifier le signal de détection par rapport à la biotine seule.
Une sensibilité améliorée a été obtenue à cause de l’augmentation de la quantité de marquage à la biotine par sonde d’ADN.
3.2.2. Optimisation des paramètres clés et des performances analytiques du capteur de dot blot d’ADN
La détection de 1 ng/pL de CP3 dans les conditions optimisées en utilisant différentes concentrations de streptavidine-HRP et de biotine-Si-NP a permis de sélectionner 25 ng/pL de streptavidine-HRP et 106 nanoparticules/mL pour la réaction chimioluminométrique. Il convient de noter que la réaction chimioluminométrique proprement dite ne contribue pas significativement au bruit de fond étant donné que l’émission de lumière provient de la réaction enzymatique sans aucune excitation photonique (Laios et al., 2011,RSC Cambridge).
3.2.3. Courbe d’étalonnage
Les courbes d’étalonnage ont été établies en utilisant une cible d’ADN de CP3 dans les deux configurations de dot blot (sans et avec des biotine-Si-NP) dans des conditions optimisées. Les courbes d’étalonnage ont été obtenues à partir de la quantification de l’intensité de la lumière chimioluminescente pour chaque concentration de CP3, provenant d’au moins trois taches indépendantes par concentration. L’intervalle linéaire pour la cible de CP3 était respectivement de 1 ng/pL à 0,1 ng/pL (avec un coefficient de corrélation R2=0, 98684), et de 6 pg/pL à 0,1 ng/pl (avec un coefficient de corrélation R2=0, 98935), pour la technique de dot blot classique et celle améliorée par des Biotine-Si-NP (Fig. 9 B et C). Les limites de détection (LOD) de 0,08 ng/pL et de 0,003 ng/pl pour respectivement le dot blot classique et le dot blot amélioré, ont été calculées en utilisant la formule 3 s/m, où ‘s’ est un écart-type de la solution à blanc et ‘m’ est une pente de la courbe d’étalonnage linéaire. En tenant compte du poids moléculaire de la CP3 qui est de 14395,5, la LOD calculée était de 5,5 nM et de 0,2 nM, pour respectivement le dot blot classique et le dot blot amélioré (figure 9).
Par conséquent, les biotine-Si-NP ont permis d’avoir une augmentation de presque 30 fois de l’intensité du signal chimioluminescent. Les LOD calculées étaient similaires ou inférieures à celles obtenues avec les capteurs rapportés précédemment pour la détection de Campylobacter, comme par exemple 0,5 ng/pL dans Fontanot et al. (2014), 0,37 ng/pL dans Manzano et al. (B&B2015) et 0,09 nM dans Morant-Minana et al. (B&B, 2015). La reproductibilité du dot blot amélioré par des biotine-Si-NP était estimée à 5% selon le signal obtenu pour la détection de la même concentration de CP3.
3.2.4. Spécificité et sélectivité de la détection
Pour examiner la sélectivité et la sensibilité du dot blot aux biotine-Si-NP, nous avons testé différentes souches de Campylobacter spp. pour l’inclusivité, et 17 autres espèces bactériennes et 1 une souche de levure pour l’exclusivité (Fig. 10). Toutes les souches ont été cultivées sous forme de monoculture et les ADN génomiques ont été extraits comme expliqué auparavant. Les analyses dot blot ont été réalisées en utilisant 10 ng/pL d’ADN extrait non amplifié. Avant l’immobilisation, tous les ADN génomiques ont été dénaturés pendant 5 min à 95°C pour permettre une ouverture des doubles brins. De la CP3 à 0,1 ng/pL a été utilisée comme témoin interne pour les intensités de signal normalisées. Les ratios des signaux pour C. jejuni , C. coii, C. tari et C. upsaliensis étaient supérieurs à 1,0, les images de membrane présentant des taches évidentes, alors que le ratio le plus élevé parmi les solutions d’ADN témoins n’était que de 0,6 pour S. enterica (figure 10).
De plus, l’intensité obtenue pour C. jejuni et C. coii était environ 4 fois supérieure à celle du témoin positif. Ceci indique que la sonde CampylC3 utilisée pour la détection a réagi plus efficacement avec l’ADN de C. jejuni et de C. coii qu’avec les autres Campylobacter spp. testés dans les conditions de dot blot optimisées dans cette étude. Nos résultats ont démontré que la plate-forme de dot blot améliorée par des biotine-Si-NP est suffisamment sensible pour détecter l’ADN entier extrait des Campylobacter spp. les plus fréquents sans amplification PCR, et pourrait permettre de faire la distinction entre un ADN de Campylobacter et d’autres bactéries.
