KR20110137370A - 면역 분석 방법 및 그것을 위한 시약 - Google Patents

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Abstract

면역 분석법에 있어서의 측정 영역을 확대시킬 수 있는 새로운 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 면역 분석 방법은 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 반응계 내에 공존시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의하면 특히 블랭크의 측정값의 편차(표준편차)를 억제할 수 있어 측정값이 안정된다. 이것에 의해 종래의 면역 분석 방법에서는 측정하기 어려운 저농도 영역에 있어서도 측정값에 유의차를 얻을 수 있게 되어 저농도 영역의 측정 정밀도가 향상된다.

Description

면역 분석 방법 및 그것을 위한 시약{IMMUNOASSAY METHOD AND REAGENT THEREFOR}
본 발명은 저농도 시료의 측정에 유용한 신규 면역 분석 방법 및 그것을 위한 시약에 관한 것이다.
면역학적 분석 방법은 혈청, 혈장, 뇨 등의 임상 검사에서 자동 분석 장치를 사용함으로써 간편·신속하게 측정을 행할 수 있기 때문에 널리 보급되어 있다.
면역학적 분석법의 용도를 확대하기 위해서는 기존의 시약보다 낮은 값 영역인 검출 감도와 신뢰성이 요구되는 경우가 있다. 면역학적 분석 시약에 계면활성제를 첨가하는 수단은 알려져 있지만 매트릭스의 영향 회피 등의 반응성을 제어하는 수단이나 흡광도 변화량을 증폭시키는 수단으로서 사용되는 것이 많았다(특허문헌 1, 2 참조).
면역학적 분석 시약의 측정 가능 영역을 확대시키는 방법으로서는 측정 영역의 검출 상한을 올리는 방법과, 검출 하한을 낮추는 방법이 있다.
면역학적 분석 시약의 측정 가능 영역의 검출 하한을 낮춰서 고감도화로 하기 위해서는 시약에 힘유되는 감작입자나 항체 또는 항원의 양을 늘려서 낮은 값 영역의 감도를 올리는 방법이 있다. 그러나 낮은 값 영역의 감도를 올려도 재현성이 나쁘면 낮은 값의 정밀도가 얻어지지 않는다.
낮은 값 영역의 감도를 올리기 위해서 반응성이 높은 성분을 사용하면 시약의 안정성이 저하되어 자기 응집에 의해 시약 보존 중에 응집 반응이 진행되거나 비특이적 응집이 일어나서 블랭크 시료에서도 응집 반응이 진행되는 경우가 있었다.
낮은 값 영역의 감도를 올리면 예를 들면 흡광도 변화를 측정하는 자동 분석 장치에서는 흡광도 변화량에 상한이 설정되어 있기 때문에 높은 값 영역의 감도에 제한이 생겨서 넓은 측정 영역이 얻어지지 않는 경우가 있다.
측정 영역의 검출 하한을 낮추고자 한 경우 상기와 같은 문제가 발생하기 때문에 측정 가능 영역을 확대시키는 것은 곤란했다.
일본 특허 공개 2005-241415호 공보 일본 특허 공개 2006-126166호 공보
따라서, 본 발명의 목적은 면역 분석법에 있어서의 측정 영역을 확대시키는 것이 가능한 새로운 방법을 제공하는 것에 있다.
본원발명자는 예의 연구의 결과 면역 분석 시에 반응계 내에 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 공존시킴으로써 블랭크의 측정값의 편차가 억제되어 블랭크 측정값도 저하되고, 피검 물질의 저농도역에 있어서의 측정 정밀도를 향상시킬 수 있는 것을 발견하여 본원발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 반응계 내에 공존시키는 것을 포함하는 면역 분석 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 면역 분석 방법에 의한 검체 중의 마커 단백질 측정 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역 분석 방법에 있어서 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 반응계 내에 공존시키는 것을 포함하는 면역 분석에 의한 측정값을 안정화하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 함유하는 면역 분석 시약을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 면역 분석 시약을 포함하는 면역 분석 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르로 이루어지는 면역 분석용 측정값 안정화제를 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명에 의해 면역 분석에 있어서 피검 물질의 저농도역에 있어서의 측정 정밀도를 향상시킬 수 있는 새로운 수단이 제공되었다. 본 발명의 방법에 의하면 소정의 물질을 반응계에 첨가하는 것만으로 특히 블랭크의 측정값의 편차(표준편차)를 억제할 수 있어 측정값이 안정된다. 이것에 의해 종래의 면역 분석 방법으로는 측정하기 어려운 저농도 영역에 있어서도 측정값에 유의차가 얻어지지 않게 되어 저농도 영역의 측정 정밀도가 향상된다. 본 발명은 검체 중에 미량으로 존재하는 물질의 미량 정량에 유리하다.
