CN1332750A

CN1332750A - 经修饰的梅素螺旋体外膜蛋白质,其免疫检测应用和含有它的试剂盒

Info

Publication number: CN1332750A
Application number: CN 99815424
Authority: CN
Inventors: 汪建; 牟峰; 李志杰; 高存记
Original assignee: 汪建; 牟峰
Current assignee: Beijing BGI-GBI Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2002-01-23
Anticipated expiration: 2019-08-06
Also published as: CN1156491C

Abstract

本发明公开了一种具有通式(Xaa_nTpp(Xaa)_m的蛋白质,其中Tpp选自梅毒螺旋体外膜蛋白质Tpp15、Tpp17、Tpp47或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物;Xaa代表天然氨基酸残基,其中与Tpp每侧最接近的至少一个Xaa和至少一个通式蛋白的末端Xaa是选自Lys、Arg和Trp的氨基酸残基;n和m分别为0－10的整数,条件是n+m≥2。还公开了利用该通式蛋白质免疫检测人梅毒螺旋体抗体的方法,特别是利用双抗原夹心法检测人梅毒螺旋体抗体的方法;还公开了利用这些方法检测人梅毒螺旋体抗体的检测试剂盒。

Description

经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质，其免疫检测应

用和含有它的试剂盒发明领域

本发明涉及一些经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质，涉及利用这些蛋白质检测梅毒螺旋体抗体的免疫学方法和含有它们的试剂盒。发明背景

梅毒是一种由梅毒螺旋体（ Treponema pallidum, 以下简称 Tp) 引起的疾病。随着蛋白质纯化技术、 DNA重组技术以及单克隆抗体技术的发展，为开发高特异性、高灵敏度的梅毒螺旋体检测技术提供了有利条件。 US4514498、 4740467制备了进行梅毒血清学检测的 ELISA试剂盒，但其灵敏度和特异性尚不能令人满意。免疫原性梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl5、 Τρρ17、 Τρρ47是已知的。 B.K Purcell 等，分子微生物学 (Molecular Microbiology) (1990) 4(8)， 1371-1379; R. A. Darrin 等，感染与免疫（ Infection and Immunity) 1993(4), 1202-1210及 L.M. Weigel等感染与免疫 1992(4), 1568-1576, 基本上阐明了梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl5、 Τρρ17、 Τρρ47的结构与组成并给出了它们的氨基酸序列和编码它们的核苷酸序列。日本专利申请公开 Hei-2-500403描述了一种制备 47kDa的梅毒螺旋体抗原的方法和利用这种抗原免疫检测抗梅毒螺旋体抗体的方法。 US5578456根据 DNA重组技术制备了梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl5、 Τρρ17、 Τρρ47 与 GST S转移酶的融合蛋白的基础上，提出一种利用以梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl5 -和 /或 Tppl7 - GST S转移酶融合蛋白作为抗原检测人梅毒螺旋体抗体的方法，据称与利用 47kDa抗原的方法相比提高了梅毒血清学检测的灵敏度。但上述融合蛋白中梅毒螺旋体抗原以外的部分占大部分，这势必增加抗原的非特异性免疫结合活性，降低对梅毒螺旋体抗体的检测特异性。因而仍需要一种以较高灵敏度和特异性检测梅毒螺旋体抗体的免疫学方法。

本发明基于如下令人惊讶的发现:对梅毒螺旋体外膜蛋白质抗原

Tppl5、 Τρρ17、 Τρρ47在基本不影响其免疫结合特异性的情况下加以修饰，显著提高了免疫检测人梅毒螺旋体抗体的灵敏度;此外，并可保留天然抗原的结合特异性，使用双抗原夹心法可得到更高的检测特异性。发明概述

本发明一方面涉及一种具有通式 (Xaa)_nTpp(Xaa)_m的蛋白质，其中 Tpp选自梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl5、 Τρρ17、 Τρρ47或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物； Xaa代表天然氨基酸残基，其中与 Tpp每侧最接近的至少一个 Xaa和至少一个通式蛋白的末端 Xaa是选自 Lys、 Arg和 Trp的氨基酸残基； n和 m分别为 0 10 的整数，条件是 n + m≥2。

本发明的另一方面涉及利用该通式蛋白质免疫检测人梅毒螺旋体抗体的方法，特别是利用双抗原夹心法定量检测人梅毒螺旋体抗体的方法》本发明也包括利用该通式蛋白质作为抗原以常规 ELISA 方法定量检测人梅毒螺旋体抗体。

本发明的又一方面涉及用于以上述免疫方法检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒. 附图说明

图 1 经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTppl5的氨基酸序列及核苷酸序列。

图 2 经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白盾 ΚΤρρΠ的氨基^^列及核苷酸序列。图 3 经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp47的氨基^^列及核苷酸序列。

图 4含有编码经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 ΚΤρρ15的核苷酸序列的重组质粒构建示意图。

图 5含有编码经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 ΚΤρρ17的核苷酸序列的重组质粒构建示意图。

图 6含有编码经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 ΚΤρρ47的核苷酸序列的重组质粒构建示意图。

图 7 纯化后经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 ΚΤρρ的 SDS - PAGE结果，考马斯亮蓝染色。其中：泳道 1为低分子蛋白标准；泳道 2为纯化前含有 ΚΤρρ15的菌体裂解物；泳道 3为纯化后的 ΚΤρρ15; 泳道 5为纯化前含有 ΚΤρρ17的菌体裂解物；泳道 6为纯化后的 ΚΤρρ17; 泳道 8为纯化前含有 ΚΤρρ47的菌体裂解物；泳道 9为纯化后的 ΚΤρρ47。

图 8利用 Western蛋白印迹法检测纯化后本发明的经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp与梅毒螺旋体抗体结合的活性。其中：右侧为氨基黑染色的分子量标准； 1为与人梅毒螺旋体阳性血清反应的 ΚΤρρ15; 2为与人梅毒螺旋体阳性血清反应的 ΚΤρρΠ; 3为与人梅毒螺旋体阳性血清反应的 ΚΤρρ47。

图 9 HRP标记修饰重组梅毒螺旋体抗原与未修饰梅毒螺旋体抗原标记效率的比较。其中上图为 HRP标记的 Τρρ17 经过 Superdex75 凝胶层析柱后的谱图，下图为 HRP标记的 KTppl7 经过 Superdex75 凝胶层析柱后的谱图。

图 10利用双抗原夹心法，分别以本发明修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp及未修饰重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tpp为包被抗原，比较酶标修饰重组梅毒螺旋体外膜蛋白 HRP-KTpp和鲦标未修饰的重组蛋白质 HRP-Tpp作为酶标抗原检测人梅毒螺旋体抗体的结果。上为酶标修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白 HRP-KTppl5与酶标未修饰的重组蛋白 HRP-Tppl5的比较；中为酶标修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白 > HRP-KTppl7与酶标未修饰的重组蛋白 HRP-Tppl7 的比较；下为酶标修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白 HRP-KTpp47与酶标未修饰的重组蛋白 HRP-Tpp47的比较；发明详述

