CN116047054A - 用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法，用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：检测抗体溶液的制备：提供抗人IgG抗体溶液和生物素，向抗人IgG抗体溶液中加入生物素进行标记处理以得到生物素标记的检测抗体溶液，将生物素标记的检测抗体溶液用血小板反应缓冲液稀释后得到检测抗体溶液，抗人IgG抗体与生物素的摩尔比为1:(5~20)；偶联物溶液的制备：提供荧光素链霉亲和素溶液，用血小板反应缓冲液稀释后得到偶联物溶液，控制每毫升偶联物溶液含有1‑5微克荧光素链霉亲和素。本发明解决了现有制备方法制备得到的试剂盒检测效率低和准确度低的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体地说，是关于一种用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法。
背景技术
自身免疫性血小板减少症是一类由自身抗体导致血小板破坏增多的出血性疾病，自身免疫性血小板减少症的英文简称为ITP。多数学者认为自身免疫性血小板减少症与体液免疫有关，机体对血小板相关抗原发生免疫反应，产生抗血小板抗体，大量的抗血小板抗体活跃于脾脏中，血小板会通过脾脏以高度的选择性与抗血小板抗体发生结合，不仅会使人们出现各种过敏反应，而且结合完成后还会被单核巨噬细胞完全吞噬掉，此时血小板的含量发生骤降，患有自身免疫性血小板减少症的患者的骨髓巨核细胞有成熟障碍。在排除其他继发性血小板减少症的基础上，目前ITP的诊断仍依赖临床表现和骨髓检查。
检测血小板抗体虽然已成为ITP实验室诊断的一个重要指标，但是市面上制备得到的检测血小板抗体的试剂盒由于检测抗体为多克隆抗体且试剂盒操作步骤繁琐的缘故，导致试剂盒在使用过程中需要的检测时间长且检测操作复杂；同时有些试剂盒中的检测抗体为单克隆抗体，然而单克隆抗体直接与生物素连接进行检测，检测过程中单克隆抗体与生物素之间的空间位阻的影响较大，从而对检测结果造成不良的影响，以上原因导致现有试剂盒存在检测效率低和准确度低的缺点。
因此，需要提供一种新的用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法以解决现有技术存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法，以解决现有制备方法制备得到的试剂盒检测效率低和准确度低的问题。
为实现上述目的，本发明的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
检测抗体溶液的制备：提供抗人IgG抗体溶液和生物素，向所述抗人IgG抗体溶液中加入生物素进行标记处理以得到生物素标记的检测抗体溶液，将所述生物素标记的检测抗体溶液用血小板反应缓冲液稀释后得到所述检测抗体溶液，所述抗人IgG抗体与所述生物素的摩尔比为1:(5~20)；
偶联物溶液的制备：提供荧光素链霉亲和素溶液，将所述荧光素链霉亲和素溶液混合均匀用血小板反应缓冲液稀释后得到所述偶联物溶液，控制每毫升所述偶联物溶液含有1-5微克荧光素链霉亲和素。
本发明所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法的有益效果在于：通过提供抗人IgG抗体溶液和生物素，使得检测抗体与血小板抗体之间更容易结合，通过向所述抗人IgG抗体溶液中加入生物素进行标记处理以得到生物素标记的检测抗体溶液，将所述生物素标记的检测抗体用血小板反应缓冲液稀释后得到所述检测抗体溶液，使得抗人IgG抗体与生物素的特异性连接得到改善，从而减少后续操作步骤，节省操作时间；通过所述抗人IgG抗体与所述生物素的摩尔比为1:(5~20)以及每毫升所述偶联物溶液含有1-5微克荧光素链霉亲和素，使得抗人IgG抗体与生物素之间的空间位阻的影响降低，从而使得试剂盒对血小板抗体检测结果的准确度和检测效率同时得到提高。本发明解决了现有制备方法制备得到的试剂盒检测效率低和准确度低的问题。
可选的，控制每毫升所述检测抗体溶液含有5-10微克所述抗人IgG抗体，控制每毫升所述检测抗体溶液含有0.1-0.5微克所述生物素。其有益效果在于：使得检测抗体和生物素之间的空间位阻的影响进一步降低。
可选的，所述生物素为琥珀酰亚胺-6-(生物素酰氨基)-6-己酰氨基己酸酯。
可选的，所述用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，还包括以下步骤：
