KR101153249B1

KR101153249B1 - 면역측정법용 측정값 저하 억제제를 이용한 면역측정법

Info

Publication number: KR101153249B1
Application number: KR1020067015298A
Authority: KR
Inventors: 야수노리 미나카와; 미치에 사이토; 히로시 마츠이
Original assignee: 덴카 세이켄 가부시키가이샤
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2012-06-05
Also published as: US20100143933A1; EP1724582B1; EP1724582A2; WO2005086594A2; CN1926432A; JP4580180B2; WO2005086594A3; CA2557473C; EP1724582A4; PL1724582T3; ES2400492T3; CA2557473A1; AU2005220672B2; US8524452B2; JP2005241415A; DK1724582T3; AU2005220672A1; CN1926432B; KR20070001937A

Abstract

피검시료중의 방해물질에 의한 영향을 억제해서 면역측정법의 정확성을 향상시킬 수 있는 면역측정법용 측정값 저하 억제제 및 그것을 이용한 방해물질에 의한 측정값 저하가 억제된 면역측정법 및 면역측정법용 시약이 개시되어 있다. 방해물질에 의한 측정값 저하를 억제하기 위한 면역측정법용 측정값 저하 억제제는 이온성 관능기를 갖는 소수성 환식 모노머가 중합된 폴리머로서, 분자량이 1000～100000인 이온성 계면활성제로 이루어진다.

Description

면역측정법용 측정값 저하 억제제를 이용한 면역측정법{IMMUNOASSAY METHOD USING MEASUREMENT VALUE LOWERING INHIBITOR FOR IMMUNOASSAY METHOD}

본 발명은, 방해물질에 의한 측정값 저하를 억제하기 위한 면역측정법용 측정값 저하 억제제 및 그것을 이용한 면역측정법 및 면역측정법용 시약에 관한 것이다.

임상검사에 있어서, 생체시료를 피검시료로 하는 검사항목은 다수 존재한다. 그 중의 면역학적 측정법에 있어서는, 목적물질의 면역반응에 영향을 주는 방해물질이 생체시료중에 존재하는 것이 알려져 있다. 이 영향이란 측정값의 정확성에 영향을 주는 것이며, 몇개의 보고도 이루어져 있다.

이들 방해물질에 의한 영향의 확인 및 저감의 가장 일반적인 방법으로서, 피검시료를 미리 희석함으로써 방해물질의 농도를 저하시키는 방법이 있다. 그러나 이 방법의 경우, 희석조작에 의해 방해물질과 함께 목적물질 농도도 저하되므로, 시료중의 저농도물질을 검출하는 측정계에서는 이용이 곤란하게 된다. 또한 희석조작이 가해짐으로써 측정시간도 연장되고, 신속성도 떨어지게 된다. 한편, 방해물질이 기지인 경우에는 방해활성을 억제 또는 억지하는 기능을 갖는 화합물의 첨가나 가온 등의 전처리방법이 취해지지만, 기지의 특정 물질에만 유효하며, 측정항목에 따라서는 미지의 물질이 측정에 악영향을 줄 가능성도 고려된다.

또한 일본 특허공개 평9-304384호 공보에서는 면역측정법에 있어서의 위양성(僞陽性) 회피를 위해, 술폰산기나 그 염을 함유하는 공역 디엔계 중합체를 이용하는 것이 기재되어 있지만, 특수한 시료중에 존재하는 위양성 물질보다, 모든 생체시료중에 존재할 수 있는 방해물질의 회피가 정확성 향상에 필요하다.