도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예의 면역 응집법에 있어서의 측정 시약 첨가 후의 시간(초)과 흡광도 변화의 관계를 나타내는 도면이다.
본 발명은 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 존재 하에서 면역 분석을 행하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 명세서 중의 %는 특별히 언급이 없는 한 질량 기준(w/w%)이다. 또한, 「측정」이라고 한 경우에는 검출, 정량 및 반정량이 포함된다.
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염으로서는 계면활성제로서 통상 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 알킬 부분은 직쇄이어도 분기이어도 좋고, 1개 이상의 불포화 결합을 포함하고 있어도 좋다. 알콕시기와 같이 1개 이상의 탄소가 산소로 치환된 불활성인 알킬기이어도 좋다. 알킬기 중의 일부가 아릴기(페닐기 등) 또는 할로겐 원자 등으로 치환되어 있어도 좋다. 알킬 부분의 탄소수는 특별히 한정되지 않지만 통상 1∼30, 바람직하게는 5∼20, 보다 바람직하게는 10∼15이다. 특히 바람직한 알킬 부분은 포화 또는 몇 개 이하의 불포화 결합을 함유하는 직쇄상의 탄소쇄이며, 구체예로서는 라우릴기 등을 들 수 있다.
황산염 부분은 1가 이상의 염이면 좋고, 구체예로서는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 암모늄염, 아민염 등을 들 수 있고, 트리에탄올아민염이나 나트륨염이 바람직하게 사용된다.
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염의 분자 중의 옥시에틸렌 단위의 수는 특별히 한정되지 않지만 통상 1∼10 정도이다.
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염은 단일 조성이어도 좋고, 2종 이상의 혼합물이어도 좋다. 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염으로서는 계면활성제로서 판매되고 있는 시판품을 바람직하게 사용할 수 있다.
폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르로서는 계면활성제로서 통상 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 지방산의 알킬 부분은 직쇄이어도 분기이어도 좋고, 1개 이상의 불포화 결합을 함유하고 있어도 좋다. 알콕시기와 같이 1개 이상의 탄소가 산소로 치환된 불활성인 알킬기이어도 좋다. 알킬기 중의 일부가 할로겐 원자 등으로 치환되어 있어도 좋다. 알킬 부분의 탄소수는 특별히 한정되지 않지만 통상 1∼30, 바람직하게는 5∼25, 보다 바람직하게는 10∼20이다. 특히 바람직한 알킬 부분은 포화 또는 몇 개 이하의 불포화 결합을 함유하는 직쇄 또는 분기의 탄소쇄이며, 지방산 부분으로서 바람직한 구체예를 들면 올레인산, 스테아린산, 라우린산, 팔미트산 등을 들 수 있다.
폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 분자 중의 옥시에틸렌 단위의 수는 특별히 한정되지 않지만 통상 1∼100 정도, 바람직하게는 5∼60 정도이다.
폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 조성은 단일 조성이어도 좋고, 2종 이상의 혼합물이어도 좋다. 조성의 구체예로서는 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트나 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르로서는 계면활성제로서 판매되고 있는 시판품을 바람직하게 사용할 수 있다.
폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르는 HLB값이 10∼20, 수평균 분자량이 1000∼50000인 것이 첨가 효과가 현저하며, 바람직하게 사용된다.
본 발명의 분석 방법에서는 항원항체 반응의 개시로부터 항원항체 반응량의 검출·정량이 종료될 때까지의 어느 한 단계에서 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 반응계 내에 공존시키면 좋지만 항원항체 반응의 개시로부터 검출·정량까지의 사이에 걸쳐서 공존시키는 것이 바람직하다. 따라서, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르는 항원항체 반응의 개시 전 또는 개시와 동시에 반응계 내에 바람직하게 첨가할 수 있다. 예를 들면, 검체를 희석할 때에 첨가해도 좋고, 항체 또는 항원과 검체를 혼합할 때에 첨가해도 좋다. 또한, 면역 분석에 사용되는 각종 시약에 미리 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 함유시켜 두어도 좋다. 예를 들면, 검체를 희석하는 완충액이나 항체 또는 항원을 함유하는 시약 등에 이들의 물질을 미리 함유시켜 둘 수 있다. 면역 응집의 경우에는 예를 들면 항체 또는 항원을 고정화(감작)한 불용성 담체 입자(감작입자)를 함유하는 시약에 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 함유시켜 둘 수 있다. 또한, B/F 분리 조작이 행해지는 경우에는 항원항체 반응 시에 공존하고 있던 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르가 손실되기 때문에 세정액으로서 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 함유하는 완충액을 사용하는 등 적당히 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 반응계 내에 추가하는 것이 바람직하다.
