JP6225212B2 - ナノレポーターによるタンパク質の検出 - Google Patents
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Description
本出願は、2009年10月13日に出願された米国仮特許出願61/251,192、2010年4月16日に出願された米国仮特許出願61/325,224、および2010年4月22日に出願された米国仮特許出願61/326,787の利益を主張し、上記仮出願の内容は、その全容が参考として各々本明細書に援用される。
本発明は、一般的に、固有のナノレポーター構築物を作製するための分子生物学のツール、およびそれらを使用するための方法を用いる、タンパク質の検出、定量化、同定、および多重分析の分野に関する。
最近のヒトゲノムの分析の完了に伴い、今、多くの注目がプロテオミクスの分野にシフトしつつあり、その分野では、遺伝子産物(タンパク質)、それらの変種、相互作用するパートナー、ならびにそれらの制御およびプロセシングの動態学が研究の重点項目である。そのような研究は、例えば、遺伝性障害および環境誘発性障害に潜む機構、または薬物による治療の影響を理解するのに必須であり、加えて、さらなる臨床分析および診断分析のための根本の基盤となる可能性がある。これらの研究にとって重要なことは、タンパク質全体の特定の変種(例えば、スプライスバリアント、点突然変異、翻訳後修飾バージョン、および環境/治療誘発性改変)を定性的に決定する能力、およびそれらの定量的調節を見る能力である。さらに、1つだけではなく、複数の生物学的液体/抽出物からこれらの分析を実施することが益々重要になりつつある。タンパク質試料に内在する追加的な難題のせいで多重化タンパク質測定テクノロジーの方法が制限されている。
本発明は、タンパク質の分析のための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、試料におけるタンパク質の検出および/または定量化のための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)(i)少なくとも1つのタンパク質、(ii)前記の少なくとも1つのタンパク質の第1の領域に特異的な第1のタンパク質プローブであって、捕獲領域を含む第1のタンパク質プローブ、(iii)少なくとも1つのタンパク質の第2の領域に特異的な第2のタンパク質プローブであって、複数の異なる検出可能な標識を含むナノレポーターを含む第2のタンパク質プローブ、および(iv)第1のタンパク質プローブにおける捕獲領域に結合し得る部分(portion)を付着させているマトリックスを供給する工程;(b)少なくとも1つのタンパク質、第1のタンパク質プローブ、第2のタンパク質プローブ、および上記部分を含む少なくとも1つの複合体を形成する工程であって、少なくとも1つのタンパク質が第1のタンパク質プローブおよび第2のタンパク質プローブに結合しており、上記部分が第1のタンパク質プローブにおける捕獲プローブに結合している、工程;ならびに(c)ナノレポーターの1つまたは複数の分子の存在を個々にカウントすることを含む方法によって複合体または複合体の少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、1つまたは複数の分子の存在が試料におけるタンパク質の濃度を示している、工程を含む、試料における少なくとも1つのタンパク質の濃度を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、個々に検出する工程は、デジタルシグナルを検出することをさらに含む。
本明細書に言及された全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に示されて参照により組み入れられるのと同じ程度で、参照により本明細書に組み入れられる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
試料における少なくとも1つのタンパク質の濃度を決定するための方法であって、
(a)(i)少なくとも1つのタンパク質、
(ii)前記少なくとも1つのタンパク質の第1の領域に特異的な第1のタンパク質プローブであって、前記第1のタンパク質プローブは、捕獲領域を含む、第1のタンパク質プローブ、
(iii)前記少なくとも1つのタンパク質の第2の領域に特異的な第2のタンパク質プローブであって、前記第2のタンパク質プローブは、複数の異なる検出可能な標識を含むナノレポーターを含む、第2のタンパク質プローブ、および
(iv)マトリックスであって、前記第1のタンパク質プローブにおける前記捕獲領域に結合し得る成分が前記マトリックスに付着している、マトリックス
を供給する工程;
(b)前記少なくとも1つのタンパク質、前記第1のタンパク質プローブ、前記第2のタンパク質プローブ、および前記成分を含む少なくとも1つの複合体を形成する工程であって、前記少なくとも1つのタンパク質が前記第1のタンパク質プローブおよび前記第2のタンパク質プローブに結合しており、前記成分が前記第1のタンパク質プローブにおける前記捕獲プローブに結合している、工程;ならびに
(c)前記ナノレポーターの1つまたは複数の分子の存在を個々にカウントする工程を含む方法によって前記複合体または前記複合体の少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、前記1つまたは複数の分子の存在が前記試料における前記タンパク質の濃度を示している、工程
を含む、方法。
(項目2)
前記個々に検出する工程が、デジタルシグナルを検出する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
複数の複合体を形成することを含む方法によって複数の標的タンパク質の濃度を決定する工程をさらに含み、各複合体が
(i)少なくとも1つの標的タンパク質、
(ii)前記少なくとも1つのタンパク質の第1の領域に特異的な第1のタンパク質プローブであって、前記第1のタンパク質プローブは、捕獲領域を含む、第1のタンパク質プローブ、
(iii)前記少なくとも1つのタンパク質の第2の領域に特異的な第2のタンパク質プローブであって、前記第2のタンパク質プローブは、複数の異なる検出可能な標識を含むナノレポーターを含む、第2のタンパク質プローブ、ならびに