특허문헌1:일본 특허공개 평9-304384호 공보

본 발명의 목적은, 피검시료중의 방해물질에 의한 영향을 억제해서 면역측정법의 정확성을 향상시킬 수 있는 면역측정법용 측정값 저하 억제제 및 그것을 이용한 방해물질에 의한 측정값 저하가 억제된 면역측정법 및 면역측정법용 시약을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은, 예의 연구의 결과, 이온성 관능기를 갖는 소수성 환식 모노머가 중합된 폴리머로서, 분자량이 1000～100000인 이온성 계면활성제를 면역측정법을 행하는 반응용액에 공존시킴으로써, 피검시료중의 방해물질에 의한 영향을 억제해서 면역측정법의 정확성을 향상시킬 수 있는 것을 찾아내어, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은, 이온성 관능기를 갖는 소수성 환식 모노머가 중합된 폴리머로서, 분자량이 1000～100000인 이온성 계면활성제로 이루어지는 방해물질에 의한 측정값 저하를 억제하기 위한 면역측정법용 측정값 저하 억제제를 제공한다. 또한 본 발명은, 상기 본 발명의 측정값 저하 억제제의 존재하에서 행하는 면역측정법을 제공한다. 또한, 본 발명은, 완충액과, 감작입자 또는 항혈청을 적어도 함유하는 면역측정법용 시약에 있어서, 상기 본 발명의 측정값 저하 억제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역측정법용 시약을 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 이온성 계면활성제의 면역측정법용 측정값 저하 억제제로서의 사용을 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 이온성 계면활성제를, 면역측정법의 반응액중에 공존시키는 것을 포함하는 면역측정법에 있어서의 측정값의 저하를 억제하는 방법을 제공한다.

(발명의 효과)

본 발명의 면역측정법의 측정값 저하 억제제의 존재하에서 면역측정법을 행함으로써, 피검시료중의 방해물질의 영향이 저감되어, 측정값 저하 억제제의 비존재하에서 행하는 경우보다 면역측정법의 정확성이 향상된다.

면역측정법 중, 면역응집법은 항원항체반응에 의해 발생되는 반응액의 탁도나 흡광도와 같은 광학적 성질의 변화에 기초하여, 피검시료중의 항원 또는 항체를 검출 또는 정량하는 방법이며, 면역비탁법 및 면역비롱법(免疫比朧法, nephelometry)이 포함된다. 측정의 감도를 높이기 위해서, 통상, 피검시료중의 목적항원 또는 목적항체와 항원항체반응하는 항체 또는 항원이 라텍스입자와 같은 입자상에 부동화되어 있고(감작입자), 항원항체반응에 의해 상기 감작입자가 응집되는 것에 기인하는 광학적 성질의 변화에 기초해서 피검물질의 검출 또는 정량이 행해진다(라텍스입자를 이용하는 경우에는 특별히 라텍스 응집법이라고도 불린다). 단, 감작입자를 이용하는 일없이 항혈청도 종종 이용된다.

본 발명의 면역측정법의 측정값 저하 억제제는, 이온성 관능기를 갖는 소수성 환식 모노머가 중합된 폴리머로서, 분자량이 1000～100000인 이온성 계면활성제로 이루어진다.

이온성 관능기로서는, 술폰기 또는 그 염, 카르복실산 또는 그 염 또는 아민(수용액중에서 이온화되는 제4급 아민 등)이 바람직하고, 특히 술폰기 또는 그 염이 바람직하다. 이렇게, 이온성 계면활성제는 음이온 계면활성제이어도 양이온 계면활성제이어도 좋다.

또한 소수성환으로서는, 방향환이나 시클로알킬환을 들 수 있고, 산소원자, 질소원자 또는 유황원자 등을 함유하는 복소환이어도 좋고, 이들이 축합된 축합환이어도 좋다. 소수성환으로서는 방향환이 바람직하고, 방향환으로서는, 벤젠환, 나프탈렌환, 안트라센환 등이 예시되고, 바람직하게는 벤젠환 또는 나프탈렌환, 더욱 바람직하게는 벤젠환이다.

측정값 저하 억제제로서 이용되는 바람직한 폴리머로서, 폴리아네톨술폰산 나트륨염, 폴리스티렌술폰산 나트륨염, 나프탈렌술폰산 포르말린 축합물의 나트륨염, 방향족 술폰산 포르말린 축합물의 나트륨염(구체적으로는, 디스롤(상품명, 니혼유카자이사제), 데몰(상품명, 카오사제), 폴리티PS-1900(라이온), 폴리티N-100K(상품명, 라이온사제) 등)을 들 수 있다.

또한 측정값 저하 억제제로서 이용되는 바람직한 폴리머로서, 반복단위가 하기 일반식[I]로 나타내어지는 것을 들 수 있다.

