EP4158341A1 - Method and system for determining the presence and/or amount of at least one analyte that may be contained in a sample - Google Patents

Method and system for determining the presence and/or amount of at least one analyte that may be contained in a sample

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Publication number
EP4158341A1
EP4158341A1 EP21728199.7A EP21728199A EP4158341A1 EP 4158341 A1 EP4158341 A1 EP 4158341A1 EP 21728199 A EP21728199 A EP 21728199A EP 4158341 A1 EP4158341 A1 EP 4158341A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
probe
affinity tag
complex
primary
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP21728199.7A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Jasmina VIDIC
Nalini RAMA RAO
Carole Chaix
Carole FARRE
Marisa Manzano
Priya VIZZINI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Universita degli Studi di Udine
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Universita degli Studi di Udine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL, Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement, Universita degli Studi di Udine filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4158341A1 publication Critical patent/EP4158341A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Definitions

  • the present invention relates to the field of techniques for the analysis of liquid samples.
  • It relates in particular to the field of methods and systems for determining the presence and / or quantity of at least one analyte likely to be contained in a sample.
  • Analytical techniques are concerned with the identification and characterization of chemicals, known as "analytes", in a sample.
  • the analysis carried out can be qualitative, when the technique allows a search for the presence of the analyte in the sample; this analysis can be quantitative, when the technique further allows a measurement of the amount of analyte in the sample.
  • Such analysis techniques include in particular biological analyzes when the desired analyte consists of a biological analyte.
  • the analytical technique must ensure a selective and sensitive assay of the analyte likely to be contained in the sample analyzed.
  • testing for pathogens may be based on propagation by culture before isolation. These methods are effective and sensitive but are generally laborious and over a long period of time (results are usually only available after several days).
  • biosensors Other analytical tools rely on the specific molecular binding properties that are encountered in biological molecules known generically as biological sensors or biosensors (also called biosensors or “biosensors”).
  • biosensors are particularly advantageous for the rapid and efficient determination of markers, typically biological markers, on account of their simplicity of use, their possible miniaturization and their capacity for analysis in real time.
  • a biosensor indeed has the ability to recognize a target biological marker (biomarker or “target biomarker”), characteristic of the target analyte (for example a pathogen of interest).
  • a target biological marker biological marker
  • the biosensor carries a detection element commonly called a “bioreceptor” (also called a biological receptor or “bioreceptor”).
  • bioreceptors consist for example of monoclonal antibodies, RNA, DNA, glycans, lectins, enzymes, tissues or whole cells.
  • the bioreceptor plays a key role because its biochemical properties provide sensitivity and selectivity in the detection of biomarkers and help to avoid interference with other compounds in the test sample.
  • biomarker The specific biochemical interaction between the biomarker and the bioreceptor is then converted, thanks to a tracer element (also called transducer or “transductor”), into a measurable signal.
  • tracer element also called transducer or “transductor”
  • the recording and display of the signal allows a qualitative, even quantitative, identification of the analyte in the analyzed sample.
  • the tracer is carried directly by the biosensor.
  • an analyte molecule is generally able to cooperate with a small number of biosensor / tracer molecules, or even with a single biosensor / tracer molecule.
  • some analysis systems rely on cascade detection in which the bioreceptor is linked to an enhancer compound capable of receiving multiple tracer molecules.
  • the present invention thus provides methods and systems suitable for determining, with increased sensitivity, the presence and / or quantity of at least one analyte likely to be contained in a sample.
  • a method for determining the presence and / or the quantity of at least one analyte capable of being contained in a sample.
  • said at least one analyte is chosen from biological analytes, in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells, infectious agents such as bacteria , viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
  • the method according to the invention comprises:
  • amplification probe of the core-envelope type, in which said envelope comprises several molecules with an affinity tag
  • a tracer intended to convert the secondary complex into a visible and / or measurable signal, said tracer being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe, so that , in said secondary complex, at least some of the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe are linked with said label.
  • Such a method thus allows, by a simple adaptation of the cascade detection systems, a significant amplification of the detection signal.
  • the secondary complex obtained comprises the amplification probe which advantageously constitutes an interface capable of receiving a plurality of tracer molecules.
  • the method according to the invention achieves indirect / cascade binding, in which a plurality of tracer molecules are linked to an analyte molecule.
  • This new technology provides improved detection of all types of analytes, in particular biological analytes (microorganisms, virulence markers, antibiotic resistance markers, etc.).
  • the addition of the amplification probe in a cascade detection system allows a significant increase in the signal.
  • the affinity tag of the envelope of said at least one amplification probe consists of: - a first affinity tag, identical to the first affinity tag of said at least one primary probe, or
  • a second affinity tag capable of binding specifically with said first affinity tag, at least part of said second affinity tag being in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, of a on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer, and
  • amplification probe of the nucleus-envelope type, in which said envelope comprises several molecules of said first affinity tag, so as to obtain, starting from said primary complex, a secondary complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag: amplification probe: secondary probes, said amplification probe of said secondary complex being linked to several molecules of said at least one secondary probe.
  • a part of said second affinity tag of the revealing step is advantageously devoid of said tracer.
  • the first affinity tag is chosen from biotin or homolog
  • the second affinity tag is chosen from streptavidin or homolog, for example avidin, NeutrAvidin or Captavidin
  • said at least one amplification probe comprises a core formed by a nanoparticle preferably having a size ranging from 10 to 100 nm; the nanoparticle is advantageously chosen from nanoparticles having a surface composed of silica, more preferably from nanoparticles composed of silica, advantageously also from silica beads; said at least one amplification probe comprises at least 20 molecules of said affinity tag;
  • the envelope of said at least one amplification probe comprises spacers, connecting the heart with a first affinity tag molecule; the spacers are for example chosen from nucleic spacers, for example DNA sequences;
  • the tracer is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic, photoacoustic or photothermal particles; where appropriate, said at least one secondary probe is advantageously chosen from enzymatic conjugates or photoactive conjugates (colored, fluorescent, luminescent conjugates); the enzymatic conjugates are advantageously chosen from streptavidin-HRP or streptavidin-PA conjugates, and the reagents for the revelation step comprise a substrate of said enzymatic conjugates for a chemiluminescence reaction in the presence of said secondary complex;
  • the revelation step is implemented in two successive phases with a first phase during which is added said second affinity tag, optionally at least a part in the form of said at least one secondary probe, to form a first sub-complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag, then a second phase during which said at least one amplification probe and said at least one secondary probe are added to form said secondary complex, or a single phase during which the reagents are simultaneously added for the formation of the secondary complex;
  • the binding site of said at least one primary probe is chosen from biomolecules, for example nucleic probes (RNA, DNA, aptamers sequences), protein probes (antibodies, enzymes, antigens, peptides);
  • said at least one analyte is fixed on a support, for example for a method of the dot blot type, or on a capture probe, carried for example by a magnetic bead for a MELISA technique or by a support for a sandwich ELISA technique,
  • the amplification step is carried out so as to obtain a secondary complex comprising several amplification probes in cascade / in series (for example two or three amplification probes); the secondary complex advantageously comprises at least two amplification probes linked together by at least a second affinity tag.
  • the present invention also relates to the use of a core-envelope type probe as a signal amplification probe in a cascade detection method for determining the presence and / or the quantity of at least one.
  • analyte capable of being contained in a sample
  • said amplification probe comprising an envelope which comprises several molecules of an affinity tag.
  • the amplification probe comprises an envelope which comprises several molecules of a first affinity tag each capable of specifically binding to a second affinity tag, at least part of said second affinity tag being intended in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer.
  • the nucleus-envelope type amplification probe comprises an envelope which comprises several molecules of said second affinity tag, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer.
  • the present invention also relates to the reagent system, for implementing the method according to the invention.
  • the reagent system includes:
  • At least one primary probe which at least one primary probe is a conjugate comprising, on the one hand, a binding site capable of binding specifically with said analyte and, on the other hand, a first affinity tag, and
  • At least one revelation reagent capable of forming a complex starting from the primary probe which at least one revelation reagent comprises:
  • nucleus-type amplification probe - envelope in which said envelope comprises several molecules with an affinity tag
  • a tracer intended to convert the complex into a visible and / or measurable signal, said tracer being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe, so that, in said complex, at least some of the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe are linked to at least one molecule of said tracer.
  • the revelation reagents comprise:
  • a second affinity tag capable of binding specifically with said first affinity tag, at least part of said second affinity tag being in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, of a on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer (enzyme, fluorophore, radioisotope, redox molecule, etc.), and
  • amplification probe of the nucleus-envelope type, in which said envelope comprises several molecules of said first affinity tag, which reagent system is capable of forming, in the presence of said analyte, a complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag: amplification probe: secondary probes, said amplification probe of said secondary complex being bound to several molecules of said at least one secondary probe.
  • the amplification probe, of the nucleus-envelope type has an envelope which comprises several molecules of said second affinity tag, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer, so in obtaining, starting from said primary complex, a secondary complex comprising analyte: primary probe: amplification probe.
  • FIG. 1 is a schematic view of a primary complex between an analyte and a primary probe (antibody type), which is obtained at the end of the recognition step according to the invention;
  • FIG. 2 is a schematic view of a first amplification probe suitable for the method according to the invention.
  • FIG. 3 is a schematic view of a secondary complex resulting from the revealing step, obtained by the cascade binding of the primary complex with in particular an amplification probe (according to FIG. 2) linked to several molecules of a secondary probe forming a tracer;
  • FIG. 4 is a schematic view of a secondary complex in which the analyte is itself fixed by a magnetic bead during an assay in the form of enzymatic immuno-absorption on a magnetic support bead (also called “magnetic bead-based enzyme -linked immunosorbent assay ”or MELISA);
  • FIG. 5 is a schematic view of a secondary complex, in which the analyte is itself supported on a support by a molecular dot blot hybridization technique
  • FIG. 6 is a schematic view of a second amplification probe suitable for the method according to the invention
  • FIG. 7 is a schematic view of a secondary complex resulting from the revealing step, obtained by the cascade binding of the primary complex with an amplification probe according to FIG. 6 carrying several tracer molecules;
  • FIG. 8 is a figure illustrating the absorbance (450 - 550 mm) by Biot-NP MELISA technique as a function of plaque-forming units (PFU / mL), for whole viruses from different strains (H1 N1, H3N2, PRRSV ) in a buffer containing 10% saliva;
  • FIG. 9 is a view comprising (A) Dot blot detection of Campylobacter DNA sequence with improved reading by biotin-Si-NP. It should be noted that no signal was obtained with a truncated Campylobacter (PR) sequence or with a control sequence of E. Coli (PE). (B) Conventional dot blot detection of the biotin-labeled CampyP3 probe using the dilution of the Campylobacter CP3 complementary sequence ranging from 1 ng / ⁇ l to 78 fg / ⁇ l.
  • PR truncated Campylobacter
  • PE E. Coli
  • FIG. 10 is a view showing the results of the inclusivity and exclusivity tests of the enhanced dot blot sensor in pure cultures
  • FIG. 11 illustrates a dot blot membrane obtained with naturally infected (C * 3 and C10) and uninfected (C4, C5 and C6) chicken samples; the CP3 template sequence (0.1 ng / pL) was used as a positive control.
  • the present invention relates to methods and systems for determining the presence and / or amount of at least one analyte likely to be contained in a sample.
  • analyte is understood to mean any chemical, biochemical or biological entity that it is desired to detect in a sample.
  • This chemical entity advantageously consists of an entity resulting from the living world, preferably from the plant or animal world, or even present in humans.
  • analytes detectable by the devices and methods according to the present invention there may be mentioned in particular biological analytes, in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells. , infectious agents such as bacteria, viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
  • biological analytes in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells.
  • infectious agents such as bacteria, viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
  • sample is meant any sample in which the desired analyte is in solution or in suspension.
  • This sample can in particular be any biological or bodily fluid.
  • the sample may also have been obtained directly or indirectly from a biological or bodily fluid.
  • the sample can also be a liquid extract from a solid or gaseous sample.
  • the sample is for example obtained from water, air, soil, biological materials (tissues, microorganisms, organelles, cell receptors, enzymes, antibodies, nucleic acids, genetically modified organisms, or materials derived from GMOs, etc.).
  • biological materials tissues, microorganisms, organelles, cell receptors, enzymes, antibodies, nucleic acids, genetically modified organisms, or materials derived from GMOs, etc.
  • the method and the system according to the invention are advantageous in that they can be adapted both to the determination of the presence of at least one analyte, as to the determination of its quantity.
  • detecting or “determining” is thus meant the qualitative determination (advantageously the presence or absence) of one or more analytes in a sample.
  • detect or “determine” also includes the measurement and quantification of one or more analytes in the sample.
  • the method according to the invention comprises the following successive steps:
  • a revelation step B (FIGS. 3 and 7 in particular) during which is added at least one revelation reagent suitable for forming a secondary complex C2 starting from the primary probe 1 (and preferably from a first label d affinity 12 of said primary probe 1) of said primary complex C1.
  • said at least one revealing reagent comprises:
  • said at least one revelation reagent is intended to bind, in cascade, from said at least one primary probe 1 (and advantageously from its first affinity tag 12) to form the secondary complex C2.
  • said at least one revelation reagent used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 in which at least some of the molecules of the label d 'affinity 321 of said at least an amplification probe 3 are linked (directly or indirectly) with at least one molecule of the tracer 21 ( Figures 3 and 7).
  • said tracer 21 can advantageously have two different forms:
  • the tracer 21 is a separate reagent compared to said at least one amplification probe 3; the tracer 21 is intended to bind with the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 (FIG. 3 in particular), or
  • the tracer 21 and the amplification probe 3 form a single reagent; the tracer 21 is linked with the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 ( Figures 6 and 7).
  • the tracer 21 also called “marker”, “transducer” or “transductor”, is intended to convert the secondary complex C2 into a visible and / or measurable signal.
  • tracer thus means any entity allowing direct or indirect detection with the naked eye, or with the aid of a device, due to the emission of a signal.
  • the signal is, for example, fluorescence, coloring, the presence of isotope or a magnetic signal.
  • the tracer 21 can thus be chosen from conventional tracers per se.
  • this tracer 21 is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic particles, photoacoustic particles or photothermal particles.
  • any strong bond for example covalent (in particular for a single reagent), but also
  • any weak binding for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type or affinity tags (in particular for separate reagents).
  • the affinity tag 321 of the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 is chosen from:
  • the revealing step B leads to adding at least the following revealing reagents:
  • the revelation reagents 2, 3, 5 used make it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: second label d affinity 5: amplification probe 3: secondary probes 2.
  • the amplification probe 3 of this secondary complex C2 is in particular linked to several molecules of said at least one secondary probe 2.
  • a plurality of molecules of said at least one secondary probe 2 (carrying the tracer) is linked to an analyte T molecule.
  • This structure offers a significant amplification of the signal obtained for each T analyte molecule present, thanks to the multiplication of the secondary probes 2 making up the secondary complex C2 (reported on the amplification probe 3).
  • amplification probe 3 of the core 31-envelope 32 type in which said envelope 32 comprises several molecules of said second label.
  • the amplification probe 3 used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
  • a plurality of tracer molecules 21 are linked to an analyte T molecule.
  • This structure then offers a significant amplification of the signal obtained for each T analyte molecule present, thanks to the multiplication of the tracers 21 carried by the amplification probe 3.
  • the revealing reagents are assembled in cascade by specific molecular bonds based on complementary affinity tags.
  • the reagents used in the process advantageously comprise at least one pair of affinity labels, or even a single pair of affinity labels.
  • affinity tags is advantageously meant a pair of chemical, biochemical or biological entities which are able to bind specifically with one another to form a complex.
  • affinity tags include in particular the biological ligands chosen from peptides and oligonucleotides.
  • affinity tags are chosen from the couple:
  • biotin also called “biotin” or “biot” in the examples
  • biotin also called “biotin” or “biot” in the examples
  • streptavidin or homolog for example avidin, NeutrAvidin, Captavidin
  • sample E is thus brought into contact with said at least one primary probe 1 forming a biosensor.
  • said at least one primary probe 1 therefore consists of a conjugate comprising:
  • binding site 11 still forming a "bioreceptor" or recognition element, capable of binding specifically with the analyte T to form, if necessary, the primary complex C1, and
  • the secondary complex C2 is advantageously formed, in cascade, from the first affinity tag 12.
  • Said at least one primary probe 1, and in particular its binding site 11, consists of any chemical, biochemical or biological entity which is able to bind specifically to the analyte T to form the primary complex C1 (advantageously binary).
  • bind or “binding” is meant any strong bond, for example covalent, but also any weak bond, for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type.
  • Such a primary probe 1, and in particular its binding site 11, is thus advantageously chosen from biomolecules, namely for example:
  • Figure 1 - protein probes ( Figure 1), including antibodies, enzymes, antigens, peptides, or
  • FIG. 5 - nucleic acid probes (FIG. 5), encompassing the RNA sequences, the DNA sequences, the aptamers.
  • the primary probe 1 (and in particular its binding site 11) is chosen for its specific binding properties to the T analyte, such as for example a ligand / anti-ligand pair, an antigen / antibody pair, a DNA / RNA pair. or a DNA / DNA pair.
  • the binding site 11 is advantageously an antibody specific for the analyte.
  • antibody specific for the analyte is meant an antibody capable of binding specifically with the analyte in a binding of the antigen / antibody type.
  • It is typically a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, having a high affinity for the analyte.
  • it is a monoclonal antibody.
  • the binding site 11 is advantageously a complementary DNA probe.
  • the primary probe 1 consists of a probe capable of binding to the DNA of Gram-negative bacteria of the genus Campylobacter, and more preferably DNA probes specific for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter tari or Campylobacter upsaliensis as described. for example in the patent application IT102020000012496.
  • the parameters (incubation time, rinsing, etc.) are adjusted so as to allow the formation of the primary complex C1 in the presence of the analyte T.
  • the first affinity tag 12 of the primary probe 1 is advantageously chosen from biotin or homolog.
  • binding site 11 and the first affinity tag 12 are advantageously linked by covalent bonds.
  • said at least one analyte T Prior to bringing said at least one primary probe 1 together, said at least one analyte T can be fixed:
  • a capture probe 6 carried for example by a magnetic ball B for a so-called MELISA technique or by a support for a sandwich ELISA technique, or
  • the aforementioned capture probe 6 consists of any chemical, biochemical or biological entity which is able to bind specifically to the analyte T.
  • bind or “binding” is meant any strong bond, for example covalent, but also any weak bond, for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type.
  • Such a capture probe 6, and in particular its binding site is thus advantageously chosen from biomolecules, namely for example:
  • - protein probes including antibodies, enzymes, antigens, peptides, or
  • nucleic acid probes encompassing RNA sequences, DNA sequences, aptamers.
  • the capture probe 6 (and in particular its binding site) is chosen for its specific binding properties to the T analyte, such as for example a ligand / anti-ligand cut, an antigen / antibody pair, a DNA / RNA pair. or a DNA / DNA pair.
  • dot blot encompasses techniques for transferring molecules which make it possible to verify the presence of specific molecules in a medium, including the Southern blot for the DNA, the northern blot for the RNAs or the western blot for the proteins.
  • dot blot also encompasses the transfer of nucleic acids (DNA or RNA) from a liquid medium directly onto a membrane, without prior separation (therefore without prior electrophoresis).
  • the transfer can be carried out by simple diffusion, by diffusion in an electric field (electrodiffusion) or by vacuum suction.
  • Revelation step B
  • the revelation step B is carried out so as to detect, by means of at least one revelation reagent, any C1 primary complexes generated during the recognition step A.
  • said at least one revelation reagent comprises:
  • the second affinity tag 5 is adapted to bind specifically with the first affinity tag which is carried by the primary probe 1 or, as developed later, by said at least one amplification probe 3.
  • the second affinity tag 5 is advantageously chosen from streptavidin or homologous, for example avidin or NeutrAvidin or Captavidin.
  • the second affinity tag 5 may appear:
  • the second affinity tag 5 in free form may represent 10 to 50%, more preferably 20 to 50%, of the second affinity tag molecules 5.
  • the aforementioned secondary probe 2 consists of a detection reagent in the form of a conjugate comprising:
  • an affinity tag 22 which consists of the aforementioned second affinity tag 5.
  • this affinity tag of the secondary probe 2 is designated indifferently by the references 5 or 22 and can also be referred to as “second affinity tag”.
  • the tracer 21 can thus be chosen from conventional tracers per se.
  • this tracer 21 is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic particles, photoacoustic particles, or photothermal particles.
  • Said at least one secondary probe 2 is thus advantageously chosen from enzymatic conjugates or photoactive conjugates.
  • enzyme conjugates is understood to mean conjugates with the enzymes H RP (horseradish peroxidase) or PA (alkaline phosphatase).
  • the reagents for development step B advantageously comprise a substrate 4 for the enzymatic conjugates for a chemiluminescence reaction in the presence of the secondary complex C2.
  • the substrate 4 can thus be chosen from, for example, the following compounds:
  • TMB - chromogenic
  • ADHP fluorescent
  • Luminol chemiluminescent
  • pNPP - chromogenic
  • MUP fluorescent
  • FPD chemiluminescent
  • photoactive conjugates includes colored conjugates, fluorescent conjugates and luminescent conjugates.
  • said at least one secondary probe 2 consists of an enzymatic conjugate chosen for example from streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) or streptavidin conjugates.
  • -PA alkaline phosphatase
  • said at least one amplification probe 3 is of the core 31 (also called “heart”) - envelope 32 type.
  • Envelope 32 includes multiple molecules of an affinity tag 321 (also referred to as "first affinity tag 321") which is identical to the first affinity tag 12 of primary probe 1.
  • said at least one amplification probe 3 advantageously comprises at least 20 molecules of said first affinity tag 321.
  • These molecules of said first affinity tag 321 are able to bind specifically with at least one molecule of the second affinity tag 5, 22, namely:
  • the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 also advantageously comprises spacers 322 which connect the nucleus 31 with a first affinity tag molecule 321.
  • Such spacers 322 aim to separate the molecules of the first affinity tag 321 with respect to the nucleus 31 and with respect to each other, thus limiting the problems of steric hindrance during the revealing step B.
  • This structure thus makes it possible to free the environment from the first affinity tags 321, and to increase the number of molecules of said at least one secondary probe 2 which is bound simultaneously with the amplification probe 3.
  • This arrangement also allows a better presentation of the first affinity tags 321, thus promoting the recognition reaction (advantageously increase in the probability of reaction) with said at least one secondary probe 2.
  • the spacers 322 are advantageously chosen from nucleic spacers, for example DNA sequences (for example a dTio-PEG 2 -dTio sequence).
  • the core 31 is for its part advantageously formed by a nanoparticle 31 (also called “NP” in the examples) preferably having a size ranging from 10 to 100 nm.
  • the size of the particles is defined as their largest size and can be measured using a scanning electron microscope or an optical microscope.
  • the size of heterogeneously shaped objects is defined as the length of the larger side of the object.
  • the nanoparticle 31 is advantageously chosen from nanoparticles having a surface composed of silica (including silicate).
  • such nanoparticles are also chosen from nanoparticles composed of silica (or even silicate), advantageously also from silica beads.
  • the nanoparticles can be chosen from silica nanoparticles (also called “Si-NP”), gold, silver, graphite, fluorescent nanocrystals (also called quantum dots), polymer nanoparticles of the type polystyrene, polypropylene or polybutadiene, or metal oxide nanoparticles, in particular of tin oxide, gadolinium, aluminum, titanium, cerium, erbium niobium, ytterbium, terbium, dysprosium , europium, or a mixture of these oxides, optionally coated to allow their functionalization.
  • silica nanoparticles also called “Si-NP”
  • gold silver
  • graphite also called quantum dots
  • polymer nanoparticles of the type polystyrene polypropylene or polybutadiene
  • metal oxide nanoparticles in particular of tin oxide, gadolinium, aluminum, titanium, cerium, erbium niobium, ytterbium,
  • the revelation step B is carried out under conditions suitable for generating the secondary complex C2 ( cascade), starting from the primary probe 1 of said primary complex C1, comprising analyte T: primary probe 1: second affinity tag 5 (free or conjugated): amplification probe 3: secondary probes 2.
  • the amplification probe 3 of this secondary complex C2, carrying a plurality of molecules of first affinity tag 321, is thus advantageously linked to several molecules of said at least one secondary probe 2 (via their second affinity tags 22) .
  • This configuration then allows a significant amplification of the signal, with a plurality of molecules of secondary probe 2 (intended to produce a signal) for one molecule of analyte T.
  • disclosure step B can take two alternative embodiments.
  • the revealing step B is implemented in two successive phases with:
  • the second phase B2 can itself be divided into two successive operations (successive addition of the revelation reagents):
  • this first embodiment comprises a preparation phase during which said at least one amplification probe 3 is linked with the secondary probe 2 (by means of their affinity tags 321, 22), to form an amplification probe 3 / secondary probes 2 complex.
  • the second phase B2 is implemented by directly adding the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex which is intended to bind with the second affinity tags 5 (free or conjugated) of the first sub-complex. .
  • the revelation step B is carried out in a single phase during which the reagents are added simultaneously for the formation of the secondary complex C2.
  • the method advantageously comprises a preparation phase during which said at least one amplification probe 3 is linked with several molecules of secondary probes 2 (by means of their affinity tags 321, 22), to form a Amplification probe 3 / secondary probe complex 2.
  • revelation step B is carried out by directly adding the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex which is intended to bind with the primary probe 1 if it is still present.
  • the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex binds with the first affinity tag 12 of the primary probe 1, this via the second affinity tags 5, 22 (free or conjugated ).
  • the amplification probe 3 used is similar to that described above in relation to FIGS. 1 to 5 in that it is of the core 31 - shell 32 type with a shell 32 which comprises several molecules of an affinity tag 321.
  • This amplification probe 3 is distinguished in that the envelope 32 comprises several molecules of a second affinity tag 321 which is complementary to the first affinity tag 12 of the primary probe 1.
  • At least 50% of the molecules of the second affinity tag 321 are linked to at least one molecule of the tracer 21.
  • bound is understood here advantageously to mean a strong bond, preferably a covalent bond.
  • the second affinity tag 321 / tracer 21 pair is thus advantageously chosen from the enzymatic conjugates or the photoactive conjugates, grafted onto the amplification probe 3.
  • said at least one amplification probe 3 advantageously comprises at least 20 molecules of said second affinity tag 321.
  • the second affinity tag 321 is adapted to bind specifically with the first affinity tag 12 which is carried by the primary probe 1.
  • the second affinity tag 321 is advantageously chosen from streptavidin or homologous, for example avidin or NeutrAvidin or Captavidin.
  • the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 also advantageously comprises spacers 322 which connect the nucleus 31 with a second affinity tag molecule 321.
