JP2010172324A

JP2010172324A - アプタマーを用いて微生物を検出する方法及びキット

Info

Publication number: JP2010172324A
Application number: JP2009021808A
Authority: JP
Inventors: Toshie Sugiura; 淑恵杉浦; Shizuko Ono; 志津子小野; Yoshio Miura; 美穂三浦
Original assignee: TDK Corp
Current assignee: TDK Corp
Priority date: 2009-02-02
Filing date: 2009-02-02
Publication date: 2010-08-12

Abstract

【課題】アプタマーと微生物の結合能を高める方法及びアプタマーを用いて微生物を検出するためのキットを提供する。
【解決手段】アプタマーを用いて微生物を検出する方法であって、アプタマーと微生物とを結合させる反応溶液のｐＨが、０．０〜６．９である方法、及び、アプタマーとｐＨが０．０〜６．９である反応溶液とを含む、微生物検出キット。
【選択図】なし

Description

本発明は、アプタマーを用いて微生物を検出する方法及びキットに関する。特に、アプタマーと微生物の結合能を向上させる方法及びそのための反応溶液を提供する。

アプタマーは、抗体などのタンパク質と比べて、酵素的分解や乾燥に強いため、保存状態や測定試料によって標的物質を検出する感度が損なわれないという特性を有している。また、抗体などの安定性保持のために使用される、人体に対して有害な薬剤（例えば、メチロサールやＮａＮ_３）を使用する必要がないため、使用後の試薬の廃棄が容易である点などでも優れている。

特許文献１には、標的分子の存在を検出するためのアプタマー・プローブ複合体が開示されている。

国際公開パンフレットＷＯ２００５／０４９８２６号

発明者らは、アプタマーを用いて微生物を検出する方法の開発を行った。この過程で、発明者らは、結合反応に使用する反応溶液の条件により、特異性の高いアプタマーの結合能が飛躍的に上がることを見出した。そこで、本発明の目的は、アプタマーと微生物の結合能を高める方法を提供することである。本発明の別の目的は、アプタマーを用いて微生物を検出するためのキットを提供することである。

発明者らは、アプタマーを用いて微生物を検出する方法を開発した。この開発過程において、反応溶液のｐＨを、通常使用されない値に調整することによって、アプタマーと微生物との結合能を向上できることを見出した。さらに、ｐＨの調整とともに、反応溶液中の塩濃度を調整することが有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

１つの態様において、本発明は、アプタマーを用いて微生物を検出する方法であって、アプタマーと微生物とを結合させる反応溶液のｐＨが、０．０〜６．９である方法を提供する。

従来、アプタマーをターゲットと結合反応させる場合、結合反応を行う反応溶液の条件を、ターゲットが存在している環境に合わせることが通常であった。すなわち、ターゲットが生体由来の試料である場合、この条件はｐＨ７．５付近であることが通常であった。これに対して、反応溶液のｐＨを０．０〜６．９に調整することによって、アプタマーと微生物の結合能を高めることが可能である。

アプタマーで検出する微生物は口腔内細菌であることが好ましい。また、口腔内細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ及びＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される細菌であることが好ましい。これらの微生物は、う蝕又は歯周病に関連していることが知られているため、これらの微生物を検出することによってう蝕や歯周病のリスクを評価することが可能である。

上記の反応溶液のｐＨは、０．０〜５．０であることが更に好ましい。反応溶液のｐＨがこの範囲にあることによって、アプタマーと微生物のより良好な結合が達成でき、アプタマーによる微生物検出の信頼性が向上する。

上記の反応溶液中のナトリウムイオン（Ｎａ^＋）濃度は、１〜１０００ｍＭであることが更に好ましい。アプタマーを用いて微生物を検出する場合に、このような反応溶液を用いることによって、アプタマーと微生物の結合能を更に高めることができる。