(iv)マトリックスに付着した成分であって、前記成分は、前記第1のタンパク質プローブにおける前記捕獲領域に結合し得る、成分
を含み、各第2のタンパク質プローブが異なるナノレポーター領域を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記複数の複合体における各ナノレポーターが、それを前記集団における他のナノレポーターから区別する検出可能なシグナルを有する、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記第1のタンパク質プローブおよび前記第2のタンパク質プローブの解離定数が約1.00×10−15〜約1.00×10−08である、項目3に記載の方法。
(項目6)
2つ以上の標的タンパク質の濃度が決定される、項目3に記載の方法。
(項目7)
3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、または1000個より多い異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目6に記載の方法。
(項目8)
最高2000個までの異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目3に記載の方法。
(項目9)
最高980個までの異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目3に記載の方法。
(項目10)
前記マトリックスがビーズおよびアレイからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記マトリックスがビーズであり、前記複数の複合体の各複合体における各成分が異なるビーズに付着している、項目3に記載の方法。
(項目12)
前記マトリックスが表面であり、前記複数の複合体の各複合体における各成分が前記表面の異なる位置に付着している、項目3に記載の方法。
(項目13)
前記第1のタンパク質プローブおよび前記第2のタンパク質プローブが、抗体、ペプチド、アプタマー、およびペプトイドからなる群から独立して選択される、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが、直線的に組み合わされて一緒に共有結合した複数の標識付着領域を含み、各標識付着領域が、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列に、前記検出可能な標識が付着している、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記ナノレポーターが、リンカーオリゴへのハイブリダイゼーションを通して前記第2のプローブに付着している、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記ナノレポーターが、摂氏約32度〜約40度の温度で前記リンカーオリゴにハイブリダイズしている、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記ナノレポーターが、摂氏約37度〜約45度の温度で前記リンカーオリゴにハイブリダイズしている、項目15に記載の方法。
(項目18)
前記ナノレポーターが、摂氏約37度の温度で前記リンカーオリゴにハイブリダイズしている、項目15に記載の方法。
(項目19)
前記ナノレポーターが、前記リンカーオリゴに相補的である部分を含む、項目15に記載の方法。
(項目20)
前記相補的領域が約15個〜約20個の塩基である、項目19に記載の方法。
(項目21)
試料における少なくとも1つのタンパク質の濃度を決定するための方法であって、
(a)(i)少なくとも1つのタンパク質、
(ii)前記少なくとも1つのタンパク質の第1の領域に特異的な第1のタンパク質プローブであって、前記第1のタンパク質プローブは、第1の捕獲領域または第1のマトリックスに付着している、第1のタンパク質プローブ、
(iii)前記少なくとも1つのタンパク質の第2の領域に特異的な第2のタンパク質プローブであって、前記第2のタンパク質プローブは、シグナルオリゴを含む、第2のタンパク質プローブ、および
(iv)前記第1のプローブが第1捕獲領域に付着している場合:第2のマトリックスであって、前記第1のタンパク質プローブにおける前記捕獲領域に結合し得る成分が前記第2のマトリックスに付着している、第2のマトリックス
を供給する工程;
(b)前記少なくとも1つのタンパク質、前記第1のタンパク質プローブ、および前記第2のタンパク質プローブを含む少なくとも第1の複合体を形成する工程であって、前記少なくとも1つのタンパク質が前記第1のタンパク質プローブおよび前記第2のタンパク質プローブに結合しており、前記第1のプローブが第1の捕獲領域に付着している場合、前記捕獲プローブが前記第2のマトリックスにおける前記成分に結合している、工程;
(c)前記シグナルオリゴを前記第1複合体から遊離させる工程;
(d)(1)少なくとも前記シグナルオリゴ、ならびに
(2)シグナルオリゴ特異的領域、およびナノレポーターを含む領域を含む少なくとも1つのオリゴプローブ
を含む第2の複合体を形成する工程であって、前記ナノレポーターが複数の異なる検出可能な標識を含む、工程;
(e)前記ナノレポーターの1つまたは複数の分子の存在を個々にカウントする工程を含む方法によって前記第2の複合体または前記第2の複合体の少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、前記第2の1つまたは複数の分子の存在が前記試料における前記タンパク質の濃度を示している、工程
を含む、方法。
(項目22)
前記シグナルオリゴが第2の捕獲領域に付着している、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記シグナルオリゴの前記遊離工程が、前記シグナル分子を第3のマトリックスへと直接的または間接的に捕獲する工程をさらに含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記ナノレポーターが定常領域をさらに含み、該定常領域が複数の反復ヌクレオチド配列を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記定常領域を前記第3マトリックスにおける第2の成分に結合させる工程であって、前記第2成分が前記定常領域を結合し得る、工程をさらに含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記個々に検出する工程が、デジタルシグナルを検出する工程をさらに含む、項目21に記載の方法。