반응계 내의 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염의 농도는 바람직하게는 0.0005∼0.25%이며, 더욱 바람직하게는 0.0125∼0.25%이다. 또한, 반응계 내의 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 농도는 바람직하게는 0.0005∼0.25%이며, 더욱 바람직하게는 0.0005∼0.005%이다. 면역 분석 시약에 미리 함유시킬 경우에는 반응계 내에서의 농도가 상기한 농도가 되도록 면역 분석 시약에 함유시킬 수 있다. 예를 들면, 감작입자를 함유하는 시약 중에 함유시킬 경우 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염의 시약 중 농도는 바람직하게는 0.001∼0.5%, 더욱 바람직하게는 0.025∼0.5%로 할 수 있고, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 시약 중 농도는 바람직하게는 0.001∼0.5%, 더욱 바람직하게는 0.001∼0.01%로 할 수 있다.
면역 분석의 수법 자체는 주지이다. 본 발명의 면역 분석 방법의 형태로서는 공지의 어떠한 면역 분석 방법이어도 좋지만 그 중에서도 면역 응집법이 바람직하고, 특히 불용성 담체 입자로서 라텍스 입자를 사용하는 라텍스 응집법이 바람직하다. 면역 응집법에 있어서 감작입자의 응집을 검출하는 방법은 주지이며, 본 발명에 있어서도 감작입자의 응집에 의한 흡광도 또는 광 산란 등을 검출하는 방법 등의 주지의 방법이 사용 가능하다. 예를 들면, 면역 비탁법(TIA법, 라텍스 응집법), 비색법, RPLA법, CL법 및 면역 크로마토그래피법 등을 들 수 있고, 감도가 높고 정량 정밀도가 좋은 비탁법 및 비색법이 바람직하게 사용된다.
면역 응집법에 의해 면역 분석을 행할 경우 사용되는 불용성 담체 입자는 특별히 한정되지 않고, 면역 분석 시약에 종래 사용되어 있는 주지의 것이어도 좋다. 예를 들면, 폴리에틸렌이나 폴리스티렌 등의 라텍스 입자, 알루미나 입자, 실리카 입자, 금 콜로이드, 자성 입자 등의 입자를 들 수 있다. 이들의 불용성 담체 중에서는 라텍스 입자, 특히 폴리스티렌 라텍스 입자가 바람직하게 사용된다. 라텍스 입자의 사이즈는 특별히 한정되지 않지만 입경은 30∼600㎚인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 면역 분석에 의한 측정 대상물의 구체예로서는 C-반응성 단백질(CRP), 페리틴(FER), 미오글로빈(Mb), 전립선 특이 항원(PSA), β-2마이크로글로불린(B㎎), 메가 인, 포도칼릭신 등의 마커 단백질이나 대장균 등의 세균, 인플루엔자 바이러스, 노로 바이러스, RS 바이러스 등의 바이러스나 이들에 대한 항체를 들 수 있다. 바람직한 측정 대상물은 각종 질병 등의 마커가 되는 마커 단백질이다.
면역 분석에 사용되는 검체는 측정 대상물을 포함할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 변, 타액, 조직액, 수액, 채취액 등의 체액 등 또는 그 희석물이 바람직하고, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 변, 수액 또는 이들의 희석물이 더욱 바람직하다.
면역 분석에 사용되는 블랭크 시료는 측정 대상물을 포함할 수 없는 것이면 특별히 한정되지 않지만 정제수, 생리 식염액, 완충액, 음성 검체 또는 그 희석물이 바람직하다.
