CN114518447A

CN114518447A - 一种检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条及其应用

Info

Publication number: CN114518447A
Application number: CN202210067681.8A
Authority: CN
Inventors: 乔薪瑗; 于晓丽; 单智夫; 王丽; 周晗; 李佳璇; 王晓娜; 姜艳平; 崔文; 唐丽杰; 李一经
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2022-05-20

Abstract

本发明公开了一种检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条及其应用。所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水垫及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述的胶体金垫上吸附有胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗牛细小病毒多克隆抗体包被的检测线，以及山羊抗鼠IgG包被的质控线，样品垫提供了待测样品加入的位置；其中，所述的抗牛细小病毒单克隆抗体由分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为8C10，菌种保藏编号为：CGMCC NO.23880。本发明的提出为牛细小病毒的检测提供了有效的技术手段。

Description

一种检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及一种胶体金免疫层析试纸条及其应用，特别涉及一种用于检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条及其应用。本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

牛细小病毒(Bovine parvovirus，BPV)是细小病毒科(Parvoviridae)博卡病毒属(Bocavirus)的成员，可以进行自主复制，是最小的20面体病毒，无囊膜，直径约23nm。病毒粒子合成时分为两种形式，一种为成熟完整的病毒粒子，另一种是不包含遗传物质的空衣壳粒子，均具有BPV血凝活性，但空衣壳粒子不具有感染活性。

牛细小病毒感染可引起怀孕母牛流产、死胎，且该病可以突破胎盘屏障，怀孕母牛孕期感染后可直接传染胎牛，各个年龄的牛均易感染BPV，但犊牛最易感染，犊牛发病后表现为呼吸道和消化道症状。1961年，Abinanti分离出第1株牛细小病毒。随后在日本、美国、澳大利亚等国家陆续发现本病的流行，并分离到BPV毒株。1973年，Inaba在日本分离出3株牛细小病毒，并发现其中一株与Abinanti分离出的毒株血清型不同，故称其为Ⅱ型BPV。BPV感染早期临床症状不明显，常为隐性感染，感染初期的诊断较为困难，且目前没有针对该病的现地检测方法，因此建立一种适用于BPV感染诊断的现地检测方法非常有利于BPV感染的防控。

现阶段对BPV感染进行快速诊断的检测技术主要包括：间接免疫荧光检测技术、ELISA检测技术等抗体检测技术以及PCR检测技术、环介导等温核酸扩增技术(LAMP)等抗原检测技术。Hayder利用免疫荧光技术研究了感染BPV的胎牛体内抗体的增长规律[Hayder HA，Storz J，Young S.Antigenicity of bovine parvovirus in fetal infections[J].American Journal of Veterinary Research，1983，44(4).]。Mengeling和Paul利用免疫荧光技术从人的血清中检测到与BPV有关的抗体反应，表明BPV与某种感染人的病毒具有相同的抗原成分[Mengeling W L，Paul P S，Bunn T O，et al.Antigenic relationshipsamong autonomous parvoviruses[J].Journal of General Virology，1986，67：2839-2844.]。免疫荧光检测具有敏感性高、检测速度快、检出率高的特点，但对操作手法具有较高的要求。PCR方法是一种快速、简便的诊断方法，Bae等利用多重PCR，建立了能同时对牛细小病毒(BPV)、鼠细小病毒(MVM)、牛疱疹病毒(BHV)进行检测的方法，采用该方法可有效的检出BPV[Jung Eun Bae，In Seop Kim.Multiplex PCR for rapid detection of minutevirus of mice,bovine parvovirus，and bovine herpesvirus during the manufactureof cell culture-derived biopharmaceuticals[J].Biotechnology and BioprocessEngineering，2010，15(6).]。ELISA是以免疫酶技术为基础开发的一种新型检测方法，测定的对象既可以是抗体也可以是抗原。李木子建立了检测BPV的双抗体夹心ELISA方法，该方法对临床病料的最低检测量达到了3.125×10^2.8TCID₅₀/mL，说明该方法灵敏度较高[李木子.牛细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立[D].东北农业大学，2018]。并且以上方法均需要在实验室中进行操作，需要熟练的技术人员，还需要特殊的仪器和设备判断检测结果，均不适用于现地检测。