(項目27)
前記第1マトリックスがビーズおよびアレイからなる群から選択される、項目21に記載の方法。
(項目28)
前記第2のマトリックスがビーズおよびアレイからなる群から選択される、項目21に記載の方法。
(項目29)
複数の複合体を形成する工程を含む方法によって複数の標的タンパク質の濃度を決定する工程をさらに含み、各複合体が
(i)少なくとも1つの標的タンパク質、
(ii)前記少なくとも1つのタンパク質の第1の領域に特異的な第1のタンパク質プローブであって、前記第1のタンパク質プローブが、捕獲領域または第1のマトリックスに付着している、第1のタンパク質プローブ、
(iii)前記少なくとも1つのタンパク質の第2の領域に特異的な第2のタンパク質プローブであって、前記第2のタンパク質プローブは、シグナル分子を含む、第2のタンパク質プローブ
を含み、前記第1のプローブが第1捕獲領域に付着している場合、前記捕獲プローブが前記第2のマトリックスにおける前記成分に結合しており、それぞれの前記複数の複合体におけるそれぞれの第2のタンパク質プローブが異なるシグナルオリゴを含む、項目21に記載の方法。
(項目30)
第1マトリックスがビーズであり、該ビーズが複数の同一の第1のタンパク質プローブを含む、項目29に記載の方法。
(項目31)
2個以上の標的タンパク質の濃度が決定される、項目29に記載の方法。
(項目32)
2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、または1000個より多い異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目29に記載の方法。
(項目33)
最高2000個までの異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目29に記載の方法。
(項目34)
最高980個までの異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目29に記載の方法。
(項目35)
前記第1のタンパク質プローブおよび前記第2のタンパク質プローブが、抗体、ペプチド、アプタマー、およびペプトイドからなる群から独立して選択される、項目21に記載の方法。
(項目36)
前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが、直線的に組み合わされて一緒に共有結合した複数の標識付着領域を含み、各標識付着領域が、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列に、前記検出可能な標識が付着している、項目21に記載の方法。
(項目37)
試料における少なくとも1つのタンパク質の濃度を決定するための方法であって、
(a)(i)少なくとも1つのタンパク質、
(ii)前記少なくとも1つのタンパク質の第1の領域に特異的な第1のタンパク質プローブであって、第1のオリゴに付着している前記第1のタンパク質プローブ、
(iii)前記少なくとも1つのタンパク質の第2の領域に特異的な第2のタンパク質プローブであって、第2のオリゴに付着している前記第2のタンパク質プローブ
を供給する工程;
(b)前記少なくとも1つのタンパク質、前記第1のタンパク質プローブ、および前記第2のタンパク質プローブを含む第1の複合体を形成する工程であって、前記少なくとも1つのタンパク質が前記第1のタンパク質プローブおよび前記第2のタンパク質プローブに結合している、工程;
(c)前記第1のオリゴおよび前記第2のオリゴをライゲーションして、シグナルオリゴを形成する工程;
(d)(1)前記第1シグナルオリゴ、ならびに
(2)シグナルオリゴ特異的領域、およびナノレポーターを含む領域を含む少なくとも1つのオリゴプローブ
を含む第2の複合体を形成する工程であって、前記ナノレポーターが複数の異なる検出可能な標識を含む、工程;
(e)前記ナノレポーターの1つまたは複数の分子の存在を個々にカウントすることを含む方法によって前記第2の複合体または前記第2の複合体の少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、前記1つまたは複数の分子の存在が前記試料における前記タンパク質の濃度を示している、工程
を含む、方法。
(項目38)
前記シグナルオリゴを前記第1複合体から遊離させる工程をさらに含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記シグナルオリゴが捕獲領域を含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記シグナルオリゴの前記遊離工程が、前記シグナル分子をマトリックスへと直接的または間接的に捕獲する工程をさらに含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記個々に検出する工程が、デジタルシグナルを検出する工程をさらに含む、項目37に記載の方法。
(項目42)
複数の複合体を形成する工程を含む方法によって複数の標的タンパク質の濃度を決定する工程をさらに含み、各複合体が
(i)少なくとも1つの標的タンパク質、
(ii)前記少なくとも1つのタンパク質の第1の領域に特異的な第1のタンパク質プローブであって、前記第1のタンパク質プローブが、第1のオリゴに付着している、第1のタンパク質プローブ、
(iii)前記少なくとも1つのタンパク質の第2の領域に特異的な第2のタンパク質プローブであって、前記第2のタンパク質プローブが、第2のオリゴに付着している、第2のタンパク質プローブ
を含み、前記第1のオリゴと前記第2のオリゴとのライゲーションがシグナルオリゴを形成し、前記複数の複合体における各複合体が異なるシグナルオリゴを含む、項目37に記載の方法。
(項目43)
2個以上の標的タンパク質の濃度が決定される、項目42記載の方法。
(項目44)
2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、または1000個より多い異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目43に記載の方法。