  • the revelation step B is carried out under conditions suitable for generating the secondary complex C2 (in cascade) comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
  • the amplification probe 3 of this secondary complex C2 carries a plurality of second affinity tag 321 / tracer 21 conjugates.
  • This configuration then allows a significant amplification of the signal, with a plurality of tracer molecules 21 (intended to produce a signal) for an analyte molecule T.
  • the revelation step B is then advantageously carried out in a single phase during which the amplification probe 3 is added for the formation of the secondary complex C2.
  • revelation step B is carried out by directly adding the amplification probe 3 which is intended to bind with the primary probe 1 if it is still present.
  • the amplification probe 3 binds with the first affinity tag 12 of the primary probe 1, through the second affinity tags 321.
  • the amplification step could be implemented so as to obtain a secondary complex C2 comprising several amplification probes 3 in cascade / in series (for example two or three probes d. amplification 3), before adding the tracer 21.
  • the secondary complex C2 then advantageously comprises at least two amplification probes 3 linked together by at least one second affinity tag 5. Such an approach would make it possible to multiply the amplification effect.
  • the revelation step B also advantageously includes a final reading phase during which:
  • the analyte T is detected (presence of the analyte T in the sample E), when a signal is detected due to the formation of the secondary complex C2 comprising the tracer 21, or
  • the present invention also relates to the reagent system, or kit, for implementing the method according to the invention.
  • said at least one primary probe 1 which at least one primary probe 1 is a conjugate comprising, on the one hand, the binding site 11 capable of binding specifically with said analyte T and, on the other hand, the first label affinity 12, and
  • a tracer 21 intended to convert the complex C2 into a visible and / or measurable signal, said tracer 21 being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 , so that, in said complex C2, at least some of the molecules of the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 are linked to at least one molecule of said tracer 21.
  • the revelation reagents comprise:
  • said second affinity tag 5 capable of binding specifically with said first affinity tag 12, at least part of said second affinity tag 5 being in the form of said secondary probe 2 consisting of a conjugate comprising, on the one hand, said second affinity tag 5 and, on the other hand, the tracer 21, and - said at least one amplification probe 3, of the core 31 type - envelope 32, in which said envelope 32 comprises several molecules of said first affinity tag 12.
  • such a system of reagents is capable of forming, in the presence of said analyte T, a C2 complex according to the invention which comprises analyte T: primary probe 1: second affinity tag 5: amplification probe 3: secondary probes 2.
  • Amplification probe 3 of this C2 complex then advantageously carries several molecules of said at least one secondary probe 2.
  • the first affinity tag 12 is chosen from biotin or homolog (for example a silica nanoparticle carrying biotin molecules, also called “biotin-Si-NP” or “biotin-nanoparticle” in the examples).
  • the second affinity tag 5 is selected from streptavidin or homolog, eg, avidin, NeutrAvidin or Captavidin.
  • such a reagent system advantageously comprises:
  • said at least one primary probe 1 which at least one primary probe 1 is a conjugate comprising, on the one hand, the binding site 11 capable of binding specifically with said analyte T and, on the other hand, the first label affinity 12, and
  • the amplification probe 3 used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
  • a plurality of tracer molecules 21 are linked to an analyte T molecule.
  • the first affinity tag 12 is chosen from biotin or homolog.
  • the second affinity tag 321 is selected from streptavidin or homolog, eg, avidin, NeutrAvidin or Captavidin.
  • the detection system according to the invention can very well be adapted to the desired T analyte.
  • the detection system is advantageously in dot blot form for the search for an analyte of the nucleic acid type (see Figure 6).
  • the binding site 11 of the primary probe 1 is advantageously a complementary DNA probe, preferably coupled to biotin.
  • the detection system is advantageously in ELISA or MELISA form for the search for an analyte of the antigen or hapten type (see FIGS. 1 and 4).
  • the binding site 11 of the primary probe 1 is advantageously an antibody specific for the analyte, preferably coupled to biotin.
  • the system also advantageously comprises a above-mentioned capture probe 6, carried for example by a magnetic ball B.
  • Example 1 Manufacturing process of an amplification probe
  • Si-NPs silicon nanoparticles
  • Si-NPs silicon nanoparticles
  • an innovative solid-phase synthesis technology that allows the functionalization of nanometric-sized particles with DNA fragments, as previously reported (Bonnet et al, Analyst 2018, Issue 10, 2018; De Crozals et al, RSC Advances, 2012, 2, 11858-11866).
  • CPG Controlled Pore Glass
  • the linker which allows better accessibility of the functions of interest, has been synthesized.
  • biotin incorporation was monitored at 498 nm using quantitation of dimethoxytrityl by a UV-visible spectrophotometer.
  • the biotin-Si-NP were released from the CPG by incubating the support in 1mL of 0.1% (w / v) DBU in a 1/1 (v / v) water-acetonitrile mixture.
  • the DBU solution was stirred in a thermomixer at 22 ° C for 1 hour before being collected.
  • NP nanoparticles
  • the release kinetics were followed by quantifying the concentration of NP (nanoparticles) in each DBU solution by measuring the U V-visible at 560 nm.
  • the released nanoparticles were washed with milli-Q water (1x 4mL then 3x2 mL) and concentrated on a 30K Amicon Ultra filter (5000g, 10 min).
  • the amount of dT10-PEG2-dT10-10% Biotin strands per NP was estimated using a Varian Cary 100 Bio UV-visible spectrophotometer (Agilent Technologies) using a quartz cuvette with 1 cm optical path.
  • the nanoparticles were released from the CPG by incubating the support in 1mL of a 0.1% (w / v) solution of DBU (1,8-Diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene) in a mixture. water- acetonitrile 1/1 (v / v).
  • the DBU solution was stirred in a thermomixer at 22 ° C for 1 hour before being collected.
  • a fresh solution of DBU was added to the CPG suspension every hour.
  • the release kinetics were followed by quantifying the nanoparticle concentration of each DBU solution by measuring the UV-visible at 560 nm.
  • the released nanoparticles were washed with water (1x 4mL then 3x2 mL) and concentrated on a 30K Amicon Ultra filter (5000g, 10 min).
  • the amount of strands per NP was estimated using a Varian Cary 100 Bio UV-visible spectrophotometer (Agilent Technologies) using a quartz cuvette with 1 cm optical path.
  • the amount of linker grafted onto the nanoparticles was quantified by measuring the absorbance in water (200pL) at 260nm and 560nm using a microplate reader (Perkin Elmer).
  • the concentration of nanoparticles was estimated as described previously by Bonnet et al. (Analyst 2018). To correspond to this estimate, we established an approximate molar extinction coefficient at 163,200 M-1 cm-1 which takes into account the epsilons of the different parts of the sequence corrected by their corresponding coupling efficiency.
  • the functionalized NPs were observed under a transmission electron microscope (TEM) using a Philips CM120 device operating at an acceleration voltage of 120kV (Center Technonova des Microstructures, Lyon).
  • TEM transmission electron microscope
  • Philips CM120 device operating at an acceleration voltage of 120kV (Center Technonova des Microstructures, Lyon).
  • the Si-NPs were observed after depositing 5 ⁇ l of dilute solution on a copper grid covered with Formvar-carbon and evaporation to dryness.
  • Biotin-Si-NP were prepared using an innovative solid phase synthesis technology which allowed very high functionalization (Crozals et al., RSC Adv. 2012, 2, 11858-11866).
  • a hydroxyl group was attached to the surface of Si-NPs by silanization as previously reported (Farre et al., Langmuir, 2010; Bonnet et al, Analyst 2018).
  • the hydroxyl functions served as a support for the synthesis of an oligonucleotide linker on the surface of the NPs.
  • biotin groups were grafted to the linker as explained in Materials and Methods. MET observations showed that the NP morphology remained stable during synthesis.
  • Functionalized biotin-Si-NP had an average size of 50 ⁇ 3 nm, as estimated from TEM images. According to the absorbance measurements, the amount of linker was about 500 per NP. Furthermore, quantification of dimethoxytrityl established the coupling efficiency of biotin at 10%, which allowed biotin to be quantified at about 50 by N P. A relatively narrow particle size distribution of the functionalized NPs was confirmed by DLS measurements.
  • the Si-NPs formed monodisperse aqueous solutions of particles having a hydrodynamic diameter (RH) of about 90 nm. The conjugation of biotin + linker groups shifted the RH to about 120 nm. This increase is probably related to the hydration layer around the biotin units bound to the arms bearing negatively charged groups. Biotin-Si-NP solutions were stable at 4 ° C for at least two months.
  • Example 2 Double recognition strategy for sensitive detection of influenza A virus using nanoparticles coated with biotin and immunomagnetic beads
  • Bovine Serum Albumin (BSA), Bradford Serum, TMB ELISA Colorimetric Reagent (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine), Tween 20, HRP-Streptavidin, 5X ELISA Assay Buffer B / Sample Thinner and high quality chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) was provided by Andrea Dutscher (Brumath, France). Sodium chloride was purchased from Laurylab (Brindas, France). The buffers were prepared with deionized water and sterilized by 0.22 ⁇ m filtration.
  • the Dynabeads® M-280 Tosylactivated and DSB-XTM Biotin Protein Labeling Kit (D-20655) are respectively from Invitrogen and Molecular Probes (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Influenza A (9G8) and (5D8) anti-NuP antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz, CA, USA). The rhodamine coated silica nanoparticles were supplied by Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Oligonucleotides were synthesized using an Applied Biosystems 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • the phosphoramidite synthons Biotin-TEG-phosphoramidite (1-dimethoxytrityloxy-3-0- (N-biotinyl-3-aminopropyl) - triethylene glycolyl-glyceryl-2-0- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) -phosphoramidite); Phosphoramidite spacer 9 (9-0-dimethoxytrityl-triethylene glycol, 1 - [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite); dT-CE phosphoramidite (5'-dimethoxytrityl-2'-deoxythymidine, 3 '- [(2 cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite) and all synthesis reagents were purchased from Glen Research (Sterling , Virginia).
  • nucleoprotein (NuP) gene of H1N1 influenza virus strain A / WSN / 33
  • strain A / WSN / 33 The full length nucleoprotein (NuP) gene of H1N1 influenza virus (strain A / WSN / 33) with a 6-His tag at its C-terminus was cloned into Escherichia coli expression vector pET22 (Novagen) and expressed in E. coli BL-21 Rosetta DE3 (Stratagene).
  • Transformed cells were grown at 37 ° C in 100 ml of Luria-Bertani medium containing ampicillin up to the mid-exponential phase, then induced for 4 hours by addition of 1 mM isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside at 37 ° C. with stirring. NuP was purified.
  • RNAse A 0.15 mg / ml at 35 ° C for 20 min in the presence of 10 mM Mg 2+ ions.
  • the protein was purified by affinity chromatography using magnetic Ni beads (PureProteome, Millipore), following the procedure recommended by the manufacturer. NuP was then dialyzed against Tris buffer (20mM Tris, 300mM NaCl, pH 7.5). After dialysis, the protein concentration was determined using an extinction coefficient e of 56200 M 1 cm -1 at 280 nm.
  • influenza A / WSN / 33 (H1N1) virus was obtained by reverse genetics and amplified on MDCK cells. Viruses were titrated by the plaque method. Purified viruses were inactivated by UV light for 38 min. The inactivation efficiency was verified by re-infection of MDCK cells. Inactivated influenza A / H1 samples were stored at -80 ° C. Influenza A / UDORN / 72 (H3N2) was spread on an embryonic chicken egg and applied to MDCK cells. Viruses were titrated by the plaque method. Purified viruses were inactivated using binary ethyleneimine (BEI) and stored at -80 ° C.
  • BEI binary ethyleneimine
  • the Flanders13 (13V09) porcine respiratory reproductive syndrome virus (VSDRP) used in this study was kindly provided by Dr. Nicolas Bertho (INRA, France) and Dr. Fanny Blanc (INRA, France).
  • viral concentrations were determined in terms of MDCK cell infection.
  • the initial virus titers were 10 8 PFU / mL for H1N1 sample 1, 1.5 10 8 PFU / mL for H1N1 sample 2, 10 8 PFU / mL for H2N3.
  • Control VSDRP virus was titrated at 10 7 PFU / mL.
  • tosyl activated magnetic beads (Dynabeads TM M-280, Invitrogen, US) were coated with 10 ⁇ g of anti-NuP Influenza A antibody (9G8) per mg of beads for 1 hour. with moderate agitation, according to the protocol recommended by the manufacturer. Then, after 15 minutes of passivation in BSA buffer (0.1M sodium phosphate, 150mM sodium chloride, 0.5% (w / v) BSA, pH 7.6), the magnetic beads were washed. three times in 0.01 M sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, 0.1% (w / v) BSA, pH 7.4 and stored at 4 ° C until testing.
  • BSA buffer 0.1M sodium phosphate, 150mM sodium chloride, 0.5% (w / v) BSA, pH 7.6
  • MELISA protocol for the detection of disabled viruses 1.10 6 magnetic beads previously coated with anti-NuP antibodies for Influenza A (9G8) were first of all washed three times with PBS buffer. Solutions of deactivated virus (PBS, 10% saliva) were incubated with the beads with moderate agitation at room temperature for 1 hour. The beads were concentrated by means of a magnet and washed three times with Wash Buffer 0.1. Conjugated anti-biotin antibody (0.5 ⁇ g / ml) in Capture Buffer (PBS, 0.1% tween, 0.1% BSA) was added to the suspension before gentle stirring for 1 hour. .
  • Streptavidin / HRP developing solution 100 ⁇ L, 1 ⁇ g / mL was added and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes at 1000rpm in a thermomixer. The beads were washed three times with Washing Buffer 0.1 before adding 100 ⁇ L of TMB and incubating in the dark for 30 minutes at room temperature. Finally, the supernatant was diluted with 100 ⁇ l of 2M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was read in a microplate reader (Perkin Elmer). A450 nm - Asso nm gave the correct value after removing the background signal.
  • biotin-NP (1.10 11 NP / mL in PBS, Tween 20 at 0.1% (v / v)) were added to the suspension of magnetic beads before a incubation for 30 minutes at 1000 rpm in a thermomixer.
  • a streptavidin / HRP developing solution 100 ⁇ L, 1 ⁇ g / mL was added before the suspension was incubated at room temperature for 30 minutes at 1000 rpm in a thermomixer.
  • the beads were washed three times with Washing Buffer 0.1 before adding 100 ⁇ L of TMB and incubating in the dark for 5 minutes at room temperature. Finally, the supernatant was diluted with 100 ⁇ l of 2M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was read in a microplate reader (Perkin Elmer). A450 nm - Asso nm gave the correct value after removing the background signal.
  • biotin-NPs to amplify the positive signal in the detection step.
  • Silica nanoparticles 50 nm in diameter were surface functionalized with an oligonucleotide strand carrying a biotin group at its end.
  • the NPs were first immobilized on a controlled porosity glass support (CPG).
  • CPG controlled porosity glass support
  • NOM Nano-on-Micro
  • SEM Sccanning Electron Microscopy
  • the NOM material was used in a DNA / RNA synthesizer to perform NP functionalization via phosphoramidite chemistry. This strategy has made it possible to obtain highly functionalized nanoparticles.
  • a spacer oligonucleotide (ODN sequence: dTio-PEG2-dTio) was synthesized on the NPs in order to remove the biotins from the surface of the NPs.
  • ODN per NP About 500 ODN per NP were estimated by measuring UV absorbance at 260 nm and 560 nm and quantifying the ODN per NP ratio in the suspension, a protocol described by Bonnet et al. (Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: Application to the sensitive detection of bacteria in human platelet concentrates. Analyst. 143 (10), 2293-2303 (2016)). Then the biotin group was incorporated. We decided to control the synthesis program on the device to obtain a coupling efficiency of 10% for the incorporation of biotin. Using this strategy, we incorporated about 50 biotins per N P. This amount was optimized to achieve efficient binding of the biotin group during the MELISA assay.
  • the number of NPs in the suspension obtained was estimated from the fluorescent NP quantification curve.
  • the structure of NPs after release was checked by TEM. This observation showed that the morphology of the NPs remained stable during the synthesis.
  • the assay based on biotin-nanoparticles and immunomagnetic beads was studied for the detection of the H1N1 viruses (samples 1 and 2), H3N2 and VSDRP (Fig. 8).
  • the viral solutions were diluted in lysis buffer supplemented with 10% saliva.
  • the detection step was performed using highly biotinylated nanoparticles to increase the anchoring efficiency of streptavidin-HRP. This strategy allowed an increase in the signal in the event of a positive response (Fig. 8). This improved sensitivity proved the effectiveness of the amplification strategy.
  • Detection limits of 3x10 3 PFU / mL, 6x10 4 PFU / mL and 4x10 4 PFU / mL were calculated for sample 1 and sample 2 of H1N1, and H3N2, respectively.
  • biotin-NP in the detection step improved the sensitivity of the MELISA assay by a factor of 65 to 75.
  • Si-NP silica nanoparticles
  • Biotin-decorated Si-NPs were used to improve the readout of the streptavidin chemiluminescent signal - HRP.
  • An improvement in signal intensity compared to the conventional test was obtained due to the conjugate effect of biotin-Si-NP compared to biotin alone.
  • Our study illustrates the invention that the conjugate effect of biotin-Si-NP could become an effective way to increase the sensitivity of the cost-effective, specific and easy to perform dot blot technique.
  • Streptavidin-HRP Proclin, acetonitrile, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU), controlled porosity glass (120-200 Mesh, CPG-3000 ⁇ ). .were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Fluorescent rhodamine B silica NPs (Si-NP, diameter ⁇ 50 nm) were supplied by Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Phosphoramidite DNA building blocks and all DNA synthesis reagents were purchased from Glen Research (Sterling, Virginia, USA). Phosphate buffered saline (PBS) was purchased from Andrea Dutscher (Brumath, France).
  • Triton, SDS, NaCl, Trizma base, phenol, chloroform, bacteriological peptone and isoamyl alcohol were purchased from SIGMA (Milan, Italy).
  • SIGMA Tinucleotide
  • Campylobacter from C. jejuni, C. edi, C. lari, C. upsaliensis and C. fétus (base localization: 72-108) was used as a recognition element (probe called CampyP3). CampyP3 has been labeled at its 5 ′ end with biotin for the development of a chemiluminescent dot blot assay. The probe was tested using the OligoAnalyzer3.1
  • PR was designed by mismatching nucleic acid positions of the CP3 sequence, while PE corresponded to the E. coli sequence which shows some similarities to Campylobacter.
  • Campylobacter strains were grown under microaerophilic conditions (5% C> 2, 10% CO2 and 80% N2) in anaerobic gas jars.
  • Microaerophilic conditions were generated using an Oxoid TM CampyGen TM 2.5 I Sachet (Oxoid, Italy) at 37 ° C for 48h.
  • DNA was extracted from Campylobacter isolates from Columbia blood agar plates (both pure strains and isolates were from chicken samples) after Gram staining and light microscopic observations of morphology and mobility. cells (Brucella broth, Thermofisher, Italy) after oxidase and catalase tests.
  • DNA extraction from pure cultures and enrichment broths DNA was extracted from pure strains and isolates of chicken samples according to Manzano et al (2015). 2 ml of Bolton Enrichment Broth was harvested by centrifugation at 13,000 g and 4 ° C for 10 min. The bacterial pellets were washed three times with PBS, before being subjected to DNA extraction as previously reported (Manzano 2015). The extracted DNAs were rehydrated using 50 ⁇ l of sterile distilled water and treated with RNase enzyme at 37 ° C for 1 h. Finally, DNA was quantified using Nanodrop TM 2000C (ThermoFisher Scientific, Italy). The DNA concentration was adjusted to 100 ng / mL using sterile distilled water.
  • the extracted DNA samples were denatured at 95 ° C for 10 min, immediately placed on ice and deposited as a fraction of 1 ⁇ l on the positively charged nylon membrane (Amersham Hybon TM -XL, GE Healthcare, France).
  • the membrane which received the deposits was exposed to UV at 254 nm for 10 minutes to fix the DNA.
  • the membrane was soaked in preheated hybridization buffer ( 0.5 M Na 2 HP0 4, 0.5 M NaH 2 PO 4, 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 7.5) at 65 ° C for 30 min. with moderate agitation.
  • the membrane was transferred to a new petri dish and incubated with 10 6 biotin-Si-NP / mL, PBS, pH 7 , 4 for 30 min, at room temperature, with moderate stirring. 0.7 mM streptavidin-HRP in blocking solution was added after washing and incubated for 30 min with shaking. The signal was then revealed using the improved chemiluminescent substrate luminol for HPR detection (Thermo Scientific, France). The membrane was removed from solution and observed using an imaging system.
  • ChemiDoc MP Biorad, France. Detection signals were quantified using Image LabTM software (Biorad). The normalized value of the dot intensity was calculated using the equation (RI0 -Pln) / PI0, where RI0 and Pin represent the pixel intensity obtained for the detection of 0.1 ng / pL of CP3 probe (standard) and experimental sample, respectively.
  • the target DNA was first immobilized on a porous nylon membrane by UV irradiation to allow DNA crosslinking to the positively charged surface.
  • the biotin-labeled CampyloP3 complementary DNA probe was allowed to hybridize with the target DNA. Hybridization was detected using a streptavidin-HRP conjugate in combination with a chemiluminogenic luminol substrate in the presence of the H2O2 activator.
  • the streptavidin-biotin sandwich made it possible to bind biotin-Si-NP to the DNA probe, and therefore, to amplify the detection signal compared to biotin alone.
  • Standard curves were established using a CP3 DNA target in both dot blot configurations (without and with biotin-Si-NP) under optimized conditions.
  • the calibration curves were obtained from the quantification of the intensity of the chemiluminescent light for each concentration of CP3, from at least three independent spots per concentration.
  • biotin-Si-NP resulted in an almost 30-fold increase in the intensity of the chemiluminescent signal.
  • the calculated LODs were similar or lower than those obtained with the sensors reported previously for the detection of Campylobacter, such as for example 0.5 ng / pL in Fontanot et al. (2014), 0.37 ng / pL in Manzano et al. (B & B2015) and 0.09 nM in Morant-Minana et al. (B&B, 2015).
  • the reproducibility of the dot blot enhanced by biotin-Si-NP was estimated at 5% according to the signal obtained for the detection of the same concentration of CP3.
  • the proposed biotin-Si-NP-enhanced dot blot method succeeded in detecting low levels of Campylobacter naturally present after enrichment, and could be considered for the determination and detection of Campylobacter spp. present in contaminated poultry meat.
  • This work describes a simple dot blot method, improved with biotin-Si-NP, for rapid and reliable detection of Campylobacter spp. present in contaminated poultry meat.
  • the dot blot test is widely used in molecular biology and genetics to detect a target DNA / RNA sequence.
  • biotin-Si-NPs resist well to temperature of use and are stable over time.
  • the LOD obtained was 0.006 ng / ⁇ l (0.2 nM). Such low concentrations of DNA detected are close to those that can be detected by qPCR (Manzano et al. 2018; Vidic et al., 2019).
  • the developed system is a promising tool for rapid and inexpensive screening of poultry samples for the presence of Campylobacter because detection is performed on bacterial DNA without a prior amplification step.
  • our dot blot can be applied to DNA extracted by different extraction methods and from various food matrices, since it is not sensitive to DNA polymerase inhibitors.
  • the proposed multiplex, miniaturized and sensitive paper test is simple to design and could be used by the food industry and regulatory agencies for the detection of other pathogens to monitor food quality. We believe that in the future it could be integrated with a lab-based biosensor on a chip that includes an automated DNA extraction protocol, or even a cell phone.
  • DNA was extracted from pure strains and isolates of chicken samples according to Manzano et al (2015). The concentration of total DNA was adjusted to 100 ng / mL using sterile distilled water. Before immobilization, the extracted DNA samples were denatured at 95 ° C for 10 min, immediately placed on ice and deposited as a fraction of 1 ⁇ l on the positively charged nylon membrane (Amersham Hybon TM -XL, GE Healthcare, France).
  • the membrane which received the deposits was exposed to UV at 254 nm for 10 minutes to fix the DNA.
  • the membrane was soaked in preheated hybridization buffer ( 0.5 M Na 2 HP0 4, 0.5 M NaH 2 P0 4 , 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 7.5) at 65 ° C. for 30 min with moderate stirring. 4 ng / pL of the CampyP3 probe labeled with denatured biotin (100 ng / pL) was added to the hybridization buffer and left overnight at 65 ° C. with moderate stirring to allow hybridization. The membrane was washed twice with 0.1 SDS, SSC (sodium citrate saline,
  • the signal was then revealed using the improved chemiluminescent substrate for HPR detection (Thermo Scientific, France).

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Abstract

The present invention relates to a method for determining the presence and/or amount of at least one analyte (T) that may be contained in a sample. The method comprises: (a) a recognition step during which said sample (E) is placed in the presence of at least one primary probe (1), in order to form, if necessary, a primary complex (C1), (b) a development step during which at least one developing reagent is added, capable of forming, starting from the primary probe (1) of said primary complex (C1), a secondary complex (C2), said at least one developing reagent comprising: - at least one amplification probe (3), of the core (31) – shell (32) type, wherein said shell (32) comprises several molecules of an affinity tag (321), and - a tracer (21) for converting the secondary complex (C2) into a visible and/or measurable signal, said tracer (21) being bound or intended to bind with the affinity tag (321) of said at least one amplification probe (3), so that in said secondary complex (C2) at least some of the molecules of said affinity tag (321) of said at least one amplification probe (3) are bound with said tracer (21).

Description

Procédé et système pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon Method and system for determining the presence and / or amount of at least one analyte likely to be contained in a sample
Domaine technique de l'invention Technical field of the invention
La présente invention concerne le domaine des techniques pour l’analyse des échantillons liquides. The present invention relates to the field of techniques for the analysis of liquid samples.
Elle concerne en particulier le domaine des procédés et systèmes pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon. It relates in particular to the field of methods and systems for determining the presence and / or quantity of at least one analyte likely to be contained in a sample.
Etat de la technique State of the art
Les techniques d’analyse s’intéressent à l'identification et la caractérisation de substances chimiques, dits « analytes », dans un échantillon. Analytical techniques are concerned with the identification and characterization of chemicals, known as "analytes", in a sample.
L’analyse mise en œuvre peut être qualitative, lorsque la technique permet une recherche de la présence de l’analyte dans l’échantillon ; cette analyse peut être quantitative, lorsque la technique permet en outre une mesure de la quantité d’analyte dans l’échantillon. The analysis carried out can be qualitative, when the technique allows a search for the presence of the analyte in the sample; this analysis can be quantitative, when the technique further allows a measurement of the amount of analyte in the sample.
De telles techniques d’analyse englobent notamment les analyses biologiques lorsque l’analyte recherché consiste en un analyte biologique. Such analysis techniques include in particular biological analyzes when the desired analyte consists of a biological analyte.