捕获抗体微球混合液的制备：提供抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和抗人GMP140特异性抗体微球溶液；将所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和所述抗人GMP140特异性抗体微球溶液混合均匀后，使用血小板反应缓冲液稀释100-300倍，得到所述捕获抗体微球混合液。其有益效果在于：该方法制备得到的试剂盒能够一次检测五种特异性抗体，使得试剂盒的检测效率和准确度均大大提高，同时降低检测时间、降低试剂和人工的成本。
可选的，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有100-300微克捕获抗体，每毫升所述捕获抗体微球混合液含有2.5×105~1.0×106个微球，所述捕获抗体包括抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体，所述微球包括第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球、第四荧光微球和第五荧光微球。其有益效果在于：每毫升捕获抗体微球混合液中，微球的数量为2.5×105~1.0×106个，使得特异性抗体的效价较好。
可选的，所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液的制备步骤包括：提供所述抗人GPⅨ特异性抗体和第一荧光微球悬浮液，将所述抗人GPⅨ特异性抗体和所述第一荧光微球悬浮液混合均匀以使所述抗人GPⅨ特异性抗体负载于所述第一荧光微球，然后使用血小板反应缓冲液稀释后得到所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有100-300微克所述抗人GPⅨ特异性抗体，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有1.0×107~4.0×107个所述第一荧光微球，所述第一荧光微球悬浮液包括所述第一荧光微球。
可选的，所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球的内部包被有不同浓度的别藻蓝蛋白以使所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球显示出不同的荧光强度。
本发明的又一目的在于提供一种用于检测血小板抗体的试剂盒，所述用于检测血小板抗体的试剂盒是由所述用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法制备得到。
本发明所述用于检测血小板抗体的试剂盒的有益效果在于：所述用于检测血小板抗体的试剂盒的检测结果具有较高的准确度和灵敏度，同时具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数不大于15%，批间实验的变异系数不大于15%。
可选的，所述用于检测血小板抗体的试剂盒还包括血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测血小板抗体的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S0：提供血小板、捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品；
S1：使用所述血小板裂解液对所述血小板进行裂解，震荡孵育后离心取上清液以得到待检样本，向所述待检样本中依次加入所述捕获抗体微球混合液和所述检测抗体溶液振荡孵育，然后再加入所述偶联物溶液振荡孵育，再加入所述洗涤缓冲液，进行涡旋重悬，以得到待检测物；
S2：检测所述待检测物的荧光类型和荧光强度，以得到所述待检测物中是否含有血小板抗体。
本发明的用于检测血小板抗体的试剂盒的使用方法的有益效果在于：使用方法简单，且检测结果的准确性和灵敏度均得到提高。
附图说明
图1为本发明实施例的抗人GPⅨ特异性抗体、抗人IgG抗体、第一荧光微球、生物素和藻红蛋白标记的链霉亲和素之间的关系示意图；
图2为本发明实施例的捕获抗体微球的分布情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明的实施例，提供了一种用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
检测抗体溶液的制备：提供抗人IgG抗体溶液和生物素，向所述抗人IgG抗体溶液中加入生物素进行标记处理以得到生物素标记的检测抗体溶液，将所述生物素标记的检测抗体溶液用血小板反应缓冲液稀释后得到所述检测抗体溶液，所述抗人IgG抗体与所述生物素的摩尔比为1:(5~20)；
偶联物溶液的制备：提供荧光素链霉亲和素溶液，将所述荧光素链霉亲和素溶液混合均匀用血小板反应缓冲液稀释后得到所述偶联物溶液，控制每毫升所述偶联物溶液含有1-5微克荧光素链霉亲和素。