3.2.5. La détection de Campylobacter spp. dans la peau d’une carcasse de poulet contaminée naturellement
Les peaux provenant de cinq échantillons de volaille, qui ont été enrichis, ont été conservées pour la méthode de comptage sur boîte ISO 10272-1:2006 et l’analyse dot blot couplée aux biotine-Si-NP (Fig. 11). La CP3 (0,1 ng/pL) a été utilisée comme témoin positif dans l’analyse dot blot. Toutes les mesures ont été effectuées trois fois. Deux échantillons ont été contaminés avec du Campylobacter jejuni (figure 11). Le dot blot amélioré par des biotine- Si-NP a réussi à détecter deux échantillons contaminés (Fig. 11). Le test a atteint une spécificité relative de 100 % grâce à la spécificité élevée de la sonde CampylP3 utilisée. Dans l’ensemble, la méthode dot blot améliorée par des biotine-Si-NP proposée a réussi à détecter des niveaux faibles de Campylobacter naturellement présents après enrichissement, et pourrait être envisagée pour la détermination et la détection des Campylobacter spp. présents dans une viande de volaille contaminée.
3.3. Conclusion
Ces travaux décrivent une méthode dot blot simple, améliorée avec des biotine-Si-NP, pour une détection rapide et fiable des Campylobacter spp. présents dans une viande de volaille contaminée.
Le test dot blot est largement utilisé en biologie moléculaire et en génétique pour détecter une séquence d’ADN/ARN cible.
Cette hybridation sur papier permet d’analyser facilement des échantillons multiples à moindre coût avec un rendement élevé, mais a ses limites en faible sensibilité.
Nous avons démontré que l’association de biotine-Si-NP hautement fonctionnalisées avec la lecture chimioluminescente du dot blot amplifiait le signal de 30 fois.
Par ailleurs, les biotine-Si-NP résistent bien à la température d’utilisation et sont stables dans le temps.
La LOD obtenue était de 0,006 ng/pl (0,2 nM). De telles faibles concentrations d’ADN détecté sont proches de celles que l’on peut détecter par qPCR (Manzano et al. 2018; Vidic et al., 2019).
L’hybridation de l’ADN génomique immobilisé avec la sonde CampylP3 a induit des signaux positifs pour tous les Campylobacter spp. responsables de la gastro-entérite humaine, alors qu’aucun bruit de fond n’a été observé avec les échantillons témoins.
Le système mis au point est un outil prometteur pour un criblage rapide et bon marché d’échantillons de volaille pour détecter la présence de Campylobacter car la détection est réalisée sur l’ADN bactérien sans étape d’amplification préalable.
Par ailleurs, notre dot blot peut s’appliquer à de l’ADN extrait par différentes méthodes d’extraction et provenant de diverses matrices alimentaires, étant donné qu’il n’est pas sensible aux inhibiteurs d’ADN polymérase.
Le test sur papier multiplex, miniaturisé et sensible proposé est simple à concevoir et pourrait être utilisé par l’industrie alimentaire et les agences de régulation pour la détection d’autres agents pathogènes afin de surveiller la qualité des aliments. Nous pensons que dans le futur, il pourrait être intégrable à un biocapteur à base de laboratoire sur puce qui comprend un protocole d’extraction d’ADN automatisé, voire même un téléphone portable.
4. Exemple 4 : Procédé alternatif en une étape
L’ADN a été extrait à partir de souches pures et d’isolats d’échantillons de poulet selon Manzano et al (2015). La concentration d’ADN total a été ajustée à 100 ng/mL en utilisant de l’eau distillée stérile. Avant l’immobilisation, les échantillons d’ADN extrait ont été dénaturés à 95 °C pendant 10 min, placés immédiatement sur de la glace et déposés en fraction de 1 pl sur la membrane de nylon chargée positivement (Amersham Hybon™-XL, GE Healthcare, France).
La membrane ayant reçu les dépôts a été exposée aux UV à 254 nm pendant 10 minutes pour fixer l’ADN. On a fait tremper la membrane dans du tampon d’hybridation préchauffé (Na2HP04 0,5 M, NaH2P04 0,5 M, EDTA 10 mM, SDS à 1 %, pH 7,5) à 65°C pendant 30 min sous agitation modérée. 4 ng/pL de la sonde CampyP3 marquée à la biotine dénaturée (100 ng/pL) ont été ajoutés au tampon d’hybridation et laissés une nuit à 65°C sous agitation modérée pour permettre l’hybridation. La membrane a été lavée deux fois avec du SDS 0,1, SSC (Citrate de sodium salin,
Meraudex, France) 300 mM pendant 5 min et avec du SSC 75 mM pendant 15 min. La membrane a été transférée dans le tampon de blocage (Tween 0,1 %, SAB 0,1 %, Proclin 0,03%, STP, pH 7,4) contenant 106 HRP-Streptavidine-Si-NP/mL, STP, pH 7,4 pendant 30 min, à température ambiante, sous agitation modérée. Après lavage avec du SDS 0,1 %, SSC 150 mM pendant 5 min à température ambiante, la membrane a été transférée dans une nouvelle boîte de Pétri et incubée dans la solution de blocage.
Le signal a ensuite été révélé en utilisant le substrat chimioluminescent amélioré pour la détection HPR (Thermo Scientific, France).