別の態様において、本発明は、アプタマーと、ｐＨが０．０〜６．９である反応溶液とを含む、微生物検出キットを提供する。このようなキットによれば、アプタマーと微生物の高い結合能を達成することができるため、信頼性の高い微生物の検出が可能である。

上記のキット中の反応溶液は、ナトリウムイオン濃度が、１〜１０００ｍＭであることが更に好ましい。このような反応溶液を用いることによって、アプタマーと微生物の結合能を更に高めることができ、アプタマーによる微生物検出の信頼性が更に向上する。

（ａ）〜（ｃ）は、本発明の第１の実施形態を示す図である。（ａ）〜（ｄ）は、本発明の第２の実施形態を示す図である。実施例１及び比較例１の結果を示すグラフである。実施例２の結果を示すグラフである。

以下、図面を参照しながら、好適な実施形態を説明する。なお、図面の説明において同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面は理解を容易にするため一部を誇張して描いており、寸法比率は説明のものとは必ずしも一致しない。本発明の実施形態は下記の態様に限定されず、当業者に明らかな種々の変更が可能である。

図１（ａ）〜（ｃ）を用いて、本発明の第１の実施形態を説明する。第１の実施形態は、担体に微生物を固定する担体準備ステップと、アプタマーと微生物とを結合させる結合ステップと、微生物に結合したアプタマーを検出する検出ステップとを備えている。担体準備ステップでは、図１（ａ）に示すように、担体１に、検出対象である微生物２を固定する。微生物２を固定した担体１は、非特異反応を防止するために、ブロッキングバッファー中で約１時間放置するなどの方法により、ブロッキングすることが好ましい。続いて、結合ステップにおいて、図１（ｂ）に示すように、本発明の反応溶液中で、微生物２に特異的なアプタマー３と、微生物２とを結合させた後、未反応のアプタマー３を洗浄して除去する。本発明の反応溶液を用いることにより、ＴＢＳ−Ｔなどの通常の反応溶液を用いた場合と比較して、アプタマー３と微生物２との結合能が向上する。続いて、検出ステップにおいて、微生物に結合したアプタマー３の量を定量する。

検出ステップにおいて、アプタマー３は、例えば次のようにして定量することができる。図１（ｂ）に示すように、アプタマー３を、あらかじめ標識４で標識しておく。標識４は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であってよい。この標識は、例えば、アプタマーを化学合成する時に、ＦＩＴＣ化ヌクレオチドを取り込ませることにより行うことができる。続いて、図１（ｃ）に示すように、標識４に対する抗体５を、微生物２に結合したアプタマー３と結合させる。この段階では、本発明の反応溶液ではなく、抗体５を用いた反応に適した反応溶液を用いてもよい。抗体５は、標識６を有しており、標識６は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。続いて、未反応の抗体５を洗浄して除去する。続いて、標識６の基質を反応させて、発色、発光又は蛍光などを生成させ、その生成量を測定する。標識６がＨＲＰである場合には、例えば、ＥＣＬＡｄｖａｎｃｅ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を基質として反応させ、化学発光を生成させて、その発光をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ３５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）で測定するとよい。以上の操作によって、アプタマー３を定量することができる。

次に、図２（ａ）〜（ｄ）を用いて、本発明の第２の実施形態を説明する。第２の実施形態は、担体にアプタマーを固定する担体準備ステップと、アプタマーと微生物とを結合させる第１結合ステップと、アプタマーに結合した微生物に更にアプタマーを結合させる第２結合ステップと、結合したアプタマーを検出する検出ステップとを備えている。担体準備ステップでは、図２（ａ）に示すように、担体１に、検出対象である微生物２に特異的なアプタマー７を結合させる。アプタマー７を固定した担体１は、非特異反応を防止するために、ブロッキングバッファー中で約１時間放置するなどの方法により、ブロッキングすることが好ましい。続いて、第１結合ステップにおいて、図２（ｂ）に示すように、本発明の反応溶液中で、アプタマー７に、検出対象である微生物２を含むサンプルを結合させる。本発明の反応溶液を用いて、アプタマー７と微生物２とを結合させることにより、アプタマー７と微生物２との結合能が向上する。続いて、未反応のサンプルを洗浄して除去する。続いて、第２結合ステップにおいて、図２（ｃ）に示すように、標識４を有し、微生物２に特異的なアプタマー３を、本発明の反応溶液中で結合させる。本発明の反応溶液を用いることにより、ＴＢＳ−Ｔなどの通常の反応溶液を用いた場合と比較して、アプタマー３と微生物２との結合能が向上する。続いて、未反応のアプタマー３を洗浄して除去する。続いて、検出ステップにおいて、図２（ｄ）に示すように、微生物に結合したアプタマー３の量を、標識４に対する抗体５を用いて、上記第１の実施形態と同様にして定量する。