(項目45)
少なくとも972個の異なる標的タンパク質の濃度が決定される、項目41に記載の方法。
(項目46)
前記第1のタンパク質プローブおよび前記第2のタンパク質プローブが、抗体、ペプチド、アプタマー、およびペプトイドからなる群から独立して選択される、項目37に記載の方法。
(項目47)
前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが、直線的に組み合わされて一緒に共有結合した複数の標識付着領域を含み、各標識付着領域が、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列に、前記検出可能な標識が付着している、項目37に記載の方法。
(項目48)
固有的に標識されたタンパク質プローブの集団であって、各プローブが、
i)標的特異的領域;および
ii)ナノレポーターを含む領域であって、前記ナノレポーターは、複数の異なる検出可能な分子を含む、領域;
を含み、各タンパク質プローブにおける前記ナノレポーターが、それを前記集団における他のナノレポーターから区別する検出可能なシグナルを有する、集団。
(項目49)
標的特異的領域が、抗体、ペプチド、アプタマー、およびペプトイドからなる群から選択される、項目48に記載の集団。
(項目50)
前記ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが、直線的に組み合わされて一緒に共有結合した複数の標識付着領域を含み、各標識付着領域が、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列に、前記検出可能な標識が付着している、項目48に記載の集団。
(項目51)
前記標的特異的領域の解離定数が約1.00×10−15〜約1.00×10−08である、項目48に記載の集団。
(項目52)
前記ナノレポーターが、リンカーオリゴへのハイブリダイゼーションを通して前記タンパク質プローブに付着している、項目48に記載の集団。
(項目53)
前記ナノレポーターが、摂氏約32度〜約40度の温度で前記リンカーオリゴにハイブリダイズしている、項目52に記載の集団。
(項目54)
前記ナノレポーターが、摂氏約37度の温度で前記リンカーオリゴにハイブリダイズしている、項目53に記載の集団。
(項目55)
前記ナノレポーターが、リンカーオリゴに相補的である部分を含む、項目52に記載の集団。
(項目56)
前記相補的領域が約15個〜約20個の塩基である、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記ナノレポーターが、リンカーオリゴへのハイブリダイゼーションを通して前記抗体に付着しており、前記ナノレポーターが、摂氏約37〜45度の温度で前記リンカーオリゴにハイブリダイズしている、項目49に記載の集団。
本発明の特に好ましい実施形態について詳細に言及する。好ましい実施形態の例は、次の実施例セクションにおいて示されている。
タンパク質プローブは、少なくとも1つの標的タンパク質、少なくとも1つの標的タンパク質代理物、または両方と結合するように設計される分子または集合体であり;適切な条件下で、タンパク質プローブおよび標的タンパク質を含む分子複合体を形成することができる。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「アミノ酸配列」は、本明細書では交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは線状でも分岐型でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸または合成アミノ酸が割り込んでいてもよい。その用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって改変されているアミノ酸ポリマーも含む。本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」は、天然および/または非天然または合成アミノ酸のいずれをも指し、それらには、グリシンおよびD型またはL型の光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体が挙げられるが、それらに限定されない。
標的タンパク質は、タンパク質プローブのそれへの結合によって検出または測定されるタンパク質であり、そのタンパク質プローブの標的特異的領域(複数可)が認識する。しかしながら、本発明は、核酸、脂質、糖質、小分子、有機モノマー、または薬物などのタンパク質以外の他の標的の検出を含む。本明細書における方法によって分析することができる核酸には、二本鎖DNA、一本鎖DNA、一本鎖DNAヘアピン、DNA/RNAハイブリッド、RNA(例えば、mRNAまたはmiRNA)、およびRNAヘアピンが挙げられる。便宜上のみ、本明細書に記載された方法は、ほとんどタンパク質を分析することに関連して説明されている。しかしながら、本明細書に記載された実施形態はまた、非タンパク質標的を検出するために用いることもできる。
本発明は、生体分子試料における個々の標的タンパク質の検出および定量化のための方法を提供する。特に、本発明は、個々の標的タンパク質を結合し得るタンパク質プローブを提供する。本発明はまた、ナノレポーターの使用を提供する。ナノレポーターの標識コードを通して、タンパク質プローブの標的分子への結合は、標的分子の同定をもたらす。そのようなタンパク質プローブおよび/またはナノレポーターを作製して用いる方法もまた提供される。
特定の標的に会合するシグナルのコード(ナノレポーター標識コード)を提供するナノレポーター。いくつかの実施形態において、タンパク質プローブに会合したシグナルオリゴまたはリンカーオリゴへのナノレポーターの結合の際、ナノレポーターコードは、ナノレポーターが結合しているシグナルオリゴまたはタンパク質プローブを同定する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のナノレポーターは、以下の2つの主要な部分を含む:(i)タンパク質プローブに会合したシグナルオリゴまたはリンカーオリゴに特異的な配列;および(ii)標識されたナノレポーター。いくつかの実施形態において、ナノレポーターはタンパク質プローブに直接的に付着している。