(단, Ar은 소수성환, X는 이온성 관능기, R¹～R³은 서로 독립적으로 수소원자 또는 알킬기를 나타내고, n은 0～10의 정수를 나타내고, Ar을 구성하는 각 탄소원자에 결합되어 있는 수소원자는 본 발명의 효과를 저해하지 않는 치환기로 치환되어 있어도 좋다).

상기 일반식[I]에 있어서, X 및 Ar은, 각각 상기한 이온성 관능기 및 소수성환이다. R¹～R³이 알킬기인 경우, 저급(본 명세서 및 청구범위에 있어서, 「저급」은 탄소수 1～4를 의미한다) 알킬기가 바람직하다. 또한 n은 0～3이 바람직하다. 또한 Ar을 구성하는 각 탄소원자에 결합되어 있는 수소원자는 본 발명의 효과를 저해하지 않는 치환기로 치환되어 있어도 좋고, 이러한 치환기의 예로서, 저급 알킬기 및 저급 알콕실기를 들 수 있다.

일반식[I]로 나타내어지는 반복단위 중, 하기 일반식[II]로 나타내어지는 것이 바람직하다.

식[II]중, M은 수용액중에서 1가의 양이온이 되는 원자 또는 기, 바람직하게는 나트륨이나 칼륨과 같은 알칼리금속, R¹～R³은, 서로 독립적으로 수소원자 또는 저급 알콕실기, R⁴～R⁶은 서로 독립적으로 수소원자 또는 저급 알킬기를 나타낸다.

상기 일반식[I]로 나타내어지는 반복단위 중, 특히 바람직한 것으로서, 하기 식[III]로 나타내어지는 아네톨술폰산염, 하기 식[IV]로 나타내어지는 스티렌술폰산염 및 하기 식[V]로 나타내어지는 나프탈렌산 술폰산 포르말린 축합물염을 들 수 있다.

단, 식[III], [IV] 및 [V]중, M은 식[I]과 동일하며, 바람직하게는 나트륨이나 칼륨과 같은 알칼리금속이다.

상기 폴리머의 분자량은 1000～100000이며, 바람직하게는, 1000～60000이다.

상기 반복단위는 1종만이어도, 2종이상을 조합해서 채용할 수도 있다. 측정값 저하 억제제로서 이용되는 폴리머는, 상기 반복단위만으로 이루어지는 것이 바람직하지만, 본 발명의 효과에 악영향을 주지 않는 범위에서 다른 단위를 함유하고 있어도 좋다. 통상, 이러한 다른 단위의 폴리머중의 함량은 20몰%이하, 바람직하게는 10몰%이하, 더욱 바람직하게는 5몰%이하이다.

본 발명의 면역측정법은 상기한 본 발명의 측정값 저하 억제제의 존재하에서 면역측정법을 행하는 것이다. 측정값 저하 억제제의 사용량은 특별히 한정되지 않 지만, 통상, 반응용액중의 최종농도가 0.01%～5%(중량/용량)이며, 바람직하게는 0.1～1%정도이다. 단, 사용하는 고분자 이온성 계면활성제의 종류, 피검시료와 완충액 및 항혈청액 또는, 감작 라텍스입자의 혼합비 등에 따라 효과가 얻어지는 최적의 농도를 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 면역측정법에 제공되는 피검시료는 특별히 한정되지 않지만, 방해물질의 영향을 억제한다는 본 발명의 효과를 크게 발휘할 수 있는 생체시료가 바람직하고, 특히, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 변, 타액, 조직액, 골수액, 스웝(swab) 등의 체액 등 또는 그 희석물이 바람직하고, 또한, 혈액, 혈청 및 혈장 또는 이들의 희석물이 바람직하다.