免疫层析技术(ICA)是一类快速检测技术的总称，该类技术利用纳米级标记物作为固相载体，将蛋白等物质标记在其表面，结合免疫学中抗原抗体相结合的原理和分子生物学中的色谱原理，对目标物质的含量进行检测。根据标记物的不同将免疫层析分为不同的种类，胶体金是最早应用于免疫层析中的标记物，也是最常见和传统的标记物，胶体金免疫层析试纸条技术属于免疫层析技术中的横向流动免疫层析，是目前兽医临床诊断中应用较多的检测方法，与其他的检测方法相比，该技术特别适用于基层现场检测，且具有检测结果易于判断、特异性高、速度快等众多优点。因此近年来胶体金试纸条技术发展迅速，在环境监测和食品安全检测等方面也有大量的创新和应用。但是其灵敏度低的缺点制约了免疫层析技术在兽医临床诊断中的进一步应用，如何提高免疫层析检测方法的灵敏度已成为目前的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于通过制备BPV多克隆抗体和单克隆抗体，利用酶信号放大系统，建立一种灵敏度更高的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，为BPV的快速诊断提供一种快速、敏感、特异的现地检测方法，为控制BPV感染的流行提供一种有效的技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明基于酶放大检测信号体系，建立了检测BPV的信号增强型胶体金免疫层析试纸条。本发明以BPV为免疫原，免疫家兔制备多克隆抗体，作为捕获抗体，包被硝酸纤维素膜(NC膜)作为检测线(T线)。同样以BPV为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取免疫后脾细胞，与骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞融合，通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选融合后的杂交瘤细胞，筛选出6株(BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1)分泌抗BPV单克隆抗体的杂交瘤细胞。对6种单克隆抗体进行间接ELISA和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定，结果表明其特异性良好。为筛选出最适合建立胶体金试纸条方法的杂交瘤细胞株，利用双抗体夹心ELISA法检测6种单克隆抗体效价，其中BPV-8C10单克隆抗体效价最高，亲和性最好，故选用该株杂交瘤细胞制备腹水并纯化，将其作为试纸条的检测抗体。同时制备胶体金颗粒，并对其进行质量鉴定，将制备的胶体金颗粒常温保存2个月后无变质情况，电镜观察其形状呈圆形或椭圆形，直径均一，分散性好，纯净度良好。制备金标抗体与酶的缀合物时，首先用辣根过氧化物酶(HRP)标记检测抗体，再将检测抗体标记胶体金颗粒，并优化标记pH值和抗体标记量。结果显示，稳定1mL胶体金所需单抗蛋白量为50.78μg/mL，最适标记pH值为8.5。利用斑点免疫金染色法鉴定金标抗体与酶的缀合物和BPV多抗，结果可见明显红色斑点，表明质量合格。

组装试纸条前，对胶体金垫处理液测试结果显示，A组处理液(0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1w/v％BSA)使金标抗体释放和吸收效果最好。对样品垫处理液的测试结果显示，A组(0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA)的效果最好，检测线条带最亮。对抗体包被液的测试结果显示，0.01mol/L PB溶液组效果最好，质控线和检测线无中空现象，颜色鲜艳，条带清晰。对NC膜封闭液的测试结果显示，3w/v％BSA效果最好，背景颜色最浅，层析时间最短。经测试，包被质控线(C线)的山羊抗小鼠IgG浓度为1.0mg/mL，包被检测线的BPV多抗浓度为5.46mg/mL。组装信号增强型胶体金试纸条后，敏感性检测结果表明，该试纸条对BPV的最小检出量约为10²个TCID₅₀，与传统试纸条相比，检测灵敏度提高了10倍。特异性检测结果显示，该试纸条与BRV、BVDV和BRSV均无交叉反应，具有良好的特异性。重复性检测结果显示，批间和批内检测变异系数均小于10％，表明具有良好的重复性。最后，对220份临床样品的检测，该试纸条检测出11份阳性样品、209份阴性样品。PCR检测出13份阳性样品、207份阴性样品，与PCR法相比符合率为99.09％。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述的胶体金垫上吸附有胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗牛细小病毒多克隆抗体包被的检测线，以及山羊抗鼠IgG包被的质控线，样品垫提供了待测样品加入的位置；

其中，所述的抗牛细小病毒单克隆抗体由分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为8C10，分类命名为分泌牛细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCCNO.23880，保藏时间为2021年11月25日。