一种具有通式 (Xaa)nTpp(Xaa)_m的蛋白质，其中 Tpp选自梅毒螺旋体外膜蛋白; Tppl5、 Tppl7、 Τρρ47或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物； Xaa代表天然氨基酸残基，其中与 Tpp 每側最接近的至少一个 Xaa和至少一个通式蛋白的末端 Xaa是选自 Lys、 Arg和 Trp的氨基酸残基； n和 m分别为 0--10的整数，条件是 n + m≥2。本发明所述的经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质，以下有时称为 KTpp, 是指在已知的梅毒螺旋体外膜蛋白质 Τρρ15、 Τρρ17、 Τρρ47或其免疫结合活性片段基上对氨基酸序列的 Ν末端和 C末端进行修饰的蛋白廣，从而提高了所述蛋白质或其片段对人梅毒螺旋体抗体的免疫结合活性。本发明所述的梅毒螺旋体外膜蛋白质 Τρρ15、 Τρρ17、 Τρρ47包括分别含有各自自身分泌信号肽的完整蛋白质，也包括不含分泌信号肽序列成熟形式的蛋白质。此外，本发明所述的梅毒螺旋体外膜蛋白质 Τρρ15、 Τρρ17、 Τρρ47也还可各自带有来自多种其它来源的本领域技术人员常用的用于蛋白质分泌表达的异源信号肽。

本发明优选的一个实施方案中， KTpp为 MetLysLys-Tpp- LysLysLeuGluLys, 且 Tpp为梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl5或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物。

本发明优选的另一个实施方案中， KTpp为 MetLysLys-Tpp- LysLysLeuGluLys, 且 Tpp为梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl7或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物。

本发明优选的又一个实施方案中， KTpp为 MetLysLys-Tpp- LysLysLeuGluLys, 且 Tpp为梅毒螺旋体外膜蛋白质 Τρρ47或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物。此处所用的术语 "免疫结合活性" 是指抗原蛋白识别梅毒螺旋体抗体并与之特异性结合的能力。

为了获得经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 ΚΤρρ, 可以通过本领域技术人员周知的 PCR扩增技术和重组 DNA技术。设计相应的 PCR引物，同时在所用 PCR引物中添加编码相应数目氨基酸残基对应的碱基，分别从临床梅毒螺旋体标准株 (Nichols)中扩增上述三种蛋白质的 DNA片段。将所得 PCR产物通过本领域技术人员周知的方法导入合适的表达载体，构建重组 DNA构建体。用所得 DNA构建体转化合适的宿主细胞，在适于目标蛋白质表达的条件下培养如此转化的宿主细胞，并通过本领域周知的技术回收并纯化目标蛋白质。

这些表达载体包括染色体的、非染色体的和合成的 DNA序列，例如， SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体 DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体 DNA结合的载体、病毒 DNA、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒。不过，只要能在宿主中复制和存活，其它载体也可以利用。

合适的 DNA序列可以通过许多方法插到载体中。通常， DNA序列用本领域中已知的方法插入到合适的限制性内切酶位点上。这些方法相信处于本领域技术人员的知识范围内。

表达载体中的 DNA序列被有效地与一个合适的表达控制序列（启动子）连在一起，从而指导 mRNA的合成。下面提到的是这种启动子的代表： LTR或 SV40启动子、大肠杆菌的 Lac或 trp启动子、噬菌体的 PL启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的其它启动子。表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以具有增强表达的合适序列。

此外，表达载体优选包含能提供表型特征的一个或多个选择标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例如真核细胞的培养可用二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，大肠杵菌则可用四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述合适的 DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。

下面列举的是合适宿主的代表：细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇 S2 和草地夜蛾 Sf ; 动物细胞，如 CHO、 COS (猴肾成纤维细胞系）或 Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。从这些讲授看，合适宿主的选择应该在本领域技术人员的知识范围内。

将构建体导入宿主细胞的方法有： PEG-介导的 DNA转化、磷酸钙转染、 DEAE—葡聚糖介导的转染、电穿孔或基因枪方法。

通常，重組表达载体包含复制起点和用于转化宿主细胞的选择标记，例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母 TRP1基因，还包含从高效表达基因而来的启动子，从而介导下游结构序列的转录。这些启动子可以从编码糖酵解酶的操纵子中得来，诸如 3一磷酸甘油酸激酶（PGK：)、 α因子、酸性碑酸诲或热休克蛋白。异源的结构序列以适当的方位与翻译起始和终止序列以及其它优选的序列装配在一起。可选择的情况是， DNA序列可以编码一个融合蛋白，该蛋白含有一个 Ν末端确认肽，表现出预期的特征，例如所表达的重組产物的稳定化和提纯简化。

细菌适用的有效表达载体这样来构建：将编码目的蛋白的结构 DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。载体应包含一个或多个表型选择标记和复制起点，复制起点保证了载体在宿主中能保留下来，更理想的是能使载体得到扩增。适于转化的原核宿主有大肠杵菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单孢菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种细菌，其它的宿主也可以被选择。

在转化合适的宿主菌株和宿主菌株生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法（例如温度转变或化学药品诱导）诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。

通常用离心的方法收获细胞，用物理或化学的方法破碎细胞，将粗提物保留以进一步纯化。用于表达蛋白质的微生物细胞可以用任何便捷的方法破碎，包括冻融循环、超声波、机械破碎，或者使用细胞溶解剂，这些方法都是本领域的技术人员熟知的。

各种哺乳动物细胞的培养系统也能用于表达重组蛋白质。哺乳类表达系统的例子有 Gluzman (Cell 23:175, 1981)所描述猴肾成纤维细胞的 COS-7细胞系，及其它的能表达相容载体的细胞系，例如 C127、 3T3、 CHO、 HeLa和 BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列和 5，側翼非转录序列。衍生于 SV40拼接序列的 DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件。

所表达的可以从重组细胞培养物中回收和纯化出来，回收和纯化的方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。高效液相层析（HPLC)应用于最后的纯化步骤。

本发明的一个优选的实施方案中，利用了表达载体 GB-syl质粒构建重组 DNA构建体，将其转化大肠杆菌 ER2566, 利用 IPTG诱导目标蛋白质表达。

在本发明的一个优选实施方案中，通过超声处理破碎培养后的转化的大肠杆菌宿主，利用金属镍 - Sepharose亲和层析柱分离纯化目标蛋白质。

本发明还包括具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的梅毒螺旋体外膜蛋白质片段或衍生物经本发明所述的修饰后得到的蛋白质或多肽。

本发明所述的经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp还可以通过化学法对梅毒螺旋体外膜蛋白质的 Τρρ15、 Τρρ17、 Τρρ47或其片段加以修饰后得到。

现发现本发明的修饰蛋白质与未修饰的蛋白相比，不但具有更高的可标记性，而且出人意外地具有更高的免疫检测活性。

"高可标记性 ^π是指采用相同常规的化学交联方法用经过修饰的蛋白质比用不修饰的蛋白质显著提高了标记复合物的产率. 这一点可以在实施例 3中得到证实。

"高免疫检测活性 " 是指利用经过修饰的蛋白质比用不修饰的蛋白庸显著提高了梅毒螺旋体抗体免疫检测的灵敏度和 /或特异性。这一点可以在实施例 10的间接 ELISA法和实施例 11的双抗原夹心法中得以证实。

因此，本发明也涉及一种利用本发明的经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白盾 KTpp免疫检测人梅毒螺旋体抗体的方法。