上記第１の実施形態において、担体１には、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、シリコーンゴム、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、アガロース、その他の天然ポリマーなどのポリマー材料、金コロイドやその他金属、ダイヤモンド薄膜、紙などからなる基板、メンブレン、ビーズなどが使用できるが、例えばニトロセルロースメンブレンを用いることができる。微生物２のニトロセルロースメンブレンへの固定は、例えば、微生物２の懸濁液を、ニトロセルロースメンブレン上に滴下し、乾燥させることで行うことができる。

上記第２の実施形態において、担体１には、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、シリコーンゴム、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、アガロース、その他の天然ポリマーなどのポリマー材料、金コロイドやその他金属、ダイヤモンド薄膜、紙などからなる基板、メンブレン、ビーズなどが使用できる。アプタマー７の担体１への固定方法は特に制限はなく、当該技術分野で通常に使用されている方法を使用できる。例えば、担体１表面をポリ−Ｌ−リジンで処理し、そこに目的量のアプタマー７を含む溶液を反応させることによって固定してもよい。あるいは、アプタマー７の末端に例えばアミノ基、チオール基、ビオチン基などの官能基を予め導入しておき、その官能基を使用して、担体１表面上の官能基と共有結合させてもよい。

上記第１及び第２の実施形態において、ブロッキングバッファーとしては、例えば、ＴＢＳ−Ｔを使用できる。ＴＢＳ−Ｔの組成は、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）である。ブロッキングバッファーとしては、この他にもウシ血清アルブミンや、スキムミルクなどを使用することができる。

また、上記第１及び第２の実施形態において、アプタマー３の標識４は、ＦＩＴＣに限定されない。例えば、テキサスレッド、ローダミン、フィコエリスリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（ヘキセクロロフルオレセイン）、ＴＡＭＲＡ（カルボテトラメチルローダミンン)、ＴＥＴ（カルボテトラクロロフルオレセイン）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒなどの蛍光色素を用いることができる。蛍光色素は特に制限はなく、当該技術分野で通常に使用されている標識方法が利用できる。また、蛍光色素に限らず、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニンなどを用いてもよい。標識４が蛍光色素である場合には、上記のような抗体を用いた定量方法以外にも、メンブレンに励起光を照射して、発生する蛍光を定量する方法を採用することができる。また、標識４がビオチンである場合には、上記の抗体５の代わりに、例えば標識６を有するストレプトアビジンを用いることができる。

また、上記第１及び第２の実施形態において、抗体５の標識６は、ＨＲＰに限定されない。例えば、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素も好適に使用できる。

「アプタマー」とは、タンパク質や糖などの様々な分子に結合する能力を持つ核酸分子のことである。上記アプタマーは、当業者が行う一般的な方法によって目的とする塩基配列の核酸を化学合成し、標的分子に特異的に結合する作用を指標にスクリーニングすることにより取得できる。

