JP2014209113A - 免疫測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、検体中の非目的物質の固相表面への非特異的な結合を抑制する方法(特許文献1)や検体由来の不純物による非特異反応を抑制する方法(特許文献2)などが挙げられる。
(項1)
検体中の抗原又は抗体との免疫反応を12〜20のHLB値を有する非イオン性界面活性剤が存在する液相中で起こし、次いで、固相上で測定を行うことを特徴とする、検体中の抗原又は抗体の測定におけるブランク値の低減方法。
(項2)
項1に記載の方法であって、以下の工程(1)〜(4)に従って実行される、測定対象物質の測定におけるブランク値の低減方法。
工程(1):測定対象物質を含有する試料と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であってリガンドで修飾された抗体(一次抗体)を含む溶液と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であって酵素で標識された抗体(二次抗体)を含む溶液とを混合し、12〜20のHLB値を有する非イオン性界面活性剤が存在する液相中で、免疫反応により前記一次抗体、前記測定対象物質および前記二次抗体のサンドイッチ複合体をつくる。
工程(2):前記サンドイッチ複合体を含む溶液を、あらかじめ前記リガンドと結合可能な物質を固相化した担体に触れさせて、前記複合体を前記固相化担体上の抗体に結合させる。
工程(3):前記固相化担体を洗浄液で洗浄することにより、前記固相化担体上の抗体に結合していない一次抗体および二次抗体を除去する。
工程(4):前記固相化担体に前記酵素の基質を含む液を添加し、前記固相化担体上で酵素による基質の化学変化量をモニタリングすることにより測定を行う。
(項3)
前記固相をブロッキング処理する工程を含む、項1または項2に記載の方法。
(項4)
前記非イオン性界面活性剤のHLB値が16〜19である、項1〜項3のいずれかに記載の方法。
(項5)
前記工程(1)における液相中の非イオン性界面活性剤の濃度が0.005〜10重量%である、項1〜項4のいずれかに記載の方法。
(項6)
前記工程(1)における液相中の非イオン性界面活性剤の濃度が0.2〜5重量%である、項5に記載の方法。
本発明は、液相中において検体中の抗原又は抗体と免疫反応を起こし、固相上で測定する免疫測定法を用いて検体中の抗原又は抗体を測定する免疫測定法において、12〜20のHLB値を有する非イオン性界面活性剤を免疫反応系に存在させて免疫反応を行なうことを特徴とする検体中の抗原又は抗体の測定におけるブランク値の低減方法に関する。
工程(1):後述の固相化担体と結合できるよう修飾された一次抗体と、酵素標識二次抗体と、測定対象物質を成分として含有する試料とを混合、インキュベートし、測定対象物質とのサンドイッチ複合体をつくる。
工程(2):工程(1)でできた複合体を含む溶液を、あらかじめ、修飾された一次抗体と結合可能な抗体を固相化し、ブロッキング剤を添加した担体の反応層に添加し、上記複合体を固相に結合させる。
工程(3):反応層を、洗浄液で洗浄することにより、未反応の標識抗体などを除去する。
工程(4):反応層に基質液を添加し、発色・発光量などをモニタリングする。
上記の手順(A)においては、工程(1)の「固相と結合できるよう修飾された抗体」および「酵素標識抗体」が固相から遊離して未結合である状態であり、工程(1)が液相中で該抗体を抗原と反応させ抗体−抗原複合体を生成する免疫反応に該当する。
工程(1):一次抗体を固相化した反応層に測定対象物質を成分として含有する試料を添加、インキュベートし、測定対象物質を一次抗体に捕捉させる。
工程(2):反応層を洗浄液で洗浄することにより、一次抗体に捕捉された測定対象物質以外の試料成分を除去する。
工程(3):酵素標識二次抗体を含む溶液を反応層に添加し、一次抗体に捕捉された測定対象物質に該標識抗体を結合させる。
工程(4):反応層を、洗浄液で洗浄することにより、未反応の標識抗体などを除去する。
工程(5):反応層に基質液を添加し、発色・発光量などをモニタリングする。
EIA法による免疫測定法は、上記の例示のほか種々のバリエーションがあり、それぞれの方法が、既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されない。
工程(1):測定対象物質を含有する試料と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であってリガンドで修飾された抗体(一次抗体)を含む溶液と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であって酵素で標識された抗体(二次抗体)を含む溶液とを混合し、12〜20のHLB値を有する非イオン性界面活性剤が存在する液相中で、免疫反応により前記一次抗体、前記測定対象物質および前記二次抗体のサンドイッチ複合体をつくる。