已知梅毒螺旋体的抗原决定簇主要位于外膜蛋白 Tpp47、 Τρρ17 和 Τρρ15上。利用至少一种本发明的经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp作为抗原，通过抗原抗体免疫结合反应形成免疫结合复合物，从而检测个体生物学样本中人梅毒螺旋体抗体。

在本发明的一个实施方案中，这种方法包括以下步骤：

1)利用纯化的至少一种本发明的修饰蛋白质包被一种固相支持物；

2)将待检测的生物学样本加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育一段时间； 3)适度清洗去除任何未结合的梅毒螺旋体抗体；

4)加入经标记的针对人抗体的第二抗体，在适合形成抗原抗体免疫复合物的条件下孵育一段时间；

5)适度清洗去除任何未结合的第二抗体；

6)定量检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在。

上述方案中，针对人抗体的第二抗体可以是用放射性同位素标记的（即 RIA)，也可以是用辣根过氧化物獰、碱性磷酸酶、 P -半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶进行标记的（即 ELISA：)。

所述第二抗体可以是抗人 -IgG或 /和 - M抗体。这些第二抗体可以从市场上购得，如绵羊抗人 -IgG或 /和 -IgM、山羊抗人 -IgG或 / 和 -IgM、小鼠抗人 -IgG或 /和 -IgM、大鼠抗人 -IgG或 /和 -IgM、兔抗人 -IgG或 /和 -IgM等。

利用不同的第二抗体可以检测出样本中特定的抗体是否存在，以及不同抗体的相对存在量。由于在梅毒感染的不同时期 G和 IgM 在人体内的相对量不同，利用不同的第二抗体进行多次检测有助于判定患者的病程。

本说明书中所述的生物学样本是指来自受试者（包括患者和阴性对照）的血液、血清、血浆、尿样、体液、唾液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。

本发明的一个优选的实施方案中，采用所谓双抗原夹心法免疫检测法 (DAGS EIA)检测人梅毒螺旋体抗体。典型地，该方法包括以下步骤：

1) 用纯化的经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp包被一种固相支持物；

2)预先标记与包被固相支持物所用抗原 KTpp种类相应的经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp;

3)将待检测个体的生物学样本及由步骤 2)标记的蛋白质加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育一段时间；

4)适度清洗去除任何未结合的梅毒螺旋体抗体；

5) 定量检测孵育混合物中抗原抗体免疫复合物的存在。

所述的 "纯化抗原" 是指作为抗原的经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质之纯度高于 95%, 更优选的高于 98%。

所述的 "固相支持物" 包括本领域周知的有机和无机多聚物，诸如包括但不局限于：葡聚糖、天然或经修饰的纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺，琼脂糖，乳胶，容器内壁如试管、滴定板、玻璃杯等。

可使用本领域周知的多种方法包被固相支持物。例如：利用双功能试剂活化，参见美国专利 5399501。

特别在采用双抗原夹心法的实施方案中，包被固相支持物的经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质优选包括不只一种经修饰的重组外膜蛋白^。即，使用选自 ΚΤρρ15、 ΚΤρρ17、 Γρρ47的两种或三种进行固相包被。

相应的，根据步骤 1 ) 包被固相支持物的经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质的种类，利用本领域常用技术标记相应种类的经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质。优选利用可由比色法、分光光度法或荧光法测定的酶进行标记，包括但不局限于氧化还原酶类，如催化酶、过氧化物酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化鲦、 β-半乳糖苷酶；碱性磷酸酶；乙酰胆碱酯酶等的鲦进行标记。本发明一个优选的实施方案是用辣根过氧化物酶标记相应种类的抗原。此外还可以使用放射性同位素标记作为抗原的经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质。

标记上述臶和本发明的经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质之方法为本领域周知，例如利用已知肽化学的方法通过形成跣胺键进行标记。也可用本领域周知的方法利用放射性同位素进行标记。所述的 "适合形成抗原抗体免疫复合物的条件" 为本领域周知，是指在适当的温度及时间条件下孵育抗原与含抗体的样品的混合物，例如在约 0-50摄氏度，优选约 4-30摄氏度下，标记约 30分钟至约 48小时，优选标记约 30分钟至约 4小时。

经孵育形成抗原抗体免疫复合物后，用本领域常用的适当洗涤溶液洗涤检测板数次，以清除未结合的经标记的抗原。所用清洗液一般为 pH约 5-8, 优选为 pH约 7.4的磷酸盐緩冲溶液。

可采用多种本领域周知的方法定量检测抗原抗体复合物的形成。根据标记经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质所使用的方法，选择适当的定量检测方案。本发明一个优选的实施方案中，标记抗原时使用辣根过氧化物酶，所以使用以过氧化物溶液为 A液及联苯胺类物质为 B液的底物与带有含标记的辣根过氧化物鲦的抗原抗体免疫复合物作用，显色后在波长为 450nm (参比波长 630nm ) 晦标仪读取吸光值。将所得读数与阴性对照的读数加以比较，判断所测样本的结果。

利用本发明的经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp作为抗原，通过免疫法检测个体生物学样本中人梅毒螺旋体抗体的方法还包括本领域中常规使用的利用特定抗原检测抗体的其它方法。

本发明也涉及用于这些方法检测人梅毒螺旋体抗体的检测试剂盒。根据本发明检测人梅毒螺旋体抗体的检测试剂盒包括：用纯化的本发明经修饰的重组梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp作为抗原包被的固相支持物;和使用该试剂盒的说明。

在一个实施方案中，本发明试剂盒还包括如上文所述标记的第二抗体。该第二抗体可以是抗 IgG抗体和 /或抗 M抗体。

在用于双抗原夹心法时，该试剂盒还包括与步骤 1 ) 中包被固相支持物的蛋白质 KTpp种类相应的经标记的重組梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp。在上述检测试剂盒中，经标记的梅毒螺旋体外膜蛋白质可以液体的形式包装在适当的容器中，也可以便于重构的冻干物的形式置于适当的包装中。在后一种情况中，检测试剂盒中还优选含有用于重构经标记的梅毒螺旋体外膜蛋白质的适当的緩冲液。

在上述检测试剂盒中，还可以含有提供判断检测结果的相应的范围。

下列实施例以 KTpp代表 SEQ ID No.l、 SEQ ID No. 2 和 SEQ ID

No. 3的蛋白质为例说明本发明，但这并不意味着限制本发明的范围。实施例

实施例 1 利用 PCR方法扩增编 ^^毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp的基因实验材料与方法

梅素螺旋体 Nichols抹、大肠杆菌 ER2566株均为中国科学院微生物所提供。 GB - Syl 质粒由中国科学院遗传所惠赠，该质粒含有 NdeL Xhol单酶切位点，在 Xhol瑭切位点一端连接有重组的特征性的组氨酸标签及用于切割组氨酸标签的天冬氨酸序列标签。限制性内切酶 Ndel、 Xhol酶及 T₄DNA连接酶由中国医学科学院基础医学研究所提供， TaqDNA聚合酶，消化蛋白酶，肠激酶均由中国科学院遗传所分子生物实验室提供。 IPTG为 PROMEGA公司产品。梅毒螺旋体 DNA的制备及纯化

梅毒螺旋体 Nichols株的培养及染色体 DNA的制备、纯化参照 Zhampionce等，感染与免疫 58， 1697-1704, 1990中提到的方法。质粒 DNA的制备和纯化