Pour un tel usage, la technique d’analyse doit assurer un dosage sélectif et sensible de l’analyte susceptible d’être contenu dans l’échantillon analysé. For such use, the analytical technique must ensure a selective and sensitive assay of the analyte likely to be contained in the sample analyzed.
Par exemple, la recherche de pathogènes peut s’appuyer sur une propagation par culture avant isolement. Ces méthodes sont efficaces et sensibles mais sont généralement laborieuses et sur un temps long (les résultats sont disponibles généralement seulement après plusieurs jours). For example, testing for pathogens may be based on propagation by culture before isolation. These methods are effective and sensitive but are generally laborious and over a long period of time (results are usually only available after several days).
Pour une telle analyse biologique, il existe également des méthodes de biologie moléculaire qui se basent sur l’amplification génétique, typiquement la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ; ces méthodes ont l’intérêt d’être spécifiques, sensibles et rapides. Mais, ces techniques ont besoin de matériel génétique isolé, nécessitant un équipement sophistiqué et coûteux. For such biological analysis, there are also molecular biology methods which are based on genetic amplification, typically the polymerase chain reaction (PCR); these methods have the advantage of being specific, sensitive and fast. But, these techniques require isolated genetic material, requiring sophisticated and expensive equipment.
D’autres outils analytiques s’appuient sur les propriétés de liaison moléculaire spécifique qui sont rencontrées chez des molécules biologiques connues génériquement sous le nom de capteurs biologiques ou biocapteurs (dits encore biosenseurs ou « biosensors »). Other analytical tools rely on the specific molecular binding properties that are encountered in biological molecules known generically as biological sensors or biosensors (also called biosensors or "biosensors").
De tels biocapteurs sont particulièrement intéressants pour la détermination rapide et efficace de marqueurs, typiquement de marqueurs biologiques, en raison de leur simplicité de mise en œuvre, de leur miniaturisation possible et de leur capacité d'analyse en temps réel. Such biosensors are particularly advantageous for the rapid and efficient determination of markers, typically biological markers, on account of their simplicity of use, their possible miniaturization and their capacity for analysis in real time.
Un biocapteur possède en effet la capacité de reconnaître un marqueur biologique cible (biomarqueur ou « target biomarker »), caractéristique de l’analyte cible (par exemple un agent pathogène d’intérêt). Le biocapteur porte pour cela un élément de détection appelé couramment « biorécepteur » (dit encore récepteur biologique ou « biorécepteur »). A biosensor indeed has the ability to recognize a target biological marker (biomarker or “target biomarker”), characteristic of the target analyte (for example a pathogen of interest). For this purpose, the biosensor carries a detection element commonly called a “bioreceptor” (also called a biological receptor or “bioreceptor”).
De tels biorécepteurs, connus en soi, consistent par exemple en des anticorps monoclonaux, ARN, ADN, glycanes, lectines, enzymes, tissus ou cellules entières. Such bioreceptors, known per se, consist for example of monoclonal antibodies, RNA, DNA, glycans, lectins, enzymes, tissues or whole cells.
Le biorécepteur joue un rôle déterminant car ses propriétés biochimiques assurent la sensibilité et la sélectivité dans la détection des biomarqueurs et permettent d’éviter les interférences avec d’autres composés de l’échantillon testé. The bioreceptor plays a key role because its biochemical properties provide sensitivity and selectivity in the detection of biomarkers and help to avoid interference with other compounds in the test sample.
L'interaction biochimique spécifique entre le biomarqueur et le biorécepteur est ensuite convertie, grâce à un élément traceur (dit encore transducteur ou « transductor »), en un signal mesurable. The specific biochemical interaction between the biomarker and the bioreceptor is then converted, thanks to a tracer element (also called transducer or “transductor”), into a measurable signal.
L'enregistrement et l'affichage du signal permettent une identification qualitative, voire quantitative, de l’analyte dans l’échantillon analysé. The recording and display of the signal allows a qualitative, even quantitative, identification of the analyte in the analyzed sample.
Dans une détection « directe », le traceur est porté directement par le biocapteur. In "direct" detection, the tracer is carried directly by the biosensor.
Mais un tel système d’analyse risque de ne pas offrir un signal suffisant pour être détectable. But such an analysis system may not provide a sufficient signal to be detectable.
En effet, une molécule d’analyte est généralement apte à coopérer avec un nombre restreint de molécules de biocapteur / traceur, voire avec une seule molécule de biocapteur / traceur. Indeed, an analyte molecule is generally able to cooperate with a small number of biosensor / tracer molecules, or even with a single biosensor / tracer molecule.
Or, dans certaines applications, par exemple les essais visant à détecter une infection d’un patient ou une contamination microbiologique d’un produit, il est nécessaire d’offrir une grande sensibilité au regard des agents pathogènes en présence qui risquent de se propager rapidement avant l'apparition de tout symptôme. However, in certain applications, for example tests aimed at detecting an infection of a patient or a microbiological contamination of a product, it is necessary to offer high sensitivity with regard to the pathogens present which risk spreading rapidly. before any symptoms appear.
Pour amplifier le signal, certains systèmes d’analyse s’appuient sur une détection en cascade dans laquelle le biorécepteur est lié à un composé amplificateur apte à recevoir plusieurs molécules de traceur. To amplify the signal, some analysis systems rely on cascade detection in which the bioreceptor is linked to an enhancer compound capable of receiving multiple tracer molecules.
Cette approche « indirecte » permet alors une fixation indirecte d’une pluralité de molécules de traceur pour une molécule d’analyte. This "indirect" approach then allows indirect binding of a plurality of tracer molecules to an analyte molecule.
Il est ainsi toujours intéressant de disposer de nouveaux procédés et systèmes adaptés à déterminer, avec une sensibilité accrue, la présence et/ou la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon. It is thus always advantageous to have new methods and systems suitable for determining, with increased sensitivity, the presence and / or quantity of at least one analyte likely to be contained in a sample.
Présentation de l'invention Presentation of the invention
La présente invention propose ainsi des procédés et systèmes adaptés à déterminer, avec une sensibilité accrue, la présence et/ou la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon. The present invention thus provides methods and systems suitable for determining, with increased sensitivity, the presence and / or quantity of at least one analyte likely to be contained in a sample.
Plus particulièrement, on propose selon l’invention un procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon. De préférence, ledit au moins un analyte est choisi parmi les analytes biologiques, notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques. More particularly, according to the invention, a method is proposed for determining the presence and / or the quantity of at least one analyte capable of being contained in a sample. Preferably, said at least one analyte is chosen from biological analytes, in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells, infectious agents such as bacteria , viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
Le procédé selon l’invention comprend : The method according to the invention comprises:
(a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon est mis en présence d’au moins une sonde primaire, laquelle au moins une sonde primaire est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte pour former le cas échéant un complexe primaire et, d’autre part, une première étiquette d’affinité, (a) a recognition step during which said sample is brought into contact with at least one primary probe, which at least one primary probe is a conjugate comprising, on the one hand, a binding site capable of binding specifically with said analyte to form, where appropriate, a primary complex and, on the other hand, a first affinity tag,
(b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant de la sonde primaire (et de préférence d’une première étiquette d’affinité de ladite sonde primaire) dudit complexe primaire, un complexe secondaire, lequel au moins un réactif de révélation comprend : (b) a revelation step during which is added at least one revelation reagent suitable for forming, starting from the primary probe (and preferably from a first affinity tag of said primary probe) of said primary complex, a secondary complex, which at least one revealing reagent comprises:
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité, et - at least one amplification probe, of the core-envelope type, in which said envelope comprises several molecules with an affinity tag, and
- un traceur destiné à convertir le complexe secondaire en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification, de sorte que, dans ledit complexe secondaire, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification sont liées avec ledit traceur. - a tracer intended to convert the secondary complex into a visible and / or measurable signal, said tracer being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe, so that , in said secondary complex, at least some of the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe are linked with said label.
Un tel procédé permet ainsi, par une simple adaptation des systèmes de détection en cascade, une amplification significative du signal de détection. Such a method thus allows, by a simple adaptation of the cascade detection systems, a significant amplification of the detection signal.
En effet, en présence de l’analyte, le complexe secondaire obtenu comporte la sonde d’amplification qui constitue avantageusement une interface apte à recevoir une pluralité de molécules de traceur. In fact, in the presence of the analyte, the secondary complex obtained comprises the amplification probe which advantageously constitutes an interface capable of receiving a plurality of tracer molecules.
En d’autres termes, le procédé selon l’invention permet d’obtenir une fixation indirecte / en cascade, dans laquelle une pluralité de molécules de traceur sont liées à une molécule d’analyte. In other words, the method according to the invention achieves indirect / cascade binding, in which a plurality of tracer molecules are linked to an analyte molecule.
Cette nouvelle technologie confère une amélioration de la détection de tout type d’analytes, en particulier d’analytes biologiques (microorganismes, marqueurs de virulence, marqueurs de résistance aux antibiotiques, etc.). This new technology provides improved detection of all types of analytes, in particular biological analytes (microorganisms, virulence markers, antibiotic resistance markers, etc.).
Encore en d’autres termes, l’ajout de la sonde d’amplification dans un système de détection en cascade permet une augmentation significative du signal. In other words, the addition of the amplification probe in a cascade detection system allows a significant increase in the signal.
Selon un mode de réalisation avantageux, l’étiquette d’affinité de l’enveloppe de ladite au moins une sonde d’amplification consiste en : - une première étiquette d’affinité, identique à la première étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde primaire, ou According to an advantageous embodiment, the affinity tag of the envelope of said at least one amplification probe consists of: - a first affinity tag, identical to the first affinity tag of said at least one primary probe, or
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde primaire. - a second affinity tag capable of specifically binding with the first affinity tag of said at least one primary probe.
Dans le cadre de ce mode de réalisation avantageux, au cours de l’étape de révélation, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés : In the context of this advantageous embodiment, during the development step, at least the following development reagents are added:
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité se présentant sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur, et a second affinity tag capable of binding specifically with said first affinity tag, at least part of said second affinity tag being in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, of a on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer, and
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau-enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité, de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité : sonde d’amplification : sondes secondaires, ladite sonde d’amplification dudit complexe secondaire étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire. - at least one amplification probe, of the nucleus-envelope type, in which said envelope comprises several molecules of said first affinity tag, so as to obtain, starting from said primary complex, a secondary complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag: amplification probe: secondary probes, said amplification probe of said secondary complex being linked to several molecules of said at least one secondary probe.
Une partie de ladite seconde étiquette d’affinité de l’étape de révélation est avantageusement dépourvue dudit traceur. A part of said second affinity tag of the revealing step is advantageously devoid of said tracer.
Selon une variante de ce mode de réalisation avantageux, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur, de sorte à obtenir, partant de la sonde primaire dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : sonde d’amplification. According to a variant of this advantageous embodiment, during the revelation step, is added at least one amplification probe, of the nucleus - envelope type, in which said envelope comprises several molecules of said second affinity tag, including at least some are linked to at least one molecule of said tracer, so as to obtain, starting from the primary probe of said primary complex, a secondary complex comprising analyte: primary probe: amplification probe.
D’autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé conforme à l’invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont les suivantes : Other non-limiting and advantageous characteristics of the process according to the invention, taken individually or in any technically possible combination, are as follows:
- la première étiquette d’affinité est choisie parmi la biotine ou homologue, et la seconde étiquette d’affinité est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine ; - the first affinity tag is chosen from biotin or homolog, and the second affinity tag is chosen from streptavidin or homolog, for example avidin, NeutrAvidin or Captavidin;
- ladite au moins une sonde d’amplification comprend un noyau formé par une nanoparticule ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm ; la nanoparticule est avantageusement choisie parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice, de préférence encore parmi les nanoparticules composées de silice, avantageusement encore parmi les billes de silice ; - ladite au moins une sonde d’amplification comporte au moins 20 molécules de ladite étiquette d’affinité ; said at least one amplification probe comprises a core formed by a nanoparticle preferably having a size ranging from 10 to 100 nm; the nanoparticle is advantageously chosen from nanoparticles having a surface composed of silica, more preferably from nanoparticles composed of silica, advantageously also from silica beads; said at least one amplification probe comprises at least 20 molecules of said affinity tag;
- l’enveloppe de ladite au moins une sonde d’amplification comprend des espaceurs, reliant le cœur avec une molécule de première étiquette d’affinité ; les espaceurs sont par exemple choisis parmi les espaceurs nucléiques, par exemple les séquences d’ADN ; - the envelope of said at least one amplification probe comprises spacers, connecting the heart with a first affinity tag molecule; the spacers are for example chosen from nucleic spacers, for example DNA sequences;
- le traceur est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, photoacoustiques, ou photothermiques ; le cas échéant ladite au moins une sonde secondaire est avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs (conjugués colorés, fluorescents, luminescents) ; les conjugués enzymatiques sont avantageusement choisis parmi les conjugués streptavidine-HRP ou streptavidine-PA, et les réactifs de l’étape de révélation comprennent un substrat desdits conjugués enzymatiques pour une réaction de chimiluminescence en présence dudit complexe secondaire ; the tracer is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic, photoacoustic or photothermal particles; where appropriate, said at least one secondary probe is advantageously chosen from enzymatic conjugates or photoactive conjugates (colored, fluorescent, luminescent conjugates); the enzymatic conjugates are advantageously chosen from streptavidin-HRP or streptavidin-PA conjugates, and the reagents for the revelation step comprise a substrate of said enzymatic conjugates for a chemiluminescence reaction in the presence of said secondary complex;
- l’étape de révélation est mise en œuvre en deux phases successives avec une première phase au cours de laquelle est ajoutée ladite seconde étiquette d’affinité, éventuellement au moins une partie sous forme de ladite au moins une sonde secondaire, pour former un premier sous-complexe comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité, puis une seconde phase au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification et ladite au moins une sonde secondaire pour former ledit complexe secondaire, ou une phase unique au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire ; - the revelation step is implemented in two successive phases with a first phase during which is added said second affinity tag, optionally at least a part in the form of said at least one secondary probe, to form a first sub-complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag, then a second phase during which said at least one amplification probe and said at least one secondary probe are added to form said secondary complex, or a single phase during which the reagents are simultaneously added for the formation of the secondary complex;
- le site de liaison de ladite au moins une sonde primaire est choisie parmi les biomolécules, par exemple les sondes nucléiques (séquences ARN, ADN, aptamères), les sondes protéiques (anticorps, enzymes, antigènes, peptides) ; the binding site of said at least one primary probe is chosen from biomolecules, for example nucleic probes (RNA, DNA, aptamers sequences), protein probes (antibodies, enzymes, antigens, peptides);
- préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire, ledit au moins un analyte est fixé sur un support, par exemple pour un procédé du type dot blot, ou sur une sonde de capture, portée par exemple par une bille magnétique pour une technique MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich, - prior to bringing said at least one primary probe into contact with each other, said at least one analyte is fixed on a support, for example for a method of the dot blot type, or on a capture probe, carried for example by a magnetic bead for a MELISA technique or by a support for a sandwich ELISA technique,
- l’étape d’amplification est mise en œuvre de sorte à obtenir un complexe secondaire comportant plusieurs sondes d’amplification en cascade / en série (par exemple deux ou trois sondes d’amplification) ; le complexe secondaire comprend avantageusement au moins deux sondes d’amplification reliées, entre elles, par au moins une seconde étiquette d’affinité. - the amplification step is carried out so as to obtain a secondary complex comprising several amplification probes in cascade / in series (for example two or three amplification probes); the secondary complex advantageously comprises at least two amplification probes linked together by at least a second affinity tag.
La présente invention concerne aussi l’utilisation d’une sonde du type noyau-enveloppe en tant que sonde d’amplification du signal dans un procédé de détection en cascade pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon, ladite sonde d’amplification comportant une enveloppe qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité. De préférence, la sonde d’amplification comporte une enveloppe qui comprend plusieurs molécules d’une première étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement chacune à une seconde étiquette d’affinité, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité étant destinée à se présenter sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur. The present invention also relates to the use of a core-envelope type probe as a signal amplification probe in a cascade detection method for determining the presence and / or the quantity of at least one. analyte capable of being contained in a sample, said amplification probe comprising an envelope which comprises several molecules of an affinity tag. Preferably, the amplification probe comprises an envelope which comprises several molecules of a first affinity tag each capable of specifically binding to a second affinity tag, at least part of said second affinity tag being intended in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer.
De manière alternative, la sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, comporte une enveloppe qui comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur. Alternatively, the nucleus-envelope type amplification probe comprises an envelope which comprises several molecules of said second affinity tag, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer.
La présente invention concerne encore le système de réactifs, pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention. The present invention also relates to the reagent system, for implementing the method according to the invention.
Le système de réactifs comprend : The reagent system includes:
- au moins une sonde primaire, laquelle au moins une sonde primaire est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte et, d’autre part, une première étiquette d’affinité, et - at least one primary probe, which at least one primary probe is a conjugate comprising, on the one hand, a binding site capable of binding specifically with said analyte and, on the other hand, a first affinity tag, and
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe partant de la sonde primaire, lequel au moins un réactif de révélation comprend : - at least one revelation reagent capable of forming a complex starting from the primary probe, which at least one revelation reagent comprises:
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité, et - at least one nucleus-type amplification probe - envelope in which said envelope comprises several molecules with an affinity tag, and
- un traceur destiné à convertir le complexe en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification, de sorte que, dans ledit complexe, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité de ladite au moins une sonde d’amplification sont liées à au moins une molécule dudit traceur. - a tracer intended to convert the complex into a visible and / or measurable signal, said tracer being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe, so that, in said complex, at least some of the molecules of the affinity tag of said at least one amplification probe are linked to at least one molecule of said tracer.
Selon un mode de réalisation préféré, les réactifs de révélation comprennent : According to a preferred embodiment, the revelation reagents comprise:
- une seconde étiquette d’affinité apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité se présentant sous la forme d’une sonde secondaire consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité et, d’autre part, un traceur (enzyme, fluorophore, radio-isotope, molécule rédox, etc.), et a second affinity tag capable of binding specifically with said first affinity tag, at least part of said second affinity tag being in the form of a secondary probe consisting of a conjugate comprising, of a on the one hand, said second affinity tag and, on the other hand, a tracer (enzyme, fluorophore, radioisotope, redox molecule, etc.), and
- au moins une sonde d’amplification, du type noyau-enveloppe, dans laquelle ladite enveloppe comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité, lequel système de réactifs est apte à former, en présence dudit analyte, un complexe comprenant analyte : sonde primaire : seconde étiquette d’affinité : sonde d’amplification : sondes secondaires, ladite sonde d’amplification dudit complexe secondaire étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire. - at least one amplification probe, of the nucleus-envelope type, in which said envelope comprises several molecules of said first affinity tag, which reagent system is capable of forming, in the presence of said analyte, a complex comprising analyte: primary probe: second affinity tag: amplification probe: secondary probes, said amplification probe of said secondary complex being bound to several molecules of said at least one secondary probe.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la sonde d’amplification, du type noyau - enveloppe, possède une enveloppe qui comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur, de sorte à obtenir, partant dudit complexe primaire, un complexe secondaire comprenant analyte : sonde primaire : sonde d’amplification. According to another preferred embodiment, the amplification probe, of the nucleus-envelope type, has an envelope which comprises several molecules of said second affinity tag, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer, so in obtaining, starting from said primary complex, a secondary complex comprising analyte: primary probe: amplification probe.
Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l'invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres. Of course, the different characteristics, variants and embodiments of the invention can be associated with each other in various combinations insofar as they are not incompatible or mutually exclusive.
Description détaillée de l'invention Detailed description of the invention
De plus, diverses autres caractéristiques de l'invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l'invention et où : In addition, various other characteristics of the invention emerge from the appended description given with reference to the drawings which illustrate non-limiting embodiments of the invention and in which:
[Fig. 1] est une vue schématique d’un complexe primaire entre un analyte et une sonde primaire (du type anticorps), qui est obtenu à l’issue de l’étape de reconnaissance selon l’invention ; [Fig. 1] is a schematic view of a primary complex between an analyte and a primary probe (antibody type), which is obtained at the end of the recognition step according to the invention;
[Fig. 2] est une vue schématique d’une première sonde d’amplification adaptée au procédé selon l’invention ; [Fig. 2] is a schematic view of a first amplification probe suitable for the method according to the invention;
[Fig. 3] est une vue schématique d’un complexe secondaire issu de l’étape de révélation, obtenu par la liaison en cascade du complexe primaire avec notamment une sonde d’amplification (selon la figure 2) liée à plusieurs molécules d’une sonde secondaire formant traceur ; [Fig. 3] is a schematic view of a secondary complex resulting from the revealing step, obtained by the cascade binding of the primary complex with in particular an amplification probe (according to FIG. 2) linked to several molecules of a secondary probe forming a tracer;
[Fig. 4] est une vue schématique d’un complexe secondaire dans lequel l’analyte est lui- même fixé par une bille magnétique lors d’un essai sous la forme immuno-absorption enzymatique sur bille support magnétique (dit encore « magnetic bead-based enzyme-linked immunosorbent assay » ou MELISA) ; [Fig. 4] is a schematic view of a secondary complex in which the analyte is itself fixed by a magnetic bead during an assay in the form of enzymatic immuno-absorption on a magnetic support bead (also called “magnetic bead-based enzyme -linked immunosorbent assay ”or MELISA);
[Fig. 5] est une vue une vue schématique d’un complexe secondaire, dans lequel l’analyte est lui-même fixé sur un support dans le cadre d’une technique d'hybridation moléculaire dot blot ; [Fig. 5] is a schematic view of a secondary complex, in which the analyte is itself supported on a support by a molecular dot blot hybridization technique;
[Fig. 6] est une vue schématique d’une seconde sonde d’amplification adaptée au procédé selon l’invention ; [Fig. 7] est une vue schématique d’un complexe secondaire issu de l’étape de révélation, obtenu par la liaison en cascade du complexe primaire avec une sonde d’amplification selon la figure 6 portant plusieurs molécules de traceur ; [Fig. 6] is a schematic view of a second amplification probe suitable for the method according to the invention; [Fig. 7] is a schematic view of a secondary complex resulting from the revealing step, obtained by the cascade binding of the primary complex with an amplification probe according to FIG. 6 carrying several tracer molecules;
[Fig. 8] est une figure illustrant l’absorbance (450 - 550 mm) par technique Biot-NP MELISA en fonction d’unités formant des plaques (PFU/mL), pour des virus entiers provenant de différentes souches (H1 N1, H3N2, PRRSV) dans un tampon contenant 10% de salive ; [Fig. 8] is a figure illustrating the absorbance (450 - 550 mm) by Biot-NP MELISA technique as a function of plaque-forming units (PFU / mL), for whole viruses from different strains (H1 N1, H3N2, PRRSV ) in a buffer containing 10% saliva;
[Fig. 9] est une vue comprenant (A) Détection par dot blot de la séquence d'ADN de Campylobacter avec lecture améliorée par biotine-Si-NP. Il est à noter qu'aucun signal n'a été obtenu avec une séquence de Campylobacter tronquée (PR) ni avec une séquence de contrôle d'E. Coli (PE). (B) Détection conventionnelle par dot blot de la sonde CampyP3 marquée à la biotine en utilisant la dilution de la séquence complémentaire Campylobacter CP3 allant de 1 ng / pl_ à 78 fg / pl_. (C) Détection dot blot améliorée de CP3 (0,1 ng / mI_ - 78 fg / mI_) en utilisant la sonde CampyP3. (D-E) Les courbes d'étalonnage correspondantes ont été obtenues en traçant l'intensité du signal chimiluminescent des points en fonction des concentrations du modèle CP3 sans et avec la lecture améliorée par biotine-Si-NP. [Fig. 9] is a view comprising (A) Dot blot detection of Campylobacter DNA sequence with improved reading by biotin-Si-NP. It should be noted that no signal was obtained with a truncated Campylobacter (PR) sequence or with a control sequence of E. Coli (PE). (B) Conventional dot blot detection of the biotin-labeled CampyP3 probe using the dilution of the Campylobacter CP3 complementary sequence ranging from 1 ng / µl to 78 fg / µl. (C) Enhanced dot blot detection of CP3 (0.1 ng / mI_ - 78 fg / mI_) using the CampyP3 probe. (D-E) The corresponding calibration curves were obtained by plotting the intensity of the chemiluminescent signal of the points as a function of the concentrations of the model CP3 without and with the reading improved by biotin-Si-NP.
[Fig. 10] est une vue montrant les résultats des tests d'inclusivité et d'exclusivité du capteur dot blot amélioré dans les cultures pures ; [Fig. 10] is a view showing the results of the inclusivity and exclusivity tests of the enhanced dot blot sensor in pure cultures;
[Fig. 11] illustre une membrane dot blot obtenue avec des échantillons de poulet naturellement infectés (C*3 et C10) et non infectés (C4, C5 et C6) ; la séquence de matrice CP3 (0,1 ng / pL) a été utilisée comme contrôle positif. [Fig. 11] illustrates a dot blot membrane obtained with naturally infected (C * 3 and C10) and uninfected (C4, C5 and C6) chicken samples; the CP3 template sequence (0.1 ng / pL) was used as a positive control.
Il est à noter que, sur ces figures, les éléments structurels et/ou fonctionnels communs aux différentes variantes peuvent présenter les mêmes références. It should be noted that, in these figures, the structural and / or functional elements common to the different variants may have the same references.
La présente invention concerne des procédés et systèmes pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte susceptible d’être contenu dans un échantillon. The present invention relates to methods and systems for determining the presence and / or amount of at least one analyte likely to be contained in a sample.
Par « analyte », on entend toute entité chimique, biochimique ou biologique, que l'on souhaite détecter dans un échantillon. The term “analyte” is understood to mean any chemical, biochemical or biological entity that it is desired to detect in a sample.
Cette entité chimique consiste avantageusement en une entité issue du monde vivant, de préférence du monde végétal ou du monde animal, voire encore présent chez l’être humain. This chemical entity advantageously consists of an entity resulting from the living world, preferably from the plant or animal world, or even present in humans.
Parmi les analytes détectables par les dispositifs et les procédés selon la présente invention, on citera en particulier les analytes biologiques, notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques. Among the analytes detectable by the devices and methods according to the present invention, there may be mentioned in particular biological analytes, in particular proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or from tumor cells. , infectious agents such as bacteria, viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or even antibiotics.
Par « échantillon », on entend tout échantillon dans lequel l'analyte recherché est en solution ou en suspension. Cet échantillon peut notamment être tout fluide biologique ou corporel. By “sample” is meant any sample in which the desired analyte is in solution or in suspension. This sample can in particular be any biological or bodily fluid.
L'échantillon peut également avoir été obtenu directement ou indirectement à partir d'un fluide biologique ou corporel. The sample may also have been obtained directly or indirectly from a biological or bodily fluid.
L'échantillon peut également être un extrait liquide d'un échantillon solide ou gazeux.The sample can also be a liquid extract from a solid or gaseous sample.