면역 응집법 자체는 주지이며, 여기서 설명할 필요는 없지만 피검 시료 중의 항원을 측정하는 경우를 예로서 간단히 설명하면 상기한 불용성 담체 입자에 측정해야 할 항원과 항원항체 반응하는 항체 및 그 항원 결합성 단편을 고정화한다. 고정화의 방법도 주지이며, 물리 흡착 또는 공유 결합 등의 주지의 방법에 의해 행해진다. 얻어진 감작입자의 현탁액과 피검 시료를 혼합하면 피검 시료 중에 함유되는 측정해야 할 항원에 의해 감작입자가 응집되어 감작입자 현탁액의 흡광도가 변화된다. 이 흡광도의 변화량(엔드 포인트법)또는 변화율(레이트법)을 측정한다. 측정해야 할 항원을 여러 가지 기지 농도로 함유하는 복수의 표준 시료를 준비하고, 그들에 대해서 상기 방법에 의해 흡광도의 변화량 또는 변화율을 측정한다. 표준 시료 중의 측정해야 할 항원의 농도를 가로축, 측정된 흡광도의 변화량 또는 변화율을 세로축에 플롯해서 검량선을 그린다. 미지의 피검 시료에 대해서도 같은 방법에 의해 흡광도의 변화량 또는 변화율을 측정하고, 측정 결과를 상기 검량선에 적용시킴으로써 피검 시료 중의 항원을 정량할 수 있다. 또한, 이러한 면역 응집법을 행하는 자동 장치가 여러 가지 시판되고 있어 시판의 면역 응집법용 자동 장치를 사용하여 용이하며, 간편하게 행할 수 있다.
하기 실시예에 기재되는 바와 같이 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 공존 하에서 면역 분석을 행하면 블랭크 및 저농도 시료(하기 실시예에서는 0.005㎎/dL의 CRP)의 측정값의 변동을 제압할 수 있어서 안정화된다. 즉, 측정값의 표준편차가 작아진다. 그 결과 블랭크와 저농도 시료 사이의 측정값의 유의차가 증대되므로 예를 들면 CRP의 경우는 0∼0.005㎎/dL정도의 저농도 영역에서의 분석 정밀도가 향상된다. 따라서, 본 발명의 분석 방법은 피검 물질의 미량 측정에 매우 유리하다.
상기한 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 미리 함유시킨 면역 분석을 위한 각종 시약은 상기 본 발명의 방법에 사용되는 면역 분석 시약으로서 제공할 수 있다. 본 발명의 면역 분석 시약에는 면역 분석에 사용되는 각종 시약류가 포함된다. 예를 들면, 검체 희석액, 항체/항원 희석액, 고상화 항체/항원, 감작입자 현탁액, 세정액, 효소액, 기질액, 검량선 작성용의 피검 물질 표준액 등을 들 수 있다.
본 발명의 면역 분석 시약으로서는 라텍스 응집 시약 등의 면역 응집 시약이 바람직하고, 구체적으로는 감작입자를 함유하는 시약이 바람직하다. 면역 분석 시약 중의 감작입자의 농도는 특별히 한정되지 않지만 0.01∼0.5%인 것이 바람직하다. 감작입자 부유액 중의 항체량 및 항원량은 상법과 같으면 좋고, 특별히 한정되지 않지만 예를 들면 항체 감작 라텍스의 경우 항체량은 라텍스 부유액 중에 0.01∼2.0㎎/mL로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역 분석 시약 중의 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염의 농도는 바람직하게는 0.0005∼0.25%, 더욱 바람직하게는 0.0125∼0.25%이다. 면역 분석 시약 중의 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 농도는 바람직하게는 0.0005∼0.25%, 더욱 바람직하게는 0.0005∼0.005%이다.
또한, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르는 면역 분석을 위한 측정값 안정화제로서 제공할 수도 있다. 여기서 말하는 측정값의 안정화란 상기한 바와 같이 측정값의 표준편차를 작게 한다는 의미이다. 상기 안정화제는 면역 분석에 사용되는 각종 시약에 첨가해서 바람직하게 사용된다.
상기한 본 발명의 면역 분석 시약은 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 함유하지 않는 통상의 시약류 등과 함께 면역 분석 키트로서 제공할 수 있다. 또는 본 발명의 면역 분석 키트는 통상의 면역 분석 시약류와 상기 본 발명의 측정값 안정화제와 조합시킨 키트일 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1
(사용 시약)
C-반응성 단백질(CRP), 페리틴(FER) 및 미오글로빈(Mb)에 대한 항체를 사용하여 이하와 같이 면역 응집법에 의한 측정 시약을 조제했다.
