CN114908048B - 一种用于全血过滤的功能化载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫检测领域，公开了一种用于全血过滤的功能化载体及其制备方法，包括以下步骤：取蚕茧，清洗浸泡，水浴处理，脱胶处理；对脱胶后的蚕茧进行打浆，过滤，干燥，得蚕丝绝干浆；取生丝，清洗浸泡，裁剪成短纤维生丝；取所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆制成蚕丝生丝混合浆；使用纸页成型机得半成品蚕丝膜；在真空、高温条件下抄造成蚕丝膜。在本申请方案中，采用生丝与蚕丝绝干浆为功能化载体的主要原料，功能化载体是以生丝为骨架，其间孔隙填充蚕丝绝干浆的复合结构，呈多层孔隙结构，与抗红细胞抗体结合的比表面积大，能结合更多的抗红细胞抗体，从而显著提高红细胞的截留效率。
Description
技术领域
本申请涉及免疫检测领域，主要涉及一种用于全血过滤的功能化载体及其制备方法。
背景技术
血清或血浆样本是免疫检测最常见的检测对象。目前，对全血样本的处理有离心获取血浆的方法，或者，放置一段时间等全血凝固取血清的方法，但是这些方法都比较耗时，而且离心需要离心机和电力，因此离心或凝固的方法不适用于即时检验(POCT)的应用场景中，由于时间的紧迫性，需要能简便快速地从全血中分离血清或血浆的装置和方法，增强POCT产品及时性的优点。
免疫侧向层析诊断技术作为一种稳定和实用的技术，适合在多样的POCT现场使用。目前在免疫侧向层析诊断技术中通常都是直接采用全血作为检测样本，并在样品垫处做过滤红细胞的处理。样品垫滤除红细胞的常见方式有两种：一是用物理过滤的方法，用特定孔径大小的全血滤膜或者柱状排列装置来过滤全血样本，使红细胞和其他杂质被截留，而血浆能通过滤膜或装置进入反应区；二是在样品垫处加抗红细胞抗体，通过抗原抗体反应使红细胞凝集并被捕获在样品垫上，而血浆与抗红细胞抗体不发生反应则能顺利通过，从而达到分离的目的。
但是以上两种样品垫滤除红细胞的方法都有一些不足之处，物理过滤的方法由于全血滤膜孔径小，容易被堵住，特别是在主动式液体流动的状态下，即给液体一定的动力驱动，滤膜或装置会由于驱动力挤压红细胞的作用，红细胞堵住滤膜或装置，阻断液体驱动力，使液体无法按预想的方式流动，另外，压力过大时甚至可能使红细胞破裂，从而影响试验结果。在加抗红细胞抗体的方法中，由于抗红细胞抗体是采用物理吸附的方式固定到样品垫（通常是聚酯纤维或玻璃纤维材料）上，吸附能力有限，而且抗体与样品垫的结合是无序结合，其暴露的有效结合位点有限，因此对红细胞的捕获能力也有限，容易有红细胞扩散到反应区，影响结果判读。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种用于全血过滤的功能化载体及其制备方法，旨在解决现有加抗红细胞抗体的样品垫对红细胞的捕获能力有限的问题。
本申请的技术方案如下：
一种用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，包括以下步骤：
（1）取蚕茧，清洗浸泡，水浴处理；
（2）在高压40-50psi、高温120-130℃下，对蚕茧进行脱胶处理；
（3）对脱胶后的蚕茧进行打浆，过滤，干燥，得蚕丝绝干浆；
（4）取生丝，清洗浸泡，裁剪成短纤维生丝；
（5）取所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆，加入水和分散剂，混匀成蚕丝生丝混合浆；
（6）在所述蚕丝生丝混合浆中加水，使用纸页成型机制得半成品蚕丝膜；
（7）在真空、高温条件下抄造成蚕丝膜；
（8）将所述蚕丝膜裁剪成小片，加入酪蛋白溶液中，50-60℃水浴浸泡所述蚕丝膜1-3h，用真空干燥机真空除气泡至少一次，再次50-60℃水浴1-3h，洗涤备用。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆的质量比为2:1。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，步骤（7）中，所述抄造的条件为压力1psi~6psi，温度100~130℃，时间5min~10min。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，步骤（1）中，所述清洗浸泡过程为用水清洗浸泡0.5~3h，所述水浴处理为70~100℃水浴1~3h；