其中，优选的，胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体是通过先用辣根过氧化物酶标记抗牛细小病毒单克隆抗体，然后将二者的偶联物标记胶体金后得到的。

其中，优选的，胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体是通过以下方法制备得到的：

调节胶体金溶液的pH值为8.5，将纯化后的辣根过氧化物酶标记的抗牛细小病毒单克隆抗体稀释后调节pH为8.5，得到辣根过氧化物酶标记的抗体溶液；向胶体金溶液中，慢慢滴加辣根过氧化物酶标记的抗体溶液，边加边混匀，静置15min；加入Tris-HC1缓冲液配制的1w/v％BSA溶液，继续搅拌5min，静置15min，1500r/min 4℃离心20min，取上清，再12000r/min 4℃离心30min，得到可流动的棕红色液体，将得到的液体用金标抗体复溶液定容至原体积的10％，得到胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体溶液，4℃无菌避光保存。

其中，优选的，每1mL的胶体金溶液中加入100μL浓度为50.78μg/mL的抗体溶液。

其中，优选的，所述的金标抗体复溶液为含有1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/L pH＝7.2的PBS溶液，4℃保存备用。

其中，优选的，组装试纸条前，使用胶体金垫处理液完全浸湿胶体金垫，在室温中晾干，完全干燥后，喷涂金标抗体，所述的胶体金垫处理液为含有0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1w/v％BSA的0.1mol/L的PB溶液。

其中，优选的，组装试纸条前，将样品垫浸泡于样品垫处理液中，在室温中晾干，待样品垫完全干燥后，分别包被检测线和质控线，组装试纸条，所述的样品垫处理液为含有0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA的0.1mol/L的PB溶液。

其中，优选的，抗体包被液使用0.01mol/L PB溶液，硝酸纤维素膜封闭液使用3w/v％BSA。

其中，优选的，包被质控线的山羊抗小鼠IgG浓度为1.0mg/mL，包被检测线的兔抗牛细小病毒多克隆抗体浓度为5.46mg/mL。

进一步的，本发明还提出了所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条在制备检测牛细小病毒的试剂中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明中，在胶体金表面偶联标记了辣根过氧化物酶的抗体，利用TMB作为显色底物，通过酶信号放大体系达到放大检测信号的效果。信号增强型试纸条放大检测信号的关键是将辣根过氧化氢酶直接标记在检测抗体上，再将抗体与酶的复合物标记胶体金颗粒，免疫层析的过程结束后，用去离子水冲洗后，滴加TMB作为显色底物，产生不溶性的蓝色固体，蓝色固体会沉积在检测线和质控线包被的抗体上，使检测线的颜色加深，呈现明显的视觉效果。Cho[Cho I H，Bhunia A，Irudayaraj J.Rapid pathogen detection bylateral-flow immunochromatographic assay with gold nanoparticle-assistedenzyme signal amplification[J].International Journal of Food Microbiology，2015，206：60-66.]等人的方法灵敏度有很大的提升，由于其利用生物素与链霉亲和素的研制过程比较复杂，且所需试剂价格高。本发明尝试将检测抗体和酶同时标记胶体金颗粒。但由于两个大分子蛋白产生竞争，影响了标记效果。故在标记过程中，没有采用将酶直接标记纳米金颗粒，而是尝试用酶直接标记检测抗体，然后将二者的偶联物标记胶体金，达到放大检测信号的效果。与传统胶体金试纸条相比，信号增强型胶体金试纸条检测灵敏度提高了10倍，最低检出量为10²个TCID₅₀，有效放大了检测信号。

2、胶体金试纸条适用于现地检测，其体积小，携带方便，检测时间短，几分钟内即可观察结果，且肉眼判定，不需要专业技术人员。其检测成本低，不需要昂贵的仪器设备，并且可以一次性检测大量样本。经测试，该试纸条操作简单、快速，检测时间只需要5-10min，检测样品量仅需200μL。

附图说明

图1为免疫层析试纸条结构图；

图2为纯化后多抗SDS-PAGE质量鉴定；注：M：蛋白Marker；1:未纯化的多抗；2：纯化后多抗；

图3为兔抗BPV多抗的间接免疫荧光试验结果；注：A：兔抗BPV多克隆抗体；B：阴性对照；

图4为间接ELISA筛选杂交瘤细胞结果；

图5为单克隆抗体亚型的鉴定；

图6为BPV单抗间接免疫荧光鉴定结果；注：A：BPV-8C10；B：BPV-10G10；C：BPV-2H2；D：BPV-3F11；E：BPV-7G11；F：BPV-5G1；G：阳性对照；H：阴性对照；