具体的，通过提供抗人IgG抗体溶液和生物素，使得检测抗体与血小板抗体之间更容易结合，通过向所述抗人IgG抗体溶液中加入生物素进行标记处理以得到生物素标记的检测抗体溶液，将所述生物素标记的检测抗体用血小板反应缓冲液稀释后得到所述检测抗体溶液，使得抗人IgG抗体与生物素的特异性连接得到改善，从而减少后续操作步骤，节省操作时间；通过所述抗人IgG抗体与所述生物素的摩尔比为1:(5~20)以及每毫升所述偶联物溶液含有1-5微克荧光素链霉亲和素，使得抗人IgG抗体与生物素之间的空间位阻的影响降低，从而使得试剂盒对血小板抗体检测结果的准确度和检测效率同时得到提高。本发明解决了现有制备方法制备得到的试剂盒检测效率低和准确度低的问题。
本发明的一些实施例，所述荧光素链霉亲和素中的荧光素为藻红蛋白、别藻蓝蛋白、紫草素叶绿素、异硫氰酸荧光素中的任意一种。
本发明的一些具体实施例，所述抗人IgG抗体与所述生物素的摩尔比为1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18和1:19中的任意一种。一些具体实施例，所述荧光素链霉亲和素溶液中的荧光素为藻红蛋白，所述荧光素链霉亲和素溶液是藻红蛋白标记的链霉亲和素溶液。一些更具体的实施例，所述藻红蛋白标记的链霉亲和素溶液含有2微克藻红蛋白标记的链霉亲和素，或含有3微克藻红蛋白标记的链霉亲和素，或含有4微克藻红蛋白标记的链霉亲和素。
本发明的一些实施例，控制每毫升所述检测抗体溶液含有5-10微克所述抗人IgG抗体，控制每毫升所述检测抗体溶液含有0.1-0.5微克所述生物素。使得检测抗体和生物素之间的空间位阻的影响进一步降低。一些具体实施例，控制每毫升所述检测抗体溶液含有6微克、7微克、8微克和9微克的任意一种所述抗人IgG抗体，控制每毫升所述检测抗体溶液含有0.2微克、0.3微克和0.4微克的任意一种所述生物素。
本发明的一些实施例，所述生物素为琥珀酰亚胺-6-(生物素酰氨基)-6-己酰氨基己酸酯。
本发明一些实施例，所述用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，还包括以下步骤：
捕获抗体微球混合液的制备：提供抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和抗人GMP140特异性抗体微球溶液；将所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和所述抗人GMP140特异性抗体微球溶液混合均匀后，使用血小板反应缓冲液稀释100-300倍，得到所述捕获抗体微球混合液。该方法制备得到的试剂盒能够一次检测五种特异性抗体，使得试剂盒的检测效率和准确度均大大提高，同时降低检测时间、降低试剂和人工的成本。
本发明的一些实施例，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有100-300微克捕获抗体，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有2.5×105~1.0×106个微球，所述捕获抗体包括抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体，所述微球包括第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球、第四荧光微球和第五荧光微球。每毫升捕获抗体微球混合液中，微球的数量为2.5×105~1.0×106个，使得特异性抗体的效价较好。一些具体实施例，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有110微克、150微克、200微克、250微克和290微克的任意一种捕获抗体，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有3.0×105个、5.0×105个、7.0×105个、8.6×105个和9.9×105个的任意一种微球。