L’échantillon est par exemple issu de l’eau, l’air, le sol, les matériaux biologiques (tissus, micro-organismes, organites, récepteurs cellulaires, enzymes, anticorps, acides nucléiques, organismes génétiquement modifiés, ou matériels issus d'OGM, etc.). The sample is for example obtained from water, air, soil, biological materials (tissues, microorganisms, organelles, cell receptors, enzymes, antibodies, nucleic acids, genetically modified organisms, or materials derived from GMOs, etc.).
Le procédé et le système selon l’invention sont intéressants en ce qu’ils peuvent être adaptés aussi bien à la détermination de la présence d’au moins un analyte, qu’à la détermination de sa quantité. The method and the system according to the invention are advantageous in that they can be adapted both to the determination of the presence of at least one analyte, as to the determination of its quantity.
Par « détecter » ou « déterminer », on entend ainsi la détermination qualitative (avantageusement la présence ou l'absence) d’un ou plusieurs analytes dans un échantillon. By "detecting" or "determining" is thus meant the qualitative determination (advantageously the presence or absence) of one or more analytes in a sample.
Par « détecter » ou « déterminer », on englobe aussi la mesure et la quantification d’un ou plusieurs analytes dans l’échantillon. The term "detect" or "determine" also includes the measurement and quantification of one or more analytes in the sample.
Procédé de détermination Determination process
De manière générale, le procédé selon l’invention comprend les étapes successives suivantes : In general, the method according to the invention comprises the following successive steps:
(a) une étape de reconnaissance A (figure 1) au cours de laquelle l’échantillon E (non représenté) est mis en présence d’au moins une sonde primaire 1 apte à se lier spécifiquement avec l’analyte T pour former le cas échéant un complexe primaire C1 , (a) a recognition step A (FIG. 1) during which the sample E (not shown) is placed in the presence of at least one primary probe 1 capable of binding specifically with the analyte T to form the case a primary C1 complex,
(b) une étape de révélation B (figures 3 et 7 notamment) au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former un complexe secondaire C2 partant de la sonde primaire 1 (et de préférence d’une première étiquette d’affinité 12 de ladite sonde primaire 1) dudit complexe primaire C1. (b) a revelation step B (FIGS. 3 and 7 in particular) during which is added at least one revelation reagent suitable for forming a secondary complex C2 starting from the primary probe 1 (and preferably from a first label d affinity 12 of said primary probe 1) of said primary complex C1.
Selon l’invention, ledit au moins un réactif de révélation comprend : According to the invention, said at least one revealing reagent comprises:
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (figures 2 et 6), et - at least one amplification probe 3, of the core 31 type - envelope 32, in which said envelope 32 comprises several molecules with an affinity tag 321 (Figures 2 and 6), and
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable (figures 3 et 6). - a tracer 21 intended to convert the secondary complex C2 into a visible and / or measurable signal (Figures 3 and 6).
De manière générale, ledit au moins un réactif de révélation est destiné à se lier, en cascade, depuis ladite au moins une sonde primaire 1 (et avantageusement depuis sa première étiquette d’affinité 12) pour former le complexe secondaire C2. In general, said at least one revelation reagent is intended to bind, in cascade, from said at least one primary probe 1 (and advantageously from its first affinity tag 12) to form the secondary complex C2.
Lors de l’étape de révélation, ledit au moins un réactif de révélation mis en œuvre permet d’obtenir, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 dans lequel certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 sont liées (directement ou indirectement) avec au moins une molécule du traceur 21 (figures 3 et 7). During the revelation step, said at least one revelation reagent used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 in which at least some of the molecules of the label d 'affinity 321 of said at least an amplification probe 3 are linked (directly or indirectly) with at least one molecule of the tracer 21 (Figures 3 and 7).
Pour cela, avant formation du complexe secondaire C2, ledit traceur 21 peut avantageusement présenter deux formes différentes : For this, before formation of the secondary complex C2, said tracer 21 can advantageously have two different forms:
- le traceur 21 est un réactif distinct par rapport à ladite au moins une sonde d’amplification 3 ; le traceur 21 est destiné à se lier avec l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 (figure 3 notamment), ou - the tracer 21 is a separate reagent compared to said at least one amplification probe 3; the tracer 21 is intended to bind with the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 (FIG. 3 in particular), or
- le traceur 21 et la sonde d’amplification 3 forment un unique réactif ; le traceur 21 est lié avec l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 (figures 6 et 7). - the tracer 21 and the amplification probe 3 form a single reagent; the tracer 21 is linked with the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 (Figures 6 and 7).
Le traceur 21, dit encore « marqueur », « transducteur » ou « transductor », est destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable. The tracer 21, also called “marker”, “transducer” or “transductor”, is intended to convert the secondary complex C2 into a visible and / or measurable signal.
Par « traceur », on entend ainsi tout entité permettant une détection directe ou indirecte à l'œil nu, ou à l'aide d'un appareil, en raison de l'émission d'un signal. The term “tracer” thus means any entity allowing direct or indirect detection with the naked eye, or with the aid of a device, due to the emission of a signal.
Le signal est par exemple une fluorescence, une coloration, une présence d'isotope ou un signal magnétique. The signal is, for example, fluorescence, coloring, the presence of isotope or a magnetic signal.
Le traceur 21 peut ainsi être choisi parmi les traceurs classiques en soi. De préférence, ce traceur 21 est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, les particules photoacoustiques ou les particules photothermiques. The tracer 21 can thus be chosen from conventional tracers per se. Preferably, this tracer 21 is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic particles, photoacoustic particles or photothermal particles.
Par « lier » ou « liaison », on entend avantageusement : The term “link” or “link” is advantageously understood to mean:
- toute liaison forte, par exemple covalente (en particulier pour un unique réactif), mais aussi - any strong bond, for example covalent (in particular for a single reagent), but also
- toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte ou étiquettes d’affinité (en particulier pour des réactifs distincts). - any weak binding, for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type or affinity tags (in particular for separate reagents).
De préférence, l’étiquette d’affinité 321 de l’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 est choisie parmi : Preferably, the affinity tag 321 of the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 is chosen from:
- une première étiquette d’affinité 321, identique à la première étiquette d’affinité 12 de ladite au moins une sonde primaire 1, ou - a first affinity tag 321, identical to the first affinity tag 12 of said at least one primary probe 1, or
- une seconde étiquette d’affinité 321 apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité 12 de ladite au moins une sonde primaire 1. - a second affinity tag 321 able to bind specifically with the first affinity tag 12 of said at least one primary probe 1.
Dans un premier mode général de réalisation, l’étape de révélation B conduit à ajouter au moins les réactifs de révélation suivants : In a first general embodiment, the revealing step B leads to adding at least the following revealing reagents:
- une seconde étiquette d’affinité 5 apte à se lier spécifiquement avec ladite sonde primaire 1, dont au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité 5 se présentant sous la forme d’une sonde secondaire 2 munie d’un traceur, et - a second affinity tag 5 capable of binding specifically with said primary probe 1, including at least part of said second affinity tag 5 in the form of a secondary probe 2 provided with a tracer, and
- au moins une sonde d’amplification 3. Lors de cette étape de révélation, les réactifs de révélation 2, 3, 5 mis en œuvre permettent l’obtention, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2. - at least one amplification probe 3. During this revelation step, the revelation reagents 2, 3, 5 used make it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: second label d affinity 5: amplification probe 3: secondary probes 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2 est en particulier liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2. The amplification probe 3 of this secondary complex C2 is in particular linked to several molecules of said at least one secondary probe 2.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 (portant le traceur) est liée à une molécule d’analyte T. In this secondary complex C2 according to the invention, a plurality of molecules of said at least one secondary probe 2 (carrying the tracer) is linked to an analyte T molecule.
Cette structure offre alors une amplification significative du signal obtenu pour chaque molécule d’analyte T en présence, grâce à la multiplication des sondes secondaires 2 composant le complexe secondaire C2 (rapportées sur la sonde d’amplification 3). This structure then offers a significant amplification of the signal obtained for each T analyte molecule present, thanks to the multiplication of the secondary probes 2 making up the secondary complex C2 (reported on the amplification probe 3).
Dans un second mode général de réalisation, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321 dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21. In a second general embodiment, during the revelation step, is added at least one amplification probe 3, of the core 31-envelope 32 type, in which said envelope 32 comprises several molecules of said second label. affinity 321, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer 21.
Lors de cette étape de révélation, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre permet l’obtention, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3. During this revelation step, the amplification probe 3 used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de traceur 21 est liée à une molécule d’analyte T. In this secondary C2 complex according to the invention, a plurality of tracer molecules 21 are linked to an analyte T molecule.
Cette structure offre alors une amplification significative du signal obtenu pour chaque molécule d’analyte T en présence, grâce à la multiplication des traceurs 21 portés par la sonde d’amplification 3. This structure then offers a significant amplification of the signal obtained for each T analyte molecule present, thanks to the multiplication of the tracers 21 carried by the amplification probe 3.
Tel que développé ci-après, pour obtenir ce complexe secondaire C2, les réactifs de révélation sont assemblés en cascade par des liaisons moléculaires spécifiques s’appuyant sur des étiquettes d’affinité complémentaires. As developed below, to obtain this secondary C2 complex, the revealing reagents are assembled in cascade by specific molecular bonds based on complementary affinity tags.
Les réactifs mis en œuvre dans le procédé comprennent pour cela avantageusement au moins un couple d’étiquettes d’affinité, voire un unique couple d’étiquettes d’affinité. For this, the reagents used in the process advantageously comprise at least one pair of affinity labels, or even a single pair of affinity labels.
De manière générale, par « étiquettes d’affinité », on entend avantageusement un couple d’entités chimiques, biochimiques ou biologiques, qui sont aptes à se lier spécifiquement l’une avec l’autre, pour former un complexe. In general, by "affinity tags" is advantageously meant a pair of chemical, biochemical or biological entities which are able to bind specifically with one another to form a complex.
De tels « étiquettes d’affinité » englobent notamment les ligands biologiques choisis parmi les peptides et les oligonucléotides. Such "affinity tags" include in particular the biological ligands chosen from peptides and oligonucleotides.
Par exemple, et tel que développé par la suite, les étiquettes d’affinité sont choisies parmi le couple : For example, and as developed below, the affinity tags are chosen from the couple:
- la biotine (dite encore « biotin » ou « biot » dans les exemples) ou homologue, d’une part, et - la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine, Captavidine, d’autre part. - biotin (also called “biotin” or “biot” in the examples) or homologous, on the one hand, and - streptavidin or homolog, for example avidin, NeutrAvidin, Captavidin, on the other hand.
Les étapes de ce procédé de détermination, y compris les réactifs mis en œuvre, sont décrits plus en détails ci-après. The steps of this determination method, including the reagents used, are described in more detail below.
Etape de reconnaissance A Recognition step A
Au cours de l’étape de reconnaissance A, l’échantillon E est ainsi mis en présence de ladite au moins une sonde primaire 1 formant un biocapteur. During recognition step A, sample E is thus brought into contact with said at least one primary probe 1 forming a biosensor.
Tel qu’illustré schématiquement sur les figures 1 et 5, ladite au moins une sonde primaire 1 consiste pour cela en un conjugué comprenant : As illustrated schematically in Figures 1 and 5, said at least one primary probe 1 therefore consists of a conjugate comprising:
- un site de liaison 11 , formant encore « biorécepteur » ou élément de reconnaissance, apte à se lier spécifiquement avec l’analyte T pour former le cas échéant le complexe primaire C1, et - a binding site 11, still forming a "bioreceptor" or recognition element, capable of binding specifically with the analyte T to form, if necessary, the primary complex C1, and
- une première étiquette d’affinité 12. - a first affinity tag 12.
De manière générale, le complexe secondaire C2 est avantageusement formé, en cascade, à partir de la première étiquette d’affinité 12. In general, the secondary complex C2 is advantageously formed, in cascade, from the first affinity tag 12.
Ladite au moins une sonde primaire 1, et en particulier son site de liaison 11, consiste en toute entité chimique, biochimique ou biologique, qui est apte à se lier spécifiquement à l’analyte T pour former le complexe primaire C1 (avantageusement binaire). Said at least one primary probe 1, and in particular its binding site 11, consists of any chemical, biochemical or biological entity which is able to bind specifically to the analyte T to form the primary complex C1 (advantageously binary).
Par « lier » ou « liaison », on entend toute liaison forte, par exemple covalente, mais aussi toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte. By “bind” or “binding” is meant any strong bond, for example covalent, but also any weak bond, for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type.
Une telle sonde primaire 1, et en particulier son site de liaison 11, est ainsi avantageusement choisie parmi les biomolécules, à savoir par exemple : Such a primary probe 1, and in particular its binding site 11, is thus advantageously chosen from biomolecules, namely for example:
- les sondes protéiques (figure 1), englobant les anticorps, les enzymes, les antigènes, les peptides, ou - protein probes (Figure 1), including antibodies, enzymes, antigens, peptides, or
- les sondes nucléiques (figure 5), englobant les séquences ARN, les séquences ADN, les aptamères. - nucleic acid probes (FIG. 5), encompassing the RNA sequences, the DNA sequences, the aptamers.
La sonde primaire 1 (et en particulier son site de liaison 11) est choisie pour ses propriétés de liaison spécifique à l'analyte T, comme par exemple un couple ligand/anti-ligand, un couple antigène/anticorps, un couple ADN/ARN ou un couple ADN/ADN. The primary probe 1 (and in particular its binding site 11) is chosen for its specific binding properties to the T analyte, such as for example a ligand / anti-ligand pair, an antigen / antibody pair, a DNA / RNA pair. or a DNA / DNA pair.
Ainsi, si l'analyte est un antigène ou un haptène, le site de liaison 11 est avantageusement un anticorps spécifique de l'analyte. Thus, if the analyte is an antigen or a hapten, the binding site 11 is advantageously an antibody specific for the analyte.
Par « anticorps spécifique de l'analyte », on entend un anticorps capable de se lier spécifiquement avec l'analyte dans une liaison de type antigène/anticorps. By “antibody specific for the analyte” is meant an antibody capable of binding specifically with the analyte in a binding of the antigen / antibody type.
Il s'agit typiquement d'un anticorps polyclonal ou d’un anticorps monoclonal, ayant une forte affinité pour l'analyte. De préférence, il s'agit d'un anticorps monoclonal. It is typically a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, having a high affinity for the analyte. Preferably, it is a monoclonal antibody.
Si l'analyte est un acide nucléique, le site de liaison 11 est avantageusement une sonde ADN complémentaire. Par exemple, la sonde primaire 1 consiste en une sonde apte à se lier à l’ADN de bactérie Gram négative du genre Campylobacter, et plus préférentiellement des sondes ADN spécifiques de Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter tari ou de Campylobacter upsaliensis telles que décrites par exemple dans la demande de brevet IT102020000012496. If the analyte is a nucleic acid, the binding site 11 is advantageously a complementary DNA probe. For example, the primary probe 1 consists of a probe capable of binding to the DNA of Gram-negative bacteria of the genus Campylobacter, and more preferably DNA probes specific for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter tari or Campylobacter upsaliensis as described. for example in the patent application IT102020000012496.
De manière générale, les paramètres (temps d’incubation, rinçage, etc.) sont ajustés à façon, de sorte à autoriser la formation du complexe primaire C1 en présence de l’analyte T. In general, the parameters (incubation time, rinsing, etc.) are adjusted so as to allow the formation of the primary complex C1 in the presence of the analyte T.
Par ailleurs, la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1 est avantageusement choisie parmi la biotine ou homologue. Furthermore, the first affinity tag 12 of the primary probe 1 is advantageously chosen from biotin or homolog.
De manière générale, le site de liaison 11 et la première étiquette d’affinité 12 sont avantageusement liés par des liaisons covalentes. Generally, the binding site 11 and the first affinity tag 12 are advantageously linked by covalent bonds.
Préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire 1, ledit au moins un analyte T peut être fixé : Prior to bringing said at least one primary probe 1 together, said at least one analyte T can be fixed:
- sur une sonde de capture 6 (figure 4), portée par exemple par une bille magnétique B pour une technique dite MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich, ou- on a capture probe 6 (Figure 4), carried for example by a magnetic ball B for a so-called MELISA technique or by a support for a sandwich ELISA technique, or
- sur un support S (figure 5), par exemple pour un procédé du type dot blot. - on a support S (FIG. 5), for example for a method of the dot blot type.
En particulier, la sonde de capture 6 précitée consiste en toute entité chimique, biochimique ou biologique, qui est apte à se lier spécifiquement à l’analyte T. In particular, the aforementioned capture probe 6 consists of any chemical, biochemical or biological entity which is able to bind specifically to the analyte T.
Par « lier » ou « liaison », on entend toute liaison forte, par exemple covalente, mais aussi toute liaison faible, par exemple du type antigène/anticorps ou analyte/anti-analyte. By “bind” or “binding” is meant any strong bond, for example covalent, but also any weak bond, for example of the antigen / antibody or analyte / anti-analyte type.
Une telle sonde de capture 6, et en particulier son site de liaison, est ainsi avantageusement choisie parmi les biomolécules, à savoir par exemple : Such a capture probe 6, and in particular its binding site, is thus advantageously chosen from biomolecules, namely for example:
- les sondes protéiques, englobant les anticorps, les enzymes, les antigènes, les peptides, ou - protein probes, including antibodies, enzymes, antigens, peptides, or
- les sondes nucléiques, englobant les séquences ARN, les séquences ADN, les aptamères. - nucleic acid probes, encompassing RNA sequences, DNA sequences, aptamers.
La sonde de capture 6 (et en particulier son site de liaison) est choisie pour ses propriétés de liaison spécifique à l'analyte T, comme par exemple un coupe ligand/anti-ligand, un couple antigène/anticorps, un couple ADN/ARN ou un couple ADN/ADN. The capture probe 6 (and in particular its binding site) is chosen for its specific binding properties to the T analyte, such as for example a ligand / anti-ligand cut, an antigen / antibody pair, a DNA / RNA pair. or a DNA / DNA pair.
Par « dot blot », on englobe les techniques de transfert de molécules permettant de vérifier la présence de molécules spécifiques dans un milieu, y compris le Southern blot pour l'ADN, le northern blot pour les ARN ou le western blot pour les protéines. The term “dot blot” encompasses techniques for transferring molecules which make it possible to verify the presence of specific molecules in a medium, including the Southern blot for the DNA, the northern blot for the RNAs or the western blot for the proteins.
Par « dot blot », on englobe également le transfère les acides nucléiques (ADN ou ARN) depuis un milieu liquide directement sur une membrane, sans séparation préalable (donc sans électrophorèse préalable). The term “dot blot” also encompasses the transfer of nucleic acids (DNA or RNA) from a liquid medium directly onto a membrane, without prior separation (therefore without prior electrophoresis).
Le transfert peut être réalisé par diffusion simple, par diffusion dans champ électrique (électrodiffusion) ou par aspiration sous vide. Etape de révélation B The transfer can be carried out by simple diffusion, by diffusion in an electric field (electrodiffusion) or by vacuum suction. Revelation step B
L’étape de révélation B est mise en œuvre de manière à détecter, au moyen d’au moins un réactif de révélation, les éventuels complexes primaires C1 générés au cours de l’étape de reconnaissance A. The revelation step B is carried out so as to detect, by means of at least one revelation reagent, any C1 primary complexes generated during the recognition step A.
Au cours de cette étape de révélation B, ledit au moins un réactif de révélation comprend :During this revelation step B, said at least one revelation reagent comprises:
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (figures 2 et 6), et - at least one amplification probe 3, of the core 31 type - envelope 32, in which said envelope 32 comprises several molecules with an affinity tag 321 (Figures 2 and 6), and
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe secondaire C2 en un signal visible et/ou mesurable (figures 3 et 6). - a tracer 21 intended to convert the secondary complex C2 into a visible and / or measurable signal (Figures 3 and 6).
Selon un mode de réalisation décrit ci-après en relation avec les figures 1 à 5, au cours de cette étape de révélation B, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés (avantageusement distincts) : According to an embodiment described below in relation to FIGS. 1 to 5, during this revelation step B, at least the following revelation reagents are added (advantageously separate):
- la seconde étiquette d’affinité 5, dont au moins une partie se présente sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2, et - the second affinity tag 5, at least part of which is in the form of said at least one secondary probe 2, and
- ladite au moins une sonde d’amplification 3. - said at least one amplification probe 3.
La seconde étiquette d’affinité 5 est apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité qui est portée par la sonde primaire 1 ou, comme développé par la suite, par ladite au moins une sonde d’amplification 3. The second affinity tag 5 is adapted to bind specifically with the first affinity tag which is carried by the primary probe 1 or, as developed later, by said at least one amplification probe 3.
Ainsi, dans le cas d’une première étiquette d’affinité du type biotine, la seconde étiquette d’affinité 5 est avantageusement choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine ou NeutrAvidine ou Captavidine. Thus, in the case of a first affinity tag of the biotin type, the second affinity tag 5 is advantageously chosen from streptavidin or homologous, for example avidin or NeutrAvidin or Captavidin.
Dans cette étape de révélation B, la seconde étiquette d’affinité 5 peut se présenter :In this revelation step B, the second affinity tag 5 may appear:
- uniquement sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 (c’est-à-dire conjuguée avec un traceur 21), ou - only in the form of said at least one secondary probe 2 (that is to say conjugated with a tracer 21), or
- en partie sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 et en partie sous une forme libre (c’est-à-dire dépourvue du traceur 21). - partly in the form of said at least one secondary probe 2 and partly in free form (that is to say without the tracer 21).
Par exemple, dans le cas d’une seconde étiquette d’affinité 5 avec un mélange des deux formes, la seconde étiquette d’affinité 5 sous forme libre peut représenter de 10 à 50%, de préférence encore de 20 à 50%, des molécules de seconde étiquette d’affinité 5. For example, in the case of a second affinity tag 5 with a mixture of the two forms, the second affinity tag 5 in free form may represent 10 to 50%, more preferably 20 to 50%, of the second affinity tag molecules 5.
La sonde secondaire 2 précitée consiste en un réactif de détection sous la forme d’un conjugué comprenant : The aforementioned secondary probe 2 consists of a detection reagent in the form of a conjugate comprising:
- un traceur 21, et - a plotter 21, and
- une étiquette d’affinité 22 qui est constituée par la seconde étiquette d’affinité 5 précitée.- an affinity tag 22 which consists of the aforementioned second affinity tag 5.
Dans un souci de simplicité, cette étiquette d’affinité de la sonde secondaire 2 est désignée indifféremment par les repères 5 ou 22 et peut encore être dénommée « seconde étiquette d’affinité ». Le traceur 21 peut ainsi être choisi parmi les traceurs classiques en soi. De préférence, ce traceur 21 est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, les particules photoacoustiques, ou les particules photothermiques. For the sake of simplicity, this affinity tag of the secondary probe 2 is designated indifferently by the references 5 or 22 and can also be referred to as “second affinity tag”. The tracer 21 can thus be chosen from conventional tracers per se. Preferably, this tracer 21 is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic particles, photoacoustic particles, or photothermal particles.
Ladite au moins une sonde secondaire 2 est ainsi avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs. Said at least one secondary probe 2 is thus advantageously chosen from enzymatic conjugates or photoactive conjugates.
Par « conjugués enzymatiques », on englobe les conjugués avec les enzymes H RP (peroxydase de raifort) ou PA (phosphatase alcaline). The term “enzymatic conjugates” is understood to mean conjugates with the enzymes H RP (horseradish peroxidase) or PA (alkaline phosphatase).
Dans ce cas, les réactifs de l’étape de révélation B comprennent avantageusement un substrat 4 pour les conjugués enzymatiques en vue d’une réaction de chimiluminescence en présence du complexe secondaire C2. In this case, the reagents for development step B advantageously comprise a substrate 4 for the enzymatic conjugates for a chemiluminescence reaction in the presence of the secondary complex C2.
Le substrat 4, classique en soi, peut ainsi être choisi parmi par exemple les composés suivants : The substrate 4, conventional in itself, can thus be chosen from, for example, the following compounds:
- les substrats chromogènes (TMB, ABTS, OPD), fluorescents (ADHP) ou chimiluminescents (Luminol) pour la HRP, - chromogenic (TMB, ABTS, OPD), fluorescent (ADHP) or chemiluminescent (Luminol) substrates for HRP,
- les substrats chromogènes (pNPP), fluorescents (MUP, FPD) ou chimiluminescents (VisiGIo) pour la PA. - chromogenic (pNPP), fluorescent (MUP, FPD) or chemiluminescent (VisiGIo) substrates for PA.
Par « conjugués photoactifs », on englobe les conjugués colorés, les conjugués fluorescents, les conjugués luminescents. The term “photoactive conjugates” includes colored conjugates, fluorescent conjugates and luminescent conjugates.
Selon un mode de réalisation préféré et dans le cas d’une première étiquette d’affinité du type biotine, ladite au moins une sonde secondaire 2 consiste en un conjugué enzymatique choisi par exemple parmi les conjugués streptavidine-HRP (peroxydase de raifort) ou streptavidine-PA (phosphatase alcaline). According to a preferred embodiment and in the case of a first affinity tag of the biotin type, said at least one secondary probe 2 consists of an enzymatic conjugate chosen for example from streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) or streptavidin conjugates. -PA (alkaline phosphatase).
Par ailleurs, tel que représenté schématiquement sur la figure 2, ladite au moins une sonde d’amplification 3 est du type noyau 31 (dit encore « cœur ») - enveloppe 32. Furthermore, as shown schematically in Figure 2, said at least one amplification probe 3 is of the core 31 (also called "heart") - envelope 32 type.
L’enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321 (désignée également « première étiquette d’affinité 321 ») qui est identique à la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1. Envelope 32 includes multiple molecules of an affinity tag 321 (also referred to as "first affinity tag 321") which is identical to the first affinity tag 12 of primary probe 1.
Pour une amplification optimale du signal, ladite au moins une sonde d’amplification 3 comporte avantageusement au moins 20 molécules de ladite première étiquette d’affinité 321. For optimum signal amplification, said at least one amplification probe 3 advantageously comprises at least 20 molecules of said first affinity tag 321.
Ces molécules de ladite première étiquette d’affinité 321 sont aptes à se lier spécifiquement avec au moins une molécule de la seconde étiquette d’affinité 5, 22, à savoir : These molecules of said first affinity tag 321 are able to bind specifically with at least one molecule of the second affinity tag 5, 22, namely:
- une seconde étiquette d’affinité 22 sous la forme de ladite au moins une sonde secondaire 2 (c’est-à-dire conjuguée avec un traceur 21), ou - a second affinity tag 22 in the form of said at least one secondary probe 2 (that is to say conjugated with a tracer 21), or
- une seconde étiquette d’affinité 5 libre (c’est-à-dire dépourvue du traceur 21). L’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 comprend encore avantageusement des espaceurs 322 qui relient le noyau 31 avec une molécule de première étiquette d’affinité 321. - a second affinity tag 5 free (that is to say devoid of the tracer 21). The envelope 32 of said at least one amplification probe 3 also advantageously comprises spacers 322 which connect the nucleus 31 with a first affinity tag molecule 321.
