JP6943371B2 - 尿中の急性腎障害マーカーの測定方法 - Google Patents
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Description
しかし、尿中NGALでは、化学発光免疫測定法 (CLIA法)(chemiluminescent immunoassay)により診断に35分、尿中KIM-1ではELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay法)により診断に6時間を要する。そのため、急性腎障害の予後改善のために、より迅速な診断法の開発が求められている。
また、尿に含まれるチオレドキン以外の他の急性腎障害マーカー、例えばNGAL(好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン)およびKIM-1(Kidney injury molecule 1)などについても、同様に迅速で正確な安定した測定法が要望されている。
(1)尿検体に含まれる急性腎障害マーカーを測定する方法であって、
尿検体を緩衝液で希釈し、尿検体のpHを6〜9の範囲内に維持する前処理工程と、
前処理した前記尿検体に含まれる急性腎障害マーカーを、免疫学的反応を利用して測定する工程と、
を含むことを特徴とする、尿中の急性腎障害マーカーの測定方法。
(2)前記急性腎障害マーカーの測定が、検出系に化学発光反応を用いる方法である、(1)に記載の測定方法。
(3)前記急性腎障害マーカーの測定が、化学発光酵素免疫測定法である、(1)または(2)に記載の測定方法。
(4)尿検体に含まれる急性腎障害マーカーを測定する方法であって、以下の(イ)および(ロ)の工程を含むことを特徴とする、尿中のチオレドキン測定方法。
(イ)尿検体を緩衝液で希釈し、尿検体のpHを6〜9の範囲内に維持する前処理工程。
(ロ)以下の(A)に記載された(a)から(e)の工程、または、(B)に記載された(a)から(d)の工程を含む、前処理した前記尿検体に含まれる急性腎障害マーカーを測定する工程。
(A)
(a)前記(イ)工程で前処理された尿検体と、この尿検体に含まれる急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合し且つリガンドが結合された第一の抗体を含む溶液とを接触させて、前記抗原と第一の抗体との複合体を形成する工程。
(b)前記複合体を含む溶液を、前記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、前記複合体のリガンド部分を前記リガンド補捉剤に結合させる工程。
(c)前記多孔性フィルタの表面に、前記抗原に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体の溶液を滴下して、第二の抗体を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体とTRX抗原との複合体に結合させる工程。
(d)多孔性フィルタを洗浄し、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
(e)多孔性フィルタに結合した前記酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
(B)
(a)前記(イ)工程で前処理された尿検体と、この尿検体に含まれる急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合し且つリガンドが結合された第一の抗体と、前記TRX抗原に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で抗原に結合する、酵素で標識された第二の抗体とを接触させて、第一の抗体と第二の抗体と抗原との複合体を溶液中にて形成する工程。
(b)前記複合体を含む溶液を、前記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、前記複合体のリガンド部分を前記リガンド補捉剤に結合させる工程。
(c)多孔性フィルタを洗浄し、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
(d)多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
(5)前記急性腎障害マーカーが、TRX(チオレドキン)、NGAL(好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン)またはKIM-1(Kidney injury molecule 1)である(1)〜(4)のいずれかに記載の測定方法。
(6)尿検体が酸性である場合に、この尿検体をpH6〜9の範囲内に調整し、緩衝液で希釈する(1)〜(5)のいずれかに記載の測定方法。
(7)前記緩衝液が、動物血清入り緩衝液である(1)〜(6)のいずれかに記載の測定方法。
(8)上記(1)〜(7)のいずれかに記載の、尿中の急性腎障害マーカーを測定する方法に用いるためのキットであって、少なくとも
(i) 前処理用の緩衝液、
(ii) 前記尿検体に含まれる急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合する第一の抗体、
(iii)前記尿検体に含まれる急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合する第二の抗体、
(iv) 未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液、および
(v) 多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定するための発光基質
を含むことを特徴とするキット。