工程(2):前記サンドイッチ複合体を含む溶液を、あらかじめ前記リガンドと結合可能な物質を固相化した担体に触れさせて、前記複合体を前記固相化担体上の抗体に結合させる。
工程(3):前記固相化担体を洗浄液で洗浄することにより、前記固相化担体上の抗体に結合していない一次抗体および二次抗体を除去する。
工程(4):前記固相化担体に前記酵素の基質を含む液を添加し、前記固相化担体上で酵素による基質の化学変化量をモニタリングすることにより測定を行う。
また、これらの抗体等を、そのタンパク質中の第1級アミンあるいは遊離のスルフヒドリル基を標的に、グルタルアルデヒドやマレイミド基を導入して活性化した酵素やビオチン結合タンパク質(アビジン)等のリガンドで、目的に応じて、修飾または標識反応する方法も公知であり、特に限定されない。このような方法で、例えば、前記固相に固相化された物質と結合可能なリガンドで修飾された抗体(一次抗体)や、酵素等で標識された抗体(二次抗体)を作成することができる。これらの修飾抗体または標識抗体等は、通常水溶液として保持されるが、その組成は、それぞれの機能を損ねない範囲で、特に限定されない。
ブロッキング処理の方法は特に限定されない。例えば、手順(A)の工程(2)で用いられる担体に、あらかじめブロッキング剤を添加する方法でもよい。本発明で用いるブロッキング剤は、特に限定されない。例えばカゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン(BSA)、ゼラチンなどのほか、血液タンパク質または植物タンパク質を有効成分とするもの、兎血液成分などが挙げられる。なかでもカゼインが好ましい。
B/F分離等に用いる洗浄液の組成は、測定対象物質に未結合の標識物を洗浄する機能を実用上保持するものであれば、特に限定されない。
また、検出に利用する酵素−基質系についても限定されない。例えば、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼを用いる系が挙げられる。酵素活性の検出に用いる基質も特に限定されない。これらは、市販品を用いることができる。基質を含む基質液の組成は、その機能を損ねない範囲で、特に限定されない。
HLB値の好ましい下限は12.1であり、さらに好ましくは14であり、さらに好ましくは15であり、さらに好ましくは16であり、さらに好ましくは16.3である。HLB値の好ましい上限は19であり、さらに好ましくは18.1である。
また、その構造は特に限定されないが、好ましくは、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤及からなる群から選ばれる化合物が挙げられる。中でも、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリステルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテルなどの、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。
これらのほかにも、ポリオキシエチレン(20)ポリオキシプロピレン(8)セチルエーテル(日光ケミカルズ製、PBC44)(HLB12.5)、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル(花王製、エマルゲンB−66)(HLB13.2)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(日光ケミカルズ製、HCO−50)(HLB13.5)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル(日本エマルジョン製、DAPE−0220)(HLB14)、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(花王製、エマルゲンLS−114)(HLB14)、ポリオキシエチレンヒマシ(日光ケミカルズ製、CO−60TX)(HLB14)、ピログルタミン酸エステル(日本エマルジョン製、GPI−25)(HLB15)、ポリオキシエチレン(15)ノニルフェニルエーテル(日光ケミカルズ製、NIKKOL NP15)(HLB18)、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(日油製、ノニオンNS270)(HLB18.7)、ポリオキシエチレン(18)ノニルフェニルエーテル(日光ケミカルズ製、NIKKOL NP18TX)(HLB19)、ポリオキシエチレン(20)ノニルフェニルエーテル(日光ケミカルズ製、NIKKOL NP20)(HLB20)、ポリオキシエチレン(30)ノニルフェニルエーテル(日光ケミカルズ製、NIKKOLOP30)(HLB20)などが例示できる。