图7为双抗体夹心ELISA鉴定单抗效价；

图8为SDS-PAGE鉴定单克隆抗体结果；注：M：蛋白Marker；1：未纯化BPV-8C10腹水；2：BPV单克隆抗体；

图9为间接免疫荧光鉴定BPV单克隆抗体；注：A：BPV单克隆抗体；B：阳性对照；C：阴性对照；

图10为双抗体夹心ELISA鉴定BPV单克隆抗效价结果；

图11为胶体金颗粒稳定性；注：A：20nm胶体金颗粒；B：制备2个月后20nm胶体金颗粒；

图12为金颗粒电镜检测结果；

图13为金标抗体最适标记量结果；

图14为胶体金标记抗体最适pH的测定；

图15为金标抗体和多抗质量鉴定结果；注：A：金标抗体；B：BPV多抗；

图16为直接ELISA鉴定HRP标记的BPV单克隆抗体结果；

图17为酶标抗体与胶体金颗粒缀合物质量鉴定结果；注：A：滴加TMB显色液前；B：滴加TMB显色液后；

图18为胶体金垫处理液选择结果；注：A：配方A；B：配方B；C：配方C；D：配方D；

图19为样品垫处理液选择结果；注：A：配方A；B：配方B；C：配方C；D：配方D；

图20为包被液选择结果；

图21为封闭液的选择结果；注：A：3％BSA；B：5％BSA；C：3％脱脂乳；D：5％脱脂乳；

图22为质控线抗体浓度的确定；

图23为检测线抗体浓度的确定；

图24为传统试纸条灵敏度；注：A：10⁵TCID₅₀；B：10⁴TCID₅₀；C：10³TCID₅₀；D：10²TCID₅₀E：10TCID₅₀；

图25为信号增强型试纸条灵敏度；注：A：10⁵TCID₅₀；B：10⁴TCID₅₀；C：10³TCID₅₀；D：10²TCID₅₀ E：10TCID₅₀；

图26为特异性试验结果；注：A：牛细小病毒；B：牛轮状病毒；C：牛病毒性腹泻病毒；D：牛合胞体病毒；E：BT细胞上清；F:PB溶液；

图27为信号增强型试纸条重复性试验结果；注：A：牛细小病毒；B：牛轮状病毒；C：牛病毒性腹泻病毒；D：牛合胞体病毒；E：BT细胞上清；F:PB溶液；

图28为PCR鉴定阳性样品结果；注：M：DNA分子质量标准；1：阳性对照；2-14阳性样品检测结果；15：阴性对照；

图29为信号增强型试纸条阳性样品检测结果；注：N：阴性对照；1-11：阳性样品检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条的制备

1试验材料

1.1实验动物

本试验依据《实验动物管理条例》和《东北农业大学实验动物伦理委员会章程》的要求进行研究。4～6周龄BALB/c小鼠，健康雌性家兔(体重2-3公斤)均购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.2细胞和病毒

骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)、牛鼻甲骨细胞(BT细胞)由本实验室保存。牛细小病毒(BPV)购自美国细胞菌种库(ATCCVR-767)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)均由本实验室保存。

1.3试剂和材料

二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶购自Biotopped公司；Biotron血清购自经纬科技有限公司；TMB显色液购自北京博奥拓达股份有限公司；培养基DMEM购自源培生物科技有限公司；基础1640培养基购自Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚乙二醇6000、HAT、HT购自Sigma公司；FITC标记山羊抗鼠IgG、HRP标记山羊抗鼠/兔IgG抗体购自中杉金桥公司；单克隆抗体亚型试剂盒购自于Sigma公司；Protein G单克隆抗体纯化树脂柱购自GE公司；液体石蜡购自天津北晨方公司；辣根过氧化物酶抗体偶联试剂盒购自LinkKine公司；正其他常规试剂均为国产分析纯级产品。免疫层析材料(NC膜、吸水垫、样品垫、PVC板、快速检测塑料卡等)均购自于上海杰一公司。