本発明のナノレポーターは、放射性同位元素、蛍光色素、色素、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または直接的(例えば、発光により)もしくは間接的(例えば、蛍光標識抗体の結合により)に検出することができる当技術分野において公知の他のモノマーなど、様々な標識モノマーのいずれかで標識することができる。一般的に、ナノレポーターにおける標識付着領域のうちの1つまたは複数が、1つまたは複数の標識モノマーで標識され、ナノレポーターの標識付着領域に付着した標識モノマーによって提供されるシグナルは、ナノレポーターの標的特異的領域が結合する標的を同定する検出可能なコードを構成する。ある特定の実施形態において、標識付着領域からの所定のシグナルの欠如(例えば、ダークスポット)もまた、ナノレポーターコードの部分を構成することができる。
当技術分野において公知の様々なアフィニティータグは、例えば、ナノレポーターを精製および/または固定化するために、用いられ得る。いくつかの実施形態において、ビオチンアンカーが、ナノレポーターに付着しており、ナノレポーターのストレプトアビジンコーティング化スライド上への固定化を可能にする。
本発明のタンパク質プローブおよびナノレポーター系は、任意の生体分子試料において標的タンパク質を検出するために用いることができる。当業者によって認識されているように、試料は、物質をいくらでも含んでいてもよく、その例には以下が挙げられるが、それらに限定されない:(初代細胞および培養細胞系の両方を含む)細胞、細胞可溶化物または細胞抽出物、ならびに組織および組織抽出物などの生体試料;体液(血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣の分泌液、汗および精液、漏出液、滲出液(例えば、膿瘍、または感染もしくは炎症の任意の他の部位から得られる液体)または事実上、任意の器官の関節(例えば、正常な関節、または関節リウマチ、変形性関節症、痛風、もしくは化膿性関節炎などの疾患に冒された関節)から得られる液体が挙げられるが、哺乳類試料が好ましく、ヒト試料が特に好ましい;環境試料(空気、農業、水、および土の試料が挙げられるが、それらに限定されない);生物戦剤試料;細胞培養物由来の細胞外液、細胞外上清、細菌における封入体、細胞コンパートメント、細胞周辺質、ミトコンドリアコンパートメントなどを含む研究試料。
ナノレポーターは、所定のナノレポーター上の特定のシグナルを検出し得る、当技術分野において利用可能な任意の手段によって検出される。ナノレポーターが蛍光標識されている場合、適切な励起源についての相応の考慮を吟味してもよい。可能な源として、アークランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオード、またはそれらのいくかの組み合わせを挙げることができるが、それらに限定されない。適切な励起源が、適切な光学的検出系、例えば、倒立蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、または共焦点顕微鏡と共に用いられる。好ましくは、ナノレポーター上のスポットの配列を決定するのに十分な空間分解能での検出を可能にすることができる顕微鏡が用いられる。例えば、一実施形態において、標的分子にハイブリダイズした二重ナノレポーターの画像を得ることができる。例えば、ナノレポーターが3つの異なる色、(それぞれ、1、2、および3と名付けられた)Alexa 488、Cy3、およびAlexa 647で標識されている場合には、色1、2、および3がそれぞれ、異なるチャネルで獲得され、スポットの列として見ることができる第1および第2レジスターは、各レジスターを個々に示すことができるように数個のピクセルによってシフトアップされる。
本発明の組成物および方法は、診断、予後、治療、患者層別化、薬物開発、処置選択、およびスクリーニングを目的として用いることができる。本発明は、多くの異なる標的タンパク質が、本発明の方法を用いて単一の生体分子試料から一度に分析することができるという利点を提供する。これは、例えば、いくつかの診断検査を1つの試料で実施することを可能にする。
本発明はさらに、本発明の1つまたは複数のコンポーネントを含むキットを提供する。キットは、例えば、1つもしくは複数のタンパク質プローブセット、および/または1つもしくは複数のナノレポーターを含み得る。キットは、上記のものを含め、当業者にとって明らかないずれの目的のためにも用いることができる。
図1に、この実施例についてのプロトコールの図を示す。この実施例において、アッセイは、タンパク質プローブの低い結合親和性とレポーターの作用濃度とのミスマッチに関する問題を排除するために、タンパク質標的の結合をレポーターのハイブリダイゼーションから分離するように設定される。
10対1のリンカーオリゴ対抗体の比を用いるランダムアミン付着により、リンカーオリゴを抗体に付着させた。簡単に述べれば、二機能性クロスリンカーのスルホサクシニミジル4−[p−マレイミドフェニル]ブチレート(SMPB)(ThermoFisher, Inc.、Waltham、MA)を、抗IL2抗体Aに結合し、その後、室温で、1:3の抗体:オリゴの比でチオール化オリゴに反応させて、クロスリンクさせた。その混合物をZebaカラム2X、1000G(ThermoFisher, Inc.、Waltham、MA)に通して流すことによって、SMPBに連結した抗体Aを精製し、収量を決定する。
オリゴ連結Il2抗体Aおよびシグナルオリゴを3:2のシグナルオリゴ:抗体の比で加えることによって、シグナルオリゴを、IL−2抗体Aに連結したオリゴにあらかじめアニーリングさせた。他の比が企図される。
シグナルオリゴにアニーリングしたIL−2抗体Aを、約1×10−15〜1×10−8Mでのビオチン化抗体B(BAF202、R&D systems, Inc.、Minneapolis、MN)、およびブロッカー(サケ精子)と、標的溶液を加えるための余裕を残して、混合した。標的タンパク質IL−2を望ましい希釈度(<1×10−8M)まで加えた。抗体を、100〜15〜100〜8Mの推定Kdに関して10×濃度とした。混合物をインキュベートした。
単離された標的タンパク質/抗体の複合体を洗浄し、シグナルオリゴを、45℃より高い温度で、0.1×SSPEを用いて10〜15分間、溶離させた。より短い時間およびより長い時間が企図される。