HLB値がわからない場合は、例えば、界面活性剤の性質と応用(刈米孝夫著、昭和55年、幸書房発行)p.89〜97に記載されたHLB既知の乳化剤Bとの混合物の乳化試験によるHLBの測定方法により次式によって求めることができる。
HLBo=(Wa×HLBa+Wb×HLBb)/(Wa+Wb)
Wa:被検界面活性剤の重量%
Wb:HLB既知の乳化剤の重量%
HLBa:被検界面活性剤のHLB値
HLBb:HLB既知の乳化剤のHLB値
HLBo:乳化する油剤の所要HLB値
ここで、WaとWbは最適な乳化状態を示す場合の配合比を用いる。既知の乳化剤としては、HLB9以上のノニオン乳化剤が使用されており、例えばモノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20EO)(HLB14.9)等が挙げられる。また、乳化する油剤としては一般的な炭化水素油やエステル油等が使用されており、例えば流動パラフィン(所要HLB10)が挙げられる。
あるいは、高速液体クロマトグラフィーによって求める方法も挙げられる。
このような場合は、非イオン性界面活性剤を、特定のステップのみに加えても良いし、全ての免疫反応系のステップに加えても良く、特に限定されるものではない。特定のステップのみに加える場合は、その最初のステップで添加することが好ましい。
たとえば、固相化担体と結合できるよう修飾された一次抗体を含む溶液、酵素標識二次抗体を含む溶液、測定対象物質を成分として含有する試料および洗浄液などに添加しておいても良いが、特に好ましくは測定対象物質を成分として含有する試料への添加が挙げられる。
S/N比は、界面活性剤非添加時に比べて1・5倍以上であることが好ましく、さらに2倍以上であることが好ましく、さらに3倍以上であることが好ましい。
ブランクは、界面活性剤非添加時に比べて7割以下であることが好ましく、さらには5割以下であることが好ましい。
より精度よい測定のためには、S/N比の向上とブランクの低減は、その両方が改善されていることが好ましい。具体的にはS/N比1.5倍以上かつブランク7割以下であることが好ましい。さらにS/N比2倍以上かつブランク7割以下であることが好ましく、さらにS/N比3倍以上かつブランク5割以下であることが好ましい。
液相での反応は、前記サンドイッチ複合体に該界面活性剤が作用してから担体に結合という順で進むので、複合体を作らない遊離抗体が水溶液中でコーティングされて可溶化し、担体に非特異結合する力が弱まると考えられる。
各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるアデノウイルス抗原の酵素免疫測定法により調べた。
(1)POCube専用13連容器の試薬ウェルに5ng/mlビオチン標識アデノウイルス抗体液Aと0.2ng/mlアルカリホスファターゼ標識抗体液Bをそれぞれ70μlずつ添加した。
(2)(1)で添加した該試薬ウェルから抗体液Aを30μl、抗体液Bを40μl吸引し、別の試薬ウェルに添加して混合した。
(3)該13連容器の検体ウェルに希釈処理済抗原液を150μl添加した。ブランクとしては抗原を含まない前処理液を150μl添加した。
(4)(2)で作製した抗体液Aと抗体液Bの混合液を含むウェルに、(3)で用意した抗原液(またはブランク)のうち100μlを添加して混合し、40℃で4分間反応させ、抗原−抗体のサンドイッチ複合体を形成した。
(5)POCube専用反応容器(第一抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタ(抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルター固相)を含む容器)に、1重量%カゼインを含むブロッキング剤を50μl添加した後、(4)で作製した混合液を該POCube専用反応容器に150μl添加し、抗原−抗体のサンドイッチ複合体を反応容器に結合させた。
(6)該13連容器の試薬ウェルに分注したB/F分離用緩衝液で洗浄し、該13連容器の試薬ウェルに分注した発色基質30μlを添加し、発光強度を測定した。
(1)POCube専用13連容器の試薬ウェルに5ng/mlビオチン標識アデノウイルス抗体液Aと0.2ng/mlアルカリホスファターゼ標識抗体液Bをそれぞれ70μlずつ添加した。
(2)該13連容器の検体ウェルに希釈処理済抗原液を150μl添加した。ブランクとしては抗原を含まない前処理液を150μl添加した。
(3)POCube専用反応容器(第一抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタ(抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルター固相)を含む容器)に1重量%カゼインを含むブロッキング剤を50μl添加した後、(1)でウェルに添加した標識抗体液A70μlのうち、25μlを添加し、40℃で3分間反応させ、抗体を反応容器に結合させた。