本发明的一些实施例，所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液的制备步骤包括：提供所述抗人GPⅨ特异性抗体和第一荧光微球悬浮液，将所述抗人GPⅨ特异性抗体和所述第一荧光微球悬浮液混合均匀以使所述抗人GPⅨ特异性抗体负载于所述第一荧光微球，然后使用血小板反应缓冲液稀释后得到所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有100-300微克所述抗人GPⅨ特异性抗体，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有1.0×107~4.0×107个所述第一荧光微球，所述第一荧光微球悬浮液包括所述第一荧光微球。一些具体实施例，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有110微克、150微克、200微克、250微克和290微克的任意一种所述抗人GPⅨ特异性抗体，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有1.5×107个、2.0×108个、2.5×107个、3.3×107个和3.9×107个的任意一种所述第一荧光微球。
本发明的一些实施例，所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球的内部包被有不同浓度的别藻蓝蛋白以使所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球显示出不同的荧光强度。
本发明的一些实施例，所述每毫升所述捕获抗体微球混合液的所述抗人GPⅨ特异性抗体、所述抗人GPⅠb特异性抗体、所述抗人GPⅡb特异性抗体、所述抗人GPⅢa特异性抗体和所述抗人GMP140特异性抗体的含量相同，所述每毫升所述捕获抗体微球混合液的所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球的数量相同。
本发明的实施例，提供了一种用于检测血小板抗体的试剂盒，所述用于检测血小板抗体的试剂盒是由所述用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法制备得到。
具体的，所述用于检测血小板抗体的试剂盒的检测结果具有较高的准确度和灵敏度，同时具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数不大于15%，批间实验的变异系数不大于15%。
本发明的一些实施例，所述用于检测血小板抗体的试剂盒还包括血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
本发明的实施例提供了一种用于检测血小板抗体的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S0：提供血小板、捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品；
S1：使用所述血小板裂解液对所述血小板进行裂解，震荡孵育后离心取上清液以得到待检样本，向所述待检样本中依次加入所述捕获抗体微球混合液和所述检测抗体溶液振荡孵育，然后再加入所述偶联物溶液振荡孵育，再加入所述洗涤缓冲液，进行涡旋重悬，以得到待检测物；
S2：检测所述待检测物的荧光类型和荧光强度，以得到所述待检测物中是否含有血小板抗体。使用方法简单，且检测结果的准确性和灵敏度均得到提高。
图1为本发明实施例的抗人GPⅨ特异性抗体、抗人IgG抗体、第一荧光微球、生物素和藻红蛋白标记的链霉亲和素之间的关系示意图。
本发明的一些实施例，参照图1，所述抗人GPⅨ特异性抗体2固定于所述第一荧光微球1，所述抗人IgG抗体4由所述生物素5标记，首先固定于所述第一荧光微球1上的所述抗人GPⅨ特异性抗体2与待测样品3之间特异性结合，然后与所述生物素5标记的所述抗人IgG抗体4之间特异性结合，最后与藻红蛋白6标记的链霉亲和素7之间结合。
本发明的一些实施例，微球为羧基修饰的不同大小的聚苯乙烯微球，每种聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白(APC)，不同种聚苯乙烯微球可以通过在Beckman公司生产的DxFLEX流式细胞仪上的别藻蓝蛋白通道荧光信号值（APC-A）及别藻蓝蛋白偶联A750染料通道荧光信号值（APC-A750-A）来区分两个通道，A指通过激光时，产生波状信号的曲线下的面积，代表信号强度。可以将聚苯乙烯微球划分成5种不同参数的微球，对应P1~P5类型的荧光微球的APC-A及APC-A750-A通道的检测结果，荧光强度见表1。
表1：
一些具体实施例，所述抗人GPⅨ特异性抗体负载于所述第一荧光微球，所述抗人GPⅠb特异性抗体负载于所述第二荧光微球，所述抗人GPⅡb特异性抗体负载于所述第三荧光微球，所述抗人GPⅢa特异性抗体负载于所述第四荧光微球，所述抗人GMP140特异性抗体负载于所述第五荧光微球。