2实验方法

2.1兔抗BPV多克隆抗体的制备

2.1.1动物免疫

将6月龄雌性家兔进行3次免疫，每次间隔14天，免疫方法均为皮下多点注射。免疫的剂量为，第1次，1mg BPV与弗氏完全佐剂1∶1体积乳化；第2次，1mg BPV与弗氏不完全佐剂1∶1体积乳化；第3次与第2次相同。第3次免疫后5-7天，间接ELISA方法测家兔血清抗体效价，达到1:10000心脏采血，收集血清。

2.1.2纯化BPV多抗

使用Protein G纯化柱纯化BPV多抗血清，具体操作如下：将收集的血清与结合缓冲液按1:3比例混合，4℃平衡8h；将0.45μm滤器组装在抗体纯化柱上端，用注射器缓慢注入10mL预冷的平衡缓冲液，流速约为1mL/min；将平衡好的腹水缓慢注入纯化柱中，室温静置10min，流速为1mL/min，收集过柱液体，重复上柱两次；用10mL结合缓冲液洗涤纯化柱；加入3mL洗脱液，洗脱抗体纯化柱中的IgG抗体，流速为1mL/min；将洗脱后的液体装入透析袋，置于PBS溶液中48h。透析完成后即获得纯化后的BPV多克隆抗体，测定抗体的浓度，分装保存于-40℃冰箱备用。

2.1.3BPV多抗的SDS-PAGE鉴定

(1)分别取纯化前与纯化后的多抗于5×SDS缓冲液混合，煮沸15min。

(2)清洗组装胶架，灌入水验漏，配制并加入分离胶5mL，凝固40min，待分离胶凝固后配制并加入积层胶5mL，并插入梳子，凝固30min。

(3)取下梳子，拆下胶条，将胶浸入电泳缓冲液中，在孔中加入(1)中处理好的样品和Marker，连接电源开始电泳。

(4)电泳完成后拆下胶板，切掉积层胶，分离胶用考马斯亮兰染色液染色约15min，脱色液脱色过夜。

(5)使用凝胶成像系统观察条带，并拍照存图。

2.1.4 BPV多抗的间接免疫荧光(IFA)鉴定

(1)将BPV接种于长满单层BT细胞的96孔板中，当开始出现CPE时，弃去细胞维持液，PBS缓冲溶液洗3次，每次5min；

(2)每孔加入0.1mL细胞固定剂，室温静置10min,PBS缓冲溶液洗3次，每次5min；

(3)每孔加入0.1mL细胞穿孔液，室温穿孔10min，PBS缓冲溶液洗三次，每次5min；

(4)每孔加入0.1mL 0.3％BSA，37℃封闭30min，PBS缓冲溶液洗三次，每次5min；

(5)每孔加入0.1mL的BPV多抗(1:2000稀释)，37℃孵育1h。设置阴性对照，每孔加入0.1mL的兔阴性血清(1:2000稀释)，37℃孵育1h。PBS缓冲溶液洗三次，每次5min；

(6)加入用3％BSA 1:200稀释的FITC山羊抗鼠IgG，100μL/孔，室温避光30min，PBS洗3次，5min/次，用荧光显微镜观察并拍照。

2.2杂交瘤细胞株的筛选与建立

2.2.1动物免疫

将6周龄雌性BALB/c小鼠进行3次免疫，每次间隔14天，免疫方法均为腹腔注射。免疫的剂量为，第1次，经紫外分光光度计测定，取100ng BPV与弗氏完全佐剂1∶1体积乳化；第2次，等量BPV与弗氏不完全佐剂1∶1体积乳化；第3次与第2次相同。第3次免疫后7天，经小鼠尾静脉采血(断尾)，采用间接ELISA检测血清抗体效价，对效价大于1:12800的小鼠加强免疫，每只腹腔注射100μL纯化的病毒，并于3d后，无菌取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合。

