CN112684171A - 一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法，所述梅毒抗体检测的免疫传感载体，包括多孔膜；多孔膜连接特异性抗蚕丝膜抗体；特异性抗蚕丝膜抗体连接交联抗体；交联抗体连接TP特异性抗体和重组TP抗原。本发明提供的梅毒抗体检测的免疫传感载体和试剂盒，可以实现快速、准确检测TP抗体。

Description

一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，主要涉及一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法。

背景技术

近年来我国梅毒发病率呈明显上升趋势，对公共卫生以及临床输血构成了严重的威胁。临床输血及血液制品的精确筛查，有助于控制TP的传播。因此，在蛋白或核酸水平建立梅毒的快速、高灵敏检测方法对该病的预防、治疗及预后至关重要。目前临床主要有病原学检测和血清学检测方法。血清学检测TP抗体是目前临床诊断梅毒的重要方法，包括性病实验室研究试验(vDRL)、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）、甲苯胺红不加热血清学试验（TRUST），荧光螺旋体吸收试验(FTA-ABS)、梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。近年来，随着梅毒螺旋体人工重组抗原技术的进步，以酶标板为载体，结合梅毒混合抗原，通过免疫学双抗原夹心比色法检测梅毒抗体己成为国内三甲级以上医院通用的诊断方法，也是血站对梅毒螺旋体IgM和IgG抗体筛查的指定方法，但操作繁琐，检验时间长，且灵敏度尚需进一步提高。鉴于灵敏度较高的核酸检测方法及基因检测优点是缩短窗口期，但目前主要依靠国外进口试剂，不适合大批量的筛检实验，且国外流行病毒的抗原与国内的存在抗原表位的不同，这些都导致漏检等问题，尚无法在医院和血站大规模推广。因此，提高梅毒螺旋体抗体免疫学检测方法的灵敏度、简化检测程序、缩短检验时间具有重要意义。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法，旨在解决现有TP抗体检测的速度、准确率有待提高的问题。

本发明的技术方案如下：

一种梅毒抗体检测的免疫传感载体，其中，包括蚕丝多孔膜；

蚕丝多孔膜连接特异性抗蚕丝膜抗体；

特异性抗蚕丝膜抗体连接交联抗体；

交联抗体连接TP特异性抗体和重组TP抗原。

所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体，其中，所述多孔膜为蚕丝膜。

所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体，其中，所述特异性抗蚕丝膜抗体为蚕丝膜鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗/多抗、鸡源多抗、驴多抗或马多抗；

所述交联抗体为抗鼠多抗、抗羊多抗、抗兔多抗、抗鸡多抗、抗驴多抗或抗马多抗；

所述TP特异性抗体为能够与交联抗体Fab端结合的特异性捕获抗体，为鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗/多抗或鸡源多抗。

所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体，其中，在本发明实施例中所述特异性抗蚕丝膜抗体为鼠特异性抗蚕丝膜抗体；所述交联抗体为兔抗鼠IgG交联抗体。

一种如上所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其中，包括以下步骤：

在多孔膜上偶联特异性抗蚕丝膜抗体；

偶联交联抗体；

偶联TP特异性抗体和重组TP抗原。

所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其中，偶联交联抗体的过程包括以下步骤：

在多孔膜中加入终浓度15-25μg/mL特异性抗蚕丝膜抗体，1-5℃孵育过夜。

所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其中，偶联交联抗体的过程包括以下步骤：

将多孔膜洗涤至少2次，再向多孔膜中加入交联抗体，终浓度10-25μg/mL，室温振荡反应1-3小时，1-5℃孵育过夜。

所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其中，偶联TP特异性抗体和重组TP抗原的过程包括以下步骤：

将多孔膜洗涤至少2次，再向多孔膜中加入终浓度为5-15μg/mL的TP特异性抗体和终浓度为5-15μg/mL的重组TP抗原，1-5℃孵育过夜。

所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其中，偶联TP特异性抗体和重组TP抗原后还包括以下步骤：