本发明一些实施例，所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液的制备步骤为：取第一荧光微球1.0×107个，加入500微升含Tween-20的磷酸盐缓冲液（英文简称PBST）清洗两次，分别加入100微克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（简称为EDC）和50微克N-羟基琥珀酰亚胺（简称为NHS）活化第一荧光微球30min，加入100微克抗人GPⅨ特异性抗体室温旋转反应5h，清洗第一荧光微球去除多余的抗人GPⅨ特异性抗体后加入5%脱脂奶粉封闭30分钟，去除封闭液后加入500微升pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷（英文简称Tris）缓冲液后即得所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液。
本发明的一些实施例，所述抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液的制备步骤、抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液的制备步骤、抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液的制备步骤和抗人GMP140特异性抗体微球溶液的制备步骤与所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液的制备步骤相似，不同之处在于：特异性抗体不同，荧光微球不同。一些具体实施例，不同所述特异性抗体与不同所述荧光微球溶液混合，不同所述荧光微球溶液是指所述荧光微球溶液中的荧光微球的内部含有不同浓度的别藻蓝蛋白以使得荧光微球显现出不同的荧光强度，用于区分所述特异性抗体的种类。具体的，所述荧光微球选自羧基修饰的聚苯乙烯微球。
以下通过具体的实施例对本发明实施例技术方案进行详细阐述。
实施例中所使用仪器的生产厂家及其型号或者牌号见表2。
表2仪器的生产厂家及其型号或者牌号：
实施例1 用于检测血小板抗体的试剂盒的制备：
本实施例所使用的各成分的生产厂家及其型号或者牌号见表3。
表3各成分的生产厂家及其型号或者牌号：
注：表3中的微球悬浮液包括第一荧光微球悬浮液、第二荧光微球悬浮液、第三荧光微球悬浮液、第四荧光微球悬浮液和第五荧光微球悬浮液；SA-PE溶液为荧光素链霉亲和素溶液，即藻红蛋白标记的链霉亲和素溶液。
试剂盒包括捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
捕获抗体微球混合液的制备：各取0.5毫升抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和抗人GMP140特异性抗体微球溶液混合均匀后得到含有五种捕获抗体的微球混合液，然后取97.5毫升血小板反应缓冲液加入上述含有五种捕获抗体微球混合液得到捕获抗体微球混合液，控制每毫升捕获抗体微球混合液含有5微克捕获抗体，捕获抗体由抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体组成。
检测抗体溶液的制备：在抗人IgG抗体上连接生物素以得到生物素标记的检测抗体，然后将生物素标记的检测抗体用血小板反应缓冲液稀释后得到检测抗体溶液，抗人IgG抗体与生物素的摩尔比为1:10，每毫升检测抗体溶液含有5微克检测抗体，每毫升检测抗体溶液含有0.5微克生物素，其中，生物素为琥珀酰亚胺-6-(生物素酰氨基)-6-己酰氨基己酸酯。
偶联物溶液的制备：将藻红蛋白标记的链霉亲和素溶液使用血小板反应缓冲液稀释以得到偶联物溶液，其中，每毫升偶联物溶液中含有2微克藻红蛋白标记的链霉亲和素。
血小板裂解液的制备：将6.3克Tris、8.95克NaCl溶于1000mL纯水中，然后加入质量分数为2%的TritonX-100（生产厂家：Sigma）得到血小板裂解液。
血小板洗涤液（10X）的制备：将5克乙二胺四乙酸（生产厂家：国药集团化学试剂有限公司，简称为EDTA）、2.3克KH2PO4、36.3克Na2HPO4·12H2O、80克NaCl和2克KCl溶于1000毫升纯水配制成质量分数为0.5%的EDTA溶液，然后加入质量分数为0.3%的Krovin500（生产厂家：西宝生物），并调节溶液的pH值至7.4得到血小板洗涤液（10X），备用。
血小板洗涤液（1X）的制备：将血小板洗涤液（10X）稳定到室温，待所有盐溶解；10mL 血小板洗涤液（10X）加入到90mL纯水中得到血小板洗涤液（1X）。
洗涤缓冲液（10X）的制备：将2.4克KH2PO4、36.32克Na2HPO4·12H2O、8克NaCl、2克KCl溶于1000mL纯水中，然后加入20克牛血清白蛋白（生产厂家：Proliant，简称为BSA）、质量分数为1.5%的ProClin300（生产厂家：Sigma）和质量分数为0.8%的Tween-20（生产厂家：Sigma）得到洗涤缓冲液（10X），备用。