2.2.2阳性血清与阴性血清的制备

以饲养的健康BALB/c小鼠为阴性对照，在细胞融合前，分别采集病毒免疫组小鼠和正常小鼠血液制备血清，分别作为阳性血清和阴性血清，-40℃保存备用。

2.2.3 SP2/0细胞的准备

融合前8天复苏SP2/0细胞，用完全1640培养，当细胞大小均匀，状态良好时进行细胞融合。为确保细胞处于对数生长期，在融合前12h左右换液。

2.2.4饲养层细胞的准备

将BALB/c小鼠麻醉处死，于75％酒精中浸泡消毒10min。将5mL的预冷1640培养液注入腹腔，用酒精棉按压小鼠腹部。在腹部的一侧轻轻刺入注射器，边转动边将液体吸出。并将吸出的液体加入45mL培养液中混匀，再将液体转移至细胞瓶中，移入培养箱中培养，隔天观察无污染即可使用。

2.2.5脾细胞的制备

(1)将免疫后阳性血清效价符合要求的小鼠置于75％酒精中5min；

(2)在超净工作台内，小心取出脾脏，移至基础1640培养液中；

(3)剥离脾脏上的结缔组织，用PBS缓冲溶液洗3～5次，将脾脏移至装有10mL基础1640培养液的平皿中；

(4)在脾脏一端用注射器针头刺若干小孔，然后用5mL注射器吸取基础1640培养液从脾脏的另一端注入，冲出脾细胞，反复多次至脾脏发白即可；

(5)将收集的脾细胞移至离心管内，1000r/min离心10min，弃去上清，用10mL基础1640培养液洗涤细胞1次，然后用2mL培养液重悬并进行细胞计数。

2.2.6细胞融合

(1)收取状态良好的SP2/0细胞，并计数；

(2)将制备的脾细胞与SP2/0细胞按照7:1的比例混合，补加1640培养液至10mL，混匀，1000r/min离心10min，弃去上清；

(3)将细胞置于37℃水浴中，加入1mL 37℃预热的PEG6000，1min内匀速加完，边轻摇边加，然后静置90s；

(4)5min内加入37℃预热的基础1640培养基：第1min加1mL、第2～3min加4mL、第4～5min加5mL，500r/min离心10min；

(5)弃上清，用10mL基础1640轻轻重悬细胞，500r/min离心10min，重复两次；

(6)用37℃预热的HAT培养基轻轻重悬细胞沉淀，混匀，然后转至制备的饲养层细胞中，100μL/孔，置于培养箱培养。

2.2.7阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆

细胞融合后观察孔板，当细胞长满孔的1/3时，用HT培养液全换液。48h后参考赵飞鹏[赵飞鹏，李木子，于晓丽，等.牛细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立[J].中国预防兽医学报，2020，42(08)：791-796.]建立的ELISA方法，取细胞上清进行检测。包被抗原BPV的量为每孔200ng，包被条件为37℃，2h。封闭液为5％脱脂乳，封闭条件为37℃，2h。一抗为杂交瘤细胞上清，孵育条件为37℃，2h。二抗为山羊抗鼠IgG-HRP(1：10000)，孵育条件为37℃，30min。洗涤液为PBST缓冲液，洗涤方法为每孔0.2mL洗涤液，每次5min。

根据P(检测样本的值)/N(阴性对照值)大于或者等于2.1样本为阳性的原则判定检测结果，筛选阳性杂交瘤细胞株。亚克隆阳性杂交瘤细胞，继续培养。重复克隆3次后，检测整板细胞孔上清效价，若阳性率为100％，则成功获得稳定的杂交瘤细胞株，并对获得的细胞株进行扩大培养。

2.2.8杂交瘤细胞的冻存与复苏

细胞冻存：将状态良好的杂交瘤细胞从细胞瓶中回收，移至离心管1000r/min离心10min，弃上清，加入现配的细胞冻存液重悬，分装于冻存管中，封口，标记细胞名称和日期后移至冻存盒，存放于-80℃冰箱2h，最后沉入液氮罐中保存。

细胞复苏：从液氮中取出冻存的细胞，迅速放入37℃水浴中至融化，在超净工作台内将细胞移至离心管，缓慢轻柔地用基础1640重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清，用完全1640培养液重悬细胞，移入细胞瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.3 BPV单克隆抗体特性的鉴定

2.3.1单抗亚类的鉴定

收集杂交瘤细胞上清液作为一抗，用商品化的单抗亚类鉴定试剂盒测定单克隆抗体的亚型，按照说明书所属步骤进行操作，包被抗原蛋白的量为每孔50ng，包被条件为37℃，1h。封闭液为5％脱脂乳，封闭条件为37℃，1h。一抗为杂交瘤细胞上清，孵育条件为37℃，1h。二抗为山羊抗鼠IgG-HRP(1：10000)，孵育条件为37℃，30min。洗涤液为PBST缓冲液，洗涤方法为每孔0.2mL洗涤液，每次5min。用酶标仪OD_450nm读取数值，根据P(检测样本的值)/N(阴性对照值)大于或者等于2.1样本为阳性的原则判定检测结果。