大肠杆菌质粒 DNA的制备纯化参照 Sambrook在 "分子克隆，实验室手册"第 2版， Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989 中提供的方法。

PCR扩增引物设计根据已知文献报道的编码 Tppl5、 Τρρ17和 Τρρ47 蛋白质的核苷^^列设计 PCR引物（ Β.Κ· Purcell 等，分子微生物学 (1990) 4(8)， 1371-1379; R. A. Darrin 等，感染与免疫 1993(4), 1202-1210及 L.M. Weigel等，感染与免疫 1992(4), 1568-1576 ) , 其中添加用于引入表达载体的酶切位点 Ndel和 Xhol以及编码赖氨酸残基的密码子。

用于 PCR扩增的引物序列如下：

KTppl5: SEQ ID NO: 4和 SEQ ID NO: 5

上游引物： 5' GGG TCGT CATATG AAG AAG ATG GTG AAA AGA GGT 3，

Ndel Lys Lys

下游引物： 5 TTCG CTCGAG TTT TTT CCT GCT AAT AAT GGC 3'

Xhol Lys Lys

Tppl5: SEQ ID NO: 6和 SEQ ID NO: 7

上游引物： 5， GGG TCGT CATATG ATG GTG AAA AGA GGT 3'

Ndel

下游引物： 5， TTCG CTCGAG CCT GCT AAT AAT GGC 3，

Xhol

KTppl7: SEQ ID NO: 8和 SEQ ID NO: 9

上游引物： 5， GATTGAG CAI41G AAG AAG ATG AAA GGA TCT GTC3'

Ndel Lys Lys

下游引物： 5， GTCAG CTCGAG TTT TTT TTT CTT TGT TTT TTT3，

Xhol Lys Lys

Tppl7: SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11

上游引物： 5， GATTGAG CATATG ATG AAA GGA TCT GTC3'

Ndel

下游引物： 5， GTCAG CTCGAG TTT CTT TGT TTT TTT3'

Xhol

KTpp47: SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13

上游引物： 5，GTACTAG CATATG AAG AAG ATG TTC GAT GCA GTT 3，

Ndel Lys Lys

下游引物： 5， CTGT CTCGAG TTT TTT CTG GGC GAC TAC CTT3，

Xhol Lys Lys

Tpp47: SEQ ID NO 14和 SEQ ID NO: 15

上游引物： 5，GTACTAG CATATG ATG TTC GAT GCA GTT 3，

Ndel 下游引物： 5， CTGT CTCGAG— CTG GGC GAC TAC CTT3，

Xhol 编码抗原蛋白质 KTpp的基因的 PCR扩增

以如上述获得的梅毒螺旋体 Nichels株总 DNA为模板，加入 50 pmmol 引物， 2.5mmol/L dNTP及 1U Taq DNA聚合酶，加水至反应总体积 ΙΟΟμΙ, 表面覆盖石蜡油。在中科院遗传所生产的 PCR- 90AD型 PCR仪中按照如下条件扩增：

95°C变性 60秒

55°C退火 60秒 (KTppl5)， 58 X退火 60秒 (ΚΤρρ17)， 60 X退火 60 秒 (ΚΤρρ47)

72 °C延伸 90秒，共 30个循环。

最后一个循环完成后再于 72Ό延伸 10分钟。 41：储存反应混合液待用。用等体积酚 /氯仿抽提反应混合液，去掉石蜡油。取 5μ1含有 PCR产物的反应液用 1 %琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况，其余产物中加入 0.1倍体积的 3Μ醋酸钾溶液，无水乙醇沉淀于 - 离心收集扩增产物。

所获 PCR扩增产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳检查知：相应于编码 KTpp, K15Tppl7和 ΚΤρρ47的核苷酸序列之反应产物分别对应有约 0.4Kb、约 0.5Kb和约 1.1Kb的 DNA条带，表明引物设计正确，获得了相应的目的基因片段。实施例 2重组质粒的构建及鉴定

PCR扩增产物的克隆

l g 的 GB - Syl质粒 DNA于 37* 下经 Ndel和 Xhol酶完全酶切，紛 /氯仿抽提， - 20t:下无水乙醇沉淀过夜。离心后沉淀溶于 13μ1 Η₂0。经过 Ndel和 Xhol醇充分臻切的 PCR产物与上述预酶切的质粒 GB - Syl 连接，转化至大肠杆菌 ER2566, 涂布含有 200μ^ιη1氨苄青霉素的 LB选择平板。 37Ό过夜培养。构建过程参见图 4、图 5和图 6。所述连接及转化的方法和条件参见， J. 萨姆布雷奇等著的《分子克隆实验指南》（ Molecular CloningiA Laboratory Manual ) P672-849(科学出版社， 1998)

重组质粒选和鉴定

从转化平板上挑取抗性菌落，提取质粒并电泳检查，筛选重组子。通过限制性内切酶 Ndel和 Xhol絝切分析，筛选含有正确插入的目的基因的重组子。对所得含有插入片段的重组质粒测序，确证在 PCR过程中目的基因片段未发生变异或出现差错。

目标蛋白的表达及纯化

将选定的重組子菌抹接种于含 20(^_g/ml氨苄青霉素的 LB培养基中，置于恒温摇床培养， 37X培养至菌液 OD值约 0.6后加入 ImM IPTG诱导， 30。C继续培养 2小时。然后将发酵培养物离心收集菌体沉淀。用超声波将所得细菌菌体破碎后再次离心，收集上清液。利用金属镍- Sepharose(Pharmacia公司）的亲和层析柱进行蛋白的分离纯化（洗脱条件 0.02M pH 7.4磷酸盐緩冲溶液（ PBS ) ，洗 J 度 lml/分钟）。经充分洗涤去除非特异性结合的蛋白质后，分离并收集与金属镍- Sepharose结合的表达蛋白，进行 SDS-PAGE 电泳和纯度鉴定及 ELISA血清学检验。纯化方法参照文献 Arnild, FH (1991) 生物工程（Bio/Tedmology ) 9, 151-156和 Dekker, N. (1992) 自然（Nature ) 362, 852-855。