De tels espaceurs 322 visent à écarter les molécules de première étiquette d’affinité 321 par rapport au noyau 31 et les unes par rapport aux autres, limitant ainsi les problèmes d’encombrement stérique lors de l’étape de révélation B. Such spacers 322 aim to separate the molecules of the first affinity tag 321 with respect to the nucleus 31 and with respect to each other, thus limiting the problems of steric hindrance during the revealing step B.
Cette structure permet ainsi de libérer l’environnement des premières étiquettes d’affinité 321, et d’augmenter le nombre de molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 qui est lié simultanément avec la sonde d’amplification 3. Cet agencement permet aussi une meilleure présentation des premières étiquettes d’affinité 321, favorisant ainsi la réaction de reconnaissance (avantageusement augmentation de la probabilité de réaction) avec ladite au moins une sonde secondaire 2. This structure thus makes it possible to free the environment from the first affinity tags 321, and to increase the number of molecules of said at least one secondary probe 2 which is bound simultaneously with the amplification probe 3. This arrangement also allows a better presentation of the first affinity tags 321, thus promoting the recognition reaction (advantageously increase in the probability of reaction) with said at least one secondary probe 2.
Les espaceurs 322 sont avantageusement choisis parmi les espaceurs nucléiques, par exemple les séquences d’ADN (par exemple une séquence dTio-PEG2-dTio). The spacers 322 are advantageously chosen from nucleic spacers, for example DNA sequences (for example a dTio-PEG 2 -dTio sequence).
Le noyau 31 est quant à lui avantageusement formé par une nanoparticule 31 (dite encore « NP » dans les exemples) ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm. The core 31 is for its part advantageously formed by a nanoparticle 31 (also called “NP” in the examples) preferably having a size ranging from 10 to 100 nm.
La taille des particules est définie comme leur plus grande taille et pourra être mesurée grâce à un microscope électronique à balayage ou un microscope optique. La taille des objets de forme hétérogène est définie comme la longueur du côté le plus grand de l'objet. The size of the particles is defined as their largest size and can be measured using a scanning electron microscope or an optical microscope. The size of heterogeneously shaped objects is defined as the length of the larger side of the object.
La nanoparticule 31 est choisie avantageusement parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice (y compris le silicate). The nanoparticle 31 is advantageously chosen from nanoparticles having a surface composed of silica (including silicate).
De préférence encore, de telles nanoparticules sont encore choisies parmi les nanoparticules composées de silice (voire de silicate), avantageusement encore parmi les billes de silice. More preferably, such nanoparticles are also chosen from nanoparticles composed of silica (or even silicate), advantageously also from silica beads.
Plus généralement, les nanoparticules peuvent être choisies parmi les nanoparticules de silice (dites encore « Si-NP »), d'or, d'argent, de graphite, des nanocristaux fluorescents (également nommés quantum dots), des nanoparticules de polymère du type polystyrène, polypropylène ou polybutadiène, ou des nanoparticules d'oxyde métallique, notamment d'oxyde d'étain, de gadolinium, d'aluminium, de titane, de cérium, de niobium d'erbium, d'ytterbium, de terbium, de dysprosium, d'europium, ou d'un mélange de ces oxydes, éventuellement enrobées pour permettre leur fonctionnalisation. More generally, the nanoparticles can be chosen from silica nanoparticles (also called “Si-NP”), gold, silver, graphite, fluorescent nanocrystals (also called quantum dots), polymer nanoparticles of the type polystyrene, polypropylene or polybutadiene, or metal oxide nanoparticles, in particular of tin oxide, gadolinium, aluminum, titanium, cerium, erbium niobium, ytterbium, terbium, dysprosium , europium, or a mixture of these oxides, optionally coated to allow their functionalization.
Pour la fabrication d’une telle sonde d’amplification 3 conforme à l’invention, l’homme du métier peut s’appuyer par exemple sur le document WO-2013 007944, le document Knopp et al. (Review: Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles ; Analytica Chimica Acta 647 (2009) 14-30) ou le document Sivakumar et al. (Silica-Coated Ln3+- Doped LaF3 Nanoparticles as Robust Down- and Upconverting Biolabels ; Chem. Eur. J. 2006, 12, 5878 - 5884). En présence du complexe primaire C1 (correspondant à la présence de l’analyte T dans l’échantillon E) et au moyen des réactifs précités, l’étape de révélation B est mise en œuvre dans des conditions adaptées à générer le complexe secondaire C2 (en cascade), partant de la sonde primaire 1 dudit complexe primaire C1, comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée) : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2. For the manufacture of such an amplification probe 3 in accordance with the invention, a person skilled in the art can rely, for example, on document WO-2013 007944, document Knopp et al. (Review: Bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles; Analytica Chimica Acta 647 (2009) 14-30) or the document Sivakumar et al. (Silica-Coated Ln 3+ - Doped LaF3 Nanoparticles as Robust Down- and Upconverting Biolabels; Chem. Eur. J. 2006, 12, 5878 - 5884). In the presence of the primary complex C1 (corresponding to the presence of the analyte T in the sample E) and by means of the aforementioned reagents, the revelation step B is carried out under conditions suitable for generating the secondary complex C2 ( cascade), starting from the primary probe 1 of said primary complex C1, comprising analyte T: primary probe 1: second affinity tag 5 (free or conjugated): amplification probe 3: secondary probes 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2, portant une pluralité de molécules de première étiquette d’affinité 321, est ainsi avantageusement liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2 (via leurs secondes étiquettes d’affinité 22). The amplification probe 3 of this secondary complex C2, carrying a plurality of molecules of first affinity tag 321, is thus advantageously linked to several molecules of said at least one secondary probe 2 (via their second affinity tags 22) .
Cette configuration permet alors une amplification significative du signal, avec une pluralité de molécules de la sonde secondaire 2 (destinées à produire un signal) pour une molécule d’analyte T. This configuration then allows a significant amplification of the signal, with a plurality of molecules of secondary probe 2 (intended to produce a signal) for one molecule of analyte T.
En pratique, l’étape de révélation B peut prendre deux formes de réalisation alternatives.In practice, disclosure step B can take two alternative embodiments.
Selon une première forme de réalisation, l’étape de révélation B est mise en œuvre en deux phases successives avec : According to a first embodiment, the revealing step B is implemented in two successive phases with:
- une première phase B1 au cours de laquelle est ajoutée la seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée) pour former un premier sous-complexe (en cascade), depuis la sonde primaire 1 dudit complexe primaire C1, comprenant analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 (libre ou conjuguée), puis - a first phase B1 during which the second affinity tag 5 (free or conjugated) is added to form a first sub-complex (in cascade), from the primary probe 1 of said primary complex C1, comprising analyte T: probe primary 1: second affinity tag 5 (free or conjugated), then
- une seconde phase B2 au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification 3 et ladite au moins une sonde secondaire 2 pour former ledit complexe secondaire C2 décrit dessus. - a second phase B2 during which said at least one amplification probe 3 and said at least one secondary probe 2 are added to form said secondary complex C2 described above.
La seconde phase B2 peut elle-même être divisée en deux opérations successives (ajout successif des réactifs de révélation) : The second phase B2 can itself be divided into two successive operations (successive addition of the revelation reagents):
- une première opération avec ajout de ladite au moins une sonde d’amplification 3, destinée à se fixer avec les secondes étiquettes d’affinité 5 (libre ou conjuguées) du premier sous-complexe, puis - a first operation with the addition of said at least one amplification probe 3, intended to bind with the second affinity tags 5 (free or conjugated) of the first sub-complex, then
- une seconde opération avec ajout de ladite au moins une sonde secondaire 2, destinée à se fixer avec ladite au moins une sonde d’amplification 3 pour former ledit complexe secondaire C2. - a second operation with the addition of said at least one secondary probe 2, intended to bind with said at least one amplification probe 3 to form said secondary complex C2.
De manière alternative, cette première forme de réalisation comprend une phase de préparation au cours de laquelle ladite au moins une sonde d’amplification 3 est liée avec la sonde secondaire 2 (au moyen de leurs étiquettes d’affinité 321, 22), pour former un complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2. Dans ce cas, la seconde phase B2 est mise en œuvre en ajoutant directement le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 qui est destiné à se lier avec les secondes étiquettes d’affinité 5 (libre ou conjuguée) du premier sous-complexe. Alternatively, this first embodiment comprises a preparation phase during which said at least one amplification probe 3 is linked with the secondary probe 2 (by means of their affinity tags 321, 22), to form an amplification probe 3 / secondary probes 2 complex. In this case, the second phase B2 is implemented by directly adding the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex which is intended to bind with the second affinity tags 5 (free or conjugated) of the first sub-complex. .
Selon une seconde forme de réalisation, l’étape de révélation B est mise en œuvre en une phase unique au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire C2. According to a second embodiment, the revelation step B is carried out in a single phase during which the reagents are added simultaneously for the formation of the secondary complex C2.
Pour cela, le procédé comprend avantageusement une phase de préparation au cours de laquelle ladite au moins une sonde d’amplification 3 est liée avec plusieurs molécules de sondes secondaires 2 (au moyen de leurs étiquettes d’affinité 321, 22), pour former un complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2. For this, the method advantageously comprises a preparation phase during which said at least one amplification probe 3 is linked with several molecules of secondary probes 2 (by means of their affinity tags 321, 22), to form a Amplification probe 3 / secondary probe complex 2.
Dans ce cas, l’étape de révélation B est mise en œuvre en ajoutant directement le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 qui est destiné à se lier avec la sonde primaire 1 si elle est toujours présente. In this case, revelation step B is carried out by directly adding the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex which is intended to bind with the primary probe 1 if it is still present.
En l’espèce, le complexe sonde d’amplification 3 / sondes secondaires 2 se lie avec la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1, cela par l’intermédiaire des secondes étiquettes d’affinité 5, 22 (libre ou conjugué). In this case, the amplification probe 3 / secondary probes 2 complex binds with the first affinity tag 12 of the primary probe 1, this via the second affinity tags 5, 22 (free or conjugated ).
Dans cette approche, la première phase B1 précitée ne serait plus nécessaire. In this approach, the aforementioned first phase B1 would no longer be necessary.
Selon une variante de réalisation décrite ci-après en relation avec les figures 6 et 7, au cours de cette étape de révélation B, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre est similaire à celle décrite ci-dessus en relation avec les figures 1 à 5 en ce qu’elle est du type noyau 31 - enveloppe 32 avec une enveloppe 32 qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321. According to an alternative embodiment described below in relation to FIGS. 6 and 7, during this revealing step B, the amplification probe 3 used is similar to that described above in relation to FIGS. 1 to 5 in that it is of the core 31 - shell 32 type with a shell 32 which comprises several molecules of an affinity tag 321.
Cette sonde d’amplification 3 se distingue en ce que l’enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une seconde étiquette d’affinité 321 qui est complémentaire de la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1. This amplification probe 3 is distinguished in that the envelope 32 comprises several molecules of a second affinity tag 321 which is complementary to the first affinity tag 12 of the primary probe 1.
Et certaines au moins des molécules de seconde étiquette d’affinité 321 sont liées à au moins une molécule du traceur 21 (figure 6). And at least some of the second affinity tag 321 molecules are linked to at least one tracer 21 molecule (Figure 6).
Par exemple et sans être limitatif, au moins 50% des molécules de seconde étiquette d’affinité 321 sont liées à au moins une molécule du traceur 21. For example and without being limiting, at least 50% of the molecules of the second affinity tag 321 are linked to at least one molecule of the tracer 21.
Par « lié », on entend ici avantageusement une liaison fort, de préférence une liaison covalente. The term “bound” is understood here advantageously to mean a strong bond, preferably a covalent bond.
Le couple seconde étiquette d’affinité 321 / traceur 21 est ainsi avantageusement choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs, greffés sur la sonde d’amplification 3. The second affinity tag 321 / tracer 21 pair is thus advantageously chosen from the enzymatic conjugates or the photoactive conjugates, grafted onto the amplification probe 3.
Par « conjugués enzymatiques », on englobe les conjugués avec les enzymes H RP (peroxydase de raifort) ou PA (phosphatase alcaline). Pour une amplification optimale du signal, ladite au moins une sonde d’amplification 3 comporte avantageusement au moins 20 molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321. The term “enzymatic conjugates” is understood to mean conjugates with the enzymes H RP (horseradish peroxidase) or PA (alkaline phosphatase). For optimum amplification of the signal, said at least one amplification probe 3 advantageously comprises at least 20 molecules of said second affinity tag 321.
La seconde étiquette d’affinité 321 est apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité 12 qui est portée par la sonde primaire 1. The second affinity tag 321 is adapted to bind specifically with the first affinity tag 12 which is carried by the primary probe 1.
Ainsi, dans le cas d’une première étiquette d’affinité 12 du type biotine, la seconde étiquette d’affinité 321 est avantageusement choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine ou NeutrAvidine ou Captavidine. Thus, in the case of a first affinity tag 12 of the biotin type, the second affinity tag 321 is advantageously chosen from streptavidin or homologous, for example avidin or NeutrAvidin or Captavidin.
Les autres caractéristiques techniques générales de la sonde d’amplification 3 (notamment espaceurs 322, noyau 31, procédé de fabrication), développés ci-dessus en relation avec les figures 1 à 5, s’appliquent dans le présent mode de réalisation. The other general technical characteristics of the amplification probe 3 (in particular spacers 322, core 31, manufacturing process), developed above in connection with Figures 1 to 5, apply in this embodiment.
En particulier, l’enveloppe 32 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 comprend encore avantageusement des espaceurs 322 qui relient le noyau 31 avec une molécule de seconde étiquette d’affinité 321. In particular, the envelope 32 of said at least one amplification probe 3 also advantageously comprises spacers 322 which connect the nucleus 31 with a second affinity tag molecule 321.
En présence du complexe primaire C1 (correspondant à la présence de l’analyte T dans l’échantillon E) et au moyen du réactif de révélation précité, l’étape de révélation B est mise en œuvre dans des conditions adaptées à générer le complexe secondaire C2 (en cascade) comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3. In the presence of the primary complex C1 (corresponding to the presence of the analyte T in the sample E) and using the aforementioned revelation reagent, the revelation step B is carried out under conditions suitable for generating the secondary complex C2 (in cascade) comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe secondaire C2 porte une pluralité de conjugués seconde étiquette d’affinité 321 / traceur 21. The amplification probe 3 of this secondary complex C2 carries a plurality of second affinity tag 321 / tracer 21 conjugates.
Cette configuration permet alors une amplification significative du signal, avec une pluralité de molécules de traceur 21 (destinées à produire un signal) pour une molécule d’analyte T. This configuration then allows a significant amplification of the signal, with a plurality of tracer molecules 21 (intended to produce a signal) for an analyte molecule T.
L’étape de révélation B est alors avantageusement mise en œuvre en une phase unique au cours de laquelle est ajoutée la sonde d’amplification 3 pour la formation du complexe secondaire C2. The revelation step B is then advantageously carried out in a single phase during which the amplification probe 3 is added for the formation of the secondary complex C2.
Dans ce cas, l’étape de révélation B est mise en œuvre en ajoutant directement la sonde d’amplification 3 qui est destiné à se lier avec la sonde primaire 1 si elle est toujours présente. In this case, revelation step B is carried out by directly adding the amplification probe 3 which is intended to bind with the primary probe 1 if it is still present.
En l’espèce, la sonde d’amplification 3 se lie avec la première étiquette d’affinité 12 de la sonde primaire 1, cela par l’intermédiaire des secondes étiquettes d’affinité 321. In this case, the amplification probe 3 binds with the first affinity tag 12 of the primary probe 1, through the second affinity tags 321.
De manière générale et selon encore une alternative de réalisation, l’étape d’amplification pourrait être mise en œuvre de sorte à obtenir un complexe secondaire C2 comportant plusieurs sondes d’amplification 3 en cascade / en série (par exemple deux ou trois sondes d’amplification 3), avant l’ajout du traceur 21. In general and according to yet another alternative embodiment, the amplification step could be implemented so as to obtain a secondary complex C2 comprising several amplification probes 3 in cascade / in series (for example two or three probes d. amplification 3), before adding the tracer 21.
Ces sondes d’amplification 3 peuvent encore être reliées par le biais desdites étiquettes d’affinité. These amplification probes 3 can still be linked through said affinity tags.
Le complexe secondaire C2 comprend alors avantageusement au moins deux sondes d’amplification 3 reliées, entre elles, par au moins une seconde étiquette d’affinité 5. Une telle approche permettrait de démultiplier l’effet d’amplification. The secondary complex C2 then advantageously comprises at least two amplification probes 3 linked together by at least one second affinity tag 5. Such an approach would make it possible to multiply the amplification effect.
De manière générale, tout au long de l’étape de révélation B, les conditions et paramètres (temps d’incubation, rinçage, etc.) sont ajustés de sorte à assurer la formation des différents complexes attendus. In general, throughout revelation step B, the conditions and parameters (incubation time, rinsing, etc.) are adjusted so as to ensure the formation of the various expected complexes.
Pour être complet, l’étape de révélation B comprend encore avantageusement une phase finale de lecture au cours de laquelle : To be complete, the revelation step B also advantageously includes a final reading phase during which:
- l’analyte T est détecté (présence de l’analyte T dans l’échantillon E), lorsqu’un signal est détecté du fait de la formation du complexe secondaire C2 comprenant le traceur 21 , ou - the analyte T is detected (presence of the analyte T in the sample E), when a signal is detected due to the formation of the secondary complex C2 comprising the tracer 21, or
- l’analyte T n’est pas détecté (absence de l’analyte T dans l’échantillon E), lorsque le signal n’est pas détecté du fait de l’absence de formation du complexe secondaire C2 et de l’élimination du traceur 21. - the analyte T is not detected (absence of the analyte T in the sample E), when the signal is not detected due to the absence of formation of the secondary complex C2 and the elimination of the plotter 21.
Système de réactifs Reagent system
La présente invention concerne encore le système de réactifs, ou kit, pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention. The present invention also relates to the reagent system, or kit, for implementing the method according to the invention.
Un tel système de réactifs comprend avantageusement : Such a reagent system advantageously comprises:
- ladite au moins une sonde primaire 1, laquelle au moins une sonde primaire 1 est un conjugué comprenant, d’une part, le site de liaison 11 apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte T et, d’autre part, la première étiquette d’affinité 12, et - said at least one primary probe 1, which at least one primary probe 1 is a conjugate comprising, on the one hand, the binding site 11 capable of binding specifically with said analyte T and, on the other hand, the first label affinity 12, and
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe C2 partant de la sonde primaire 1 de la sonde primaire 1, lequel au moins un réactif de révélation comprend : - at least one revelation reagent capable of forming a C2 complex starting from the primary probe 1 of the primary probe 1, which at least one revelation reagent comprises:
- au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité 321, et - at least one amplification probe 3, of the core 31 type - envelope 32, in which said envelope 32 comprises several molecules with an affinity tag 321, and
- un traceur 21 destiné à convertir le complexe C2 en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur 21 étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3, de sorte que, dans ledit complexe C2, certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité 321 de ladite au moins une sonde d’amplification 3 sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21. - a tracer 21 intended to convert the complex C2 into a visible and / or measurable signal, said tracer 21 being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 , so that, in said complex C2, at least some of the molecules of the affinity tag 321 of said at least one amplification probe 3 are linked to at least one molecule of said tracer 21.
Selon un mode de réalisation préféré, les réactifs de révélation comprennent : According to a preferred embodiment, the revelation reagents comprise:
- ladite seconde étiquette d’affinité 5 apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité 12, au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité 5 se présentant sous la forme de ladite sonde secondaire 2 consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité 5 et, d’autre part, le traceur 21, et - ladite au moins une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité 12. said second affinity tag 5 capable of binding specifically with said first affinity tag 12, at least part of said second affinity tag 5 being in the form of said secondary probe 2 consisting of a conjugate comprising, on the one hand, said second affinity tag 5 and, on the other hand, the tracer 21, and - said at least one amplification probe 3, of the core 31 type - envelope 32, in which said envelope 32 comprises several molecules of said first affinity tag 12.
Tel que développé dessus, un tel système de réactifs est apte à former, en présence dudit analyte T, un complexe C2 selon l’invention qui comprend analyte T : sonde primaire 1 : seconde étiquette d’affinité 5 : sonde d’amplification 3 : sondes secondaires 2. As developed above, such a system of reagents is capable of forming, in the presence of said analyte T, a C2 complex according to the invention which comprises analyte T: primary probe 1: second affinity tag 5: amplification probe 3: secondary probes 2.
La sonde d’amplification 3 de ce complexe C2 porte alors avantageusement plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire 2. Amplification probe 3 of this C2 complex then advantageously carries several molecules of said at least one secondary probe 2.
Selon un mode de réalisation avantageux précité, la première étiquette d’affinité 12 est choisie parmi la biotine ou homologue (par exemple une nanoparticule de silice portant des molécules de biotine, dit encore « biotin-Si-NP » ou « biotin-nanoparticle » dans les exemples). Et la seconde étiquette d’affinité 5 est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine. According to an above-mentioned advantageous embodiment, the first affinity tag 12 is chosen from biotin or homolog (for example a silica nanoparticle carrying biotin molecules, also called “biotin-Si-NP” or “biotin-nanoparticle” in the examples). And the second affinity tag 5 is selected from streptavidin or homolog, eg, avidin, NeutrAvidin or Captavidin.
De manière alternative, un tel système de réactifs comprend avantageusement : Alternatively, such a reagent system advantageously comprises:
- ladite au moins une sonde primaire 1, laquelle au moins une sonde primaire 1 est un conjugué comprenant, d’une part, le site de liaison 11 apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte T et, d’autre part, la première étiquette d’affinité 12, et - said at least one primary probe 1, which at least one primary probe 1 is a conjugate comprising, on the one hand, the binding site 11 capable of binding specifically with said analyte T and, on the other hand, the first label affinity 12, and
- une sonde d’amplification 3, du type noyau 31 - enveloppe 32, dans laquelle ladite enveloppe 32 comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité 321 dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur 21. - an amplification probe 3, of the core 31 - envelope 32 type, in which said envelope 32 comprises several molecules of said second affinity tag 321, at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer 21.
Lors de cette étape de révélation, la sonde d’amplification 3 mise en œuvre permet l’obtention, partant de la sonde primaire 1 du complexe primaire C1, un complexe secondaire C2 comprenant analyte T : sonde primaire 1 : sonde d’amplification 3. During this revelation step, the amplification probe 3 used makes it possible to obtain, starting from the primary probe 1 of the primary complex C1, a secondary complex C2 comprising analyte T: primary probe 1: amplification probe 3.
Dans ce complexe secondaire C2 selon l’invention, une pluralité de molécules de traceur 21 est liée à une molécule d’analyte T. In this secondary C2 complex according to the invention, a plurality of tracer molecules 21 are linked to an analyte T molecule.
Selon un mode de réalisation avantageux précité, la première étiquette d’affinité 12 est choisie parmi la biotine ou homologue. Et la seconde étiquette d’affinité 321 est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine. According to an above-mentioned advantageous embodiment, the first affinity tag 12 is chosen from biotin or homolog. And the second affinity tag 321 is selected from streptavidin or homolog, eg, avidin, NeutrAvidin or Captavidin.
De manière générale, le système de détection selon l’invention peut tout-à-fait être adapté à l’analyte T recherché. In general, the detection system according to the invention can very well be adapted to the desired T analyte.
Par exemple, le système de détection est avantageusement sous forme dot blot pour la recherche d’un analyte du genre acide nucléique (voir figure 6). For example, the detection system is advantageously in dot blot form for the search for an analyte of the nucleic acid type (see Figure 6).
Dans ce cas, le site de liaison 11 de la sonde primaire 1 est avantageusement une sonde ADN complémentaire, de préférence couplé à la biotine. Le système de détection est avantageusement sous forme ELISA ou MELISA pour la recherche d’un analyte du genre antigène ou haptène (voir figures 1 et 4). In this case, the binding site 11 of the primary probe 1 is advantageously a complementary DNA probe, preferably coupled to biotin. The detection system is advantageously in ELISA or MELISA form for the search for an analyte of the antigen or hapten type (see FIGS. 1 and 4).
Dans ce cas, le site de liaison 11 de la sonde primaire 1 est avantageusement un anticorps spécifique de l'analyte, de préférence couplé à la biotine. In this case, the binding site 11 of the primary probe 1 is advantageously an antibody specific for the analyte, preferably coupled to biotin.
Pour une technique MELISA, le système comprend encore avantageusement une sonde de capture 6 précitée, portée par exemple par une bille magnétique B. For a MELISA technique, the system also advantageously comprises a above-mentioned capture probe 6, carried for example by a magnetic ball B.
Bien entendu, diverses autres modifications peuvent être apportées à l’invention dans le cadre des revendications annexées. Of course, various other modifications can be made to the invention within the scope of the appended claims.
Exemples Examples
1. Exemple 1 : Procédé de fabrication d’une sonde d’amplification 1. Example 1: Manufacturing process of an amplification probe
1.1. Matériel et Méthode 1.1. Material and method
Des Si-NP (nanoparticules de silice) ont été fonctionnalisées à l’aide d’une technologie innovante de synthèse en phase solide qui permet la fonctionnalisation de particules de taille nanométrique avec des fragments d’DNA, comme rapporté précédemment (Bonnet et al, Analyst 2018, Issue 10, 2018; De Crozals et al, RSC Advances, 2012, 2, 11858-11866). Si-NPs (silica nanoparticles) have been functionalized using an innovative solid-phase synthesis technology that allows the functionalization of nanometric-sized particles with DNA fragments, as previously reported (Bonnet et al, Analyst 2018, Issue 10, 2018; De Crozals et al, RSC Advances, 2012, 2, 11858-11866).
En bref, l’immobilisation des nanoparticules sur du verre à porosité contrôlée (CPG, Controlled Pore Glass) permet une fonctionnalisation très élevée avec un lieur à base d’oligonucléotide modifié. Le lieur (séquence: dT10-PEG2-dT10) a été synthétisé en utilisant un synthétiseur d’ARN/ADN Applied Biosystems 394 (Applied Biosystems). In short, immobilization of nanoparticles on Controlled Pore Glass (CPG) allows very high functionalization with a modified oligonucleotide linker. The linker (sequence: dT10-PEG2-dT10) was synthesized using an Applied Biosystems 394 RNA / DNA synthesizer (Applied Biosystems).