洗涤缓冲液（1X）的制备：将洗涤缓冲液（10X）稳定到室温，待所有盐溶解；10mL 洗涤缓冲液（10X）加入到90mL纯水中得到洗涤缓冲液（1X）。
阳性对照品：是将抗人GPⅨ抗体、抗人GPⅠb抗体、抗人GPⅡb抗体、抗人GPⅢa抗体和抗人GMP140抗体上的氨基和人IgG上的氨基结合分别形成抗人GPⅨ抗体偶联IgG抗体，抗人GPⅠb抗体偶联IgG抗体、抗人GPⅡb抗体偶联IgG抗体、抗人GPⅢa抗体偶联IgG抗体、抗人GMP140抗体偶联IgG抗体；将5种偶联IgG抗体混合后得到。
阴性对照品的制备：将3.5克Tris、9.1克NaCl溶于1000mL纯水中，然后加入23克牛血清白蛋白（生产厂家：Proliant，简称为BSA）、质量分数为0.2%的Krovin500（生产厂家：西宝生物）得到阴性对照品，备用。
血小板反应缓冲液的制备：将6.5克Tris、8.65克NaCl溶于1000mL纯水中，然后加入10克牛血清白蛋白（生产厂家：Proliant，简称为BSA）、质量分数为0.3%的Krovin500（生产厂家：西宝生物）和质量分数为0.2%的Tween-20（生产厂家：Sigma）得到血小板反应缓冲液，备用。
试剂盒的制备：2.0毫升捕获抗体微球混合液装入第一包装瓶，2.0毫升检测抗体溶液装入第二包装瓶，2.0毫升偶联物溶液装入第三包装瓶，20毫升血小板裂解液装入第四包装，30毫升血小板洗涤液（10X）装入第五包装瓶，20毫升洗涤缓冲液(10X)装入第六包装瓶，1.25毫升阳性对照品装入第七包装瓶，2毫升阴性对照品装入第八包装瓶，将第一包装瓶、第二包装瓶、第三包装瓶、第四包装瓶、第五包装瓶、第六包装瓶、第七包装瓶和第八包装瓶装入包装盒中以得到试剂盒。其中，试剂盒为100人份/盒。
试剂盒的批内实验和批间实验：
取批次I试剂盒，用阳性对照品重复检测10次，计算10次结果的平均值x和标准差SD，计算变异系数CV。批内试验结果详见表4，表4中的数值为藻红蛋白（PE）荧光通道的平均荧光强度（简称为MFI）。
表4批内试验结果：
通过表4可知，试剂盒的批内试验的变异系数不大于15%。
取批次I、批次II和批次III试剂盒，用阳性对照品检测，每个批次重复检测10次，计算30次结果的平均值x和标准差SD，计算变异系数CV。批间试验结果详见表5，表5中的数值为藻红蛋白（PE）荧光通道的平均荧光强度（简称为MFI）。
表5批间试验结果：
通过表5可知，试剂盒的批间试验的变异系数不大于15%。
分别对第一荧光微球悬浮液（标记为GPⅨ）、第二荧光微球悬浮液（标记为GPⅠb）、第三荧光微球悬浮液（标记为GPⅡb）、第四荧光微球悬浮液（标记为GPⅢa）和第五荧光微球悬浮液（标记为GMP140）的平均荧光强度进行测定，微球测定结果为：1666.40、990.80、566.30、185.40和930.40。
分别对本申请中的含有第一荧光微球悬浮液的待检测物、含有第二荧光微球悬浮液的待检测物、含有第三荧光微球悬浮液的待检测物、含有第四荧光微球悬浮液的待检测物和含有第五荧光微球悬浮液的待检测物的平均荧光强度进行测定，阴性样本测定结果分别为：2030.40、1067.90、721.30、351.50和1245.70；阳性对照测定结果分别为：143201.10、338925.50、107253.20、15298.50和71736.40。
对比例中待检测物的制备步骤与本申请的待检测物的制备步骤相似，不同之处在于：每毫升捕获抗体微球混合液含有400微克捕获抗体，每毫升捕获抗体微球混合液含有1.0×107个微球，每毫升检测抗体溶液含有6微克检测抗体，每毫升检测抗体溶液含有0.6微克生物素，每毫升偶联物溶液含有6微克荧光素链霉亲和素。分别对对比例中的含有第一荧光微球悬浮液的待检测物、含有第二荧光微球悬浮液的待检测物、含有第三荧光微球悬浮液的待检测物、含有第四荧光微球悬浮液的待检测物和含有第五荧光微球悬浮液的待检测物的平均荧光强度进行测定，阴性样本测定结果分别为：1999.70、1078.50、422.70、366.40和1193.90；阳性对照测定结果分别为：78000.40、219970.40、63155.70、7517.30和52144.90。
由上述阴性样本测定结果和阳性对照测定结果可知，与对比例中的待检测物的平均荧光强度相比，本申请的待检测物的平均荧光强度有所提升，从而使得检测结果的准确度和灵敏度均有所提高，是因为本申请中的抗人IgG抗体与生物素连接之后，又与藻红蛋白标记的链霉亲和素连接，从而使得抗人IgG抗体与生物素之间的空间位阻的影响降低。
实施例2使用本发明提供的试剂盒检测样品：
按照下述步骤进行加样：
(1)待测样本制备：采集2mL全血样本，在200g条件下离心5min，分离富含血小板的血浆，取富含血小板的血浆500μL，在3000g条件下离心2min，弃上清，下层为血小板，加入800μL血小板洗涤液，在3000g条件下离心2min，弃上清，用血小板洗涤液洗涤三遍；