(4)該13連容器の試薬ウェルに予め分注しておいたB/F分離用緩衝液で洗浄した後、該反応容器に検体を含む前処理液を添加し、40℃で3分間反応させ、抗原−抗体免疫反応を起こした。
(5)該反応容器に(1)でウェルに添加した標識抗体液B70μlのうち、35μlを添加し、40℃で3分間反応させ、抗原−抗体のサンドイッチ複合体を形成した。
(6)該13連容器の試薬ウェルに分注したB/F分離用緩衝液で洗浄した後、該13連容器の試薬ウェルに分注した発色基質30μlを添加し、発光強度を測定した。
これに対し、PEG4000の場合は、対照(添加物なし)と比較してブランク、S/N比ともに目立った改善は見られなかった。また、非イオン界面活性剤であっても、HLB値10.5のポリオキシエチレン(5)アルキルエーテルの場合は、目立った改善は見られなかった。
また、固相反応での検討では、すべての試験において目立った改善は見られなかった。
各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるアデノウイルス抗原の酵素免疫測定法により調べた。
実施例1に記載の液相反応と同様の手順で反応を行った。
同様の検討を、ブロッキング剤を添加せずに行い、それぞれの発光強度を測定した。
各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるアデノウイルス抗原の酵素免疫測定法により調べた。
実施例1に記載の液相反応と同様の手順で反応を行った。
これに対し、PEG400、PEG4000、PEG20000の場合は、対照(添加物なし)と比較してブランク、S/N比ともに目立った改善は見られなかった。
各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるアデノウイルス抗原の酵素免疫測定法により調べた。
実施例1に記載の液相反応と同様の手順で反応を行った。
実施例5
各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるアデノウイルス抗原の酵素免疫測定法により調べた。
実施例1に記載の液相反応と同様の手順で反応を行った。
各種界面活性剤の効果を下記のサンドイッチ法によるアデノウイルス抗原の酵素免疫測定法により調べた。
実施例1に記載の液相反応と同様の手順で反応を行った。
Claims (6)
- 検体中の抗原又は抗体との免疫反応を12〜20のHLB値を有する非イオン性界面活性剤が存在する液相中で起こし、次いで、固相上で測定を行うことを特徴とする、検体中の抗原又は抗体の測定におけるブランク値の低減方法。
- 請求項1に記載の方法であって、以下の工程(1)〜(4)に従って実行される、測定対象物質の測定におけるブランク値の低減方法。
工程(1):測定対象物質を含有する試料と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であってリガンドで修飾された抗体(一次抗体)を含む溶液と、前記測定対象物質と結合可能な抗体であって酵素で標識された抗体(二次抗体)を含む溶液とを混合し、12〜20のHLB値を有する非イオン性界面活性剤が存在する液相中で、免疫反応により前記一次抗体、前記測定対象物質および前記二次抗体のサンドイッチ複合体をつくる。
工程(2):前記サンドイッチ複合体を含む溶液を、あらかじめ前記リガンドと結合可能な物質を固相化した担体に触れさせて、前記複合体を前記固相化担体上の抗体に結合させる。
工程(3):前記固相化担体を洗浄液で洗浄することにより、前記固相化担体上の抗体に結合していない一次抗体および二次抗体を除去する。
工程(4):前記固相化担体に前記酵素の基質を含む液を添加し、前記固相化担体上で酵素による基質の化学変化量をモニタリングすることにより測定を行う。 - 前記固相をブロッキング処理する工程を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記非イオン性界面活性剤のHLB値が16〜19である、請求項1〜請求項3のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(1)における液相中の非イオン性界面活性剤の濃度が0.005〜10重量%である、請求項1〜請求項4のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(1)における液相中の非イオン性界面活性剤の濃度が0.2〜5重量%である、請求項5に記載の方法。
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