各試料におけるシグナルオリゴの検出を、標識ナノレポータープローブおよび非標識ナノレポータープローブの両方を有する二重ナノレポーター系を用いて行った。各試料由来のシグナルオリゴを、以下のような最終濃度のハイブリダイゼーション試薬とハイブリダイズさせた:非標識ビオチン化プローブ、標識レポータープローブ、5×SSPE(pH7.5)、5×デンハルト試薬(Sigma)、剪断化サケ精子DNA(Sigma)、および界面活性剤。試薬を混合し、加熱フタ付きのサーモサイクラーブロック内で16時間、インキュベートした。
ハイブリダイズしていないレポーターを除去するために、ビオチン化プローブごとに含まれる3’−反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合した磁気ビーズ(InvitrogenTM)に関して反応物を精製した。反応物をまず、0.1%界面活性剤中のSSPE混合物/TEで希釈し、20℃より高い温度で、連続的に回転させながら、ビーズに結合させた。ビーズを、SSPEおよび界面活性剤の中で3回洗浄し、ハイブリダイズした複合体を0.1×SSPE/0.1%界面活性剤混合物中、45℃で15分間、溶離させた。溶離後、レポータープローブごとに含まれる5’−反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合した磁気ビーズに結合させることによって過剰のビオチン化プローブを除去するように、試料の2度目の精製を行った。抗3’−反復配列ビーズからの溶離は、最終濃度の1×SSPEでもたらされ、回転させながら、22.5℃で15分間、結合させた。ビーズを上記のように洗浄し、0.1×SSPE/0.1%界面活性剤混合物中、40℃より高い温度で、溶離させた。その後、その二重に精製された試料を、下記のような捕獲のために調製した。
結果を図2に示す。この実験の結果より、IL−2が本明細書に記載されたアッセイによって検出されたことが示された(図2)。この実験より、約110−11〜110−10Mの感度が示された。検出の効率は、図3においてプロットで示された傾きである。観察された効率は、おそらく、シグナルオリゴが付着している抗体の結合親和性によるものであった。この抗体は、約1.3×10−7のKdを有すると思われる。効率は、この抗体を約10−9のKdを有する抗体と交換することによって100×増加し得ることが予想される。
図4に、この実施例についてのプロトコールの図を示す。この実施例において、ナノレポーターは抗体のうちの1つに付着している。抗体の調製および試料への結合は、実施例1に記載されたプロトコールと類似して起こる。図4に記載されたアッセイにおいて、抗体のうちの1つがビオチンに結合しており、その他の抗体がナノレポーターを付着させている、標的タンパク質と抗体の複合体が形成される。
1つのアプローチは、抗体の標的タンパク質への結合前に、抗体をレポーターに付着させることである。このアプローチは、1×10−7Mのレポーターからみ合い閾値より有意に低い多重化レポーターの濃度を可能にするために、非常に強い結合親和性(Kd)抗体を必要とする。
図6に、この実施例についてのプロトコールの図を示す。この実施例において、捕獲抗体は、表面、例えば、磁気ビーズに付着しており、第2抗体はシグナルオリゴに付着している。抗体は、実施例1に記載された方法を含む当技術分野において公知の任意の方法によって調製することができる。この実施例において、タンパク質とナノレポーターは、十分離れており、それが、タンパク質の粘着性に関する懸念を排除している。このアッセイにおいて、表面における局所的抗体濃度は高くあり得る。
図7に、この実施例についてのプロトコールの図を示す。この実施例において、捕獲抗体は、表面、例えば、磁気ビーズに付着しており、第2抗体は、溶液中にあるか、またはビオチン化シグナルオリゴに付着している。このアッセイは、それがたった2回のビーズ精製を必要とするのみであるという利点を提供する。加えて、このアッセイにおいて、実施例2のように、タンパク質とナノレポーターは、十分離れており、それが、タンパク質の粘着性に関する懸念を排除している。実施例3に記載されているように、標的タンパク質を、捕獲抗体、標識抗体シグナルオリゴの複合体、およびブロッカーと混合する。実施例3に記載されているように、標的タンパク質と抗体の複合体を、捕獲抗体における磁気ビーズを用いて精製する。
図8に、この実施例についてのプロトコールの図を示す。このアッセイにおいて、2つの物理的に近接したオリゴをライゲーションさせる。オリゴを含むプローブは、標的タンパク質に対として結合するように、かつプローブが近接した状態になった場合、ライゲーションによってシグナルオリゴを形成するように設計される。
この実施例は実施例1に類似しているが、検出が多重化されており、抗体とオリゴの間に異なる結合化学作用を利用している。
シグナルオリゴを、一連の温度、典型的には、約4℃〜約37℃までで、かつ1×PBSにおいて最小の交差反応性を有するように設計した。シグナルオリゴと標識オリゴの間の固有の重複は、1×PBSにおいて51〜56の融解温度を有し、37℃でシグナルオリゴを標識オリゴにハイブリダイズさせることを可能にした。これらの15〜17個の塩基の重複は、0.1×SSPEにおいて41℃〜45℃の融解温度を有し、磁気ビーズ精製後の溶離を可能にした。
オリゴを、アルデヒド−ヒドラジン化学作用を用いて、抗体に結合させた。全ての抗体および標的を、R&D systems,Inc.(Minneapolis、MN)から購入した。各抗体A(表1参照)を、サイズ排除スピンカラム(0.5ml Zeba Spin Column、Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)を用いて脱塩した。サクシニミジル6−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン(Solulink、San Diego、CA)を各抗体Aに反応させた。各抗体を再び、サイズ排除スピンカラムを用いて精製した。
各固有のシグナルオリゴを、各抗体Aに連結した固有オリゴに、オリゴ連結抗体Aおよび対応するシグナルオリゴを4:1の比、シグナルオリゴ:抗体比で加えることによって、別々にあらかじめアニーリングさせた。他の比が企図される。