步骤（2）中，所述脱胶处理的时间为0.5-1h。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，在步骤（3）中，所述打浆过程中，刀片负重4.3kg~9.8kg，打浆时间1200-2400s，打浆度10°SR -20°SR；
在步骤（3）中，所述过滤为采用100目筛进行过滤。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，步骤（4）中，所述清洗浸泡过程为用水清洗浸泡0.5~1h，所述裁剪过程为将所述生丝裁剪至长度为0.2-0.5cm的所述短纤维生丝；
在步骤（5）中，所述分散剂为羟乙基纤维素、拉米夫定中间体、聚氧化乙烯中的一种或两种以上的混合物；所述分散剂的添加量为所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆的总重量的0.5%~1%；
在步骤（6）中，每1L所述蚕丝生丝混合浆加4~6L所述水。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，在步骤（5）中，所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆的总重量占所述蚕丝生丝混合浆重量的0.5%。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，在步骤（8）之后还包括以下步骤：
在蚕丝膜上偶联特异性抗蚕丝膜抗体；
偶联交联抗体；
偶联抗红细胞抗体；
20~25℃室温晾干。
所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其中，所述在蚕丝膜上偶联特异性抗蚕丝膜抗体的过程为在所述蚕丝膜中加入终浓度15~25μg/mL的特异性抗蚕丝膜抗体，1~5℃孵育过夜；
所述偶联交联抗体的过程为将所述蚕丝膜洗涤至少2次，再向所述蚕丝膜中加入交联抗体，交联抗体的终浓度为10~25μg/mL，室温振荡反应1~3小时，1~5℃孵育过夜；
所述偶联抗红细胞抗体的过程为将所述蚕丝膜洗涤至少2次，再向所述蚕丝膜中加入终浓度为5~25μg/mL的抗红细胞抗体，1~5℃孵育过夜。
一种用于全血过滤的功能化载体，其中，采用如上所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法制备得到。
有益效果：本申请提供的一种用于全血过滤的功能化载体及其制备方法，采用生丝与蚕丝绝干浆为功能化载体的主要原料，功能化载体是以生丝为骨架，其间孔隙填充有蚕丝绝干浆的复合结构，呈多层孔隙结构，与抗红细胞抗体结合的比表面积大，能结合更多的抗红细胞抗体，从而显著提高红细胞的截留效率。
具体实施方式
本申请提供一种用于全血过滤的功能化载体及其制备方法，为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本申请进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请提供一种用于全血过滤的功能化载体的制备方法，包括以下步骤：
一、制备蚕丝膜。
具体地，制备蚕丝膜的过程包括以下步骤：
（1）取蚕茧，用水清洗浸泡0.5~3h，70~100℃水浴1~3h；
（2）在高压40-50psi、高温120-130℃下，脱胶处理0.5-1h；
（3）将脱胶后的蚕茧加入瓦利打浆机进行打浆，刀片负重4.3kg~9.8kg，打浆时间1200-2400s，打浆度10°SR -20°SR，使用100目筛过滤，干燥，得蚕丝绝干浆；
（4）取生丝，用水清洗浸泡0.5~1h，裁剪至长度为0.2-0.5cm短纤维生丝；
（5）取短纤维生丝与蚕丝绝干浆，按照质量比2:1于疏解器中加入水和分散剂，混匀成蚕丝生丝混合浆；
（6）在蚕丝生丝混合浆中加水，使用纸页成型机制得半成品蚕丝膜；
（7）在真空、高温条件下抄造成蚕丝膜；
（8）将蚕丝膜裁剪成小片，加入质量浓度为0.5~1.5%的酪蛋白溶液中，50-60℃水浴浸泡蚕丝膜1-3h，用真空干燥机真空除气泡2次，再次50-60℃水浴1-3h，洗涤2次后备用。
其中，生丝是指蚕茧缫丝后所得的产品。
在本申请方案中，采用生丝与蚕丝绝干浆为主要原料制备蚕丝膜，可形成以生丝为骨架，其间孔隙填充蚕丝绝干浆的复合结构，保证了蚕丝膜有合适的孔隙率，孔径不会过大或过小，可透过红细胞，并能保证蚕丝膜结构的稳定；而且，合适的孔隙率可以使红细胞被抗红细胞抗体捕获后，其余成分仍能顺利通过蚕丝膜，不被堵住。而且，通过实验研究发现，生丝与蚕丝绝干浆的比例需控制在2：1，才能保证最后蚕丝膜有合适的孔隙率。