항CRP 항체, 항FER 항체 및 항Mb 항체 중 어느 하나를 평균 입경 190㎚의 폴리스티렌 라텍스 부유액 1mL에 대하여 0.08㎎ 담지시켜서 이루어지는 감작입자를 완충액(트리스, pH 8.0)에 0.1%가 되도록 현탁하여 라텍스 부유액을 조제했다.
상기 라텍스 부유액에 하기와 같이 계면활성제를 첨가하고, 각 단백질(CRP, FER, Mb)의 측정 시약을 조제했다. 비교예로서 상기 계면활성제 성분을 첨가하지 않은 라텍스 부유액을 사용했다.
측정 시약(실시예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0.1%
계면활성제2 0.005%
측정 시약(비교예)
라텍스 부유액만
계면활성제1:
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 트리에탄올아민(카오제 「에말20T」(상품명), 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 황산 트리에탄올아민을 주체)
계면활성제2:
폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(와코쥰야쿠제「Tween80」(상품명), 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트를 주체, HLB=15, 수평균 분자량 5000)
(자동 분석 장치에 의한 측정)
자동 분석 장치는 히타치 7180형 자동 분석 장치에 의해 엔드 포인트법으로 자동 측정을 행했다.
상술한 측정 시약을 사용해서 생리 식염수(블랭크) 샘플액의 측정을 합계 10회 행했다. 샘플액 2.4㎕에 완충액(트리스, pH 8.5) 120㎕를 첨가하고, 이 혼합액을 37℃에서 교반 혼합했다. 5분간 방치한 후 상기에서 조제한 측정 시약을 120㎕ 첨가하고, 37℃에서 더 교반 혼합했다. 약 5분간의 응집 반응을 흡광도 변화량으로 해서 측정하여 표준편차를 산출했다.
(결과)
측정 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 또한, 측정 시약 첨가 직후의 흡광도를 0.000Abs로 했을 경우의 경과 시간에 있어서의 흡광도의 변화를 도 1에 나타낸다.
Figure pct00001
(고찰)
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 트리에탄올아민 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 첨가함으로써 블랭크의 표준편차가 작아져 블랭크의 정밀도가 향상되는 것이 나타내어졌다. 또한, 상기 성분의 첨가 효과는 항체의 종류에 상관없이 얻어지는 것이 나타내어졌다.
블랭크의 정밀도가 향상된 요인은 도 1에 나타내고 있는 바와 같이 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 트리에탄올아민 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 첨가함으로써 측정 시약 첨가 후의 경과 시간에 의한 흡광도의 불균형이 억제되었다. 이 불균형의 억제 효과는 2회 측정해도 바뀌지 않으므로 재현성이 있는 것이 나타내어졌다.
실시예 2
(사용 시약)
항CRP 항체를 평균 입경 150㎚의 폴리스티렌 라텍스 부유액 1mL에 대하여 0.06㎎ 담지시켜서 이루어지는 감작입자를 완충액(트리스, pH 8.0)에 0.12%가 되도록 현탁하여 라텍스 부유액을 조제했다.
상기 라텍스 부유액에 이하와 같이 계면활성제를 첨가해서 3종류의 CRP 측정 시약을 조제했다.
시약 No.2-1(실시예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0.1%
계면활성제2 0.005%
시약 No.2-2(비교예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0.1%
시약 No.2-3(비교예)
라텍스 부유액만
계면활성제1:
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 트리에탄올아민(상술)
계면활성제2:
폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(상술)
(자동 분석 장치에 의한 측정)
자동 분석 장치는 히타치 7180형 자동 분석 장치에 의해 엔드 포인트법으로 자동 측정을 행했다.
상기 CRP 측정 시약 3시약을 사용해서 샘플액의 측정을 각 10회씩 행했다. 샘플액으로서 생리 식염수(블랭크) 및 CRP를 농도 0.005㎎/dL로 함유하는 생리 식염수(CRP)를 사용했다. 샘플액 2.4㎕에 완충액(트리스, pH8.5) 120㎕를 첨가하고, 이 혼합액을 37℃에서 교반 혼합했다. 5분간 방치 후 상기 CRP 측정 시약을 120㎕ 첨가하고, 37℃에서 더 교반 혼합했다. 약 5분간의 응집 반응을 흡광도 변화량으로 해서 측정했다.
