CN105738625A

CN105738625A - 梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法

Info

Publication number: CN105738625A
Application number: CN201610098378.9A
Authority: CN
Inventors: 刘莉莉; 童曼莉; 张惠林; 杨天赐; 林丽蓉
Original assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Current assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Priority date: 2016-02-23
Filing date: 2016-02-23
Publication date: 2016-07-06

Abstract

梅毒螺旋体IgG抗体Dot?ELISA检测方法，涉及梅毒特异性IgG抗体的检测。制备梅毒螺旋体特异性重组抗原；制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜；制备抗人γ链特异性片段单克隆抗体；抗人γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；检测标本处理；加样；硝酸纤维素膜洗涤；加入辣根过氧化物标记的抗人γ链单克隆抗体孵育；用磷酸盐缓冲液洗涤；显色；加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。快诊膜可延长已包被抗原的保存时间，实现单个样本独立保存，避免反复冻融造成的抗原变性。应用斑点酶联免疫吸附法检测梅毒特异性IgG抗体不需特殊仪器，可实现大规模筛查，应用范围广，实用性强。

Description

梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法

技术领域

本发明涉及梅毒特异性IgG抗体的检测，尤其是涉及梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法。

背景技术

梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率居高不下，梅毒的防控已成为我国公共卫生服务的主要任务之一。

梅毒的实验室诊断方法主要有如下几种([1]林丽蓉,杨波,潘锡涛,等.潜在的血源传播患者梅毒血清学检测方法的选择.中华医院感染学杂志.2010，20(10)：1491-1494)：

(1)病原学检测：梅毒螺旋体感染早期，当梅毒抗体还未产生或含量较低时，暗视野显微镜查找螺旋体成为最早的实验室诊断方法，但易受取材技术、取材部位、样本中梅毒螺旋体含量、局部用药及送检时间等诸多因素影响，灵敏度较低。

(2)抗体检测试验：梅毒螺旋体不能进行体外培养，诊断主要依赖于实验室检查，现有的血清学检测灵敏度、特异性不高，任何一种检测方法均存在缺陷，临床漏诊和误诊率较高。

用于梅毒血清学检验的抗原主要以重组抗原TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47为主([2]Lin,L.R.,Z.G.Fu,etal."Developmentofacolloidalgold-immunochromatographyassaytodetectimmunoglobulinGantibodiestoTreponemapallidumwithTPN17andTPN47."Diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease.2010.68(3):193-200.)，检测方法包括生物素亲和素检测法(中国专利CN201410410641.4)、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验等方法，这些检测方法的结果判断需要特殊的仪器设备，前者需要酶标仪，而后者不仅需要荧光显微镜，还需要有经验丰富的技术人员进行结果判读，因此在基层或边远地区，急需一种灵敏度和特异性较高的梅毒螺旋体特异性抗体检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供不需要特殊仪器，也可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强的梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法。

本发明包括如下步骤：

1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47。

2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位；取抗原混合物加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭；将封闭后之硝酸纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，晾干后得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴燥处备用；

3)以人γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人γ链单克隆抗体。

4)采用过碘酸钠法进行抗人γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；

5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下,光滑面向上置于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育；

6)在硝酸纤维素膜中加入磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

7)加入50μL步骤4)中的辣根过氧化物标记的抗人γ链单克隆抗体,37℃孵育10min；

8)用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

9)显色：加入3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色剂50μL，37℃放置5min，所述DAB显色剂按50mgDAB加入0.05mol/LTris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制；

10)加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；

11)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。

在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔可采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔；所述抗原混合物的用量可为0.5μL；所述奶粉可采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉；所述封闭的时间可为30min；所述磷酸盐缓冲液可采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。

在步骤5)中，所述孵育的时间可为10min。

在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL，摩尔浓度为0.01mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；所述洗涤可洗涤3次,每次2min。

在步骤8)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL，摩尔浓度为0.01mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；所述洗涤可洗涤3次,每次2min。

在步骤10)中，所述磷酸盐缓冲液可采用350μL，摩尔浓度为0.01mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

本发明所述快诊膜，作为一种抗原的干燥保存形式，延长已包被抗原的保存时间，可实现单个样本独立保存，避免反复冻融造成的抗原变性。本发明应用斑点酶联免疫吸附法(dotenzyme-linkedimmunosorbentassay，dot-ELISA)检测梅毒特异性IgG抗体不需要特殊仪器，也可实现大规模的筛查，其应用范围广，实用性强。

附图说明

图1为硝酸纤维素膜压迹示意图。

在图1中，各标记为：1、硝酸纤维素膜，2、硝酸纤维素膜压迹。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例一