(2)阳性对照制备：提取1份正常人血小板；加入50μL试剂盒内的阳性对照品在18-25摄氏度下震荡孵育0.5h；
(3)阴性对照制备：取3个阴性对照管，各加入100μL阴性对照品，得3份阴性对照；
(4)向待测样本血小板、阳性对照中各加入120μL血小板裂解液；
在室温避光条件下，通过96孔板混匀仪振荡孵育0.5h，96孔板混匀仪的振荡频率为1000~2000rpm；
(5)将待测样本、阳性对照置于离心机中，离心机在3000g的条件下离心20min，取三种上清液各100μL分别加入至待测样本管、阳性对照管中；
(6)分别向待测样本管、阳性对照管、阴性对照管中加入20μL捕获抗体微球混合液，然后加入20μL检测抗体溶液；
(7)在室温避光条件下，通过96孔板混匀仪振荡孵育1.5h，96孔板混匀仪的振荡频率为1000~2000rpm；
(8)分别向待测样本管、阳性对照管、阴性对照管中加入20μL偶联物溶液；
(9)在室温避光条件下，通过96孔板混匀仪振荡孵育0.5h，96孔板混匀仪的振荡频率为1000~2000rpm；
(10)向待测样本管、阳性对照管、阴性对照管中加入1000μL 洗涤缓冲液（1X），涡旋重悬；
(11)将待测样本管、阳性对照管、阴性对照管置于离心机中，离心机在300g的条件下离心5min，弃上清液，保留微球；
(12)加入150~300μL洗涤缓冲液（1X），涡旋重悬；
(13)使用Beckman公司生产的DxFLEX流式细胞仪检测；
(14)使用FCAPArray™SoftwareVersion3.0对检测结果进行分析。
图2为本发明实施例的捕获抗体微球的分布情况。
参照图2，以别藻蓝蛋白通道荧光信号值（简称为APC-A）为横坐标，横坐标用于区分荧光微球所带别藻蓝蛋白的荧光强度，以前向角散射光通道荧光信号值（简称为FSC-A）为纵坐标，纵坐标用于区分荧光微球的大小。由横坐标可知，通过别藻蓝蛋白的吸光度能够区分出：P1代表的是第一荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅨ特异性抗体；P2代表的是第二荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅠb特异性抗体；P3代表的是第三荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅡb特异性抗体；P4代表的是第四荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅢa特异性抗体；P5代表的是第五荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GMP140特异性抗体。
以3份阴性对照检测结果平均值作为阴性对照均值。
临界值按照如下公式计算：
GPⅨ的临界值=2.7×阴性对照均值；
GPⅠb的临界值=2.0×阴性对照均值；
GPⅡb的临界值=2.4×阴性对照均值；
GPⅢa的临界值=3.9×阴性对照均值；
GMP140的临界值=1.5×阴性对照均值；阳性符合率和阴性符合率评价的测试数据见表6和表7。
表6：
注：临界值用于判断阳性对照的阴阳性，当阳性对照的数值大于临界值时，阳性对照显示阳性；
表7：
注：临界值用于判断阴性对照的阴阳性，当阴性对照的数值小于临界值时，阴性对照显示阴性；
通过表6和表7可知，对10份阳性对照进行检测，结果阳性率100%，对10份阴性对照进行检测，结果阴性率100%，说明使用本发明所述用于检测血小板抗体的试剂盒检测结果准确率较高。
实施例3使用本发明提供的试剂盒检测健康人和自身免疫性血小板减少症：
本实施例提供了3例健康人和3例自身免疫性血小板减少症患者中GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa、GMP140的判读结果。血小板抗体阳性判断标准为5个指标中如有一个为阳性即判为阳性，3例健康人和3例自身免疫性血小板减少症患者的判读结果见表8。
表8：
通过表8中的数据可知，健康人中血小板抗体均为阴性，自身免疫性血小板减少症患者的血小板抗体均为阳性。本发明提供的试剂盒一次可检测五种血小板抗体，且检测结果的准确率较高。
前述的实施例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的具体实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。
Claims (10)
1.一种用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