ブロッカー(サケ精子)と共に約1×10−15〜1×10−8Mで単一チューブ中にシグナルオリゴにアニーリングした各抗体Aおよびビオチン化抗体B(4ペア)を含む2×マスターミックスを作製した。このマスターミックスのアリコートに望ましい希釈度(<1×10−8M)まで標的タンパク質を加えた。抗体は、10−15〜10−8Mの推定Kdに関して10×濃度であった。混合物をインキュベートした。
単離された標的タンパク質/抗体の複合体を洗浄し、シグナルオリゴを、45℃より高い温度で、0.1×SSPEを用いて10〜15分間、溶離させた。より短い時間およびより長い時間が企図される。
各試料におけるシグナルオリゴの検出を、標識ナノレポータープローブおよび非標識ナノレポータープローブの両方を有する二重ナノレポーター系を用いて行った。各試料由来のシグナルオリゴを、以下のような最終濃度のハイブリダイゼーション試薬とハイブリダイズさせた:非標識ビオチン化プローブ、標識レポータープローブ、5×SSPE(pH7.5)、5×デンハルト試薬(Sigma)、剪断化サケ精子DNA(Sigma)、および界面活性剤。試薬を混合し、加熱フタ付きのサーモサイクラーブロック内で16時間、インキュベートした。
ハイブリダイズしていないレポーターを除去するために、ビオチン化プローブごとに含まれる3’−反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合した磁気ビーズ(InvitrogenTM)に関して反応物を精製した。反応物をまず、0.1%界面活性剤中のSSPE混合物/TEで希釈し、20℃より高い温度で、連続的に回転させながら、ビーズに結合させた。ビーズを、SSPEおよび界面活性剤の中で3回洗浄し、ハイブリダイズした複合体を0.1×SSPE/0.1%界面活性剤混合物中、45℃で15分間、溶離させた。溶離後、レポータープローブごとに含まれる5’−反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合した磁気ビーズに結合させることによって過剰のビオチン化プローブを除去するように、試料の2度目の精製を行った。抗3’−反復配列ビーズからの溶離は、最終濃度の1×SSPEでもたらされ、回転させながら、22.5℃で15分間、結合させた。ビーズを上記のように洗浄し、0.1×SSPE/0.1%界面活性剤混合物中、40℃より高い温度で、溶離させた。その後、その二重に精製された試料を、下記のような捕獲のために調製した。
Tetraspeck蛍光マイクロスフェア(InvitrogenTM)のカスタム製剤の溶液を各試料に加えた。試料をNanoString流体装置へ投入し、処理し、画像化した。
結果を図10に示す。この実験の結果より、4つのタンパク質が、本明細書に記載されたアッセイによって同時に検出されたことが示された(図10)。検出されたタンパク質は、TNFα、IL1α、IL6、およびVEGFであった。この実験より、約1×10−12Mの感度が示された。図11は、液体試料に対してプロットされた同じデータを示す。次の実験(図12)により、これらのタンパク質のうちの2つの検出の限界が、26pg/mlおよび38pg/ml(IL1αおよびIL6のそれぞれについて、1.4×10−12Mおよび1.9×10−12M)であることが示された。
抗ストレプトアビジン抗体(Affinity Bioreagents、Rockford、IL)を、実施例1に記載されているように、オリゴヌクレオチド(オリゴ)で標識した。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、かつ記載するが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者にとって明白であろう。多数のバリエーション、変化、および置換が、本発明から逸脱することなしに、当業者に思い浮かぶであろう。本明細書に記載された発明の実施形態の様々な代替を、本発明を実践するのに用い得ることは理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義すること、およびこれらの特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内の方法および構造がそれらに網羅されることが意図される。
Claims (14)
- 試料における少なくとも1つのタンパク質の濃度および少なくとも1つの核酸の濃度を同時に決定するための方法であって、
(a)(i)少なくとも1つのタンパク質、
(ii)少なくとも1つの核酸、
(iii)前記少なくとも1つのタンパク質に特異的な第1のタンパク質プローブであって、前記第1のタンパク質プローブは、第1のシグナルオリゴに直接またはリンカーオリゴを介して間接的に付着している、第1のタンパク質プローブ、および
(iv)前記少なくとも1つの核酸に特異的な第1の核酸プローブであって、前記第1の核酸プローブは、第2のシグナルオリゴに直接またはリンカーオリゴを介して間接的に付着している、第1の核酸プローブ
を供給する工程;
(b)前記少なくとも1つのタンパク質、および前記第1のタンパク質プローブを含む少なくとも第1の複合体を形成する工程;
(c)前記少なくとも1つの核酸、および前記第1の核酸プローブを含む少なくとも第2の複合体を形成する工程;
(d)前記第1のシグナルオリゴを前記第1の複合体から遊離させる工程;
(e)前記第2のシグナルオリゴを前記第2の複合体から遊離させる工程;
(f)(1)少なくとも前記第1のシグナルオリゴ、ならびに
(2)前記第1のシグナルオリゴにハイブリダイズ可能な領域、および第1のナノレポーターを含む領域を含む少なくとも1つの第1のオリゴプローブ
を含む第3の複合体を形成する工程であって、前記第1のナノレポーターが複数の異なる検出可能な標識を含む、工程;ならびに
(g)(1)少なくとも前記第2のシグナルオリゴ、ならびに
(2)前記第2のシグナルオリゴにハイブリダイズ可能な領域、および第2のナノレポーターを含む領域を含む少なくとも1つの第2のオリゴプローブ
を含む第4の複合体を形成する工程であって、前記第2のナノレポーターが複数の異なる検出可能な標識を含む、工程;
(h)前記第1のナノレポーターの複数の異なる検出可能な標識の存在を個々にカウントする工程を含む方法によって前記第3の複合体または前記第3の複合体の少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、前記第1のナノレポーターの前記複数の異なる検出可能な標識のカウントが前記試料における前記タンパク質の濃度を示している、工程;ならびに