Après la greffe des nanoparticules sur le support de CPG, elles ont été fonctionnalisées par synthèse automatisée en utilisant la chimie des phosphoramidites. After the grafting of the nanoparticles on the CPG support, they were functionalized by automated synthesis using the chemistry of phosphoramidites.
Premièrement, le lieur, qui permet une meilleure accessibilité des fonctions d’intérêt, a été synthétisé. First, the linker, which allows better accessibility of the functions of interest, has been synthesized.
Deuxièmement, le groupe biotine a été incorporé. Second, the biotin group has been incorporated.
Nous avons contrôlé l’incorporation de biotine pour atteindre un rendement de couplage de 10%. Pour cela, on a utilisé des solutions diluées de biotine phosphoramidite (10 mM) et de tétrazole dans l’acétonitrile (45 mM) et on a réduit le temps de couplage à 10 s. L’incorporation de biotine a été contrôlée à 498 nm à l’aide de la quantification du diméthoxytrityle par un spectrophotomètre UV-visible. We controlled the incorporation of biotin to achieve a coupling efficiency of 10%. For this, dilute solutions of biotin phosphoramidite (10 mM) and tetrazole in acetonitrile (45 mM) were used and the coupling time was reduced to 10 s. Biotin incorporation was monitored at 498 nm using quantitation of dimethoxytrityl by a UV-visible spectrophotometer.
Troisièmement, les biotine-Si-NP ont été libérées du CPG par incubation du support dans 1mL de DBU à 0,1% (m/v) dans un mélange eau-acétonitrile 1/1 (v/v). La solution de DBU a été agitée dans un thermomélangeur à 22°C pendant 1 heure avant d’être récupérée. Third, the biotin-Si-NP were released from the CPG by incubating the support in 1mL of 0.1% (w / v) DBU in a 1/1 (v / v) water-acetonitrile mixture. The DBU solution was stirred in a thermomixer at 22 ° C for 1 hour before being collected.
On a ajouté toutes les heures une solution fraîche de DBU à la suspension de CPG. La cinétique de libération a été suivie en quantifiant la concentration en N P (nanoparticules) de chaque solution de DBU par une mesure de l’U V-visible à 560 nm. Les nanoparticules libérées ont été lavées avec de l’eau milli-Q (1x 4mL puis 3x2 mL) et concentrées sur un filtre 30K Amicon Ultra (5000g, 10 min). Enfin, la quantité de brins dT10-PEG2-dT10-10% Biotine par NP a été estimée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible Varian Cary 100 Bio (Agilent Technologies) en utilisant une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique. A fresh solution of DBU was added to the CPG suspension every hour. The release kinetics were followed by quantifying the concentration of NP (nanoparticles) in each DBU solution by measuring the U V-visible at 560 nm. The released nanoparticles were washed with milli-Q water (1x 4mL then 3x2 mL) and concentrated on a 30K Amicon Ultra filter (5000g, 10 min). Finally, the amount of dT10-PEG2-dT10-10% Biotin strands per NP was estimated using a Varian Cary 100 Bio UV-visible spectrophotometer (Agilent Technologies) using a quartz cuvette with 1 cm optical path.
Les nanoparticules ont été libérées du CPG en faisant incuber le support dans 1mL d’une solution à 0,1% (m/v) de DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène) dans un mélange eau- acétonitrile 1/1 (v/v). La solution de DBU a été agitée dans un thermomélangeur à 22°C pendant 1 heure avant d’être récupérée. On a ajouté toutes les heures une solution fraîche de DBU à la suspension de CPG. La cinétique de libération a été suivie en quantifiant la concentration en nanoparticules de chaque solution de DBU par une mesure de l’UV-visible à 560 nm. Les nanoparticules libérées ont été lavées avec de l’eau (1x 4mL puis 3x2 mL) et concentrées sur un filtre 30K Amicon Ultra (5000g, 10 min). The nanoparticles were released from the CPG by incubating the support in 1mL of a 0.1% (w / v) solution of DBU (1,8-Diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene) in a mixture. water- acetonitrile 1/1 (v / v). The DBU solution was stirred in a thermomixer at 22 ° C for 1 hour before being collected. A fresh solution of DBU was added to the CPG suspension every hour. The release kinetics were followed by quantifying the nanoparticle concentration of each DBU solution by measuring the UV-visible at 560 nm. The released nanoparticles were washed with water (1x 4mL then 3x2 mL) and concentrated on a 30K Amicon Ultra filter (5000g, 10 min).
La quantité de brins par NP a été estimée au moyen d’un spectrophotomètre UV-visible Varian Cary 100 Bio (Agilent Technologies) en utilisant une cuve en quartz de 1 cm de trajet optique. La quantité de lieur greffé sur les nanoparticules a été quantifiée en mesurant l’absorbance dans l’eau (200pL) à 260 nm et 560 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque (Perkin Elmer). La concentration en nanoparticules a été estimée de la manière décrite précédemment par Bonnet et al. (Analyst 2018). Pour correspondre à cette estimation, nous avons établi un coefficient d’extinction molaire approximatif à 163200 M-1 cm-1 qui tient compte des epsilons des différentes parties de la séquence corrigés par leur rendement de couplage correspondant. The amount of strands per NP was estimated using a Varian Cary 100 Bio UV-visible spectrophotometer (Agilent Technologies) using a quartz cuvette with 1 cm optical path. The amount of linker grafted onto the nanoparticles was quantified by measuring the absorbance in water (200pL) at 260nm and 560nm using a microplate reader (Perkin Elmer). The concentration of nanoparticles was estimated as described previously by Bonnet et al. (Analyst 2018). To correspond to this estimate, we established an approximate molar extinction coefficient at 163,200 M-1 cm-1 which takes into account the epsilons of the different parts of the sequence corrected by their corresponding coupling efficiency.
Les NP fonctionnalisées ont été observées au microscope électronique à transmission (MET) en utilisant un appareil Philips CM120 fonctionnant à une tension d’accélération de 120kV (Centre Technologique des microstructures, Lyon). Les Si-NP ont été observées après dépôt de 5pL de solution diluée sur une grille de cuivre recouverte de Formvar-carbone et évaporation à sec. The functionalized NPs were observed under a transmission electron microscope (TEM) using a Philips CM120 device operating at an acceleration voltage of 120kV (Center Technologique des Microstructures, Lyon). The Si-NPs were observed after depositing 5 μl of dilute solution on a copper grid covered with Formvar-carbon and evaporation to dryness.
1.2. Résultats 1.2. Results
Les Biotine-Si-NP ont été préparées grâce à une technologie innovante de synthèse en phase solide qui a permis une fonctionnalisation très élevée (Crozals et al., RSC Adv. 2012, 2, 11858-11866). Un groupe hydroxyle a été fixé à la surface des Si-NP par silanisation comme rapporté précédemment (Farre et al., Langmuir, 2010; Bonnet et al, Analyst 2018). Les fonctions hydroxyle ont servi de support à la synthèse de lieur oligonucléotidique à la surface des N P. Dans l’étape finale, des groups biotine ont été greffés au lieur comme expliqué dans Matériel et Méthodes. Les observations au MET ont montré que la morphologie des N P restait stable durant la synthèse. Les biotine-Si-NP fonctionnalisées avaient une dimension moyenne de 50 ± 3 nm, telle qu’estimée à partir des images de MET. Selon les mesures d’absorbance, la quantité de lieur était d’environ 500 par NP. Par ailleurs, la quantification du diméthoxytrityle a établi le rendement de couplage de la biotine à 10%, ce qui a permis de quantifier la biotine à environ 50 par N P. Une distribution granulométrique relativement étroite des NP fonctionnalisées a été confirmée par des mesures de DLS. Les Si-NP formaient des solutions aqueuses monodispersées de particules ayant un diamètre hydrodynamique (RH) de 90 nm environ. La conjugaison de la biotine + groupements lieurs a décalé le RH à environ 120 nm. Cette augmentation est probablement liée à la couche d’hydratation autour des unités de biotine liées aux bras portant des groupes chargés négativement. Les solutions de biotine-Si-NP restaient stables à 4°C pendant au moins deux mois. Biotin-Si-NP were prepared using an innovative solid phase synthesis technology which allowed very high functionalization (Crozals et al., RSC Adv. 2012, 2, 11858-11866). A hydroxyl group was attached to the surface of Si-NPs by silanization as previously reported (Farre et al., Langmuir, 2010; Bonnet et al, Analyst 2018). The hydroxyl functions served as a support for the synthesis of an oligonucleotide linker on the surface of the NPs. In the final step, biotin groups were grafted to the linker as explained in Materials and Methods. MET observations showed that the NP morphology remained stable during synthesis. Functionalized biotin-Si-NP had an average size of 50 ± 3 nm, as estimated from TEM images. According to the absorbance measurements, the amount of linker was about 500 per NP. Furthermore, quantification of dimethoxytrityl established the coupling efficiency of biotin at 10%, which allowed biotin to be quantified at about 50 by N P. A relatively narrow particle size distribution of the functionalized NPs was confirmed by DLS measurements. The Si-NPs formed monodisperse aqueous solutions of particles having a hydrodynamic diameter (RH) of about 90 nm. The conjugation of biotin + linker groups shifted the RH to about 120 nm. This increase is probably related to the hydration layer around the biotin units bound to the arms bearing negatively charged groups. Biotin-Si-NP solutions were stable at 4 ° C for at least two months.
2. Exemple 2 : Stratégie de double reconnaissance pour une détection sensible du virus de la grippe A en utilisant des nanoparticules enrobées de biotine et des billes immunomagnétiques 2. Example 2: Double recognition strategy for sensitive detection of influenza A virus using nanoparticles coated with biotin and immunomagnetic beads
2.1 Matériel et Méthodes 2.1 Materials and Methods
2.1.1. Réactifs 2.1.1. Reagents
La sérumalbumine bovine (SAB), le sérum de Bradford, le réactif colorimétrique pour dosage ELISA TMB (3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine), le Tween 20, la HRP-Streptavidine, le tampon B de Dosage ELISA 5X/Diluant d’Echantillon et les produits chimiques de haute qualité ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). La solution saline tamponnée au phosphate (STP) 10x a été fournie par Dominique Dutscher (Brumath, France). Le chlorure de sodium a été acheté chez Laurylab (Brindas, France). Les tampons ont été préparés avec de l’eau déminéralisée et stérilisés par filtration 0,22pm. Bovine Serum Albumin (BSA), Bradford Serum, TMB ELISA Colorimetric Reagent (3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine), Tween 20, HRP-Streptavidin, 5X ELISA Assay Buffer B / Sample Thinner and high quality chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) was provided by Dominique Dutscher (Brumath, France). Sodium chloride was purchased from Laurylab (Brindas, France). The buffers were prepared with deionized water and sterilized by 0.22 µm filtration.
Les Dynabeads® M-280 Tosylactivated et DSB-XTM Biotin Protein Labelling Kit (D- 20655) proviennent respectivement de chez Invitrogen et Molecular Probes, (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les anticorps anti- NuP d’Influenza A (9G8) et (5D8) proviennent de chez Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz, CA, USA). Les nanoparticules de silice recouvertes de rhodamine ont été fournies par Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Les oligonucléotides ont été synthétisés en utilisant un synthétiseur d’ADN/ARN Applied Biosystems 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les synthons au phosphoramidite: Biotine-TEG-phosphoramidite (1-diméthoxytrityloxy-3-0-(N-biotinyl-3-aminopropyl)- triéthylèneglycolyl-glycéryl-2-0-(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite); Espaceur phosphoramidite 9 (9-0-diméthoxytrityl-triéthylèneglycol,1-[(2-cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)]- phosphoramidite); dT-CE phosphoramidite (5'-diméthoxytrityl-2'-désoxythymidine,3'-[(2- cyanoéthyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite) et tous les réactifs de synthèse ont été achetés chez Glen Research (Sterling, Virginie). The Dynabeads® M-280 Tosylactivated and DSB-XTM Biotin Protein Labeling Kit (D-20655) are respectively from Invitrogen and Molecular Probes (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Influenza A (9G8) and (5D8) anti-NuP antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz, CA, USA). The rhodamine coated silica nanoparticles were supplied by Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Oligonucleotides were synthesized using an Applied Biosystems 394 DNA / RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA). The phosphoramidite synthons: Biotin-TEG-phosphoramidite (1-dimethoxytrityloxy-3-0- (N-biotinyl-3-aminopropyl) - triethylene glycolyl-glyceryl-2-0- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) -phosphoramidite); Phosphoramidite spacer 9 (9-0-dimethoxytrityl-triethylene glycol, 1 - [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite); dT-CE phosphoramidite (5'-dimethoxytrityl-2'-deoxythymidine, 3 '- [(2 cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite) and all synthesis reagents were purchased from Glen Research (Sterling , Virginia).
2.1.2. Expression et production de nucléoprotéine 2.1.2. Nucleoprotein expression and production
Le gène de nucléoprotéine (NuP) de pleine longueur du virus de la grippe H1N1 (souche A/WSN/33) avec une étiquette 6-His à son extrémité C-terminale a été cloné dans le vecteur d’expression pET22 d’Escherichia coli (Novagen) et exprimé dans les cellules d’E. coli BL-21 Rosetta DE3 (Stratagene). Les cellules transformées ont été cultivées à 37°C dans 100 ml de milieu de Luria-Bertani contenant de l’ampicilline jusqu’à la phase exponentielle médiane, puis induites pendant 4 heures par addition d’isopropyl^-D-thiogalactopyranoside 1 mM à 37°C sous agitation. On a procédé à la purification de la NuP. En bref, après centrifugation, le culot bactérien a été remis en suspension dans un tampon de lyse (Tris 20 mM à pH 7,4 avec du NaCI (50 mM ou 300 mM), imidazole 5 mM, Triton à 1% et 1 mg/ml de lysozyme), soumis à des ultrasons et traité avec de la RNAse A à 0,15 mg/ml à 35 °C pendant 20 min en présence d’ions Mg2+ 10 mM. La protéine a été purifiée par chromatographie d’affinité en utilisant des billes magnétiques de Ni (PureProteome, Millipore), en suivant le mode opératoire recommandé par le fabricant. La NuP a ensuite été dialysée contre du tampon Tris (Tris 20 mM, NaCI 300 mM, pH 7,5). Après dialyse, la concentration en protéine a été déterminée en utilisant un coefficient d’extinction e de 56200 M 1 cm-1 à 280 nm. The full length nucleoprotein (NuP) gene of H1N1 influenza virus (strain A / WSN / 33) with a 6-His tag at its C-terminus was cloned into Escherichia coli expression vector pET22 (Novagen) and expressed in E. coli BL-21 Rosetta DE3 (Stratagene). Transformed cells were grown at 37 ° C in 100 ml of Luria-Bertani medium containing ampicillin up to the mid-exponential phase, then induced for 4 hours by addition of 1 mM isopropyl ^ -D-thiogalactopyranoside at 37 ° C. with stirring. NuP was purified. Briefly, after centrifugation, the bacterial pellet was resuspended in lysis buffer (20 mM Tris pH 7.4 with NaCl (50 mM or 300 mM), 5 mM imidazole, 1% Triton and 1 mg. / ml lysozyme), sonicated and treated with RNAse A at 0.15 mg / ml at 35 ° C for 20 min in the presence of 10 mM Mg 2+ ions. The protein was purified by affinity chromatography using magnetic Ni beads (PureProteome, Millipore), following the procedure recommended by the manufacturer. NuP was then dialyzed against Tris buffer (20mM Tris, 300mM NaCl, pH 7.5). After dialysis, the protein concentration was determined using an extinction coefficient e of 56200 M 1 cm -1 at 280 nm.
2.1.3. Souches virales 2.1.3. Viral strains
Le virus de la grippe A/WSN/33 (H1N1) a été obtenu par génétique inverse et amplifié sur des cellules MDCK. Les virus ont été titrés par la méthode des plages. Les virus purifiés ont été inactivés à la lumière UV pendant 38 min. L’efficacité d’inactivation a été vérifiée par une nouvelle infection des cellules MDCK. Des échantillons d’Influenza A/H1 inactivés ont été conservés à -80°C. De l’Influenza A/UDORN/72 (H3N2) a été propagé sur un œuf de poulet embryonnaire et appliqué à des cellules MDCK. Les virus ont été titrés par la méthode des plages. Les virus purifiés ont été inactivés en utilisant de l’éthylèneimine binaire (BEI) et conservés à -80 °C. The influenza A / WSN / 33 (H1N1) virus was obtained by reverse genetics and amplified on MDCK cells. Viruses were titrated by the plaque method. Purified viruses were inactivated by UV light for 38 min. The inactivation efficiency was verified by re-infection of MDCK cells. Inactivated influenza A / H1 samples were stored at -80 ° C. Influenza A / UDORN / 72 (H3N2) was spread on an embryonic chicken egg and applied to MDCK cells. Viruses were titrated by the plaque method. Purified viruses were inactivated using binary ethyleneimine (BEI) and stored at -80 ° C.
Le virus du syndrome dysgénésique respiratoire porcin (VSDRP) Flanders13 (13V09) utilisé dans cette étude a été gracieusement fourni par le Dr. Nicolas Bertho (INRA, France) et le Dr. Fanny Blanc (INRA, France). The Flanders13 (13V09) porcine respiratory reproductive syndrome virus (VSDRP) used in this study was kindly provided by Dr. Nicolas Bertho (INRA, France) and Dr. Fanny Blanc (INRA, France).
Avant l’inactivation, les concentrations virales ont été déterminées en termes d’infection des cellules MDCK. Les titres initiaux des virus étaient de 108 PFU/mL pour l’échantillon 1 de H1N1, 1,5 108 PFU/mL pour l’échantillon 2 de H1N1, 108 PFU/mL pour H2N3. Le virus VSDRP témoin a été titré à 107 PFU/mL. Prior to inactivation, viral concentrations were determined in terms of MDCK cell infection. The initial virus titers were 10 8 PFU / mL for H1N1 sample 1, 1.5 10 8 PFU / mL for H1N1 sample 2, 10 8 PFU / mL for H2N3. Control VSDRP virus was titrated at 10 7 PFU / mL.
2.1.4. Fonctionnalisation des billes magnétiques 2.1.4. Functionalization of magnetic balls
Des billes magnétiques activées au tosyle de 2,8 pm de diamètre (Dynabeads™ M-280, Invitrogen, US) ont été recouvertes de 10 pg d’anticorps anti- NuP d’Influenza A (9G8) par mg de billes pendant 1 heure sous agitation modérée, selon le protocole recommandé par le fabricant. Ensuite, après 15 minutes de passivation dans du tampon à la SAB (phosphate de sodium 0,1M, chlorure de sodium 150mM, SAB à 0,5% (p/v), pH 7,6), les billes magnétiques ont été lavées trois fois dans du phosphate de sodium 0,01 M, du chlorure de sodium 150 mM, de la SAB à 0,1% (p/v), pH 7,4 et stockées à 4°C jusqu’aux essais. 2.8 µm diameter tosyl activated magnetic beads (Dynabeads ™ M-280, Invitrogen, US) were coated with 10 µg of anti-NuP Influenza A antibody (9G8) per mg of beads for 1 hour. with moderate agitation, according to the protocol recommended by the manufacturer. Then, after 15 minutes of passivation in BSA buffer (0.1M sodium phosphate, 150mM sodium chloride, 0.5% (w / v) BSA, pH 7.6), the magnetic beads were washed. three times in 0.01 M sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, 0.1% (w / v) BSA, pH 7.4 and stored at 4 ° C until testing.
2.1.5. Protocole MELISA pour la détection de virus désactivés 1.106 billes magnétiques préalablement recouvertes d’anticorps anti-NuP d’Influenza A (9G8) ont été tout d’abord lavées trois fois avec du tampon STP. Des solutions de virus désactivés (STP, 10% de salive) ont été mises à incuber avec les billes sous agitation modérée à température ambiante pendant 1 heure. Les billes ont été concentrées au moyen d’un aimant et lavées trois fois avec du Tampon de lavage 0.1. On a ajouté à la suspension, de l’anticorps anti-biotine conjugué (0,5 pg/ml) dans un Tampon de capture (STP, tween 0,1%, SAB 0,1%) avant une agitation modérée pendant 1 heure. Après trois étapes de lavage, on a ajouté une solution de révélation de Streptavidine/HRP (100pL, 1pg/mL) et on a agité le mélange à température ambiante pendant 30 minutes à 1000rpm dans un thermomélangeur. Les billes ont été lavées trois fois avec le Tampon de lavage 0.1 avant l’ajout de 100pL de TMB et une incubation dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Enfin, on a dilué le surnageant avec 100 pL d’acide sulfurique 2M et on a lu l’absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques (Perkin Elmer). A450nm - Assonm a donné la bonne valeur après suppression du signal de fond. 2.1.5. MELISA protocol for the detection of disabled viruses 1.10 6 magnetic beads previously coated with anti-NuP antibodies for Influenza A (9G8) were first of all washed three times with PBS buffer. Solutions of deactivated virus (PBS, 10% saliva) were incubated with the beads with moderate agitation at room temperature for 1 hour. The beads were concentrated by means of a magnet and washed three times with Wash Buffer 0.1. Conjugated anti-biotin antibody (0.5 µg / ml) in Capture Buffer (PBS, 0.1% tween, 0.1% BSA) was added to the suspension before gentle stirring for 1 hour. . After three washing steps, Streptavidin / HRP developing solution (100 µL, 1 µg / mL) was added and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes at 1000rpm in a thermomixer. The beads were washed three times with Washing Buffer 0.1 before adding 100 µL of TMB and incubating in the dark for 30 minutes at room temperature. Finally, the supernatant was diluted with 100 µl of 2M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was read in a microplate reader (Perkin Elmer). A450 nm - Asso nm gave the correct value after removing the background signal.
Pour le protocole MELISA utilisant une amplification de biotine-NP, le même protocole a été utilisé pour la capture d’antigène. Ensuite, les deux étapes suivantes ont été ajoutées pour la détection: des biotine-NP (1.1011 NP/mL dans STP, Tween 20 à 0,1% (v/v)) ont été ajoutées à la suspension de billes magnétiques avant une incubation pendant 30 minutes à 1000 rpm dans un thermomélangeur. Après trois étapes de lavage, on a ajouté une solution de révélation de streptavidine/HRP (100pL, 1pg/mL) avant l’incubation de la suspension à température ambiante pendant 30 minutes à 1000 rpm dans un thermomélangeur. Les billes ont été lavées trois fois avec le Tampon de lavage 0.1 avant l’ajout de 100pL de TMB et une incubation dans l’obscurité pendant 5 minutes à température ambiante. Enfin, on a dilué le surnageant avec 100 pL d’acide sulfurique 2M et on a lu l’absorbance à 450 nm dans un lecteur de microplaques (Perkin Elmer). A450nm - Assonm a donné la bonne valeur après suppression du signal de fond. For the MELISA protocol using biotin-NP amplification, the same protocol was used for antigen capture. Then, the following two steps were added for the detection: biotin-NP (1.10 11 NP / mL in PBS, Tween 20 at 0.1% (v / v)) were added to the suspension of magnetic beads before a incubation for 30 minutes at 1000 rpm in a thermomixer. After three washing steps, a streptavidin / HRP developing solution (100 µL, 1 µg / mL) was added before the suspension was incubated at room temperature for 30 minutes at 1000 rpm in a thermomixer. The beads were washed three times with Washing Buffer 0.1 before adding 100 µL of TMB and incubating in the dark for 5 minutes at room temperature. Finally, the supernatant was diluted with 100 µl of 2M sulfuric acid and the absorbance at 450 nm was read in a microplate reader (Perkin Elmer). A450 nm - Asso nm gave the correct value after removing the background signal.
2.2. Résultats et discussion 2.2. Results and discussion
2.2.1. MELISA aux Biotine-NP pour une détection sensible du virus de la grippe A2.2.1. MELISA with Biotin-NP for sensitive detection of influenza A virus
Pour améliorer les performances du dosage MELISA et pousser les limites de détection encore plus loin, nous avons développé les biotine-NP pour amplifier le signal positif dans l’étape de détection. To improve the performance of the MELISA assay and push the detection limits even further, we have developed biotin-NPs to amplify the positive signal in the detection step.
Des nanoparticules de silice de 50 nm de diamètre ont été fonctionnalisées en surface avec un brin oligonucléotidique portant un groupe biotine à son extrémité. Silica nanoparticles 50 nm in diameter were surface functionalized with an oligonucleotide strand carrying a biotin group at its end.
Les N P ont d’abord été immobilisées sur un support de verre à porosité contrôlée (CPG). Le support Nano-on-Micro (NOM) assemblé résultant a été caractérisé par MEB (Microscopie Electronique à Balayage). Ensuite, le matériau NOM a été utilisé dans un synthétiseur d’ADN/ARN pour réaliser la fonctionnalisation des NP via chimie des phosphoramidites. Cette stratégie a permis d’obtenir des nanoparticules hautement fonctionnalisées. Un espaceur oligonucléotidique (séquence ODN: dTio-PEG2-dTio) a été synthétisé sur les NP afin d’éloigner les biotines de la surface des NP. Environ 500 ODN par NP ont été estimées en mesurant l’absorbance UV à 260 nm et 560 nm et en quantifiant le ratio ODN par N P dans la suspension, un protocole décrit par Bonnet et al. (Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: Application to the sensitive détection of bacteria in human platelet concentrâtes. Analyst. 143(10), 2293-2303 (2018)). Ensuite, le groupe biotine a été incorporé. Nous avons décidé de contrôler le programme de synthèse sur l’appareil pour obtenir un rendement de couplage de 10% pour l’incorporation de biotine. En utilisant cette stratégie, nous avons incorporé environ 50 biotines par N P. Cette quantité a été optimisée pour obtenir une liaison efficace du groupe biotine lors du dosage MELISA. Après la libération des NP à partir du support de CPG par traitement au DBU et lavage à l’eau, le nombre de NP dans la suspension obtenue a été estimé à partir de la courbe de quantification des N P fluorescentes. La structure des N P après la libération a été contrôlée par MET. Cette observation a montré que la morphologie des N P restait stable durant la synthèse. The NPs were first immobilized on a controlled porosity glass support (CPG). The resulting assembled Nano-on-Micro (NOM) carrier was characterized by SEM (Scanning Electron Microscopy). Next, the NOM material was used in a DNA / RNA synthesizer to perform NP functionalization via phosphoramidite chemistry. This strategy has made it possible to obtain highly functionalized nanoparticles. A spacer oligonucleotide (ODN sequence: dTio-PEG2-dTio) was synthesized on the NPs in order to remove the biotins from the surface of the NPs. About 500 ODN per NP were estimated by measuring UV absorbance at 260 nm and 560 nm and quantifying the ODN per NP ratio in the suspension, a protocol described by Bonnet et al. (Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: Application to the sensitive detection of bacteria in human platelet concentrates. Analyst. 143 (10), 2293-2303 (2018)). Then the biotin group was incorporated. We decided to control the synthesis program on the device to obtain a coupling efficiency of 10% for the incorporation of biotin. Using this strategy, we incorporated about 50 biotins per N P. This amount was optimized to achieve efficient binding of the biotin group during the MELISA assay. After the release of the NPs from the CPG support by treatment with DBU and washing with water, the number of NPs in the suspension obtained was estimated from the fluorescent NP quantification curve. The structure of NPs after release was checked by TEM. This observation showed that the morphology of the NPs remained stable during the synthesis.