면역측정법이 면역응집법인 경우에 이용되는 감작입자에 감작되는 항체 또는 항원은 특별히 한정되는 것은 아니고, 종래와 마찬가지로, 예를 들면 C-반응성 단백(CRP), 류머티즘 인자(RF), 페리틴(FER) 및 미오글로빈(Mb) 및 이들에 대한 항체를 예시할 수 있지만, 물론 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 측정값 저하 억제제의 존재하에서 면역측정법을 행하는 것을 제외하고, 본 발명의 면역측정법은 종래와 마찬가지로 행할 수 있다. 즉, 면역측정법이 면역응집법인 경우, 반응액중의 감작입자의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 통상, 0.01～0.5%정도이며, 반응은, 통상, 1℃~56℃, 바람직하게는 37℃에서 1분간～10분간정도 행해진다. 단, 반응조건은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한 반응매체로서는, 통상, 글리신 완충액 등의 각종 완충액이 이용된다. 반응용액의 탁도 또는 흡광도를 반응의 개시전과 개시후 일정시간후 측정하고, 또는, 반응의 개시전 및 개시후 경시적으로 측정하고, 탁도 또는 흡광도의 변화의 크기(엔드포인트법) 또는 변화의 속도(레이트법)에 기초해서, 피검물질의 검출 또는 정량을 행한다. 또, 면역응집법은, 수동에 의해 행할 수도 있고, 자동분석장치를 이용해서 행할 수도 있다.

면역측정법이 면역응집법인 경우, 본 발명의 방법에서는, 측정값 저하 억제제와, 감작입자 또는 항혈청을 동시에 피검시료와 혼합해도 좋지만, 피검시료를 측정값 저하 억제제와 접촉시키는 제1공정과, 계속해서, 제1공정후의 피검시료를 감작입자 또는 항혈청과 항원항체반응시키는 제2공정을 포함하는 것이 본 발명의 효과를 최대한으로 얻는데에 있어서 바람직하다. 이 경우, 제1공정, 제2공정 모두, 특별히 한정되지 않지만, 반응시간은 각각, 통상 1분간～10분간, 바람직하게는 1분간～5분간, 반응온도는 통상, 1℃~56℃, 바람직하게는 37℃에서 행해진다. 또한 2단계로 반응을 행할 경우, 측정값 저하 억제제의 농도는 제1공정의 반응액중, 바람직하게는 0.01%～5%(중량/용량)이며, 더욱 바람직하게는 0.05～1%정도이다.

본 발명의 면역측정법은, 면역응집법에 한정되는 것은 아니고, 샌드위치 ELISA 등의 샌드위치법, 면역크로마토(Immunochromato)법, 경합법 등도 포함된다. 이들 면역측정법의 경우에도, 본 발명의 측정값 저하 억제제를 면역반응의 매체중에 함유시켜서 각각의 면역측정법을 행하면 좋다. 그 때의 측정값 저하 억제제의 농도는 상기와 동일하면 좋다.

본 발명은, 또한 완충액과, 감작입자와, 상기 측정값 저하 억제제를 함유하는 면역측정법용 시약도 제공한다. 상기와 같이, 면역응집법을 2단계로 반응을 행 하는 경우에는, 면역측정법용 시약은 완충액을 적어도 함유하고, 피검시료와 먼저 혼합되는 제1시약과, 완충액 및 감작입자를 적어도 함유하고, 피검시료와 제1시약의 혼합물에 첨가되는 제2시약으로 이루어지는 2액계 시약인 것이 조작성 및 시약의 안정성의 관점에서 바람직하고, 이 경우, 상기 측정값 저하 억제제는 상기 제1시약중에 함유된다. 이 경우, 제1시약중의 측정값 저하 억제제의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 통상, 0.01～5%(w/v), 바람직하게는 0.01～1%(w/v)정도이다. 또, 이들 시약 외에, 희석액을 이용하여 피검시료를 희석해도 좋다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초해서 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1

시약

이하의 조성으로 이루어지는 미오글로빈 측정용 라텍스 비탁용 시약을 조제했다.

제1시약

170mM 글리신 완충액 pH7.0

50mM EDTA

100mM 염화나트륨

0.3% 폴리아네톨술폰산 나트륨염(분자량 40000)

제2시약

Mb-라텍스「세이켄」/라텍스 부유액(덴카세이켄사제)

실시예2

시약

제1시약

170mM 글리신 완충액 pH7.0

50mM EDTA

100mM 염화나트륨

0.3% 폴리스티렌p-술폰산 나트륨염(분자량 14000)

제2시약

Mb-라텍스「세이켄」/라텍스 부유액(덴카세이켄사제)

(비교예1)

시약

비교용 시약으로서 제1시약중에 폴리아네톨술폰산 나트륨염 및 폴리스티렌p-술폰산 나트륨염을 함유하지 않는 이하의 조성으로 이루어지는 미오글로빈 측정용 라텍스 비탁용 시약을 조제했다.