20-25℃室温晾干，1-5℃保存备用。

一种梅毒抗体检测的试剂盒，其中，包括如上所述梅毒抗体检测的免疫传感载体、固相载体、隔离膜和吸水棉；

所述固相载体上设置有至少2个卡槽；

所述卡槽内由上至下依次放置所述梅毒抗体检测的免疫传感载体、隔离膜和吸水棉。

有益效果：本发明提供的梅毒抗体检测的免疫传感载体和试剂盒，可以实现快速、准确检测TP抗体，适用于体检等大批量筛检实验，同时实现高通量自动化定量检测，也适于少量标本，或病人病床旁检测（POCT）。

附图说明

图1为本发明梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备、检测流程示意图。

图2为实施例1中待测样本反应后的结果示意图。

图3为不同方式处理蚕茧后蚕丝形态的电镜对比图。

具体实施方式

本发明提供一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为解决对输血的零风险要求，本发明提供一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法，以提供一种新型TP抗体检测方法，可用于体检等大批量筛检实验，同时实现高通量自动化定量检测，还适于少量标本，或病人病床旁检测（POCT）。

具体地，本发明提供的所述梅毒抗体检测的免疫传感载体，包括多孔膜；

在多孔膜上连接特异性抗蚕丝膜抗体；

特异性抗蚕丝膜抗体连接交联抗体；

交联抗体连接TP特异性抗体和重组TP抗原。

进一步地，所述多孔膜为蚕丝膜。本发明中优选采用蚕丝膜作为基底膜，由于蚕丝膜是多层膜，因此与免疫反应物结合的表面积大，远大于传统ELISA实验中96孔板微孔表面积，使反应敏感性增强。

在本发明中，制备了针对蚕丝膜特异性抗体，利用抗原抗体异性结合的免疫学反应将其制备成了TP免疫传感载体，抗原抗体特异性结合更牢固，位点更明确，特异性更好。通过使用蚕丝膜制备成所述梅毒抗体检测的免疫传感载体，可以实现快速、准确检测TP抗体。

其中，所述特异性抗蚕丝膜抗体可以为蚕丝膜鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗/多抗、鸡源多抗、驴多抗或马多抗等等；

所述交联抗体可以为抗鼠多抗、抗羊多抗、抗兔多抗、抗鸡多抗、抗驴多抗或抗马多抗等等；

所述TP特异性抗体为能够与交联抗体Fab端结合的特异性捕获抗体，可以为鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗/多抗或鸡源多抗等等。

在本发明实施例中，以所述特异性抗蚕丝膜抗体为鼠特异性抗蚕丝膜抗体、交联抗体为兔抗鼠IgG交联抗体为例进行详细说明。

所述鼠特异性抗蚕丝膜抗体的制备过程为：将蚕茧膜粉末制成抗原乳剂，然后多点腹腔注入Balb/c小鼠。初次免疫持续2周，随后通过尾静脉进行2周增强免疫。用间接ELISA法检测血清中的抗体效价，如果抗体效价大于25，将免疫小鼠脾细胞与NS1骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞并进行进一步的克隆和亚克隆，筛选到单克隆特异性表达的细胞株后进行单克隆抗体的特异性、亲和力、效价等性能进行鉴定。鉴定合格后进行细胞增殖培养、并收集上清。最后，用饱和硫酸沉淀法以及亲和层析纯化细胞上清液，并将单克隆抗体储存在-20℃下备用。单克隆抗体的制备方法为本领域的常规技术手段，在此不赘述。

所述梅毒抗体检测的免疫传感载体的结构具体描述如下：

免疫传感载体，即蚕丝膜；

特异性抗蚕丝膜抗体，所述特异性抗蚕丝膜抗体与所述蚕丝膜免疫传感载体发生抗原抗体特异性结合从而牢固结合在所述蚕丝膜免疫传感载体的表面；

交联抗体，所述交联抗体与所述特异性抗蚕丝膜抗体亲和偶联结合在一起；

其中，所述特异性抗蚕丝膜抗体抗体为能够与所述蚕丝膜免疫传感载体发生抗原抗体特异性反应的抗体；

所述交联抗体的一Fab端能与所述特异性抗蚕丝膜抗体偶联，另一Fab端能够与特异性梅毒捕获抗体结合。

本发明中还提供所述梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，包括以下步骤：

1）预处理蚕丝膜

首先将蚕茧剪开，对蚕茧进行预处理去除蚕蛹、杂丝及其他杂质，纯水清洗两遍后放入90-110℃水中浸泡10-20min，取出后室温晾干，用打孔器打成4-10mm圆形蚕丝膜；加入1-3%BSA封闭液浸泡蚕丝膜1-3小时，用真空干燥机真空除气泡一次，纯净水洗涤至少1次，后备用。