收集含有组氨酸标签的目标蛋白，加入 1U肠激酶对組氨酸进行切割。目标蛋白再经过 DEAE - Sepharose 柱 (Pharmacia 公司）和 Superdex 75柱 (Pharmacia公司) ϋ一步纯化得到。具体操作过程如下：收集 M-Sepharose柱上切割下的连接有 6个组氨酸标签的目标蛋白质溶液，按 1L加入 1U肠激酶的比例加入切割酶， 4X过夜，然后将切割后的蛋白质溶液上样于用 pH7.2， 0.01M的 Tris-HCl緩冲液预平衡的 DEAE - Sepharose柱，收集各个組分。通过 ELISA 的方法鉴定目标蛋白免疫活性：将收集到的各个组分用 0.05M pH9.6 碳酸盐緩冲液（ CB ) 1:10稀释成包被工作液，对 96孔酶标板 4"C包被过夜。然后加入 1 %牛血清白蛋白（ BSA )和 1%脱脂奶粉的 0.02M pH7.4磷酸盐緩冲液（PBS ), 4 :下封闭 2 小时后弃去。再加入梅毒螺旋体阳性病人血清 10微升 /孔，用 100微升含 1%BSA的 PBS 的溶液为样品稀释液， 37"C , 30分钟后，弃去。用含有 0.5 % TW - 20的 0.05M PBS洗涤液 (PBS-T)洗两遍，加入用醻标抗体稀释液（ 20 %山羊血清 (浙江三利血液制品公司生产）， 1 %酪蛋白（Sigma), 0.02M PBS pH7.4 ) )以 1: 5000稀释的羊抗人 IgG ( DAKO公司生产） 100 微升 /孔， 37°C , 30分钟，再用含有 0.5 %吐温 20 ( TW - 20 )的 0.02M pH7.4 PBS洗涤液 (PBS-T)洗两遍，最后每孔中加入 50μ1 由 0.06% 过氧化脲 (Sigma) 0.01M pH4.5的醋酸盐緩冲液组成的鋒作用底物 A 液以及 50μ1由 0.06% 3，3，、5，5、-四甲基联笨胺（ ΤΜΒ ) (Sigma)， 0.01M pH 4.5的柠檬酸盐緩冲液组成的酶作用底物 37 , 显色 10分钟，最后加入 1M H₂S0₄终止，在 450nm 处读取吸光值（参比波长 630nm), 如果吸光值高，说明收集的级分中含有目标重组梅毒螺旋体蛋白。将这些高吸光值级分低温浓缩之后，再经过 Superdex75柱 (采用 0.02M pH7.4 PBS平衡柱体）纯化，收集单一組分，进一步采用 ELISA法进行免疫活性评价，方法同上。

重组抗原的鉴定

编码本发明经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 KTpp的基因分别在大肠杆菌表达后，经亲和层析分离并纯化后，经过 SDS-PAGE电泳鉴定，经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质 ΚΤρρ15、 ΚΤρρΠ和 KTpp⁴⁷ 的分子量分别约为 15KD、 17KD和 47KD, (参见图 7 ) ; 通过 Western 蛋白印迹法，证实所得的蛋白质具有与人梅毒螺旋体抗体结合的活性 (参见图 8) 。实施例 3 重组抗原蛋白质 KTpp的酶法标记

由上述方法纯化制备的 ΚΤρρ蛋白质经过本领域周知的间接 ELISA法证实所获蛋白质免疫活性良好。用于酶标记的辣根过氧化物酶（HRP ) ， NaI04, NaBH₃CN, 乙醇胺，甲基 - α -D-甘露糖苷均购自 Sigma公司。酶法标记重组抗原蛋白质 KTpp采用改良的过碘酸盐法，参考 Tijssien (Analytical Biochem 136,451-457,1984), 具体步骤如下：

1 )激活 HRP: 用 ΙΟΟμΙ 0.1M NaI0₄加入 lml 5mg/ml 的 HRP, 室温下充分混匀，置于震荡器上充分反应，避光震荡 150转 /分， 20分钟，对 ImM pH4.4的醋酸盐緩冲液充分透析 24小时；

2 )与梅毒螺旋体抗原的交联：向 lml上述激活后的 HRP 中加入 1/4 体积的 0.2MpH9.6碳酸盐緩沖液 (CB)调节 pH值至 9.6, 向梅毒螺旋体抗原（ KTppl5，KTppl7或 KTpp47 3mg/ml ) lml中加入 1/4体积的 0.2MpH9.6CB调节 pH值至 9.6, 然后将上述两种液体充分混匀，置于震荡器上 200转 /分，室温下避光充分反应 2小时；

3 ) 双键 Shiff 碱的还原：将上述交联后的产物中加入 25μ1 5Μ的 NaBH₃CN, 充分混匀后 4* 避光静置 2小时；

4 ) 封闭未反应搭基：加入 125μ1 1M乙醇胺封闭未与梅毒螺旋体抗原交联的 HRP上的多余醛基，充分混匀后 4 避光静置 1小时；

5 ) 去除交联产物中的小分子物质：将上述的交联产物对 0.02ΜρΗ7.4的 PBS充分透析 24小时；

6 ) 去除未交联的游离酶：从透析袋取出液体加入等体积的 50% 饱和（NH4 ) ₂S0₄，充分混匀后 4 静置 24小时，离心 2000转 /分 20 分钟，收集沉淀，用 0.02M pH7.4的 PBS稀释沉淀，对 0.02M pH7.4 PBS 充分透析 24小时；

7 ) 去除未交联的游离抗原：准备一支 2ml的 ConA-Sepharose纯化柱 (Pharmaca公司生产），采用 0.02M pH7.4 的 PBS平衡柱体，加入透析后的酶标抗原，先用 0.02M pH7.4 的 PBS充分洗脱，再用含有甲基 - α -D-甘露糖苷的 0.02M pH7.4的 PBS为洗脱液，收集含有糖基化蛋白的酶标抗原洗脱峰；

8 )纯化鲦标抗原的保存：将收集的酶标抗原加入等体积甘油， -20 °C保存，即制得蘇标梅毒螺旋体抗原原液。

为了比较经修饰的重组梅毒螺旋体抗原和未经修饰的梅毒螺旋体抗原采用上述方法标记的标记效率，以相同浓度的 KTppl7 和 Τρρ17 抗原 (3mg/ml)为例，完全按照上述标记方法中采用的量，进行平行实验，将经过纯化的标记的产物（未加入甘油前）经由 Superdex75凝胶柱 (上样量 100 l)(Pharmaca公司生产）采用 AKTO purifier蛋白质纯化分析仪（ Armersham pharmaca公司生产）分析，用 ²⁸0nm的紫外检测器检测结合物中抗原蛋白量的变化，用 403mn紫外检测器检测结合物中辣根过氧化物酶量的变化 (参考文献 Tijssien (Analytical Biochem 136,451-457,1984)，用 403nm的与 280nm的主峰峰面积的比值来检测重组梅毒螺旋体抗原分子能够被辣根过氧化物酶标记的程度，产物出峰结果参见附图 9。现将积分结果列表如下：

表 1 HRP标记修饰重组梅毒螺旋体抗原 Γρρ17与未修饰梅毒螺旋体抗原 Τρρ17的比较

由实验结果来看，修饰的梅毒螺旋体抗原 KTppl7的标记效率明显高于未修饰的梅毒螺旋体抗原 Τρρ17。实施例 4 确定包被固相支持物的抗原与经过酶法标记的抗原的最佳浓度及所用抗原种类的优选配伍包被固相支持物的抗原与酶标抗原的浓度的优化选择

96孔板条选用吸附性良好的聚苯乙烯板 (深圳立基公司生产）（孔间，板间和批间差 CV<10% )，选用 0.05M pH9.6碳酸盐緩冲液 (CB) 为包被液，每孔加入按照实验设计浓度配好抗原的包被液 100微升，室温包被过夜。然后弃去抗原液，包被板用含有 0.5% TW - 20的 0.02M PBS洗涤液 (PBS-T)洗两次，拍干，加入 1 %牛血清白蛋白（ BSA ) 和 1%脱脂奶粉的 0.02M pH7.4麟酸盐緩冲液（ PBS ) 室温封闭 2小时。弃去封闭液，风干包被板，铝箔袋真空包装 41保存。通过选用浓度为 5、 12.5、 25、 50、 75、 100 μ g/ml的 KTppl5抗原包被浓度进行包被，选用浓度为 0、 10、 20、 30、 40、 60、 80、 100 /ml的酶标