在步骤（5）中，优选地，混匀成的蚕丝生丝混合浆中，短纤维生丝与蚕丝绝干浆的总重量占蚕丝生丝混合浆重量的0.5%。
在本申请日以前，脱胶处理大多采用化学脱胶或酶脱胶的方式，比如采用碱脱胶或蛋白酶脱胶，彻底去除丝胶蛋白，以提高蚕丝的洁净度。但在本申请方案中，步骤（2）中的脱胶方式改为高温高压脱胶，无额外化学品加入，同时保留部分丝胶蛋白，经过高温高压脱胶处理后的蚕丝上保留3%重量以下丝胶蛋白，剩余的少量丝胶蛋白可使之后的蚕丝绝干浆与生丝黏合更加紧密，并起到增强蚕丝膜强度的作用，使功能化载体的膜结构更稳定。
在步骤（3）中，干燥的条件为37℃过夜，干燥处理后便于后续实验定量称取蚕丝绝干浆，方便控制生丝与蚕丝绝干浆的比例，保证蚕丝膜具备多层孔隙结构。
在步骤（4）中，分散剂可以为羟乙基纤维素、拉米夫定中间体、聚氧化乙烯中的一种或两种以上的混合物。分散剂的添加量为短纤维生丝与蚕丝绝干浆的总重量的0.5%~1%。
在步骤（6）中，每1L蚕丝生丝混合浆加4~6L水；
在步骤（7）中，抄造的条件为压力1psi~6psi，温度100~130℃，时间5min~10min。在本申请方案中，也对抄造条件进行了优化，通过降低抄造压力，可使膜厚度增加，使生丝骨架扩大，蚕丝绝干浆填充更均匀，多层孔隙结构层数更多，可增加抗体结合有效位点，可以更有效的捕获红细胞，提高红细胞的截留效果，提高反应灵敏度；通过增加温度，可以加强生丝骨架与蚕丝绝干浆黏合强度，提高结构稳定。
步骤（8）中，采用0.5~1.5%酪蛋白溶液50-60℃水浴处理蚕丝膜，可以降低非特异反应。真空除气泡可以去除蚕丝膜中的气泡，提高蚕丝膜的亲水性，使红细胞能更好地通过而不会堵塞。洗涤时所采用的洗液可以为PBS缓冲液。
二、在蚕丝膜上偶联特异性抗蚕丝膜抗体。
具体地，步骤二的过程如下：
在蚕丝膜中加入终浓度15~25μg/mL的特异性抗蚕丝膜抗体，1~5℃孵育过夜。
上述特异性抗蚕丝膜抗体可以为鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗、兔源多抗、鸡源多抗、驴源多抗或马源多抗中的一种。
三、偶联交联抗体。
具体地，步骤三的过程如下：
将蚕丝膜洗涤至少2次，再向蚕丝膜中加入交联抗体，交联抗体的终浓度为10~25μg/mL，室温振荡反应1~3小时，1~5℃孵育过夜。
上述交联抗体可以为抗鼠多抗、抗羊多抗、抗兔多抗、抗鸡多抗、抗驴多抗或抗马多抗。
四、偶联抗红细胞抗体。
具体地，步骤四的过程如下：
将蚕丝膜洗涤至少2次，再向蚕丝膜中加入终浓度为5~25μg/mL的抗红细胞抗体，1~5℃孵育过夜。
步骤三和步骤四中，洗涤时可以采用PBS缓冲液或PBST缓冲液作为洗液。
上述抗红细胞抗体为能够与交联抗体Fab端结合的特异性捕获抗体，可以为鼠源单抗、羊源多抗、兔源单抗、兔源多抗或鸡源多抗。
五、20~25℃室温晾干，1~5℃保存备用。
本申请中还提供一种用于全血过滤的功能化载体，采用上述用于全血过滤的功能化载体的制备方法制备得到。本申请的用于全血过滤的功能化载体采用生丝与蚕丝绝干浆混合制备得到，本申请的功能化载体为以生丝为骨架，其间孔隙填充蚕丝绝干浆的复合结构，呈多层孔隙结构，与抗红细胞抗体结合的比表面积大于现有的聚酯纤维、玻璃纤维载体或现有直接采用蚕丝抄造而成的蚕丝膜。
本申请所提供的用于全血过滤的功能化载体，通过抗原抗体结合的方式使抗红细胞抗体高效固定在蚕丝膜表面，而且蚕丝膜呈多层孔隙结构，能结合更多的抗红细胞抗体，从而显著提高红细胞的截留效率，克服了传统方法中抗红细胞抗体非特异性结合、包被无序、效率低的缺点；蚕丝膜的孔径比全血滤膜大，不容易被堵住；蚕丝膜与血液标本中非红细胞成分几乎无非特异性结合，不影响后续反应；蚕丝膜蛋白成分对抗红细胞抗体有良好的保护作用，试剂稳定性更好。
以下通过具体实施例对本申请做进一步说明。
实施例1：
1)预处理蚕丝膜
取20g蚕茧，将蚕茧剪开，用水清洗浸泡1h，100℃水浴1h，浸泡洗涤去除蚕茧表面杂质。于高压灭菌锅中高压40psi，高温120℃脱胶处理0.5h。清洗后加入瓦利打浆机进行打浆，刀片负重7.2kg，打浆时间1800s，打浆度12°SR，用100目筛筛分并干燥后得到蚕丝绝干浆。
取10g生丝，用水清洗浸泡0.5h，裁剪至长度为0.5cm短纤维生丝。
