CN105652006A - 梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法 - Google Patents

梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法 Download PDF

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Abstract

梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，涉及梅毒特异性总抗体的检测。制备梅毒螺旋体特异性重组抗原；制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜；制备抗人Ig单克隆抗体；抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；将重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下,光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品孵育；硝酸纤维素膜洗涤；加入辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体孵育；磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；加入显色剂，放置，磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。不需要特殊仪器，可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强。

Description

梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法
技术领域
本发明涉及梅毒特异性总抗体的检测，尤其是涉及梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率居高不下，梅毒的防控已成为我国公共卫生服务的主要任务之一。
梅毒的实验室诊断方法主要有如下几种([1]林丽蓉,杨波,潘锡涛,等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010，20(10)：1491-1494)：
(1)病原学检测：梅毒螺旋体感染早期，当梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视野显微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但易受取材技术、取材部位、样本中梅毒螺旋体含量、局部用药及送检时间等诸多因素影响，灵敏度较低。
(2)抗体检测试验：梅毒螺旋体不能进行体外培养，诊断主要依赖于实验室检查，现有的血清学检测灵敏度、特异性不高，任何一种检测方法均存在缺陷，临床漏诊和误诊率较高。
用于梅毒血清学检验的抗原主要以重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47为主([2]Lin,L.R.,Z.G.Fu,etal."Developmentofacolloidalgold-immunochromatographyassaytodetectimmunoglobulinGantibodiestoTreponemapallidumwithTPN17andTPN47."Diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease.2010.68(3):193-200.)，检测方法包括生物素亲和素检测法(中国专利CN201410410641.4)、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验等方法，这些检测方法的结果判断需要特殊的仪器设备(前者需要酶标仪而后者不仅需要荧光显微镜还需要有经验丰富的技术人员进行结果判读，因此在基层或边远地区，急需一种灵敏度和特异性较高的梅毒螺旋体特异性抗体检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供不需要特殊仪器，可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强的梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法。
本发明包括如下步骤：
1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47；
2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位，将抗原混合物加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭，将封闭后的硝酸纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴晾干燥处备用；
3)以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人Ig单克隆抗体；
4)采用过碘酸钠法进行抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；
5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min；
6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；
7)加入50μL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体,37℃孵育10min，再用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；
8)加入显色剂，放置后再用磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；
9)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。
在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔可采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔；所述抗原混合物的用量可为0.5μL；所述奶粉可采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉；所述封闭的时间可为30min；所述磷酸盐缓冲液可采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。
在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。
在步骤7)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。
在步骤8)中，所述显色剂可采用3,3-二氨基苯联胺(DAB)；显色剂的加入量可为50μL；所述3,3-二氨基苯联胺(DAB)可按50mg3,3-二氨基苯联胺加入摩尔比0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制；所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明作为一种抗原的干燥保存形式，延长已包被抗原的保存时间，可实现单个样本独立保存，避免反复冻融造成的抗原变性。本发明应用斑点酶联免疫吸附法(dotenzyme-linkedimmunosorbentassay，dot-ELISA)检测梅毒特异性总抗体不需要特殊仪器，也可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强。
附图说明
图1为硝酸纤维素膜压迹示意图。
在图1中，各标记为：1、硝酸纤维素膜，2、硝酸纤维素膜压迹。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例一
参见图1，所述的梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)制备梅毒螺旋体特异性重组抗原：
采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性抗原TPN17和TPN47。
(2)制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜：
用直径6mm的的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位；用微量取液器取0.5μL抗原混合物，加至硝酸纤维素膜上的压迹中央,室温下干燥；将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于5％的脱脂奶粉中,室温下封闭30min；将封闭后之硝酸纤维素膜置于0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗3次,每次2min。取出后将硝酸纤维素膜片置室温晾干即为“快诊膜”,存放于阴晾干燥处备用。
(3)制备抗人Ig单克隆抗体
以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人Ig单克隆抗体。
(4)采用过碘酸钠法进行抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；
(5)检测标本处理：
取人静脉血5mL，置37℃水浴30min，3000g离心10min，上清为检测样品备用。
(6)加样：
将步骤(2)中的快诊膜沿压迹或划痕剪下,光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min。
(7)硝酸纤维素膜洗涤：
加350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次,每次2min，每次洗涤后弃液体。
(8)加入50μL步骤(4)中辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体,37℃孵育10min。
(9)350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次,每次2min，每次洗涤后弃液体。
(10)显色：加入3.3-二氨基苯联胺(DAB)显色剂50μL，37℃放置5min,所述的DAB显色剂按50mgDAB加入0.05mol/LTris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。
(11)加入350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤液漂洗1次，弃液体。
结果判读：硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。
实施例二
以下给出梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA检测方法检测患者的临床标本中的梅毒螺旋体抗体：
(1)检测标本处理：
取人静脉血5mL，置37℃水浴30min，3000g离心10min，上清为检测样品备用。
(2)加样：
在已放入快诊膜的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min。
(3)硝酸纤维素膜洗涤：
加350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次,每次2min，每次洗涤后弃液体。
(4)加入50μL辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体,37℃孵育10min。
(5)350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次,每次2min，每次洗涤后弃液体。
(6)显色：加入3.3-二氨基苯联胺(DAB)显色剂50μL，37℃放置5min,所述的DAB显色剂按50mgDAB加入0.05mol/LTris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。
(7)加入350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤液漂洗1次，弃液体。
(8)结果判读：硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。
实施例三
以下给出梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA检测方法的稳定性检定：
(1)外观检查：白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。
(2)阳性标本符合率：用梅毒螺旋体总抗体阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA检测方法检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。
(3)阴性标本符合率：用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。
(4)批内差异：同一批次的梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA试剂，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示棕色的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。
(5)批间差异：不同批次梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA试剂，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示棕色的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。
(6)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。血清(或血浆)来自本申请人所在单位的临床标本。
(7)交叉反应：采用梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA试剂，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝30)、免疫性肝炎(n＝30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。自身免疫系统疾病的血清来自本申请人临床确诊患者。
(8)稳定性检测：应用Arrhenius法则，将梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA试剂放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。将梅毒螺旋体特异性总抗体的dot-ELISA中包被的快诊膜，至-20℃保存，分别于6个月，12个月，18个月，24个月取出，检测以上各指标的变化，其阳性颜色深浅一致。

Claims (10)

1.梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47；
2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位，将抗原混合物加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭，将封闭后的硝酸纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴晾干燥处备用；
3)以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人Ig单克隆抗体；
4)采用过碘酸钠法进行抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；
5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min；
6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；
7)加入50μL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体,37℃孵育10min，再用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；
8)加入显色剂，放置后再用磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；
9)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。
2.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔是采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔。
3.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述抗原混合物的用量为0.5μL。
4.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述奶粉采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉。
5.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述封闭的时间为30min。
6.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述磷酸盐缓冲液采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。
7.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。
8.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤7)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。
9.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8)中，所述显色剂采用3,3-二氨基苯联胺；显色剂的加入量可为50μL；所述3,3-二氨基苯联胺可按50mg3,3-二氨基苯联胺加入摩尔比0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。
10.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
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