心法实验。结果显示， KTppl5包被浓度为 50 μ g/ml，醇标抗原为 40 μ g/ml时阳性质评血清（该阳性质评血清经过 Western Blot确证为 Tppl⁵，Tppl7及 Tpp⁴⁷条带的梅毒阳性血清)达最大 OD值，阴性质评血清的反应均值小于 0.05。据此我们选用 50 μ g/ml为 ΚΤρρ15包被浓度， 40 μ g/ml为酶标抗原浓度。采用相同的方法确定 KTppl7 的包被浓度为 20 y g/ml，酶标抗原浓度为 40 μ g/ml; 确定 KTpp47 的包被浓度为 40 y g/ml，酶标抗原浓度为 40 μ g/ml。

确定所用抗原种类配伍的选择

参见如下表中所示的包被抗原与酶标抗原的比例通过方阵试验选择各抗原之间适当的配伍浓度。表 2.双抗原夹心结果（ S/CO) 雜

& ¾抗

\ Γρρ15: Γρρ17:ΚΓρρ47 原 Γρρ17 ΚΓρρ47

§ ¾¾¾ί5- 、\ Γρρ15 (μ^πιΐ)

\、 (μ^ιηΐ)

质

评

血 50:50:50 50:20:40 20:20:20 50 20 40

HRP- ΚΓρρ15 阳 5.0 7.0 45 6.8 6.7 62

40

HRP- 性

40

Γρρ17

40

HRP- 阴 025 0.19 0.12 0.15 0.1 ΚΓρρ47 性

阳

Γρρ15 20 4.6 8·5 6.8 7.6 7.8 7.4

性

Γρρ17 40

阴

Γρρ47 20 023 0.1 02 0.1 0.09 0.12

性

阳

6.9 65 5.0 4.4

性

40

HRP- 阴

0.1 0.1 0.1 0.1

Γρρ15 性

阳

6.4 7.0 6.8 63

性

HRP- 40

阴

Κ ρρ17 0.1 0.1 0.1 0.1

性

阳

5.6 5.7 6·5

性

HRP- 40

阴

ΚΤρρ47 0.1 0.1 0.1 0.1

性由以上数据，我们选择抗原的配伍浓度如下： KTppl5、 Τρρ17、 ΚΤρρ47的包被浓度分别为 50、 20、 40 μ g/ml; 螓标抗原的浓度分别为 20、 40、 20 μ g/mL 这种配伍选择突出了 ΓρρΠ的作用，也兼顾了 ΚΤρρ15、 ΚΤρρ47的可能互补作用。

优化后的包被抗原组合物称为梅毒 S-3系列抗原，优化后的鲦标抗原统称为酶标 S-3抗原实施例 5合适的抗原抗体反应条件及时间的确定

在上述实施例确定的包被抗原及酶标抗原浓度下，采用如前述的酶标板和反应緩冲液，研究适于抗原抗体反应形成免疫结合复合物的条件。选用弱、中、强 3个阳性血清及阴性对照，按照实施例 7 中详细描述的操作方法进行双抗原夹心法实验。通过在 37 条件下分别反应 20、 40、 60、 90、 120分钟，显色 15分钟，所测的 OD值在 60 分钟时达到最高值。故选择反应时间为 60分钟。实施例 6双抗原夹心法免疫检测样品的阳性罔值的确定按照如前实施例所述免疫检测的方法，检测 300份经间接 ELISA 法确定为阴性的正常义务献血员血清，取正态分布值进行统计分析。得均值为 0.021， SD为 0.004。设定阳性阈值为 0.18 + 阴性对照均值。实施例 7双抗原夹心法检测梅毒螺旋体抗体在 96孔微孔反应板上加入预先用 0.02Μ ρΗ9.6的碳酸盐緩冲液 (CB)稀释 ΚΤρρ15、 ΚΤρρ17、 ΚΤρρ47至最适浓度 (梅毒 S-3系列抗原）的包被液，静置 24小时，加入含 0.1%TW - 20的 0.02M pH7.4 PBS 洗涤液 (PBS-T)加满各孔，静置数秒后弃去，重复清洗两次。每孔加入 200μ1入 1 %牛血清白蛋白（BSA ) 和 1%脱脂奶粉的 0.02Μ ρΗ7.4 磷酸盐緩冲液（PBS ) , 下封闭 2小时。弃去封闭液，室温下晾干，用铝薄袋封板， 4X保藏待用。在微孔反应板孔中加入预先用酶标抗原稀释液（ 20%山羊血清， 1 %酪蛋白， 0.02M PBS， pH7.4 ) 以优化好的浓度稀译的梅毒 S-3系列抗原相应的醇标抗原，每孔 50μ1，再加入 15个来自不同待检测的受试者血清， 37°C温育 60分钟。然后用含 0.1%TW - 20的 0.02M PBS-T洗涤液加满各孔，静置数秒后弃去，重复清洗 5次。每孔中加入 50μ1 由 0.06%过氧化脲 (Sigma) O.OlM pH4.5的醋酸盐緩冲液組成的酶作用底物 A液以及 50μ1由 0.06%TMB (Sigma) 0.01M pH 4.5的柠檬酸益緩冲液组成的酶作用底物 B液， 37 °C温育 15分钟。每孔中加入 50 μΐ 的 2Μ H₂S0₄终止反应。在醻标仪 ( Dynatech MR 4100 ) 上读取 450nm处的吸光值（以 630为参比波长)。其中阳性对照和阴性对照均为经过 TPHA，RPR及 FTA-ABS方法复核的人血清，根据实施例 6所确定的阈值判定样本结果，高于 0.18+0.024的样本为梅毒螺旋体阳性。检测血清标本来自北京医科大学第一附属医院皮肤科临床确诊的梅毒病人血清 49份，其中一期梅毒病人血清 11份（ I 1-- I 11 )，二期梅毒病人血清 38份 ( Π 12―— Π 49 ) (其中 4份治疗后血清，以 Π *表示）。平行实验采用的 RPR 试剂盒为 Organon公司产品（批号： 0349 ) , TPPA试剂盒为日本富士生物株式会社产品（批号： VN81204 )。所得结果如下：

表 3.双抗原夹心法检测梅毒病人血清结果

ELISA(¾¾夹心、法） RPR

判别滴度判别 ΤΡΡΑ 阳时照 2231 + 1:32 + + 阴树照 0.024 - - -

I 1 1.892 + 1:16 + +

I 2 0·54 + - +

I 3 1.766 + - +

I 4 1.869 + 1:1 + +

I 5 1.935 + 1:2 + +

I 6 1.436 + 1:1 + +

I 7 0·557 + - +

I 8 0·505 + - +

I 9 1238 + 1:1 + +

I 10 0.658 + - +

I 11 1.154 + 1:4 + +

Π12 1.133 + 1:8 + +

Π 13* 2.159 + 1:4 + +

Π14 76 + 1:8 + +

Π15 0530 + 1:16 + +

Π16 0.869 + 1:16 + +

Π17 0.901 + 1:32 + +

Π18 0.898 + 1:8 + +

Π19 0.760 + 1:16 + +

Π20 1.018 + 1:32 + +

II 21 0564 + 1:16 + +

Π22 72 + 1:8 + +

Π23 1.932 + 1:16 + +

Π24 0.821 + 1:8 + +

Π25 0.741 + 1:32 + +

Π26* 0.785 + 1:4 + +

Π27 0.682 + 1:16 + +

Π28 0.676 + 1:32 + + 表 3 (续）

实施例 8双抗原夹心法梅毒螺旋体免疫检测试剂盒的组成本发明优选的双抗原夹心法梅毒螺旋体免疫检测试剂盒由以下几个部分组成：

包被抗原：梅毒 S-3系列抗原；即：浓度分别为 50、 20、 40 μ g/ml 的 KTppl5、 ΚΤρρ17、 ΚΤρρ47。

抗原包被板：为国产 96孔可拆板，按照实施例 4所述包被梅毒 S-3 系列抗原，真空干燥密封；

酶标抗原：辣根过氧化物酶标记的梅毒 S-3系列抗原。即：浓度分别为 20、 40、 20 μ g/ml的酶标抗原 HRP-KTppl5、 HRP-KTppl7, HRP-KTpp47„