(i)前記第2のナノレポーターの複数の異なる検出可能な標識の存在を個々にカウントする工程を含む方法によって前記第4の複合体または前記第4の複合体の少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、前記第2のナノレポーターの前記複数の異なる検出可能な標識のカウントが前記試料における前記核酸の濃度を示している、工程
を含む、方法。 - 前記第1または第2のシグナルオリゴの前記遊離工程が、前記第1または第2のシグナルオリゴをマトリックスへと直接的または間接的に捕獲する工程をさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記第1または第2のナノレポーターが定常領域をさらに含み、前記定常領域が複数の反復ヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記定常領域が前記マトリックスにおける成分に結合する工程をさらに含み、前記成分が前記定常領域を結合し得る、請求項3に記載の方法。
- 前記マトリックスが、ビーズおよびアレイからなる群から選択される、請求項2または4に記載の方法。
- 複数の第1の複合体および複数の第2の複合体を形成する工程を含む方法によって試料における複数の標的タンパク質および複数の標的核酸の濃度を決定する工程をさらに含み、各第1の複合体が
(i)少なくとも1つの標的タンパク質、および
(ii)前記少なくとも1つの標的タンパク質に特異的な第2のタンパク質プローブであって、前記第2のタンパク質プローブの標的タンパク質は、前記第1のタンパク質プローブの標的タンパク質とは異なり、前記複数の第1の複合体における前記第2のタンパク質プローブは、シグナルオリゴに直接、または、リンカーオリゴを介して間接的に付着しており、ここで、前記複数の第1の複合体のそれぞれにおける各第2のタンパク質プローブのシグナルオリゴは、前記第1のタンパク質プローブに付着した前記第1のシグナルオリゴとは異なる、第2のタンパク質プローブ
を含み、
各第2の複合体が
(i)少なくとも1つの標的核酸、および
(ii)前記少なくとも1つの標的核酸に特異的な第2の核酸プローブであって、前記第2の核酸プローブの標的核酸は、前記第1の核酸プローブの標的核酸とは異なり、前記複数の第2の複合体における前記第2の核酸プローブは、シグナルオリゴに直接、または、リンカーオリゴを介して間接的に付着しており、ここで、前記複数の第2の複合体のそれぞれにおける各第2の核酸プローブのシグナルオリゴは、前記第1の核酸プローブに付着した前記第2のシグナルオリゴとは異なる、第2の核酸プローブ
を含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記シグナルオリゴを、前記複数の第1の複合体および前記複数の第2の複合体から遊離させることにより、複数の遊離したシグナルオリゴが生成される工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- さらに以下:
それぞれが(1)少なくとも1つの遊離したシグナルオリゴ、および、(2)前記遊離したシグナルオリゴにハイブリダイズ可能な領域と、ナノレポーターを含む領域とを含む少なくとも1つのオリゴプローブ、を含む複数の第3および第4の複合体を形成する工程であって、前記ナノレポーターが複数の異なる検出可能な標識を含む、工程;ならびに
前記ナノレポーターの複数の異なる検出可能な標識の存在を個々にカウントする工程を含む方法によって前記複数の第3の複合体のそれぞれまたは前記複数の第3の複合体のそれぞれの少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、前記ナノレポーターの前記複数の異なる検出可能な標識のカウントが前記試料における前記複数の標的タンパク質のそれぞれの濃度を示している、工程;ならびに
前記ナノレポーターの複数の異なる検出可能な標識の存在を個々にカウントする工程を含む方法によって前記複数の第4の複合体のそれぞれまたは前記複数の第4の複合体のそれぞれの少なくとも一部分を個々に検出する工程であって、前記ナノレポーターの前記複数の異なる検出可能な標識のカウントが前記試料における前記複数の標的核酸のそれぞれの濃度を示している、工程
を含む、請求項7に記載の方法。 - 前記個々に検出する工程が、デジタルシグナルを検出する工程を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、または1000個より多く、かつ、2000個以下の異なる標的タンパク質の濃度が決定され、そして、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個、50個、100個、200個、300個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、または1000個より多く、かつ、2000個以下の異なる標的核酸の濃度が決定される、
請求項6〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも972個の異なる標的タンパク質の濃度が決定され、そして、少なくとも972個の異なる標的核酸の濃度が決定される、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 各タンパク質プローブが、抗体、ペプチド、アプタマー、およびペプトイドからなる群から独立して選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 各ナノレポーターが一本鎖核酸バックボーンを含み、前記バックボーンが、直線的に組み合わされて一緒に共有結合した複数の標識付着領域を含み、各標識付着領域が、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、前記相補的ポリヌクレオチド配列に、前記検出可能な標識が付着している、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 各タンパク質プローブの解離定数または各タンパク質プローブの標的特異的領域の解離定数がそれぞれ、1.00×10−15〜1.00×10−08である、請求項13に記載の方法。
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