2）TP免疫传感载体制备

向步骤1）中洗好的蚕丝膜中加15-25μg/mL特异性抗蚕丝膜抗体（鼠特异性抗蚕丝膜抗体），1-5℃孵育过夜。洗液洗涤至少2次，再向偶联好蚕丝膜抗体的膜中加入兔抗鼠IgG交联抗体，终浓度为10-25μg/mL，室温振荡反应1-3小时，1-5℃孵育过夜。洗液洗涤至少2次后备用。向功能化的免疫传感载体中分别加入终浓度为5-15μg/mL的效价为128的TP单克隆抗体，和终浓度为5-15μg/mL重组TP抗原，1-5℃孵育过夜。20-25℃室温晾干，1-5℃保存备用。其中，洗液为0.01 mol/L，pH为 7.0-7.2的磷酸盐缓冲液，含0.05%吐温-20。

其中，在上述偶联过程中需将蚕丝膜完全浸泡，以保证抗体的偶联率。

蚕丝膜具有多层孔隙膜结构，比表面积大，与反应物结合表面积远大于现有载体，大大增强了检测敏感性。进一步地，本发明实施方案中还提供优选的蚕丝膜处理方法，此种方法属于生物处理方式，相对于现有的物理处理方式（高温水浴）和化学处理方式（加碱），如图3所示，此种方法处理处理温和，对蚕丝没有损伤，蚕丝膜其表面可以具有更多的可与抗原抗体特异性结合的蛋白偶联位点，进一步提高检测的敏感性。具体地包括以下步骤：

取适当蚕茧，剪开，用水清洗浸泡0.5-3h，水浴50-70℃，1-3h，浸泡洗涤去除蚕茧表面杂质；

将蚕茧浸泡在pH为7.2-7.4的混合缓冲液中，洗涤搅拌20~50min；其中，每克蚕茧加入4-8mL混合缓冲液；

加入甘油和酶的混合液，25-37℃下边搅拌边孵育20~50min；其中，每升混合缓冲液按20%-50%体积比加入的甘油、酶混合液；

加入蛋白酶抑制剂PMSF，作用3~10min，用200目筛网过滤，去除滤液，用纯水洗涤蚕茧3次后，将蚕茧悬浮于水中；其中，每升混合缓冲液加入2-10克的蛋白酶抑制剂；所述蛋白酶抑制剂用于抑制木瓜蛋白酶，防止木瓜蛋白酶损伤蚕丝纤维；

用打浆机进行打浆，得到蚕丝浆；

在蚕丝含量为30%-50%的蚕丝浆中加入分散剂，加水，使用纸页成型机得半成品蚕丝膜；其中，每1L蚕丝浆加1-3L水；

在真空、高温条件下抄造成蚕丝膜。

其中，所述pH为7.2-7.4的混合缓冲液为浓度为0.01M的PBS缓冲液、浓度为0.01M的tris-Hcl缓冲液、浓度为0.01M的硼酸盐缓冲液的混合缓冲液。采用这种混合缓冲液，可以更好地维持纤维形态，保证蛋白酶活性，且能更好地将杂质分离。

所述甘油和酶的混合液，按照质量份数计，组成如下：

甘油10-40份，脂肪酶10-20份，木瓜蛋白酶5-20份。

甘油用于保护酶活性，维持酶的作用活性，避免不利条件，如温度、pH等变化带来损失，保证杂质的去除效果。

采用以上试剂和方法处理蚕茧，得到的蚕丝脱胶效果好，蚕丝表面圆润光滑、无杂质，不会损伤丝素、降低纤维强伸度等物理性能，可以提供更多的蛋白偶联位点，更好地保护偶联的生物活性成分。

所述打浆过程的条件可以为用瓦利打浆机进行打浆，刀片负重4.3kg-9.8kg，打浆时间360s-540s，打浆度25°SR-30°SR，蚕丝浆中蚕丝的纤维长度为0.1mm-5mm。在此步骤中，用打浆机以物理方法处理蚕茧，用打浆机的剪切力与纤维之间的摩擦力适当切断蚕丝的天然长纤维，制备短纤维原料。而且，在打浆过程中，蚕丝纤维吸水润胀变软，可以提高柔软性与可塑性。