阴性对照及阳性对照血清：各 0.2毫升，含 0.05%硫柳汞， 0.01% 叠氮钠，使用时每孔加入 50μ1;

酶标 S-3抗原 6ml 工作液：用含 20%羊血清（浙江三利血液制品公司生产)，0.05%硫柳汞 (Sigma), 0.02M pH7.4 PBS的酶标抗原稀释液将酶标 S-3抗原稀释至适当的效价。

底物液 A: 6ml 0.06%过氧化脲 (Sigma)的 0.01M pH 4.5柠檬酸 (Sigma)緩冲液；

底物液 B: 6ml 0.06%TMB(Sigma) 0.01M pH 4.5柠檬酸 (Sigma) 緩冲液；

终止液： 6ml lM硫酸

洗涤液： 20ml 50 X PBS, 含 0.1%吐温- 20;

抗梅毒螺旋体阳性血清 OlM 当在 0.18+阴性对照均值以上。

抗梅毒螺旋体阴性血清 OD值当在 0.18以下。

双抗原夹心法免疫检测梅毒螺旋体抗体试剂盒说明书一份。实施例 9双¾夹心法与间接 ELESA法检毒職体的雌按照前述实施例条件用经修饰的重组梅毒螺旋体抗原蛋白质 KTpp 包被的 96孔板，采用实施例 3酶法标记的抗原蛋白质 KTpp遵照实施例 7 的方法对获自中国医学科学院皮肤病研究所，北京市性病防治所，北京市红十字血液中心，中曰友好医院检验科，北京医科大学第一附属医院皮肤科的临床血清，用双抗原夹心法免疫检测梅毒螺旋体抗体，所得结果与常规间接 ELISA法进行比较。 30份阳性血清评定结果表明双抗原夹心法与间接 ELISA法两种方法对弱阳性样品检测，比较样品 OD值与临界值（ cut off)的比值 (S/CO),结果潜伏期梅毒 (表中以 *表示)及早期梅毒 (表中以 **表示; 高于间接 ELISA法。结果见下表。 . 双抗原夹心法与间接法的比较 (S/CO)

以上实验结果表明，双抗原夹心法免疫检测梅毒螺旋体试剂盒，由于可以同时检测 I_gG，IgM和 IgA，与主要检测 IgG抗体的间接 ELISA 法相比，既可以早期诊断潜伏期梅毒，又降低了漏检的几率。

此外，通过对 400份临床阴性血清样品的测定，采用本发明实施双抗原夹心法梅毒螺旋体试剂盒明显优于间接 ELISA法，双抗原夹心法测得的 00值<0.02, 而间接 ELISA法在 0.04左右，间接 ELISA法的假阳性率为 5%o , 双抗原夹心法为 0。实施例 10 重组 KTpp抗原与未经修饰的梅毒螺旋体抗原 Tpp间接 ELISA法测定梅毒螺旋体抗体的效果比较

为了比较采用本发明制备的经修饰的梅毒螺旋体抗原 KTppl5、 ΚΤρρ17、 ΚΤρρ47与 Ν末端和 C末端未添加赖氨酸残基的梅毒螺旋体抗原的抗原性，采用间接 ELISA法进行比较。即分别采用多种浓度的两种重组蛋白质抗原 Tppl5和 KTppl5、 Τρρ17和 Γρρ17、 Τρρ47 和 ΚΤρρ47分别包被固相酶标板后，通过间接 ELISA法，检测相同的梅毒螺旋体阳性血清样品，比较两种抗原检测梅毒螺旋体抗体的情况，具体实验操作及结果参见下表。

分别用 0， 2.5， 5, 10， 15， 20, 25, 30， 40， 50( μ g/ml)浓度的重组 KTpp抗原及 Tpp抗原均以 0.05M pH9.6碳酸盐緩冲液（ CB ) 配成包被工作液，对 96孔酶标板 4*C包被过夜。然后相同地加入 1 %牛血清白蛋白（BSA ) 和 1%脱脂奶粉的 0.02M pH7.4 磷酸盐緩冲液 ( PBS ), 4X下封闭 2 小时后弃去。 ^加入同一份梅毒螺旋体阳性质评血清 (经过 Western Blot确证为 Tppl5，Tppl7，和 Τρρ47条带的阳性血清) 10微升 /孔，用 100微升含 1%BSA的 PBS的溶液为样品稀释液, 37 , 30分钟后，弃去。用含有 0.5 % TW - 20的 0.05M PBS 洗涤液 (PBS-T)洗两遍，相同地加入用醉标抗体稀释液（ 20 %山羊血清（浙江三利血液制品公司生产）， 1 %酪蛋白（Sigma), 0.02M PBS pH7.4 ) )以 1: 5000稀释的羊抗人 IgG ( DAKO公司生产） 100微升 /孔， 30分钟，再用含有 0.5%吐温 20 ( TW - 20 ) 的 0.02M pH7.4 PBS洗涤液 (PBS-T)洗两遍，最后每孔中加入 50μ1 由 0.06% 过氧化脲 (Sigma) 0.01M pH4.5的醋酸盐緩冲液组成的鲦作用底物 A 液以及 50μ1由 0.06% 3，3、，5，5、-四甲基联苯胺（ ΤΜΒ ) (Sigma)， 0.01M pH 4.5的柠檬酸盐緩冲液组成的醻作用底物 B, 37€, 显色 10分钟，最后加入 1M H₂S0₄终止，在 450nm处读取吸光值 (参比波长 630nm)，实验结果列表：表 5: 间接 ELISA 法 Tppl5抗原和 ΚΤρρ15抗原检测梅毒螺旋体阳性质评血清的比较（450nmOD值，参比波长 630nm)

表 6：间接 ELISA 法 Tppl7抗原和 ΚΤρρΠ抗原检测梅毒螺旋体阳性质评血清的比较（⁴⁵0nmOD值，参比波长 630nm)

包被浓度（μ g/ml) ΤρρΠ ΚΤρρ17

0 0 0

2.5 0.3 0.3

5.0 0.615 0.689

15 1.04 1.28

20 1.28 1.58

25 1.44 1.74

30 1.52 1.86

40 1.61 1.973

50 1.64 2 表 7: 间接 ELISA 法 Tpp47抗原和 ΚΤρρ47抗原检测梅毒螺旋体阳性质评血清的比较（450nmOD值，参比波长 630nm)