检测抗体溶液的制备：提供抗人IgG抗体溶液和生物素，向所述抗人IgG抗体溶液中加入生物素进行标记处理以得到生物素标记的检测抗体溶液，将所述生物素标记的检测抗体溶液用血小板反应缓冲液稀释后得到所述检测抗体溶液，所述抗人IgG抗体与所述生物素的摩尔比为1:(5~20)；
偶联物溶液的制备：提供荧光素链霉亲和素溶液，将所述荧光素链霉亲和素溶液混合均匀用血小板反应缓冲液稀释后得到所述偶联物溶液，控制每毫升所述偶联物溶液含有1-5微克荧光素链霉亲和素。
2.根据权利要求1所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，控制每毫升所述检测抗体溶液含有5-10微克所述抗人IgG抗体，控制每毫升所述检测抗体溶液含有0.1-0.5微克所述生物素。
3.根据权利要求1所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述生物素为琥珀酰亚胺-6-(生物素酰氨基)-6-己酰氨基己酸酯。
4.根据权利要求1所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
捕获抗体微球混合液的制备：提供抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和抗人GMP140特异性抗体微球溶液；将所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、所述抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和所述抗人GMP140特异性抗体微球溶液混合均匀后，使用血小板反应缓冲液稀释100-300倍，得到所述捕获抗体微球混合液。
5.根据权利要求4所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有100-300微克捕获抗体，每毫升所述捕获抗体微球混合液含有2.5×105~1.0×106个微球，所述捕获抗体包括抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体，所述微球包括第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微球、第四荧光微球和第五荧光微球。
6.根据权利要求5所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液的制备步骤包括：提供所述抗人GPⅨ特异性抗体和第一荧光微球悬浮液，将所述抗人GPⅨ特异性抗体和所述第一荧光微球悬浮液混合均匀以使所述抗人GPⅨ特异性抗体负载于所述第一荧光微球，然后使用血小板反应缓冲液稀释后得到所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有100-300微克所述抗人GPⅨ特异性抗体，控制每毫升所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液含有1.0×107~4.0×107个所述第一荧光微球，所述第一荧光微球悬浮液包括所述第一荧光微球。
7.根据权利要求6所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球的内部包被有不同浓度的别藻蓝蛋白以使所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球显示出不同的荧光强度。
8.一种用于检测血小板抗体的试剂盒，其特征在于，由所述权利要求1-7任一项所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的用于检测血小板抗体的试剂盒，其特征在于，还包括血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
10.一种如权利要求9所述的用于检测血小板抗体的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S0：提供血小板、捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品；
S1：使用所述血小板裂解液对所述血小板进行裂解，震荡孵育后离心取上清液以得到待检样本，向所述待检样本中依次加入所述捕获抗体微球混合液和所述检测抗体溶液振荡孵育，然后再加入所述偶联物溶液振荡孵育，再加入所述洗涤缓冲液，进行涡旋重悬，以得到待检测物；
S2：检测所述待检测物的荧光类型和荧光强度，以得到所述待检测物中是否含有血小板抗体。
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