所述分散剂为羟乙基纤维素、拉米夫定中间体、聚氧化乙烯的一种或两种以上混合物。在本发明实施例方案中，分散剂的添加量为蚕丝浆重量的0.5%-1%。加入分散剂有利于蚕丝均匀地分布在体系中，使抄造得到的生物反应载体厚度均匀。

所述抄造的条件为压力6psi-12psi，温度90-110℃，时间5min-10min。

进一步地，本发明中还提供所述梅毒抗体检测的试剂盒，包括所述梅毒抗体检测的免疫传感载体、固相载体、隔离膜和吸水棉；

所述固相载体可以为塑料固相载体；

所述固相载体上设置有至少2个卡槽；

所述卡槽内由上至下依次放置所述梅毒抗体检测的免疫传感载体、隔离膜和吸水棉。

按所述梅毒抗体检测的免疫传感载体的大小尺寸，设计并加工固相载体的卡槽。将偶联好血型抗体的所述梅毒抗体检测的免疫传感载体与隔离膜以及吸水棉，按顺序组装到固相塑料载体卡槽中形成TP抗体检测卡，用于TP抗体检测。卡槽的数量可以设置为多个，这样可以用于批量检测血液样本。

所述梅毒抗体检测的免疫传感载体，其检测方法为：待检样本加入卡槽内的膜上，孵育30min；抽滤后，PBS洗涤后加入标记的检测抗体，孵育15min；抽滤后PBST洗涤3次，加入底物显色，孵育5min后观察结果。本技术检测梅毒标准血清盘，检测结果符合率为100%（表1）。

所述梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备、使用检测流程如图1所示。本发明中的检测方法采用的是垂直渗滤法，可极大减少血液层析以及清洗所需时间，简化操作步骤，缩短检测时间。而且，结果判定可以采用肉眼进行人工判读，同时也可以结合常规光谱检测进行自动判断。人工判读时，阳性结果与阴性结果区别在于有无蓝色，颜色差异明显，可快速准确判断。结合常规光谱检测时，可实现批量化检测，以满足大量样本检测需求。

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1）预处理蚕丝膜

取适当50g蚕茧，将蚕茧剪开，用水清洗浸泡1h，水浴60℃，2h，浸泡洗涤去除蚕茧表面杂质。将浓度为0.01M、pH为7.2的PBS缓冲液、浓度为0.01M、pH为7.2的tris-Hcl缓冲液、浓度为0.01M、pH为7.2的硼酸盐缓冲液按照1:1:1的体积比混合制成混合缓冲液。将上述蚕茧用300ml混合缓冲液浸泡，洗涤搅拌30min。加入120ml甘油和酶的混合液，30℃下边搅拌边孵育30min。所述甘油和酶的混合液，按照质量份数计，组成包括甘油40份，脂肪酶20份，木瓜蛋白酶20份。加入1.8g蛋白酶抑制剂PMSF，作用5min后，用200目筛网过滤，弃滤液，用纯水洗涤3次后，悬浮于水中。加入瓦利打浆机进行打浆，刀片负重9.8kg，打浆时间480s，打浆度28°SR，得到蚕丝浆。

在10L的蚕丝含量为30%的蚕丝浆中加入50.25g羟乙基纤维素，混合均匀后，加入11L水，将蚕丝浆加入至纸页成型器的搅拌容器中，气动搅拌20s及手动搅拌10s使纤维均匀分布，快速排水，待表面液体排干后，使用真空脱水50s制得半成品蚕丝膜。最后在干燥箱中100℃，压力12psi、时间5min真空高温抄造成蚕丝膜。

纯水清洗蚕丝膜两遍后放入100℃水中浸泡15min，取出后室温晾干，用打孔器打成8mm圆形膜。加入1%BSA浸泡蚕片2小时，用真空干燥机真空除气泡一次，洗涤2次后备用。

2）TP免疫传感载体制备

向步骤1）中蚕丝膜中加入终浓度20μg/mL特异性抗蚕丝膜抗体（鼠特异性抗蚕丝膜抗体），4℃过夜。洗液洗涤3次，再向偶联好蚕丝膜抗体的膜中加入兔抗鼠IgG交联抗体，终浓度20μg/mL，室温振荡反应2小时，4℃过夜。洗液洗涤3次后备用。其中，在偶联过程中需将膜完全浸泡。向功能化的免疫传感载体中分别加入效价为128的鼠源TP单克隆抗体和20μg/mL重组TP抗原，4℃过夜。20-25℃室温晾干，4℃保存备用。