实验结果表明 ΚΤρρ15、 ΚΤρρ17、 ΚΤρρ47 的抗原灵敏程度高于 Τρρ15、 Τρρ17和 Τρρ47。实施例 11 酶标重组 ΚΤρρ抗原与酶标未经修饰的梅毒螺旋体抗原 Τρρ双抗原夹心法测定梅毒螺旋体抗体的效果比较

为了比较采用本发明制备的经修饰的梅毒螺旋体抗原 ΚΤρρ15、 ΚΤρρΠ、 ΚΤρρ47与 Ν末端和 C末端未添加赖氨酸残基的梅毒螺旋体抗原的酶标记复合物的效果，采用双抗原夹心 ELISA法进行比较。即分别采用优化浓度的重组蛋白质抗原 Tppl5和 KTppl5、 Τρρ17和 ΚΤρρ17、 Τρρ47和 ΚΤρρ47分别包被固相酶标板后，分別采用系列浓度的重组蛋白质抗原 Τρρ15和 ΚΤρρ15、 Τρρ17和 ΚΤρρ17、 Τρρ47 和 ΚΤρρ47的酶标复合物，检测相同的梅毒螺旋体阳性血清样品，比较两种酶标抗原对检测梅毒螺旋体抗体影响的情况。

分别用重组 ΚΤρρ抗原 (间接法优化的浓度 ΚΤρρ15 50 μ g/ml, KTppl7 20 /ml,KTpp47 40 μ g/ml)及 Tp 抗原（间接法优化的浓度 Τρρ15 50 μ g/ml,Tppl7 30 μ g/mI,KTpp47 40 μ g/ml)均以 0.05M pH9.6碳酸盐緩沖液（ CB ) 配成包被工作液，对 96孔皞标板 4"C包被过夜。然后相同地加入 1 %牛血清白蛋白（BSA )和 1%脱脂奶粉的 0.02M pH7.4磷酸盐緩冲液（PBS )， 4匸下封闭 2小时后弃去。然后加入用酶标抗原稀释液（ 20%山羊血清（浙江三利血液制品公司生产)， 1 %酪蛋白（Sigma), 0·02Μ PBS pH7.4 ) )稀释成 0， 2.5， 5， 10， 15， 20， 25, 30， 40， 50( μ g/ml)系列浓度的酶标抗原复合物 HRP- KTppl5、 HRP-KTppl7、 HRP-KTpp47 以及 HRP-Tppl5、 HRP-Tppl7、 HRP-Tpp47，50微升 /孔 ,37^ , 60分钟，用含有 0.5% 吐温 20 ( TW - 20 ) 的 0.02M pH7.4 PBS洗涤液 (PBS-T)洗两遍，最后每孔中加入 50μ1 由 0.06%过氧化脲 (Sigma) 0.01M pH4.5的醋酸盐緩冲液组成的醻作用底物 A液以及 50μ1由 0.06% 3，3、，5，5、-四甲基联苯胺（ TMB ) (Sigma)， 0.01M pH 4.5的柠檬酸盐緩冲液组成的酶作用底物 B， 37€, 显色 10分钟，最后加入 1M H₂S0₄终止，在 450nm处读取吸光值 (参比波长 630nm)，实验结果见图 10.

实验结果表明不论采用修饰的重组 ΚΓρρ15、 ΚΤρρ17、 ΚΤρρ47 的抗原包被，还是采用未修饰的重組 Τρρ15、 Τρρ17、 Τρρ47的抗原包被，采用酶标修饰的重組抗原 HRP-KTppl5、 HRP-KTppl7、 HRP-KTpp47 的双抗原夹心法检测梅毒阳性盾评血清总比采用酶标未修饰的重组抗原 HRP-Tppl5、 HRP-Tppl7、 HRP-Tpp47灵敏程度高。

Claims

权利要求

1. 一种具有通式 (Xaa)_nTpp(Xaa)_m的蛋白质，其中 Tpp选自梅毒螺旋体外膜蛋白质 Τρρ15、 Τρρ17、 Τρρ47或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物； Xaa代表天然氨基酸残基，其中与 Tpp 每侧最接近的至少一个 Xaa和至少一个通式蛋白的末端 Xaa是选自 Lys、 Arg和 Trp的氨基酸残基； π和 m分别为 0 10的整数，条件是 n + m≥2。
2. 根据权利要求 1的蛋白质，其中该蛋白质为 MetLysLys-Tpp- LysLysLeuGluLys, 且 Tpp为梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl5或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物。
3. 根据权利要求 1的蛋白质，其中该蛋白质为 MetLysLys-Tpp- LysLysLeuGluLys, 且 Tpp为梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tppl7或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物。
4. 根据权利要求 1的蛋白质，其中该蛋白质为 MetLysLys-Tpp- LysLysLeuGIuLys, 且 Tpp为梅毒螺旋体外膜蛋白质 Tpp47或其具有结合人免疫球蛋白之免疫活性的片段或衍生物。
5. 权利要求 2的蛋白质，其具有 SEQ ID No. 1的氨基^^列。
6. 权利要求 3的蛋白质，其具有 SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
7. 权利要求 4的蛋白质，其具有 SEQ ID No. 3的氨基酸序列。
8. 一种免疫检测梅毒螺旋体抗体的方法，其中包括利用权利要求 1 - 7中任一项的至少一种蛋白质与生物学样本中梅毒螺旋体抗体间的抗原 -抗体反应。
9. 权利要求 8的方法，其包括以下步骤：

1)利用权利要求 1 - 7中任一项的至少一种纯化蛋白质包被一种固相支持物；

2)将待检测的生物学样本加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育一段时间；

3)适度清洗去除任何未结合的梅毒螺旋体抗体；

4)加入经标记的针对人抗体的第二抗体，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育一段时间；

5)适度清洗去除任何未结合的第二抗体；

6)检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在。
10. 权利要求 9的方法，其中针对人梅毒螺旋体抗体的第二抗体是用选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 β -半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的酶进行标记的。
11. 权利要求 8的方法，其包括以下步骤：

1)利用权利要求 1 - 7任一项的至少一种纯化蛋白质包被一种固相支持物；

2)预先制备经标记的与 1)中所用蛋白质相应的蛋白质；

3)将待检测个体的生物学样本及由步骤 2)标记的蛋白质加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育一段时间；

4)适度清洗去除任何未结合的梅毒螺旋体抗体；

5)检测孵育混合物中抗原抗体免疫复合物的存在.
12. 权利要求 11的方法，其中步骤 2)中的蛋白质是用选自辣根过氧化物獰、碱性磷酸酶、 β -半乳糖苷醇和乙酰胆碱酯酶的皡进行标记的。
13. 一种用于免疫检测人梅毒螺旋体抗体的检测试剂盒，其包括用纯化的权利要求 1 - 7任一项的至少一种蛋白质包被的检测板。
14. 权利要求 13的检测试剂盒，其还包括与包被检测板种类相对应的经标记的权利要求 1 - 7任一项的蛋白质。
15. 权利要求 13的检测试剂盒，其中蛋白质是用选自辣根过氧化物酶、碱性碑酸酶、半乳糖苷酶和乙跣胆碱酯酵的酶进行标记的。
16. 权利要求 13的检测试剂盒，其还包括经标记的针对人抗体的第二抗体。
17. 权利要求 13的检测试剂盒，其中针对人抗体的第二抗体是用选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 P -半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶的酶进行标记的。