제1시약

170mM 글리신 완충액 pH7.0

50mM EDTA

100mM 염화나트륨

제2시약

Mb-라텍스「세이켄」/라텍스 부유액(덴카세이켄사제)

또, 실시예1, 실시예2 및 비교예1의 제1시약, 제2시약에서 이용하는 완충액은 인산 완충액, 굿 완충액 등을 사용할 수 있고, pH에 대해서도 완충액의 바람직한 pH를 사용할 수 있다.

측정예

피검시료 무작위로 추출한 임상검체 일례(혈청)

측정방법 시료조제 피검시료를, 생리식염액을 희석액으로 해서 희석농도 1/10(10배희석)～10/10(희석하지 않음)의 단계로 희석한다.

측정방법 도시바 TBA-30R형 자동분석장치에 의한 측정

자동분석장치에 의한 측정

실시예1, 실시예2 및 비교예1의 각 시약을 이용하여 측정을 행했다. 상술의 조제한 시료 20μL에 제1시약 200μL를 첨가하고, 37℃에서 교반혼합하고, 5분간 방치후, 제2시약 100μL를 첨가하고, 다시 37℃에서 교반혼합한 후, 약 2분간의 응집반응을 570nm의 흡광도 변화량으로서 측정했다. 또 미리 기지 농도의 시료를 동일조건으로 측정하고, 농도와 흡광도 변화량의 관계를 나타내는 검량선을 작성해 두었다. 제1시약중의 측정값 저하 억제제의 유무에 따라, 구한 각각의 측정값(ng/mL)을 비교했다.

결과를 하기 표1에 나타낸다. 표1 중, 「이론값」은 각 예에 있어서의 공존하는 방해물질이 일으키는 측정값 저하작용을 무시할 수 있는 희석농도 1/10(10배 희석)의 측정값을 기준으로 하고, 이것에 희석농도의 분자를 곱한 값(희석농도 10/10이면 10배, 2/10이면 2배)을 의미한다. 또한 차(%)는, (이론값-측정값)/이론값×100(%)을 의미하고, 차(%)가 작을 수록, 이론값과의 괴리가 작은 것을 나타낸다.

표1

(측정값, 이론값 단위:ng/ml)

표1에 나타내듯이, 측정값 저하 억제제를 함유하지 않는 비교예1에서는, 무희석의 시료(희석 농도 10/10)에서, 이론값과 측정값의 차가 33%에나 이르는 것에 대해서, 본 발명의 실시예1 및 2에서는, 무희석의 경우에도 차는 5% 또는 4%였다. 이들 결과는, 본 발명의 측정값 저하 억제제의 첨가에 의해 이론값과 측정값의 차가 작게 되는 것을 나타내고 있으며, 방해물질의 영향이 저감됨으로써 측정값의 정확성이 대폭 향상되어 있는 것을 알 수 있다.

Claims

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일반식[III] 또는 일반식[V]로 나타내어지는 반복단위를 갖는 폴리머로서, 분자량이 1000～100000인 이온성 계면활성제로 이루어지는 피검시료중의 방해물질에 의한 측정값 저하를 억제하기 위한 면역측정법용 측정값 저하 억제제의 존재하에서, 무희석의 피검시료에 대해 행하는 것을 특징으로 하는 면역측정법.

(식 [III]에서 M은 수용액중에서 1가의 양이온이 되는 원자 또는 기를 나타낸다.)

(식 [V]에서 M은 수용액중에서 1가의 양이온이 되는 원자 또는 기를 나타낸다.)
제10항에 있어서, 피검시료를 상기 측정값 저하 억제제와 접촉시키는 제1공정과, 계속해서, 제1공정후의 피검시료를 감작입자 또는 항혈청과 항원항체 반응시키는 제2공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역측정법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 피검시료가 생체시료인 것을 특징으로 하는 면역측정법.
제12항에 있어서, 피검시료가 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 면역측정법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 반응용액중의 상기 측정값 저하 억제제의 농도가 0.01%～5%(중량/용량)인 것을 특징으로 하는 면역측정법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 면역응집법인 것을 특징으로 하는 면역측정법.
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