3）TP免疫传感载体检测卡制备

按制备的多孔膜大小尺寸，设计并加工固相塑料载体卡槽。将偶联好血型抗体的多孔膜与隔离膜以及吸水棉，按顺序组装到固相塑料载体卡槽中形成TP抗体检测卡，用于TP抗体检测。

4）TP抗体检测

将待检样本加入到检测膜上孵育30min；抽滤后，PBS洗涤后加入标记的检测抗体，孵育15min；抽滤后PBST洗涤3次，加入底物显色，孵育5min后观察结果。最后将结果与血清盘标准进行比较。

将梅毒抗原通过特异性单克隆抗体连接在生物膜表面，与待检测标本反应后，通过酶联反应催化沉淀性底物显色以判定反应结果，从而建立多孔膜免疫分析技术。测试条件和预期结果如表1所示，实际检测结果如图2所示，将所建立的梅毒TP抗体检测技术用于检测TP血清盘，结果与血清盘标准完全一致。由此可以看出，本实施例的TP免疫传感载体检测卡检测的准确率高、反应敏感性增强，检测快速。

表1.本技术检测梅毒标准血清盘结果

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性，“±”表示可疑，“非特异性抗体（TRUST）”表示非特异性梅毒抗体检测，“特异性抗体（酶免）”表示特异型性梅毒抗体检测，背景表示血清盘实际阴阳性情况。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种梅毒抗体检测的免疫传感载体，其特征在于，包括多孔膜；

多孔膜连接特异性抗蚕丝膜抗体；

特异性抗蚕丝膜抗体连接交联抗体；

交联抗体连接TP特异性抗体和重组TP抗原。

2.根据权利要求1所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体，其特征在于，所述多孔膜为蚕丝膜。

3.根据权利要求1所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体，其特征在于，所述特异性抗蚕丝膜抗体为蚕丝膜鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗/多抗、鸡源多抗、驴多抗或马多抗；

所述交联抗体为抗鼠多抗、抗羊多抗、抗兔多抗、抗鸡多抗、抗驴多抗或抗马多抗；

所述TP特异性抗体为能够与交联抗体Fab端结合的特异性捕获抗体，为鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗/多抗或鸡源多抗。

4.根据权利要求1所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体，其特征在于，所述特异性抗蚕丝膜抗体为鼠特异性抗蚕丝膜抗体；所述交联抗体为兔抗鼠IgG交联抗体。

5.一种如权利要求1-4任一所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在多孔膜上偶联特异性抗蚕丝膜抗体；

偶联交联抗体；

偶联TP特异性抗体和重组TP抗原。

6.根据权利要求5所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其特征在于，偶联交联抗体的过程包括以下步骤：

在多孔膜中加入终浓度15-25μg/mL特异性抗蚕丝膜抗体，1-5℃孵育过夜。

7.根据权利要求5所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其特征在于，偶联交联抗体的过程包括以下步骤：

将多孔膜洗涤至少2次，再向多孔膜中加入交联抗体，终浓度10-25μg/mL，室温振荡反应1-3小时，1-5℃孵育过夜。

8.根据权利要求5所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其特征在于，偶联TP特异性抗体和重组TP抗原的过程包括以下步骤：

将多孔膜洗涤至少2次，再向多孔膜中加入终浓度为5-15μg/mL的TP特异性抗体和终浓度为5-15μg/mL的重组TP抗原，1-5℃孵育过夜。

9.根据权利要求5-8任一所述的梅毒抗体检测的免疫传感载体的制备方法，其特征在于，偶联TP特异性抗体和重组TP抗原后还包括以下步骤：

20-25℃室温晾干，1-5℃保存备用。

10.一种梅毒抗体检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4任一所述梅毒抗体检测的免疫传感载体、固相载体、隔离膜和吸水棉；

所述固相载体上设置有至少2个卡槽；

所述卡槽内由上至下依次放置所述梅毒抗体检测的免疫传感载体、隔离膜和吸水棉。

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