取4g短纤维生丝与2g蚕丝绝干浆，在疏解器中使用1.2L纯水与占短纤维生丝与蚕丝绝干浆的总重量的1%的羟乙基纤维素混合均匀后，加入至纸页成型器的搅拌容器中，补充纯水至6L，气动搅拌20S及手动搅拌10S使纤维均匀分布，快速排水，待表面液体排干后，使用真空脱水50S制得半成品蚕丝膜。
最后在干燥箱中120℃、压力1psi、时间10min真空高温抄造成蚕丝膜。
将蚕丝膜裁剪成小片，加入质量浓度为1%酪蛋白溶液中，55℃水浴浸泡蚕丝膜2h，用真空干燥机真空除气泡2次，再次55℃水浴2h，洗涤2次后备用。
2) 用于全血过滤的功能化载体制备
在蚕丝膜中加入终浓度20μg/mL鼠特异性抗蚕丝膜抗体，4℃孵育过夜。
将蚕丝膜用洗液洗涤3次，再向偶联好蚕丝膜抗体的蚕丝膜中加入兔抗鼠IgG交联抗体，兔抗鼠IgG交联抗体的终浓度为20μg/mL，室温振荡反应2小时，4℃孵育过夜。
将蚕丝膜用洗液洗涤3次，再向上述蚕丝膜中加入终浓度为20μg/mL的效价为128的抗红细胞抗体，4℃孵育过夜。
20~25℃室温晾干，4℃保存备用。
3）全血过滤实验
①主动式液流
将制备好的用于全血过滤的功能化载体放入适配的装置中，加入50μL全血样本，采用上部加压的方式过滤，设置收集装置收集过滤后的血浆。过滤的结果如下表1所示。
表1 主动式液流全血过滤的结果
| 滤出血浆体积（μL） | 有无红细胞滤过 | |
| 样本1 | 27.5 | 无 |
| 样本2 | 26.4 | 无 |
| 样本3 | 28.1 | 无 |
②被动式液流
取制备好的用于全血过滤的功能化载体，下面放置吸水纸，在上面加50μL全血样本，等血浆被吸到吸水纸上后，称量吸水纸前后的重量差，结合样本血浆的密度，计算出滤出血浆体积。过滤的结果如下表2所示。
表2 被动式液流全血过滤的结果
| 滤出血浆体积（μL） | 有无红细胞滤过 | |
| 样本1 | 23.2 | 无 |
| 样本2 | 22.7 | 无 |
| 样本3 | 23.9 | 无 |
从上述结果可看出，本申请实施例制备的用于全血过滤的功能化载体对红细胞的截留效果非常好，滤出的血浆体积也很多。
对本实施例步骤1）制备得到的蚕丝膜和蚕茧进行压汞测试，结果表3和表4所示，表3为蚕丝膜的压汞测试结果，表4为蚕茧的压汞测试结果，从表3和表4可以看出，蚕丝膜平均孔径及孔隙率都大于蚕茧。
表3
| 在29995.62psia条件下的总侵入体积（Total intrusion volume at 29995.62psia） | 2.8489mL/g |
| 在29995.62psia条件下的总孔隙面积（Total pore area at 29995.62psia） | 0.452m2/g |
| 在4.16psia和1.424mL/g条件下的中位孔隙直径（体积）（Median pore diameter (volume) at 4.16psia and 1.424mL/g） | 43513.25nm |
| 在10.38psia和0.226 m2/g条件下的中位孔隙直径（区域）（Median pore diameter (area) at 10.38psia and 0.226 m2/g） | 17430.96nm |
| 平均孔隙直径（4V/A）（Average pore diameter (4V/A)） | 25236.85nm |
| 在0.48psia条件下的容积密度（Bulk density at 0.48psia） | 0.0649g/mL |
| 在29995.62psia条件下的表观（骨骼）密度（Apparent (skeletal) density at 29995.62psia） | 0.0797g/ mL |
| 孔隙率（Porosity） | 18.4971% |
表4
| 在29993.43psia条件下的总侵入体积（Total intrusion volume at 29993.43psia） | 1.4790mL/g |
| 在29993.43psia条件下的总孔隙面积（Total pore area at 29993.43psia） | 0.462m2/g |
| 在5.96psia和0.739mL/g条件下的中位孔隙直径（体积）（Median pore diameter (volume) at 5.96psia and 0.739mL/g） | 30355.74nm |
| 在36.13psia和0.231m2/g条件下的中位孔隙直径（区域）（Median pore diameter (area) at 36.13psia and 0.231m2/g） | 5006.51nm |