Nous avons également confirmé l’accessibilité et la réactivité des biotines greffées à la surface des NP par RPS (résonance plasmonique de surface), via l’interaction biotine/avidine. Après immobilisation de l’avidine sur une puce à RPS recouverte d’une multicouche de polyélectrolyte, nous avons réussi à observer la capture spécifique des nanoparticules biotinylées. We also confirmed the accessibility and reactivity of biotins grafted to the surface of NPs by RPS (surface plasmon resonance), via the biotin / avidin interaction. After immobilization of avidin on an RPS chip coated with a multilayer polyelectrolyte, we were able to observe the specific capture of the biotinylated nanoparticles.
2.2.2. Détection du virus de la grippe A en milieu clinique 2.2.2. Detection of influenza A virus in clinical settings
Le dosage à base de biotine-nanoparticules et de billes immunomagnétiques (Biot-NP MELISA) a été étudié pour la détection des virus H1N1 (échantillons 1 et 2), H3N2 et VSDRP (Fig. 8). The assay based on biotin-nanoparticles and immunomagnetic beads (Biot-NP MELISA) was studied for the detection of the H1N1 viruses (samples 1 and 2), H3N2 and VSDRP (Fig. 8).
Pour reproduire les échantillons cliniques, les solutions virales ont été diluées dans du tampon de lyse supplémenté avec de la salive à 10%. Après la partie sandwich de l’essai avec les virus, l’étape de détection a été réalisée en utilisant des nanoparticules hautement biotinylées pour augmenter l’efficacité d’ancrage de la streptavidine-HRP. Cette stratégie a permis une augmentation du signal dans le cas d’une réponse positive (Fig. 8). Cette sensibilité améliorée prouvait l’efficacité de la stratégie d’amplification. To reproduce the clinical samples, the viral solutions were diluted in lysis buffer supplemented with 10% saliva. After the sandwich portion of the virus assay, the detection step was performed using highly biotinylated nanoparticles to increase the anchoring efficiency of streptavidin-HRP. This strategy allowed an increase in the signal in the event of a positive response (Fig. 8). This improved sensitivity proved the effectiveness of the amplification strategy.
Des limites de détection de 3x103 PFU/mL, 6x104 PFU/mL et 4x104 PFU/mL ont été respectivement calculées pour l’échantillon 1 et l’échantillon 2 de H1N1, et H3N2. Detection limits of 3x10 3 PFU / mL, 6x10 4 PFU / mL and 4x10 4 PFU / mL were calculated for sample 1 and sample 2 of H1N1, and H3N2, respectively.
L’utilisation des biotine-NP lors de l’étape de détection améliorait la sensibilité du dosage MELISA d’un facteur de 65 à 75. The use of biotin-NP in the detection step improved the sensitivity of the MELISA assay by a factor of 65 to 75.
Des limites de détection en dessous de 104 PFU/mL et de 105 PFU/mL ont été respectivement obtenues pour les souches H1N1 et H3N2, en présence de 10% de salive pour reproduire un contexte clinique. Une bonne sélectivité des souches a été également confirmée par les réponses négatives observées à différentes concentrations de VSDRP (Fig. 8). 3. Exemple 3 : Détection hautement sensible de Campylobacter spp. dans des échantillons de volailles en utilisant un biocapteur à ADN de Dot Blot amélioré par des nanoparticules de silice Detection limits below 10 4 PFU / mL and 10 5 PFU / mL were respectively obtained for the H1N1 and H3N2 strains, in the presence of 10% saliva to reproduce a clinical context. A good selectivity of the strains was also confirmed by the negative responses observed at different concentrations of VSDRP (Fig. 8). 3. Example 3: Highly sensitive detection of Campylobacter spp. in poultry samples using a Dot Blot DNA biosensor enhanced with silica nanoparticles
Nous avons couplé des nanoparticules de silice fonctionnalisées (Si-NP) à un test dot blot (buvardage en taches) d’ADN sur papier pour permettre une détection sensible d’acide nucléique de Campylobacter sans étape de préamplification. We coupled functionalized silica nanoparticles (Si-NP) to a DNA dot blot test on paper to allow sensitive detection of Campylobacter nucleic acid without a pre-amplification step.
On a utilisé dans le test une sonde d’ADN hautement spécifique qui reconnaît le gène de l’ARNr 16S des Campylobacter spp. les plus répandus provoquant des infections (C. jejuni , C. edi, C. lari, et C. upsaliensis). On a employé des Si-NP décorées de biotine (biotine-Si-NP) pour améliorer la lecture du signal chimioluminescent de streptavidine - HRP. Une amélioration de l’intensité du signal par comparaison avec le test classique a été obtenue grâce à l’effet conjugué des biotine-Si-NP par rapport à la biotine seule. Nous avons démontré que le nouveau test dot blot couplé aux biotine-Si-NP a réussi à détecter le Campylobacter en utilisant de l’ADN extrait de carcasse de poulet contaminée sans avoir besoin de passer par une étape de PCR. Notre étude illustre l’invention selon laquelle l’effet conjugué des biotine-Si-NP pourrait devenir un moyen efficace pour augmenter la sensibilité de la technique rentable, spécifique et facile à mettre en œuvre de dot blot. A highly specific DNA probe which recognizes the 16S rRNA gene of Campylobacter spp. the most common causing infections (C. jejuni, C. edi, C. lari, and C. upsaliensis). Biotin-decorated Si-NPs (biotin-Si-NP) were used to improve the readout of the streptavidin chemiluminescent signal - HRP. An improvement in signal intensity compared to the conventional test was obtained due to the conjugate effect of biotin-Si-NP compared to biotin alone. We have demonstrated that the new biotin-Si-NP coupled dot blot test successfully detected Campylobacter using DNA extracted from contaminated chicken carcasses without the need for a PCR step. Our study illustrates the invention that the conjugate effect of biotin-Si-NP could become an effective way to increase the sensitivity of the cost-effective, specific and easy to perform dot blot technique.
3.1. Matériel et Méthodes 3.1. Material and methods
3.1.1. Matériels et réactifs 3.1.1. Materials and reagents
La Streptavidine-HRP, le Proclin, l’acétonitrile, le 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène (DBU), le verre à porosité contrôlée (120-200 Mesh, CPG-3000 Â)...ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Les NP de silice à la rhodamine B fluorescente (Si-NP, diamètre~50 nm) ont été fournies par Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Les synthons d’ADN au phosphoramidite et tous les réactifs de synthèse d’ADN ont été achetés chez Glen Research (Sterling, Virginie, USA). La solution saline tamponnée au phosphate (STP) a été achetée auprès de Dominique Dutscher (Brumath, France). Streptavidin-HRP, Proclin, acetonitrile, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU), controlled porosity glass (120-200 Mesh, CPG-3000 Å). .were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Fluorescent rhodamine B silica NPs (Si-NP, diameter ~ 50 nm) were supplied by Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Phosphoramidite DNA building blocks and all DNA synthesis reagents were purchased from Glen Research (Sterling, Virginia, USA). Phosphate buffered saline (PBS) was purchased from Dominique Dutscher (Brumath, France).
Tous les milieux bactériens et les suppléments utilisés provenaient de chez Oxoid (Italie), à l’exception de la gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (Violet red Bile glucose (VRBG)) et du milieu Coli ID qui ont été achetés chez Biomérieux (Italie). All the bacterial media and supplements used were from Oxoid (Italy), with the exception of Crystal Violet and Neutral Red Bile Glucose Agar (Violet red Bile glucose (VRBG)) and Coli ID medium which were purchased. at Biomérieux (Italy).
Le Triton, le SDS, le NaCI, la base Trizma, le phénol, le chloroforme, la peptone bactériologique et l’alcool isoamylique ont été achetés chez SIGMA (Milan, Italie). Un oligonucléotide 36-mère associé au gène 16S codant pour l’ARN ribosomique deTriton, SDS, NaCl, Trizma base, phenol, chloroform, bacteriological peptone and isoamyl alcohol were purchased from SIGMA (Milan, Italy). A 36-mer oligonucleotide associated with the 16S gene encoding the ribosomal RNA of
Campylobacter de C. jejuni, C. edi, C. lari, C. upsaliensis et C. fétus (localisation des bases: 72- 108) a été utilisé comme élément de reconnaissance (sonde appelée CampyP3). CampyP3 a été marquée à son extrémité 5’ avec de la biotine pour la mise au point d’un dosage dot blot chimioluminescent. La sonde a été testée à l’aide de l’OligoAnalyzer3.1Campylobacter from C. jejuni, C. edi, C. lari, C. upsaliensis and C. fétus (base localization: 72-108) was used as a recognition element (probe called CampyP3). CampyP3 has been labeled at its 5 ′ end with biotin for the development of a chemiluminescent dot blot assay. The probe was tested using the OligoAnalyzer3.1
(https://eu.idtdna.com/calc/analyzer), du logiciel Amplifix, Fast PCR 6.1 et Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Une séquence d’ADN simple brin complémentaire à la sonde CampyP3, appelée CP3, et deux séquences d’ADN simples brins non spécifiques, appelées respectivement PR et PE, ont été conçues pour étudier la sélectivité du capteur par le biais de leur hybridation avec la sonde. PR a été conçue par mésappariement de positions d’acides nucléiques de la séquence CP3, tandis que PE correspondait à la séquence de E. coli qui présente quelques similarités avec Campylobacter. (https://eu.idtdna.com/calc/analyzer), Amplifix software, Fast PCR 6.1 and Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). A single-stranded DNA sequence complementary to the CampyP3 probe, called CP3, and two nonspecific single-stranded DNA sequences, called PR and PE, respectively, were designed to study the selectivity of the sensor through their hybridization with the probe. PR was designed by mismatching nucleic acid positions of the CP3 sequence, while PE corresponded to the E. coli sequence which shows some similarities to Campylobacter.
3.1.2. Souches bactériennes 3.1.2. Bacterial strains
Les souches de Campylobacter ont été cultivées dans des conditions microaérophiles (5% d’C>2, 10 % de CO2 et 80% de N2) dans des jarres anaérobies de gaz. Campylobacter strains were grown under microaerophilic conditions (5% C> 2, 10% CO2 and 80% N2) in anaerobic gas jars.
Les conditions microaérophiles ont été générées à l’aide d’un Sachet Oxoid™ CampyGen™ 2,5 I (Oxoid, Italie) à 37°C pendant 48h. L’ADN a été extrait des isolats de Campylobacter à partir de boîtes de gélose Columbia au sang (les souches pures et les isolats proviennent tous deux d’échantillons de poulet) après coloration Gram et observations au microscope optique de la morphologie et de la mobilité des cellules (bouillon Brucella, Thermofisher, Italie) après des tests d’oxydase et de catalase. Microaerophilic conditions were generated using an Oxoid ™ CampyGen ™ 2.5 I Sachet (Oxoid, Italy) at 37 ° C for 48h. DNA was extracted from Campylobacter isolates from Columbia blood agar plates (both pure strains and isolates were from chicken samples) after Gram staining and light microscopic observations of morphology and mobility. cells (Brucella broth, Thermofisher, Italy) after oxidase and catalase tests.
Toutes les souches témoins négatifs ont été cultivées sur les milieux spécifiques dans des conditions optimales et soumises aux mêmes tests réalisés pour les Campylobacter avant les extractions d’ADN. All negative control strains were cultured on specific media under optimal conditions and subjected to the same tests performed for Campylobacter before DNA extractions.
3.1.3. Collecte d’échantillons alimentaires et isolement des bactéries 3.1.3. Collecting food samples and isolating bacteria
Cinq échantillons de poulet ont été achetés dans les supermarchés locaux en Italie. 10 g de peau de poulet ont été transférés dans un sac Stomacher, stérile par filtration, avec 40 mL d’eau peptonée salée (8 g/L de NaCI, 1 g/L de peptone bactériologique) et homogénéisés dans un Stomacher (PBI, Milan, Italie) pendant 90 s. Des fractions aliquotes de 0,1 mL ont été utilisées pour le comptage aérobie mésophile sur de la gélose tryptone soja à 30°C pendant 48h, et de la levure/moisissures sur 48h pour l’Agar Malt tétracycline à 30°C pendant 48h. Des fractions aliquotes de 1 mL ont été utilisées pour l’énumération des Enterobacteriaceae sur de la gélose VRBG (37°C pendant 24h), et des coliformes et de E. coli sur milieu Coli ID (37°C pendant 24h). La détection des Campylobacter a été réalisée selon la méthode classique ISO 10272-1:2006. Pour l’isolement sélectif des bactéries, 10 pi du bouillon Bolton ont été ensemencés par stries sur des boîtes de gélose Skirrow, et des boîtes mCCDA (charbon- céfopérazone-désoxycholate) et incubés à 41,5 °C pendant 48h, dans des conditions microaérophiles. Une colonie sélectionnée à partir de la gélose mCCDA et purifiée sur deux boîtes de gélose Columbia au sang a été obtenue par ensemencement par stries. Une boîte a été incubée à 41,5°C pendant 48h et l’autre à 25°C pendant 48h. La croissance sur Skirrow a servi de confirmation pour procéder aux étapes d’identification. Five chicken samples were purchased from local supermarkets in Italy. 10 g of chicken skin were transferred into a Stomacher bag, sterile by filtration, with 40 mL of salted peptone water (8 g / L of NaCl, 1 g / L of bacteriological peptone) and homogenized in a Stomacher (PBI, Milan, Italy) for 90 s. Aliquots of 0.1 mL were used for mesophilic aerobic counting on tryptone soy agar at 30 ° C for 48h, and yeast / mold over 48h for Agar Malt tetracycline at 30 ° C for 48h. 1 mL aliquots were used for the enumeration of Enterobacteriaceae on VRBG agar (37 ° C for 24 h), and coliforms and E. coli on Coli ID medium (37 ° C for 24 h). The detection of Campylobacter was carried out according to the standard ISO 10272-1: 2006 method. For the selective isolation of bacteria, 10 µl of Bolton broth were streaked onto Skirrow agar dishes, and mCCDA (charcoal-cefoperazone-deoxycholate) dishes and incubated at 41.5 ° C for 48h, under conditions microaerophiles. A colony selected from mCCDA agar and purified on two plates of Columbia blood agar was obtained by streak seeding. One dish was incubated at 41.5 ° C for 48h and the other at 25 ° C for 48h. The growth on Skirrow served as confirmation to proceed with the identification steps.
3.1.4. Extraction d’ADN à partir de cultures pures et de bouillons d’enrichissement L’ADN a été extrait à partir de souches pures et d’isolats d’échantillons de poulet selon Manzano et al (2015). 2 ml_ de bouillon d’enrichissement Bolton ont été récoltés par centrifugation à 13.000 g et à 4°C pendant 10 min. Les culots bactériens ont été lavés trois fois avec de la STP, avant de faire l’objet d’une extraction d’ADN comme rapporté précédemment (Manzano 2015). Les ADN extraits ont été réhydratés en utilisant 50 pL d’eau distillée stérile et traités avec de l’enzyme RNase à 37°C pendant 1 h. Enfin, l’ADN a été quantifié en utilisant Nanodrop™ 2000C (ThermoFisher Scientific, Italie). La concentration d’ADN a été ajustée à 100 ng/mL en utilisant de l’eau distillée stérile. 3.1.4. DNA extraction from pure cultures and enrichment broths DNA was extracted from pure strains and isolates of chicken samples according to Manzano et al (2015). 2 ml of Bolton Enrichment Broth was harvested by centrifugation at 13,000 g and 4 ° C for 10 min. The bacterial pellets were washed three times with PBS, before being subjected to DNA extraction as previously reported (Manzano 2015). The extracted DNAs were rehydrated using 50 µl of sterile distilled water and treated with RNase enzyme at 37 ° C for 1 h. Finally, DNA was quantified using Nanodrop ™ 2000C (ThermoFisher Scientific, Italy). The DNA concentration was adjusted to 100 ng / mL using sterile distilled water.
3.1.5. Immobilisation des échantillons et mode opératoire de détection 3.1.5. Immobilization of samples and detection procedure
Avant l’immobilisation, les échantillons d’ADN extrait ont été dénaturés à 95 °C pendant 10 min, placés immédiatement sur de la glace et déposés en fraction de 1 pl sur la membrane de nylon chargée positivement (Amersham Hybon™-XL, GE Healthcare, France). La membrane ayant reçu les dépôts a été exposée aux UV à 254 nm pendant 10 minutes pour fixer l’ADN. On a fait tremper la membrane dans du tampon d’hybridation préchauffé (Na2HP04 0,5 M, NaH2PÜ4 0,5 M, EDTA 10 mM, SDS à 1 %, pH 7,5) à 65°C pendant 30 min sous agitation modérée. 4 ng/pL de la sonde CampyP3 marquée à la biotine dénaturée (100 ng/pL) ont été ajoutés au tampon d’hybridation et laissés une nuit à 65°C sous agitation modérée pour permettre l’hybridation. La membrane a été lavée deux fois avec du SDS 0,1, SSC (Citrate de sodium salin, Meraudex, France) 300 mM pendant 5 min et avec du SSC 75 mM pendant 15 min. La membrane a été transférée dans le tampon de blocage (Tween 0,1 %, SAB 0,1 %, Proclin 0,03%, STP, pH 7,4) à température ambiante pendant 15 minutes pour saturer la surface. Enfin, la membrane a été incubée avec la solution de blocage contenant de la streptavidine-HRP 0,7 mM pendant 15 minutes à température ambiante. Before immobilization, the extracted DNA samples were denatured at 95 ° C for 10 min, immediately placed on ice and deposited as a fraction of 1 µl on the positively charged nylon membrane (Amersham Hybon ™ -XL, GE Healthcare, France). The membrane which received the deposits was exposed to UV at 254 nm for 10 minutes to fix the DNA. The membrane was soaked in preheated hybridization buffer ( 0.5 M Na 2 HP0 4, 0.5 M NaH 2 PO 4, 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 7.5) at 65 ° C for 30 min. with moderate agitation. 4 ng / pL of the CampyP3 probe labeled with denatured biotin (100 ng / pL) was added to the hybridization buffer and left overnight at 65 ° C. with moderate stirring to allow hybridization. The membrane was washed twice with 0.1 SDS, SSC (Sodium citrate saline, Meraudex, France) 300 mM for 5 min and with 75 mM SSC for 15 min. The membrane was transferred to blocking buffer (0.1% Tween, 0.1% BSA, 0.03% Proclin, PBS, pH 7.4) at room temperature for 15 minutes to saturate the surface. Finally, the membrane was incubated with the blocking solution containing 0.7 mM streptavidin-HRP for 15 minutes at room temperature.
Après lavage avec du SDS à 0,1 %, du SSC 150 mM pendant 5 min à température ambiante, la membrane a été transférée dans une nouvelle boîte de Pétri et incubée avec 106 biotine-Si-NP/mL, STP, pH 7,4 pendant 30 min, à température ambiante, sous agitation modérée. Une streptavidine-HRP 0,7 mM dans une solution de blocage a été ajoutée après le lavage et incubée pendant 30 min sous agitation. Le signal a ensuite été révélé en utilisant le substrat chimioluminescent amélioré luminol pour la détection HPR (Thermo Scientific, France). La membrane a été retirée de la solution et observée à l’aide d’un système d’imagerieAfter washing with 0.1% SDS, 150 mM SSC for 5 min at room temperature, the membrane was transferred to a new petri dish and incubated with 10 6 biotin-Si-NP / mL, PBS, pH 7 , 4 for 30 min, at room temperature, with moderate stirring. 0.7 mM streptavidin-HRP in blocking solution was added after washing and incubated for 30 min with shaking. The signal was then revealed using the improved chemiluminescent substrate luminol for HPR detection (Thermo Scientific, France). The membrane was removed from solution and observed using an imaging system.
ChemiDoc MP (Biorad, France). Les signaux de détection ont été quantifiés en utilisant le logiciel Image LabTM (Biorad). La valeur normalisée de l’intensité des points a été calculée à l’aide de l’équation (RI0 -Pln)/PI0, où RI0 et Pin représentent l’intensité de pixel obtenue pour la détection de 0,1 ng/pL de sonde CP3 (étalon) et de l’échantillon expérimental, respectivement. ChemiDoc MP (Biorad, France). Detection signals were quantified using Image LabTM software (Biorad). The normalized value of the dot intensity was calculated using the equation (RI0 -Pln) / PI0, where RI0 and Pin represent the pixel intensity obtained for the detection of 0.1 ng / pL of CP3 probe (standard) and experimental sample, respectively.
3.1.6. Détection de Campylobacter dans des échantillons de poulet contaminés naturellement Cinq carcasses de poulets choisies de manière aléatoire, achetées au marché avec une quantité inconnue de Campylobacter spp. calls ont été testées le capteur dot blot. Les peaux de volaille de chaque carcasse ont été échantillonnées et enrichies comme expliqué au paragraphe 2.3. Pour la validation des résultats, les carcasses de poulet ont été testées pour déterminer la présence de Campylobacter spp. par la méthode de culture sur gélose sélective selon la norme ISO 10272-1: 2006. 3.1.6. Detection of Campylobacter in naturally contaminated chicken samples Five randomly selected chicken carcasses purchased from the market with an unknown quantity of Campylobacter spp. calls have been tested with the dot blot sensor. The poultry skins from each carcass were sampled and enriched as explained in paragraph 2.3. For validation of the results, the chicken carcasses were tested for the presence of Campylobacter spp. by the selective agar culture method according to ISO 10272-1: 2006.
3.2. Résultats et discussion 3.2. Results and discussion
3.2.1. Concept de dot blot d’ADN à base de biotine-Si-NP 3.2.1. Biotin-Si-NP based DNA dot blot concept
L’ADN cible a d’abord été immobilisé sur une membrane de nylon poreuse par irradiation aux UV pour permettre la réticulation de l’ADN à la surface chargée positivement. Ensuite, on a laissé la sonde d’ADN complémentaire CampyloP3 marquée à la biotine s’hybrider avec l’ADN cible. L’hybridation a été détectée à l’aide d’un conjugué streptavidine-HRP en combinaison avec un substrat luminol chimioluminogène en présence de l’activateur H2O2. Le sandwich streptavidine-biotine a permis de fixer les biotine-Si-NP à la sonde d’ADN, et par conséquent, d’amplifier le signal de détection par rapport à la biotine seule. The target DNA was first immobilized on a porous nylon membrane by UV irradiation to allow DNA crosslinking to the positively charged surface. Next, the biotin-labeled CampyloP3 complementary DNA probe was allowed to hybridize with the target DNA. Hybridization was detected using a streptavidin-HRP conjugate in combination with a chemiluminogenic luminol substrate in the presence of the H2O2 activator. The streptavidin-biotin sandwich made it possible to bind biotin-Si-NP to the DNA probe, and therefore, to amplify the detection signal compared to biotin alone.
Une sensibilité améliorée a été obtenue à cause de l’augmentation de la quantité de marquage à la biotine par sonde d’ADN. Improved sensitivity was obtained due to the increased amount of biotin labeling per DNA probe.
3.2.2. Optimisation des paramètres clés et des performances analytiques du capteur de dot blot d’ADN 3.2.2. Optimization of key parameters and analytical performance of the DNA dot blot sensor
La détection de 1 ng/pL de CP3 dans les conditions optimisées en utilisant différentes concentrations de streptavidine-HRP et de biotine-Si-NP a permis de sélectionner 25 ng/pL de streptavidine-HRP et 106 nanoparticules/mL pour la réaction chimioluminométrique. Il convient de noter que la réaction chimioluminométrique proprement dite ne contribue pas significativement au bruit de fond étant donné que l’émission de lumière provient de la réaction enzymatique sans aucune excitation photonique (Laios et al., 2011,RSC Cambridge). The detection of 1 ng / pL of CP3 under the optimized conditions using different concentrations of streptavidin-HRP and biotin-Si-NP allowed to select 25 ng / pL of streptavidin-HRP and 10 6 nanoparticles / mL for the chemiluminometric reaction. . It should be noted that the chemiluminometric reaction itself does not contribute significantly to the background noise since the light emission arises from the enzymatic reaction without any photon excitation (Laios et al., 2011, RSC Cambridge).
3.2.3. Courbe d’étalonnage 3.2.3. Calibration curve
Les courbes d’étalonnage ont été établies en utilisant une cible d’ADN de CP3 dans les deux configurations de dot blot (sans et avec des biotine-Si-NP) dans des conditions optimisées. Les courbes d’étalonnage ont été obtenues à partir de la quantification de l’intensité de la lumière chimioluminescente pour chaque concentration de CP3, provenant d’au moins trois taches indépendantes par concentration. L’intervalle linéaire pour la cible de CP3 était respectivement de 1 ng/pL à 0,1 ng/pL (avec un coefficient de corrélation R2=0, 98684), et de 6 pg/pL à 0,1 ng/pl (avec un coefficient de corrélation R2=0, 98935), pour la technique de dot blot classique et celle améliorée par des Biotine-Si-NP (Fig. 9 B et C). Les limites de détection (LOD) de 0,08 ng/pL et de 0,003 ng/pl pour respectivement le dot blot classique et le dot blot amélioré, ont été calculées en utilisant la formule 3 s/m, où ‘s’ est un écart-type de la solution à blanc et ‘m’ est une pente de la courbe d’étalonnage linéaire. En tenant compte du poids moléculaire de la CP3 qui est de 14395,5, la LOD calculée était de 5,5 nM et de 0,2 nM, pour respectivement le dot blot classique et le dot blot amélioré (figure 9). Standard curves were established using a CP3 DNA target in both dot blot configurations (without and with biotin-Si-NP) under optimized conditions. The calibration curves were obtained from the quantification of the intensity of the chemiluminescent light for each concentration of CP3, from at least three independent spots per concentration. The linear interval for the CP3 target was 1 ng / pL to 0.1 ng / pL (with a correlation coefficient R2 = 0.98684), and 6 pg / pL to 0.1 ng / pl ( with a correlation coefficient R2 = 0, 98935), for the classic dot blot technique and that improved by Biotin-Si-NP (Fig. 9 B and C). The limits of detection (LOD) of 0.08 ng / pL and 0.003 ng / pl for the classical dot blot and the enhanced dot blot, respectively, were calculated using the formula 3 s / m, where 's' is a standard deviation of the blank solution and 'm' is a slope of the linear calibration curve. Taking into account the weight molecular weight of CP3 which is 14395.5, the calculated LOD was 5.5 nM and 0.2 nM, for the classic dot blot and the improved dot blot, respectively (FIG. 9).