例えば、検出対象である微生物の菌体表面に特異的に存在する菌体表層物質を選択し、その菌体表層物質のアミノ酸配列をコードする塩基配列をコンピューター内進化プログラムで処理して１０世代の塩基配列をコンピューター上に発生させ、これらの塩基配列を、検出対象である微生物に結合するアプタマーの候補とする。なお、コンピューター内進化プログラムは、例えば、Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏらの文献（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２００５年、３３巻、ｅ１０８）を参照し、通常利用されている遺伝的アルゴリズムを用いて、ｖｉｓｕａｌｂａｓｉｃなどで作成できる。

その後、上記の処理によって候補として挙げられた複数の塩基配列からなるオリゴＤＮＡを化学合成し、実際に検出対象である微生物と反応させて結合性の高いものをアプタマーとして回収し、これを鋳型にＰＣＲで増幅することによって、検出対象である微生物と結合するアプタマーを大量に取得できる。

上記のアプタマーは、製造が容易であり、安定性が高い点で、ＤＮＡアプタマーであることが好ましい。また、塩基長は、１０〜５００塩基であることが好ましく、２０〜１５０塩基であることが更に好ましい。

「微生物」とは、細菌又はウイルスを意味する。「口腔内細菌」とは、口腔内で生存している常在細菌のことを意味する。口腔内細菌のうち、う蝕菌としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが挙げられ、歯周病菌としては、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔｕｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｐａｒｖｕｌａなどが挙げられる。

アプタマーを用いて生体由来の試料を測定する場合、酸性条件下ではサンプルが変性してしまうため、酸性の反応溶液を使用しないのが技術常識である。しかしながら、発明者らは、これに反して、反応溶液のｐＨをｐＨ０．０〜６．９に設定することによって、アプタマーと微生物の結合能を向上できることを見出した。本発明の反応溶液は、ｐＨ０．０〜６．９であることが好ましく、ｐＨ０．０〜６．５であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜５．５であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜５．０であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜４．５であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜４．０であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜３．５であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜３．０であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜２．５であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜２．０であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜１．５であることが更に好ましく、ｐＨ０．０〜０．９であることが更に好ましく、ｐＨ０．９であることが特に好ましい。ｐＨは、クエン酸、塩酸、酢酸などを用いて調整することができる。

例えば、反応溶液はＮａＣｌ及び０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０を含むクエン酸バッファーであってよい。

反応溶液中のナトリウムイオン濃度は、１〜１０００ｍＭであることが好ましく、５０〜１０００ｍＭであることが更に好ましく、２００〜１０００ｍＭであることが更に好ましく、５００〜１０００ｍＭであることが更に好ましく、７５０〜１０００ｍＭであることが更に好ましい。

本発明のキットは、上記の微生物に結合可能なアプタマーと、ｐＨが０．０〜６．９である反応溶液とを含む。反応溶液のｐＨは、アプタマーと微生物とを結合させる結合反応時においてｐＨが０．０〜６．９となっていればよく、そのまま反応に用いることができる液体状態で供給されても良いし、濃縮状態や粉末状態で供給され、使用前に水、希釈バッファー、唾液などで所定の容量に希釈することによって、ｐＨが０．０〜６．９となり、反応に用いることができる状態になるものであっても良い。

本発明のキットの反応溶液のナトリウムイオン濃度は、アプタマーと微生物との結合反応時において１〜１０００ｍＭとなっていることが、より好ましい。反応溶液のナトリウムイオン濃度についてもｐＨと同様であり、そのまま反応に用いることができる液体状態で供給されても良いし、濃縮状態や粉末状態で供給され、使用前に水、希釈バッファー、唾液などで所定の容量に希釈することによって、ナトリウムイオン濃度が、１〜１０００ｍＭとなり、反応に用いることができる状態になるものであっても良い。

本発明の方法によれば、アプタマーと微生物の結合能を高めることができる。ここで、高い結合能とは、非特異的な結合が少なく、高いシグナル強度が得られる結合である。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）アプタマーによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓの検出
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ菌体の調製）
ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓをＢＨＩ培地（ＢｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ）を用いて、３７℃で２０時間培養した。続いて、培養液を遠心分離し、菌体をＴＢＳで洗浄後、濃縮し、菌懸濁液とした。