本発明に係る尿中のチオレドキン測定方法は、(I)尿検体を緩衝液で希釈し、尿検体のpHを6〜9の範囲内に維持する前処理工程と、(II)前処理した前記尿検体に含まれるチオレドキンを測定する工程と、を含む。チオレドキンの測定は、免疫学的反応を利用して行い、特に検出系に化学発光反応を用いる方法、例えば化学発光酵素免疫測定法(CLEIA法)が好適に利用される。
使用可能なアルカリ剤としては、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、グリシン-NaOH緩衝液、トリシン−NaOH緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが使用可能である。
なお、尿検体のpHが上記範囲内にある場合や、上記範囲内にあると推測される場合等には、pH補正を行うことなく、緩衝液で希釈するだけでもよい。
動物血清入りの緩衝液としては、具体的には、例えば東洋紡(株)製のピオキューブFluAB検体前処理液などが挙げられる。
pH調整が必要な場合、pH調整と緩衝液の希釈との順序は特に限定されるものではないが、尿検体をpH調整後、緩衝液で希釈するのが好ましい。pH調整を行わない場合には、東洋紡(株)製のピオキューブFluAB検体前処理液などの動物血清入りのリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはトリス塩酸緩衝液で希釈するだけでもよい。
(A)
(a)前処理した尿検体と、この尿検体に含まれるチオレドキン(TRX抗原)に特異的に結合し且つリガンドが結合された第一の抗体を含む溶液とを接触させて、前記TRX抗原と第一の抗体との複合体を形成する工程(第一免疫反応)。
(b)前記複合体を含む溶液を、前記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、前記複合体のリガンド部分を前記リガンド補捉剤に結合させる工程。
(c)前記多孔性フィルタの表面に、前記TRX抗原に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体の溶液を滴下して、第二の抗体を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体とTRX抗原との複合体に結合させる工程(第二免疫反応)。
(d)多孔性フィルタを洗浄し、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
(e)多孔性フィルタに結合した前記酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
(B)
(a)前処理した尿検体と、この尿検体に含まれるチオレドキン(TRX抗原)に特異的に結合し且つリガンドが結合された第一の抗体と、前記TRX抗原に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分でTRX抗原に結合する、酵素で標識された第二の抗体とを接触させて、第一の抗体と第二の抗体とTRX抗原との複合体を溶液中にて形成する工程。
(b)前記複合体を含む溶液を、前記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、前記複合体のリガンド部分を前記リガンド補捉剤に結合させる工程。
(c)多孔性フィルタを洗浄し、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
(d)多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
CLEIA法に使用可能な測定装置としては、例えば東洋紡(株)製の小型化学発光免疫自動分析装置POCube(登録商標)等が挙げられる。
前処理工程なしで、急性腎障害患者6人の尿検体について、CLEIA法を用いてチオレドキンの測定を行い、測定結果を従来のELISA法と比較した。
<CLEIA法>
(実験1)第1抗体(ビオチン標識抗体)の調製
TRX11抗体(MBL(医学生物学研究所)社)1 mgと、ビオチンアミドカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを25℃で4時間反応させ、Amicon Ultra−4(ミリポア社製)を用いて分画し、第1抗体液を調製した。
(実験2)第2抗体(ALP標識抗体)の調製
TRX21抗体(MBL(医学生物学研究所)社)0.1 mgをAlkaline Phosphatase Labeling Kit - SH(同人化学社製)を用いて、第2抗体液を調製した。
(実験3)チオレドキン抗原測定
急性腎障害患者より採取した尿検体液75μLに第1抗体液20μLを添加し、混合後、40℃でインキュベーションした(第一免疫反応)。10秒後に、検体・第1抗体液混合液70μLをあらかじめ50μLの蒸留水を添加したPOCube(東洋紡績(株)製)専用反応容器(第1抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタを含む容器)に添加し、さらに、第2抗体液を20μL添加し、40℃でインキュベーションした。150秒後に、0.05%のTween20を含む蒸留水を80μLずつ2回添加し、さらに発色基質としてLumigen(登録商標)APS−5(Lumigen社製)30μLを添加し、発光強度を測定した。そして、事前に作成した発光強度とチオレドキン量との関係を示す検量線から、尿検体中のチオレドキン量を測定した。なお、チオレドキン抗原測定に要した時間は約6分間であった。
<ELISA法>
上記と同じ急性腎障害患者の尿検体について、従来のELISA法にてチオレドキン量を測定した。
<ELISA法とCLEIA法との対比>