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte (T) susceptible d’être contenu dans un échantillon, ledit au moins un analyte (T) étant de préférence choisi parmi les analytes biologiques, notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques, lequel procédé comprend :
(a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon (E) est mis en présence d’au moins une sonde primaire (1), laquelle au moins une sonde primaire (1) est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison (11) apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte (T) pour former le cas échéant un complexe primaire (C1) et, d’autre part, une première étiquette d’affinité (12),
(b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant de la sonde primaire (1) dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2), lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321), et
- un traceur (21) destiné à convertir le complexe secondaire (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3), de sorte que, dans ledit complexe secondaire (C2), certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) sont liées avec ledit traceur (21).
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étiquette d’affinité (321) de l’enveloppe (32) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) consiste en :
- une première étiquette d’affinité (321), identique à la première étiquette d’affinité (12) de ladite au moins une sonde primaire (1), ou
- une seconde étiquette d’affinité (321) apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité (12) de ladite au moins une sonde primaire (1). [Revendication 3] Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, au cours de l’étape de révélation, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés :
- une seconde étiquette d’affinité (5) apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité (12), au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité (5) se présentant sous la forme d’une sonde secondaire (2) consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité (5, 22) et, d’autre part, le traceur (21), et
- ladite au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité (321), de sorte à obtenir, partant de la sonde primaire (1) dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2) comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : seconde étiquette d’affinité (5) : sonde d’amplification (3) : sondes secondaires (2), ladite sonde d’amplification
(3) dudit complexe secondaire (C2) étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire (2).
[Revendication 4] Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu’une partie de ladite seconde étiquette d’affinité (5) de l’étape de révélation est dépourvue dudit traceur (21).
[Revendication 5] Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité (321) dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur (21), de sorte à obtenir, partant de la sonde primaire (1) dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2) comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : sonde d’amplification (3).
[Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la première étiquette d’affinité (12, 321) est choisie parmi la biotine ou homologue, et en ce que la seconde étiquette d’affinité (5, 22) est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine.
[Revendication 7] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite au moins une sonde d’amplification (3) comprend un noyau (31) formé par une nanoparticule ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm.
[Revendication 8] Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la nanoparticule est choisie parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice, de préférence encore parmi les nanoparticules composées de silice, avantageusement encore parmi les billes de silice.
[Revendication 9] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite au moins une sonde d’amplification (3) comporte au moins 20 molécules de ladite étiquette d’affinité (321).
[Revendication 10] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’enveloppe (32) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) comprend des espaceurs (322), reliant le cœur (31) avec une molécule d’étiquette d’affinité (321).
[Revendication 11] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le traceur (21) est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, photoacoustiques ou photothermiques, le cas échéant ladite au moins une sonde secondaire (2) étant choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs.
[Revendication 12] Procédé selon la revendication 11, en combinaison avec la revendication 3, caractérisé en ce que les conjugués enzymatiques sont choisis parmi les conjugués streptavidine-HRP ou streptavidine-PA, et en ce que les réactifs de révélation de l’étape de révélation comprennent un substrat desdits conjugués enzymatiques pour une réaction de chimiluminescence en présence dudit complexe secondaire (C2).
[Revendication 13] Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 ou 5, caractérisé en ce que l’étape de révélation est mise en œuvre en :
- deux phases successives, dans le cadre de la revendication 3, avec :
-- une première phase au cours de laquelle est ajoutée ladite seconde étiquette d’affinité (5), éventuellement au moins une partie sous forme de ladite au moins une sonde secondaire (2), pour former un premier sous-complexe comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : seconde étiquette d’affinité (5), puis
-- une seconde phase au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification (3) et ladite au moins une sonde secondaire (2) pour former ledit complexe secondaire (C2), ou - une phase unique, dans le cadre de la revendication 3, au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire (C2), ou
- une phase unique, dans le cadre de la revendication 5, au cours de laquelle est ajoutée ladite au moins une sonde d’amplification (3) pour la formation du complexe secondaire (C2).
[Revendication 14] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le site de liaison (11) de ladite au moins une sonde primaire (1) est choisie parmi les biomolécules, par exemple les sondes nucléiques ou les sondes protéiques.
[Revendication 15] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire (1), ledit au moins un analyte (T) est fixé :
- sur un support (S), par exemple pour un procédé du type dot blot, ou
- sur une sonde de capture (6), portée par exemple par une bille magnétique (B) pour une technique MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich.
[Revendication 16] Utilisation d’une sonde du type noyau-enveloppe en tant que sonde d’amplification du signal dans un procédé de détection en cascade pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte (T) susceptible d’être contenu dans un échantillon (E), ladite sonde d’amplification (3) comportant une enveloppe (32) qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321).
[Revendication 17] Système de réactifs, pour la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, lequel système de réactifs comprend :
- au moins une sonde primaire (1), laquelle au moins une sonde primaire (1) est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison (11) apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte (T) et, d’autre part, une première étiquette d’affinité (12), et
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe (C2) partant de la sonde primaire
(1), lequel au moins un réactif de révélation comprend :
- au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321), et - un traceur (21) destiné à convertir le complexe (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3), de sorte que, dans ledit complexe (C2), certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) sont liées à au moins une molécule dudit traceur (21).
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