(결과)
각 샘플의 10회 측정의 데이터로부터 평균값와 표준편차를 산출하고, 하기 식에 의해 수치(이하, 간단하게 「차」라고 한다 )를 구해서 측정 정밀도를 평가했다. 하기 식에 의해 구해지는 차는 블랭크과 CRP 시료 사이의 측정값의 유의차의 지표가 되는 것이며, 차의 값이 클수록 측정값 사이의 유의차가 큰 것을 나타낸다.
[CRP의 평균값-2×(CRP의 SD)]-[블랭크의 평균값+2×(블랭크의 SD)]
Figure pct00002
(고찰)
계면활성제를 첨가함으로써 블랭크 및 CRP 시료의 측정 데이터의 표준편차(SD)가 작아져 상기 식으로 산출한 CRP 농도 0㎎/dL(블랭크)와 0.005㎎/dL(CRP 시료)의 측정값의 차가 커졌다. 표준편차(SD) 값은 블랭크측에서 특히 작아졌다. 이와 같이 검체 중의 CRP 농도 0㎎/dL와 CRP 농도 0.005㎎/dL의 측정값의 차가 확대되었으므로 저농도측의 측정 가능 영역이 넓어지는 것이 나타내어졌다.
실시예3
(사용 시약)
항CRP 항체를 평균 입경 190㎚의 폴리스티렌 라텍스 부유액 1mL에 대하여 0.04㎎ 담지시켜서 이루어지는 감작입자를 완충액(트리스, pH 8.0)에 0.1%가 되도록 현탁하여 라텍스 부유액을 조제했다.
상기 라텍스 부유액에 이하와 같이 계면활성제를 첨가하고, 계면활성제1의 농도를 바꾼 5종류의 CRP 측정 시약을 조제했다.
시약 No.3-1(비교예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0%
계면활성제2 0.005%
시약 No.3-2(실시예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0.01%
계면활성제2 0.005%
시약 No.3-3(실시예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0.05%
계면활성제2 0.005%
시약 No.3-4(실시예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0.10%
계면활성제2 0.005%
시약 No.3-5(실시예)
라텍스 부유액
+ 계면활성제1 0.20%
계면활성제2 0.005%
계면활성제1:
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 트리에탄올아민(상술)
계면활성제2:
폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(상술)
(자동 분석 장치에 의한 측정)
자동 분석 장치는 히타치 7180형 자동 분석 장치에 의해 엔드 포인트법으로 자동 측정을 행했다.
상기 CRP 측정 시약 5종류를 사용해서 생리 식염수(블랭크) 샘플액의 측정을 각 시약 모두 5회 행하여 평균값을 취했다. 샘플액 2.4㎕에 완충액(트리스, pH 8.5) 120㎕를 첨가하고, 이 혼합액을 37℃에서 교반 혼합했다. 5분간 방치 후 상기 CRP 측정 시약을 120㎕ 첨가하고, 37℃에서 더 교반 혼합했다. 약 5분간의 응집 반응을 흡광도 변화량으로 해서 측정하고, 흡광도 변화량의 평균값의 비교를 행했다.
Figure pct00003
(고찰)
폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 트리에탄올아민을 첨가함으로써 생리 식염수(블랭크) 측정 시의 흡광도 변화량이 작아져 비특이적 응집이 현저하게 억제되어 있던 것을 확인할 수 있었다. 이것에 의해 측정 대상 농도가 낮은 영역에서의 시약의 안정성이 향상되는 것이 나타내어졌다.

Claims (17)

  1. 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 반응계 내에 공존시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염의 농도는 0.0005∼0.25%인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 농도는 0.0005∼0.005%인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 HLB값은 10∼20인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 수평균 분자량은 1000∼50000인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염은 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 황산 트리에탄올아민인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르는 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 응집법인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  9. 제 9 항에 있어서,
    라텍스 응집법인 것을 특징으로 하는 면역 분석 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 분석 방법에 의한 것을 특징으로 하는 검체 중의 마커 단백질 측정 방법.
  11. 면역 분석 방법에 있어서 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 반응계 내에 공존시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 분석에 의한 측정값을 안정화하는 방법.
  12. 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 분석 시약.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염의 농도는 0.0005∼0.25%인 것을 특징으로 하는 면역 분석 시약.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르의 농도는 0.0005∼0.005%인 것을 특징으로 하는 면역 분석 시약.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 분석 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 분석 키트.
  16. 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염 및 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 분석용 측정값 안정화제.
  17. 제 16 항에 있어서,
    면역 분석 시약에 첨가된 형태인 것을 특징으로 하는 면역 분석용 측정값 안정화제.
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