図1にCLEIA法とELISA法との各測定結果を示す。同図に示すように、ELISA法では、尿中チオレドキンが200ng/mL以上であった尿検体が、CLEIA法で測定すると、0.02〜50.0ng/mLであった。従って、そのままではCLEIA法で尿中チオレドキンを正確に測定できないことがわかる。
(至適pH条件の検討)
以下の尿検体について、前記したCLEIA法にて尿中チオレドキン(TRX)を測定した。
・pH8の尿検体1
・pH8の尿検体1をpH4に調整した尿検体2
・pH4の尿検体2をpH8に戻した尿検体3
pH調整には、酸としてHCl水溶液を使用し、アルカリとしてNaOH水溶液を使用した。
試験結果を図2に示す。同図に示すように、pH4の尿検体2では、前記したCLEIA法で測定した尿中チオレドキンは、測定感度以下まで低下していた。これに対して、pHを8まで戻すことにより(「pH4−8」として表示)、正確な測定が可能になることがわかる。
(pH補正+緩衝液で希釈)
急性腎障害患者から採取した尿検体のpHを6〜9の範囲内に調整し、ついで、動物血清入り緩衝液(東洋紡(株)製のピオキューブFluAB検体前処理液)にて2、4、8、16、32倍に希釈した。このようにして前処理した尿検体中のチオレドキンを、試験例1と同様にしてCLEIA法にて測定した。
一方、上記の前処理をしていない同じ尿検体について、従来のELISA法にて、ELISA法所定の専用希釈液で40倍に希釈した後、チオレドキンを測定し、東洋紡(株)製のピオキューブFluAB検体前処理液で8倍希釈した尿検体をCLEIA法で測定した結果と比較した。その結果を図3に示す。同図において、グラフ内の黒点は、試験に供した各急性腎障害患者の尿検体を示している。
図3に示すように、pH補正し緩衝液で希釈した尿検体を使用して、CLEIA法にて測定した尿中チオレドキンの測定値は、ELISA法による測定値と良好な直線関係を有していることがわかる。
これにより、臨床尿検体の尿中チオレドキンを6分程度の短時間にしかも正確に且つ安定的に測定できることから、急性腎障害の迅速な診断が可能になる。
Claims (5)
- 尿検体に含まれる急性腎障害マーカーを測定する方法であって、以下の(イ)および(ロ)の工程を含むことを特徴とする、尿中の急性腎障害マーカーの測定方法。
(イ)尿検体を緩衝液で希釈し、尿検体のpHを6〜9の範囲内に維持する前処理工程。
(ロ)以下の(A)に記載された(a)から(e)の工程、または、(B)に記載された(a)から(d)の工程を含む、前処理した前記尿検体に含まれる前記急性腎障害マーカーを測定する工程。
(A)
(a)前記(イ)工程で前処理された尿検体と、この尿検体に含まれる前記急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合し且つリガンドが結合された第一の抗体を含む溶液とを接触させて、前記抗原と第一の抗体との複合体を形成する工程。
(b)前記複合体を含む溶液を、前記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、前記複合体のリガンド部分を前記リガンド補捉剤に結合させる工程。
(c)前記多孔性フィルタの表面に、前記抗原に特異的に結合する、酵素で標識された第二の抗体の溶液を滴下して、第二の抗体を、リガンド補捉剤とリガンド部分とを介して多孔性フィルタに結合している第一の抗体と抗原との複合体に結合させる工程。
(d)多孔性フィルタを洗浄し、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
(e)多孔性フィルタに結合した前記酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。
(B)
(a)前記(イ)工程で前処理された尿検体と、この尿検体に含まれる前記急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合し且つリガンドが結合された第一の抗体と、前記抗原に特異的に結合する第一の抗体とは別の抗体であって、第一の抗体と同じもしくは異なる部分で抗原に結合する、酵素で標識された第二の抗体とを接触させて、第一の抗体と第二の抗体と抗原との複合体を溶液中にて形成する工程。
(b)前記複合体を含む溶液を、前記リガンドの補捉剤が結合された多孔性フィルタの表面に滴下して、前記複合体のリガンド部分を前記
リガンド補捉剤に結合させる工程。
(c)多孔性フィルタを洗浄し、多孔性フィルタに結合していない試薬を除去する工程。
(d)多孔性フィルタに結合した酵素の活性を、発光基質を用いて測定する工程。 - 前記急性腎障害マーカーが、TRX(チオレドキン)、NGAL(好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン)またはKIM-1(Kidney injury molecule 1)である請求項1に記載の測定方法。
- 尿検体が酸性である場合に、この尿検体をpH6〜9の範囲内に調整し、緩衝液で希釈する請求項1または2に記載の測定方法。
- 前記緩衝液が、動物血清入り緩衝液である請求項1〜3のいずれかに記載の測定方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の、尿中の急性腎障害マーカーを測定する方法に用いるためのキットであって、少なくとも
(i) 前処理用の緩衝液、
(ii) 前記尿検体に含まれる急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合する第一の抗体、
(iii)前記尿検体に含まれる急性腎障害マーカー(抗原)に特異的に結合する第二の抗体、
(iv) 未結合の検体・抗体を除去するための洗浄液、および
(v) 多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定するための発光基質
を含むことを特徴とするキット。
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