（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓの固定）
ニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に、一定量ずつ菌懸濁液を滴下し、乾燥させた。これにより、メンブレンにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ菌体が固定された。

（アプタマーとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓの反応）
アプタマーとして、コンピューター内進化プログラムによる処理においてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓに対する結合能が高かったＳＭａＦ＃３−８（配列番号１）を使用した。ＳＭａＦ＃３−８（配列番号１）は、５’末端がＦＩＴＣ標識されていた。菌体を固定したメンブレンを、ＴＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．５）に浸して１時間室温でブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンに０．０１μＭの濃度のアプタマーＳＭａＦ＃３−８（配列番号１）を、室温で１時間反応させた。反応溶液には５０ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液を用い、反応溶液のｐＨは０．９〜６．５となるように調整した。

続いて、新しい反応溶液を用いて洗浄し、結合しなかったＦＩＴＣ標識アプタマーを除去した。続いて、菌体と結合したＦＩＴＣ標識アプタマーを検出するために、ＴＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．５）で１／２０，０００希釈したＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体（タカラバイオ株式会社製）を、室温で１時間反応させた。続いて、ＴＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．５）を用いてメンブレンを洗浄し、ＦＩＴＣ標識アプタマーに結合しなかったＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を除去した。

結合したＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体のＨＲＰ活性を測定した。メンブレンに、基質試薬としてＥＣＬＡｄｖａｎｃｅ（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を使用し、化学発光検出装置ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ３５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用い、発光強度を５分間測定した。

（比較例１）：ｐＨ７．５〜９．５の反応溶液を用いた、アプタマーによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓの検出
反応溶液として、ＴＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．５、ｐＨ８．５、ｐＨ９．５）を用いた以外は、実施例１と同様にして、アプタマーＳＭａＦ＃３−８（配列番号１）による、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓの検出を行った。

表１−１、１−２、１−３及び図３に、実施例１（ｐＨ０．９〜６．５）及び比較例１（ｐＨ７．５〜９．５）の発光強度の測定値及びグラフを示す。ｐＨ０．０〜６．５の反応溶液を用いた場合において、ｐＨ７．５〜９．５の反応溶液を用いた場合よりも、高い反応性が観察された。他の複数のアプタマーを用いた実験においても、同様の結果が得られた。したがって、微生物に結合する様々なアプタマーにおいて、結合能を高めるために、ｐＨ０．０〜６．５の反応溶液を用いることが有効であると考えられる。

（実施例２）アプタマーによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓの検出における、反応溶液のナトリウムイオン濃度の検討
ナトリウムイオン濃度５０、１００、１５０、３００、５００、７５０及び１０００ｍＭの反応溶液（ｐＨ３．５）を用いて、発光強度の測定時間を３分間とした以外は、実施例１と同様の反応を行った。アプタマーにはＳＭａＦ＃３−８（配列番号１）を用いた。表２及び図４に発光強度の測定値及びグラフを示す。

１…担体、２…微生物、３，７…アプタマー、４，６…標識、５…抗標識抗体。

Claims

アプタマーを用いて微生物を検出する方法であって、アプタマーと微生物とを結合させる反応溶液のｐＨが、０．０〜６．９である方法。
前記微生物が口腔内細菌である、請求項１に記載の方法。
前記口腔内細菌が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ及びＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される細菌である、請求項２に記載の方法。
前記反応溶液のｐＨが、０．０〜５．０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記反応溶液中のナトリウムイオン濃度が、１〜１０００ｍＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
アプタマーと、ｐＨが０．０〜６．９である反応溶液とを含む、微生物検出キット。
前記反応溶液中のナトリウムイオン濃度が、１〜１０００ｍＭである、請求項６に記載のキット。