| 平均孔隙直径（4V/A）（Average pore diameter (4V/A)） | 12804.5nm |
| 在0.48psia条件下的容积密度（Bulk density at 0.48psia） | 0.0716g/mL |
| 在29993.43psia条件下的表观（骨骼）密度（Apparent (skeletal) density at 29993.43psia） | 0.0801g/ mL |
| 孔隙率（Porosity） | 10.5871% |
应当理解的是，本申请的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本申请的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取蚕茧，清洗浸泡，水浴处理；
（2）在高压40-50psi、高温120-130℃下，对蚕茧进行脱胶处理；
（3）对脱胶后的蚕茧进行打浆，过滤，干燥，得蚕丝绝干浆；
（4）取生丝，清洗浸泡，将所述生丝裁剪至长度为0.2-0.5cm的短纤维生丝；
（5）取所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆，加入水和分散剂，混匀成蚕丝生丝混合浆；
（6）在所述蚕丝生丝混合浆中加水，使用纸页成型机制得半成品蚕丝膜；
（7）在真空和高温100~130℃条件下抄造成蚕丝膜；
（8）将所述蚕丝膜裁剪成小片，加入酪蛋白溶液中，50-60℃水浴浸泡所述蚕丝膜1-3h，用真空干燥机真空除气泡至少一次，再次50-60℃水浴1-3h，洗涤备用；
在步骤（8）之后还包括以下步骤：
a、加入终浓度为15~25μg/mL的特异性抗蚕丝膜抗体，在蚕丝膜上偶联特异性抗蚕丝膜抗体；
b、加入终浓度为10~25μg/mL的交联抗体，偶联交联抗体；
c、加入终浓度为5~25μg/mL的抗红细胞抗体，偶联抗红细胞抗体；
d、20~25℃室温晾干；
所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆的质量比为2:1；
在步骤（3）中，所述过滤为采用100目筛进行过滤；
在步骤（5）中，所述分散剂为羟乙基纤维素；所述分散剂的添加量为所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆的总重量的0.5%~1%；所述短纤维生丝与所述蚕丝绝干浆的总重量占所述蚕丝生丝混合浆重量的0.5%。
2.根据权利要求1所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其特征在于，步骤（7）中，所述抄造的条件为压力1psi~6psi，时间5min~10min。
3.根据权利要求1所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述清洗浸泡过程为用水清洗浸泡0.5~3h，所述水浴处理为70~100℃水浴1~3h；
步骤（2）中，所述脱胶处理的时间为0.5-1h。
4.根据权利要求1所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述打浆过程中，刀片负重4.3kg~9.8kg，打浆时间1200-2400s，打浆度10°SR -20°SR。
5.根据权利要求1所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述清洗浸泡过程为用水清洗浸泡0.5~1h；
在步骤（6）中，每1L所述蚕丝生丝混合浆加4~6L所述水。
6.根据权利要求1所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法，其特征在于，所述在蚕丝膜上偶联特异性抗蚕丝膜抗体的过程为在所述蚕丝膜中加入特异性抗蚕丝膜抗体，1~5℃孵育过夜；
所述偶联交联抗体的过程为将所述蚕丝膜洗涤至少2次，再向所述蚕丝膜中加入交联抗体，室温振荡反应1~3小时，1~5℃孵育过夜；
所述偶联抗红细胞抗体的过程为将所述蚕丝膜洗涤至少2次，再向所述蚕丝膜中加入抗红细胞抗体，1~5℃孵育过夜。
7.一种用于全血过滤的功能化载体，其特征在于，采用如权利要求1~6任一项所述的用于全血过滤的功能化载体的制备方法制备得到。
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