Par conséquent, les biotine-Si-NP ont permis d’avoir une augmentation de presque 30 fois de l’intensité du signal chimioluminescent. Les LOD calculées étaient similaires ou inférieures à celles obtenues avec les capteurs rapportés précédemment pour la détection de Campylobacter, comme par exemple 0,5 ng/pL dans Fontanot et al. (2014), 0,37 ng/pL dans Manzano et al. (B&B2015) et 0,09 nM dans Morant-Minana et al. (B&B, 2015). La reproductibilité du dot blot amélioré par des biotine-Si-NP était estimée à 5% selon le signal obtenu pour la détection de la même concentration de CP3. Therefore, biotin-Si-NP resulted in an almost 30-fold increase in the intensity of the chemiluminescent signal. The calculated LODs were similar or lower than those obtained with the sensors reported previously for the detection of Campylobacter, such as for example 0.5 ng / pL in Fontanot et al. (2014), 0.37 ng / pL in Manzano et al. (B & B2015) and 0.09 nM in Morant-Minana et al. (B&B, 2015). The reproducibility of the dot blot enhanced by biotin-Si-NP was estimated at 5% according to the signal obtained for the detection of the same concentration of CP3.
3.2.4. Spécificité et sélectivité de la détection 3.2.4. Specificity and selectivity of detection
Pour examiner la sélectivité et la sensibilité du dot blot aux biotine-Si-NP, nous avons testé différentes souches de Campylobacter spp. pour l’inclusivité, et 17 autres espèces bactériennes et 1 une souche de levure pour l’exclusivité (Fig. 10). Toutes les souches ont été cultivées sous forme de monoculture et les ADN génomiques ont été extraits comme expliqué auparavant. Les analyses dot blot ont été réalisées en utilisant 10 ng/pL d’ADN extrait non amplifié. Avant l’immobilisation, tous les ADN génomiques ont été dénaturés pendant 5 min à 95°C pour permettre une ouverture des doubles brins. De la CP3 à 0,1 ng/pL a été utilisée comme témoin interne pour les intensités de signal normalisées. Les ratios des signaux pour C. jejuni , C. coii, C. tari et C. upsaliensis étaient supérieurs à 1,0, les images de membrane présentant des taches évidentes, alors que le ratio le plus élevé parmi les solutions d’ADN témoins n’était que de 0,6 pour S. enterica (figure 10). To examine the selectivity and sensitivity of the dot blot to biotin-Si-NP, we tested different strains of Campylobacter spp. for inclusiveness, and 17 other bacterial species and 1 yeast strain for exclusivity (Fig. 10). All the strains were grown as a monoculture and the genomic DNAs were extracted as explained previously. Dot blot analyzes were performed using 10 ng / pL of unamplified extracted DNA. Prior to immobilization, all genomic DNAs were denatured for 5 min at 95 ° C to allow double stranded opening. 0.1 ng / pL CP3 was used as an internal control for normalized signal intensities. Signal ratios for C. jejuni, C. coii, C. tari, and C. upsaliensis were greater than 1.0 with membrane images showing obvious spots, while the highest ratio among control DNA solutions was only 0.6 for S. enterica (Figure 10).
De plus, l’intensité obtenue pour C. jejuni et C. coii était environ 4 fois supérieure à celle du témoin positif. Ceci indique que la sonde CampylC3 utilisée pour la détection a réagi plus efficacement avec l’ADN de C. jejuni et de C. coii qu’avec les autres Campylobacter spp. testés dans les conditions de dot blot optimisées dans cette étude. Nos résultats ont démontré que la plate-forme de dot blot améliorée par des biotine-Si-NP est suffisamment sensible pour détecter l’ADN entier extrait des Campylobacter spp. les plus fréquents sans amplification PCR, et pourrait permettre de faire la distinction entre un ADN de Campylobacter et d’autres bactéries. In addition, the intensity obtained for C. jejuni and C. coii was approximately 4 times that of the positive control. This indicates that the CampylC3 probe used for detection reacted more efficiently with DNA from C. jejuni and C. coii than with other Campylobacter spp. tested under the optimized dot blot conditions in this study. Our results demonstrated that the biotin-Si-NP enhanced dot blot platform is sensitive enough to detect whole DNA extracted from Campylobacter spp. most common without PCR amplification, and may be able to distinguish between Campylobacter DNA and other bacteria.
3.2.5. La détection de Campylobacter spp. dans la peau d’une carcasse de poulet contaminée naturellement 3.2.5. The detection of Campylobacter spp. in the skin of a naturally contaminated chicken carcass
Les peaux provenant de cinq échantillons de volaille, qui ont été enrichis, ont été conservées pour la méthode de comptage sur boîte ISO 10272-1:2006 et l’analyse dot blot couplée aux biotine-Si-NP (Fig. 11). La CP3 (0,1 ng/pL) a été utilisée comme témoin positif dans l’analyse dot blot. Toutes les mesures ont été effectuées trois fois. Deux échantillons ont été contaminés avec du Campylobacter jejuni (figure 11). Le dot blot amélioré par des biotine- Si-NP a réussi à détecter deux échantillons contaminés (Fig. 11). Le test a atteint une spécificité relative de 100 % grâce à la spécificité élevée de la sonde CampylP3 utilisée. Dans l’ensemble, la méthode dot blot améliorée par des biotine-Si-NP proposée a réussi à détecter des niveaux faibles de Campylobacter naturellement présents après enrichissement, et pourrait être envisagée pour la détermination et la détection des Campylobacter spp. présents dans une viande de volaille contaminée. The skins from five poultry samples, which were enriched, were saved for the ISO 10272-1: 2006 dish counting method and the dot blot analysis coupled with biotin-Si-NP (Fig. 11). CP3 (0.1 ng / pL) was used as a positive control in the dot blot analysis. All measurements were performed three times. Two samples were contaminated with Campylobacter jejuni (Figure 11). The biotin-Si-NP enhanced dot blot successfully detected two contaminated samples (Fig. 11). The assay achieved 100% relative specificity due to the high specificity of the CampylP3 probe used. Generally, the proposed biotin-Si-NP-enhanced dot blot method succeeded in detecting low levels of Campylobacter naturally present after enrichment, and could be considered for the determination and detection of Campylobacter spp. present in contaminated poultry meat.
3.3. Conclusion 3.3. Conclusion
Ces travaux décrivent une méthode dot blot simple, améliorée avec des biotine-Si-NP, pour une détection rapide et fiable des Campylobacter spp. présents dans une viande de volaille contaminée. This work describes a simple dot blot method, improved with biotin-Si-NP, for rapid and reliable detection of Campylobacter spp. present in contaminated poultry meat.
Le test dot blot est largement utilisé en biologie moléculaire et en génétique pour détecter une séquence d’ADN/ARN cible. The dot blot test is widely used in molecular biology and genetics to detect a target DNA / RNA sequence.
Cette hybridation sur papier permet d’analyser facilement des échantillons multiples à moindre coût avec un rendement élevé, mais a ses limites en faible sensibilité. This paper-based hybridization allows easy multiple sample analysis at low cost with high throughput, but has its limitations in low sensitivity.
Nous avons démontré que l’association de biotine-Si-NP hautement fonctionnalisées avec la lecture chimioluminescente du dot blot amplifiait le signal de 30 fois. We demonstrated that the combination of highly functionalized biotin-Si-NP with chemiluminescent dot blot reading amplified the signal 30-fold.
Par ailleurs, les biotine-Si-NP résistent bien à la température d’utilisation et sont stables dans le temps. Furthermore, biotin-Si-NPs resist well to temperature of use and are stable over time.
La LOD obtenue était de 0,006 ng/pl (0,2 nM). De telles faibles concentrations d’ADN détecté sont proches de celles que l’on peut détecter par qPCR (Manzano et al. 2018; Vidic et al., 2019). The LOD obtained was 0.006 ng / µl (0.2 nM). Such low concentrations of DNA detected are close to those that can be detected by qPCR (Manzano et al. 2018; Vidic et al., 2019).
L’hybridation de l’ADN génomique immobilisé avec la sonde CampylP3 a induit des signaux positifs pour tous les Campylobacter spp. responsables de la gastro-entérite humaine, alors qu’aucun bruit de fond n’a été observé avec les échantillons témoins. Hybridization of the immobilized genomic DNA with the CampylP3 probe induced positive signals for all Campylobacter spp. responsible for human gastroenteritis, while no background noise was observed with the control samples.
Le système mis au point est un outil prometteur pour un criblage rapide et bon marché d’échantillons de volaille pour détecter la présence de Campylobacter car la détection est réalisée sur l’ADN bactérien sans étape d’amplification préalable. The developed system is a promising tool for rapid and inexpensive screening of poultry samples for the presence of Campylobacter because detection is performed on bacterial DNA without a prior amplification step.
Par ailleurs, notre dot blot peut s’appliquer à de l’ADN extrait par différentes méthodes d’extraction et provenant de diverses matrices alimentaires, étant donné qu’il n’est pas sensible aux inhibiteurs d’ADN polymérase. In addition, our dot blot can be applied to DNA extracted by different extraction methods and from various food matrices, since it is not sensitive to DNA polymerase inhibitors.
Le test sur papier multiplex, miniaturisé et sensible proposé est simple à concevoir et pourrait être utilisé par l’industrie alimentaire et les agences de régulation pour la détection d’autres agents pathogènes afin de surveiller la qualité des aliments. Nous pensons que dans le futur, il pourrait être intégrable à un biocapteur à base de laboratoire sur puce qui comprend un protocole d’extraction d’ADN automatisé, voire même un téléphone portable. The proposed multiplex, miniaturized and sensitive paper test is simple to design and could be used by the food industry and regulatory agencies for the detection of other pathogens to monitor food quality. We believe that in the future it could be integrated with a lab-based biosensor on a chip that includes an automated DNA extraction protocol, or even a cell phone.
4. Exemple 4 : Procédé alternatif en une étape 4. Example 4: One-step alternative process
L’ADN a été extrait à partir de souches pures et d’isolats d’échantillons de poulet selon Manzano et al (2015). La concentration d’ADN total a été ajustée à 100 ng/mL en utilisant de l’eau distillée stérile. Avant l’immobilisation, les échantillons d’ADN extrait ont été dénaturés à 95 °C pendant 10 min, placés immédiatement sur de la glace et déposés en fraction de 1 pl sur la membrane de nylon chargée positivement (Amersham Hybon™-XL, GE Healthcare, France). DNA was extracted from pure strains and isolates of chicken samples according to Manzano et al (2015). The concentration of total DNA was adjusted to 100 ng / mL using sterile distilled water. Before immobilization, the extracted DNA samples were denatured at 95 ° C for 10 min, immediately placed on ice and deposited as a fraction of 1 µl on the positively charged nylon membrane (Amersham Hybon ™ -XL, GE Healthcare, France).
La membrane ayant reçu les dépôts a été exposée aux UV à 254 nm pendant 10 minutes pour fixer l’ADN. On a fait tremper la membrane dans du tampon d’hybridation préchauffé (Na2HP04 0,5 M, NaH2P04 0,5 M, EDTA 10 mM, SDS à 1 %, pH 7,5) à 65°C pendant 30 min sous agitation modérée. 4 ng/pL de la sonde CampyP3 marquée à la biotine dénaturée (100 ng/pL) ont été ajoutés au tampon d’hybridation et laissés une nuit à 65°C sous agitation modérée pour permettre l’hybridation. La membrane a été lavée deux fois avec du SDS 0,1, SSC (Citrate de sodium salin,The membrane which received the deposits was exposed to UV at 254 nm for 10 minutes to fix the DNA. The membrane was soaked in preheated hybridization buffer ( 0.5 M Na 2 HP0 4, 0.5 M NaH 2 P0 4 , 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 7.5) at 65 ° C. for 30 min with moderate stirring. 4 ng / pL of the CampyP3 probe labeled with denatured biotin (100 ng / pL) was added to the hybridization buffer and left overnight at 65 ° C. with moderate stirring to allow hybridization. The membrane was washed twice with 0.1 SDS, SSC (sodium citrate saline,
Meraudex, France) 300 mM pendant 5 min et avec du SSC 75 mM pendant 15 min. La membrane a été transférée dans le tampon de blocage (Tween 0,1 %, SAB 0,1 %, Proclin 0,03%, STP, pH 7,4) contenant 106 HRP-Streptavidine-Si-NP/mL, STP, pH 7,4 pendant 30 min, à température ambiante, sous agitation modérée. Après lavage avec du SDS 0,1 %, SSC 150 mM pendant 5 min à température ambiante, la membrane a été transférée dans une nouvelle boîte de Pétri et incubée dans la solution de blocage. Meraudex, France) 300 mM for 5 min and with 75 mM SSC for 15 min. The membrane was transferred to blocking buffer (0.1% Tween, 0.1% BSA, 0.03% Proclin, PBS, pH 7.4) containing 10 6 HRP-Streptavidin-Si-NP / mL, PBS , pH 7.4 for 30 min, at room temperature, with moderate stirring. After washing with 0.1% SDS, 150 mM SSC for 5 min at room temperature, the membrane was transferred to a new petri dish and incubated in the blocking solution.
Le signal a ensuite été révélé en utilisant le substrat chimioluminescent amélioré pour la détection HPR (Thermo Scientific, France). The signal was then revealed using the improved chemiluminescent substrate for HPR detection (Thermo Scientific, France).

Claims

Revendications Claims
[Revendication 1] Procédé pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte (T) susceptible d’être contenu dans un échantillon, ledit au moins un analyte (T) étant de préférence choisi parmi les analytes biologiques, notamment les protéines, les peptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les composés thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques, lequel procédé comprend : [Claim 1] Method for determining the presence and / or the quantity of at least one analyte (T) capable of being contained in a sample, said at least one analyte (T) preferably being chosen from analytes biological, including proteins, peptides, antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or tumor cells, infectious agents such as bacteria, viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic compounds, drugs or antibiotics, which process comprises:
(a) une étape de reconnaissance au cours de laquelle ledit échantillon (E) est mis en présence d’au moins une sonde primaire (1), laquelle au moins une sonde primaire (1) est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison (11) apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte (T) pour former le cas échéant un complexe primaire (C1) et, d’autre part, une première étiquette d’affinité (12), (a) a recognition step during which said sample (E) is brought into contact with at least one primary probe (1), which at least one primary probe (1) is a conjugate comprising, on the one hand, a binding site (11) capable of binding specifically with said analyte (T) to form, where appropriate, a primary complex (C1) and, on the other hand, a first affinity tag (12),
(b) une étape de révélation au cours de laquelle est ajouté au moins un réactif de révélation adapté à former, partant de la sonde primaire (1) dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2), lequel au moins un réactif de révélation comprend : (b) a revelation step during which is added at least one revelation reagent suitable for forming, starting from the primary probe (1) of said primary complex (C1), a secondary complex (C2), which at least one reagent revelation includes:
- au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321), et - at least one amplification probe (3), of the core type (31) - envelope (32), in which said envelope (32) comprises several molecules of an affinity tag (321), and
- un traceur (21) destiné à convertir le complexe secondaire (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3), de sorte que, dans ledit complexe secondaire (C2), certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) sont liées avec ledit traceur (21). - a tracer (21) intended to convert the secondary complex (C2) into a visible and / or measurable signal, said tracer (21) being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag (321) of said at least one amplification probe (3), so that, in said secondary complex (C2), at least some of the molecules of the affinity tag (321) of said at least one amplification probe (3 ) are linked with said tracer (21).
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étiquette d’affinité (321) de l’enveloppe (32) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) consiste en :[Claim 2] A method according to claim 1, characterized in that the affinity tag (321) of the envelope (32) of said at least one amplification probe (3) consists of:
- une première étiquette d’affinité (321), identique à la première étiquette d’affinité (12) de ladite au moins une sonde primaire (1), ou - a first affinity tag (321), identical to the first affinity tag (12) of said at least one primary probe (1), or
- une seconde étiquette d’affinité (321) apte à se lier spécifiquement avec la première étiquette d’affinité (12) de ladite au moins une sonde primaire (1). [Revendication 3] Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, au cours de l’étape de révélation, au moins les réactifs de révélation suivants sont ajoutés : - a second affinity tag (321) able to bind specifically with the first affinity tag (12) of said at least one primary probe (1). [Claim 3] A method according to claim 2, characterized in that, during the development step, at least the following development reagents are added:
- une seconde étiquette d’affinité (5) apte à se lier spécifiquement avec ladite première étiquette d’affinité (12), au moins une partie de ladite seconde étiquette d’affinité (5) se présentant sous la forme d’une sonde secondaire (2) consistant en un conjugué comprenant, d’une part, ladite seconde étiquette d’affinité (5, 22) et, d’autre part, le traceur (21), et - a second affinity tag (5) capable of binding specifically with said first affinity tag (12), at least part of said second affinity tag (5) being in the form of a secondary probe (2) consisting of a conjugate comprising, on the one hand, said second affinity tag (5, 22) and, on the other hand, the tracer (21), and
- ladite au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules de ladite première étiquette d’affinité (321), de sorte à obtenir, partant de la sonde primaire (1) dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2) comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : seconde étiquette d’affinité (5) : sonde d’amplification (3) : sondes secondaires (2), ladite sonde d’amplification - said at least one amplification probe (3), of the core type (31) - envelope (32), in which said envelope (32) comprises several molecules of said first affinity tag (321), so as to obtain , starting from the primary probe (1) of said primary complex (C1), a secondary complex (C2) comprising analyte (T): primary probe (1): second affinity tag (5): amplification probe (3) : secondary probes (2), said amplification probe
(3) dudit complexe secondaire (C2) étant liée à plusieurs molécules de ladite au moins une sonde secondaire (2). (3) of said secondary complex (C2) being linked to several molecules of said at least one secondary probe (2).
[Revendication 4] Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu’une partie de ladite seconde étiquette d’affinité (5) de l’étape de révélation est dépourvue dudit traceur (21). [Claim 4] A method according to claim 3, characterized in that a part of said second affinity tag (5) of the revealing step is devoid of said tracer (21).
[Revendication 5] Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, au cours de l’étape de révélation, est ajouté au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules de ladite seconde étiquette d’affinité (321) dont certaines au moins sont liées à au moins une molécule dudit traceur (21), de sorte à obtenir, partant de la sonde primaire (1) dudit complexe primaire (C1), un complexe secondaire (C2) comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : sonde d’amplification (3). [Claim 5] The method of claim 2, characterized in that, during the revealing step, is added at least one amplification probe (3), of the core (31) - envelope (32) type, in wherein said envelope (32) comprises several molecules of said second affinity tag (321), at least some of which are linked to at least one molecule of said tracer (21), so as to obtain, starting from the primary probe (1) of said primary complex (C1), a secondary complex (C2) comprising analyte (T): primary probe (1): amplification probe (3).
[Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la première étiquette d’affinité (12, 321) est choisie parmi la biotine ou homologue, et en ce que la seconde étiquette d’affinité (5, 22) est choisie parmi la streptavidine ou homologue, par exemple avidine, NeutrAvidine ou Captavidine. [Claim 6] A method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the first affinity tag (12, 321) is chosen from biotin or homolog, and in that the second affinity tag ( 5, 22) is chosen from streptavidin or homologous, for example avidin, NeutrAvidin or Captavidin.
[Revendication 7] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite au moins une sonde d’amplification (3) comprend un noyau (31) formé par une nanoparticule ayant de préférence une taille allant de 10 à 100 nm. [Claim 7] A method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said at least one amplification probe (3) comprises a core (31) formed by a nanoparticle preferably having a size ranging from 10 to 100 nm.
[Revendication 8] Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la nanoparticule est choisie parmi les nanoparticules présentant une surface composée de silice, de préférence encore parmi les nanoparticules composées de silice, avantageusement encore parmi les billes de silice. [Claim 8] Method according to claim 7, characterized in that the nanoparticle is chosen from nanoparticles having a surface composed of silica, preferably again from nanoparticles composed of silica, advantageously also from silica beads.
[Revendication 9] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite au moins une sonde d’amplification (3) comporte au moins 20 molécules de ladite étiquette d’affinité (321). [Claim 9] A method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that said at least one amplification probe (3) comprises at least 20 molecules of said affinity tag (321).
[Revendication 10] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l’enveloppe (32) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) comprend des espaceurs (322), reliant le cœur (31) avec une molécule d’étiquette d’affinité (321). [Claim 10] A method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the envelope (32) of said at least one amplification probe (3) comprises spacers (322), connecting the heart (31 ) with an affinity tag molecule (321).
[Revendication 11] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le traceur (21) est choisi parmi les enzymes, les fluorophores, les radio-isotopes, les molécules rédox (ou électroactives), les particules magnétiques, photoacoustiques ou photothermiques, le cas échéant ladite au moins une sonde secondaire (2) étant choisie parmi les conjugués enzymatiques ou les conjugués photoactifs. [Claim 11] A method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the tracer (21) is chosen from enzymes, fluorophores, radioisotopes, redox (or electroactive) molecules, magnetic particles , photoacoustic or photothermal, where appropriate said at least one secondary probe (2) being chosen from enzymatic conjugates or photoactive conjugates.
[Revendication 12] Procédé selon la revendication 11, en combinaison avec la revendication 3, caractérisé en ce que les conjugués enzymatiques sont choisis parmi les conjugués streptavidine-HRP ou streptavidine-PA, et en ce que les réactifs de révélation de l’étape de révélation comprennent un substrat desdits conjugués enzymatiques pour une réaction de chimiluminescence en présence dudit complexe secondaire (C2). [Claim 12] A method according to claim 11, in combination with claim 3, characterized in that the enzymatic conjugates are chosen from streptavidin-HRP or streptavidin-PA conjugates, and in that the revealing reagents of the step of disclosure comprise a substrate of said enzymatic conjugates for a chemiluminescence reaction in the presence of said secondary complex (C2).
[Revendication 13] Procédé selon l’une quelconque des revendications 3 ou 5, caractérisé en ce que l’étape de révélation est mise en œuvre en : [Claim 13] A method according to any one of claims 3 or 5, characterized in that the revealing step is carried out by:
- deux phases successives, dans le cadre de la revendication 3, avec : - two successive phases, within the framework of claim 3, with:
-- une première phase au cours de laquelle est ajoutée ladite seconde étiquette d’affinité (5), éventuellement au moins une partie sous forme de ladite au moins une sonde secondaire (2), pour former un premier sous-complexe comprenant analyte (T) : sonde primaire (1) : seconde étiquette d’affinité (5), puis - a first phase during which is added said second affinity tag (5), optionally at least part in the form of said at least one secondary probe (2), to form a first sub-complex comprising analyte (T ): primary probe (1): second affinity tag (5), then
-- une seconde phase au cours de laquelle sont ajoutées ladite au moins une sonde d’amplification (3) et ladite au moins une sonde secondaire (2) pour former ledit complexe secondaire (C2), ou - une phase unique, dans le cadre de la revendication 3, au cours de laquelle sont ajoutés simultanément les réactifs pour la formation du complexe secondaire (C2), ou - a second phase during which said at least one amplification probe (3) and said at least one secondary probe (2) are added to form said secondary complex (C2), or - a single phase, within the framework of claim 3, during which the reagents are added simultaneously for the formation of the secondary complex (C2), or
- une phase unique, dans le cadre de la revendication 5, au cours de laquelle est ajoutée ladite au moins une sonde d’amplification (3) pour la formation du complexe secondaire (C2). - a single phase, within the framework of claim 5, during which is added said at least one amplification probe (3) for the formation of the secondary complex (C2).
[Revendication 14] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que le site de liaison (11) de ladite au moins une sonde primaire (1) est choisie parmi les biomolécules, par exemple les sondes nucléiques ou les sondes protéiques. [Claim 14] A method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the binding site (11) of said at least one primary probe (1) is chosen from biomolecules, for example nucleic probes or protein probes.
[Revendication 15] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en présence de ladite au moins une sonde primaire (1), ledit au moins un analyte (T) est fixé : [Claim 15] A method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that, prior to the bringing together of said at least one primary probe (1), said at least one analyte (T) is fixed:
- sur un support (S), par exemple pour un procédé du type dot blot, ou - on a support (S), for example for a method of the dot blot type, or
- sur une sonde de capture (6), portée par exemple par une bille magnétique (B) pour une technique MELISA ou par un support pour une technique ELISA sandwich. - on a capture probe (6), carried for example by a magnetic ball (B) for a MELISA technique or by a support for a sandwich ELISA technique.
[Revendication 16] Utilisation d’une sonde du type noyau-enveloppe en tant que sonde d’amplification du signal dans un procédé de détection en cascade pour la détermination de la présence et/ou de la quantité d’au moins un analyte (T) susceptible d’être contenu dans un échantillon (E), ladite sonde d’amplification (3) comportant une enveloppe (32) qui comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321). [Claim 16] Use of a core-shell type probe as a signal amplification probe in a cascade detection method for determining the presence and / or amount of at least one analyte (T ) capable of being contained in a sample (E), said amplification probe (3) comprising an envelope (32) which comprises several molecules of an affinity tag (321).
[Revendication 17] Système de réactifs, pour la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, lequel système de réactifs comprend : [Claim 17] A reagent system, for carrying out the method according to any one of claims 1 to 15, which reagent system comprises:
- au moins une sonde primaire (1), laquelle au moins une sonde primaire (1) est un conjugué comprenant, d’une part, un site de liaison (11) apte à se lier spécifiquement avec ledit analyte (T) et, d’autre part, une première étiquette d’affinité (12), et - at least one primary probe (1), which at least one primary probe (1) is a conjugate comprising, on the one hand, a binding site (11) capable of binding specifically with said analyte (T) and, d '' on the other hand, a first affinity tag (12), and
- au moins un réactif de révélation apte à former un complexe (C2) partant de la sonde primaire- at least one revelation reagent capable of forming a complex (C2) starting from the primary probe
(1), lequel au moins un réactif de révélation comprend : (1), which at least one revealing reagent comprises:
- au moins une sonde d’amplification (3), du type noyau (31) - enveloppe (32), dans laquelle ladite enveloppe (32) comprend plusieurs molécules d’une étiquette d’affinité (321), et - un traceur (21) destiné à convertir le complexe (C2) en un signal visible et/ou mesurable, ledit traceur (21) étant lié ou destiné à se lier avec les molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3), de sorte que, dans ledit complexe (C2), certaines au moins des molécules de l’étiquette d’affinité (321) de ladite au moins une sonde d’amplification (3) sont liées à au moins une molécule dudit traceur (21). - at least one amplification probe (3), of the core type (31) - envelope (32), in which said envelope (32) comprises several molecules of an affinity tag (321), and - a tracer (21) intended to convert the complex (C2) into a visible and / or measurable signal, said tracer (21) being bound or intended to bind with the molecules of the affinity tag (321) of said at least one amplification probe (3), so that, in said complex (C2), at least some of the molecules of the affinity tag (321) of said at least one amplification probe (3) are linked to at least one molecule of said tracer (21).
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