参见图1，所述梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA检测方法，包括如下步骤：

(1)制备梅毒螺旋体特异性重组抗原：

采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性抗原TPN17和TPN47。

(2)制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜：

用直径6mm的的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位；用微量取液器取0.5μL抗原混合物，加至硝酸纤维素膜上的压迹中央,室温下干燥；将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于5％的脱脂奶粉中,室温下封闭30min；将封闭后之硝酸纤维素膜置于0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗3次,每次2min。取出后将硝酸纤维素膜片置室温晾干即为“快诊膜”,存放于阴晾干燥处备用。

(3)制备抗人γ链特异性片段单克隆抗体：

以人γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人Ig单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(4)抗人γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记：

采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；

(5)检测标本处理：

取人静脉血5mL，置37℃水浴30min，3000g离心10min，上清为检测样品备用。

(6)加样：

将步骤(2)中的快诊膜沿压迹或划痕剪下,光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min。

(7)硝酸纤维素膜洗涤：

加350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次,每次2min，每次洗涤后弃液体。

(8)加入50μL步骤(4)中辣根过氧化物标记的抗人γ链单克隆抗体,37℃孵育10min。

(9)350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次,每次2min，每次洗涤后弃液体。

(10)显色：加入3.3-二氨基苯联胺(DAB)显色剂50μL，37℃放置5min,所述DAB显色剂按50mgDAB加入0.05mol/LTris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。

(11)加入350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤液漂洗1次，弃液体。

结果判读：硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。

实施例二

以下给出梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA检测方法检测患者的临床标本中的梅毒螺旋体抗体：

(1)检测标本处理：

(2)加样：

在已放入快诊膜的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min。

(3)硝酸纤维素膜洗涤：

(4)加入50μL辣根过氧化物标记的抗人γ链单克隆抗体,37℃孵育10min。

(5)350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤3次,每次2min，每次洗涤后弃液体。

(6)显色：加入3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色剂50μL，37℃放置5min,所述DAB显色剂按50mgDAB加入0.05mol/LTris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。

(7)加入350μL0.01mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液充分洗涤液漂洗1次，弃液体。

(8)结果判读：硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。

实施例三

以下给出梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA检测方法的稳定性检定：

(1)外观检查：白色包被反应膜平整、干净无污染斑点、无裂缝，胶带无开胶，无切斜现象。

(2)阳性标本符合率：用梅毒螺旋体IgG抗体阳性的不同滴度的阳性参比血清各50份采用梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA检测方法检定，计算阳性符合率。阳性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。

(3)阴性标本符合率：用50份阴性参比血清检定，计算阳性符合率。阴性参比血清的确定采用TPPA(日本富士株式会社)法确定的临床标本。

(4)批内差异：同一批次的梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA试剂，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示棕色的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

(5)批间差异：不同批次梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA试剂，用特征性血清检测，要求阳性血清检测结果显示棕色的颜色深浅一致，阴性血清检测的结果阴性。

(6)干扰试验：检测结果不受标本溶血(n＝50)、脂血(n＝50)和黄疸(n＝50)的干扰。血清(或血浆)来自本申请人所在单位的临床标本。

(7)交叉反应：采用梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA试剂，进行系统性红斑狼疮(n＝30)、类风湿病(n＝30)、免疫性肝炎(n＝30)等自身免疫系统疾病的检测，未发现交叉反应。自身免疫系统疾病的血清来自本申请人临床确诊患者。

(8)稳定性检测：应用Arrhenius法则，将梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA试剂放置37℃20天后检测，以上各项指标无显著变化，确保成品在室温干燥条件下保存，有效期为18个月。将梅毒螺旋体特异性IgG抗体的dot-ELISA中包被的快诊膜，至-20℃保存，分别于6个月，12个月，18个月，24个月取出，检测以上各指标的变化，其阳性颜色深浅一致。

Claims

1.梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：

4)采用过碘酸钠法进行抗人γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；

8)用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；

10)加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；

2.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔。

3.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述抗原混合物的用量为0.5μL。

4.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述奶粉采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉。

5.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述封闭的时间为30min。

6.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述磷酸盐缓冲液采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。

7.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述孵育的时间为10min。

8.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL，摩尔浓度为0.01mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；所述洗涤可洗涤3次,每次2min。

9.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL，摩尔浓度为0.01mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；所述洗涤可洗涤3次,每次2min。

10.如权利要求1所述梅毒螺旋体IgG抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤10)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL，摩尔浓度为0.01mmol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。