2.3.2单抗特异性的鉴定

分别将BPV、BRV、BVDV和BRSV等病毒的细胞培养物包被到酶标板中，收集杂交瘤细胞上清液作为一抗，通过间接ELISA方法进行检测，方法同2.1.7，根据P(检测样本的值)/N(阴性对照值)大于或者等于2.1样本为阳性的原则判定检测结果。

2.3.3单抗的间接免疫荧光的鉴定

通过IFA检测复苏后6株杂交瘤细胞(BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1)上清液，方法同2.1.4。

2.3.4筛选合适的杂交瘤细胞株

收集杂交瘤细胞上清液，分别进行1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400倍比稀释，参考赵飞鹏(同上)建立的双抗体夹心ELISA方法筛选6株杂交瘤细胞(BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1)上清液中抗体效价最高的一株作为建立试纸条的细胞株，其中多抗稀释浓度1：1600，抗原BPV每孔200ng，单抗为杂交瘤细胞培养液上清，封闭液为5％脱脂乳，封闭时间为2h，洗涤液为PBST缓冲液，洗涤方法为每孔0.2mL洗涤液，每次洗5min。

2.4单克隆抗体腹水的制备及纯化

2.4.1腹水的制备

(1)致敏：取无菌液体石蜡0.5mL，注入10周龄的BALB/c小鼠腹腔中。

(2)复苏杂交瘤细胞BPV-8C10，弃去培养液，用基础1640培养液吹散杂交瘤细胞，计数，取10⁵个细胞1000r/min离心7min，弃上清，用0.5mL基础1640培养液重悬细胞，无菌注射入小鼠腹腔中。

(3)待小鼠腹围明显增大后(约7-10天)无菌收集腹水，以1000r/min、4℃梯度离心15min收集上清，存于-40℃。

2.4.2腹水的纯化

参照抗体Protein G纯化层析柱的使用说明书纯化腹水，方法同2.1.2。

2.4.3 BPV单抗的SDS-PAGE鉴定

对纯化前后的腹水进行SDS-PAGE鉴定，方法同2.1.3。

2.4.4 BPV单抗体的IFA鉴定

对纯化后的单克隆抗体进行IFA鉴定，其中二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG,方法同2.1.4。

2.4.5双抗体夹心ELISA法测BPV单抗效价

根据胶体金试纸条的反应原理，对纯化后的单克隆抗体分别进行10倍比梯度稀释(10^-1至10^-10)，通过双抗体夹心ELISA测效价。

2.5胶体金的制备及鉴定

2.5.1胶体金颗粒的制备

胶体金颗粒制备主要试剂配方：

(1)柠檬酸三钠溶液：1g柠檬酸三钠溶于100mL超纯水，4℃保存备用。

(2)氯金酸溶液：1g氯金酸溶于100mL超纯水，4℃避光保存。

(3)金标抗体复溶液：1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/LpH＝7.2的PBS溶液，4℃保存备用。

(4)样品处理液：2.0w/v％NaCl、1.0v/v％TritonX-100、0.3w/v％EDTA的0.01mol/L pH＝7.2的PB溶液，现用现配。

制备胶体金颗粒前，准备清洁的玻璃器皿。由于不同直径的胶体金颗粒在制备是需要加入不同体积的柠檬酸三钠溶液，本研究尝试制备20nm的胶体金颗粒，加入2mL的1％柠檬酸三钠溶液，制备胶体金的方法如下：向500mL锥形瓶中加入100mL去离子水，加热至沸腾，倒掉沸水，此步骤用于清洁锥形瓶。再次向此锥形瓶中加入100mL超纯水，并取出1mL水，加入1mL 1％HAuCl₄，加热至沸腾。然后加入提前配置好的1％柠檬酸三钠溶液，当溶液颜色保持不变时，再持续加热15min，将制备好的胶体金溶液分装至干净的玻璃容器中，等待冷却后定容至100mL，置于4℃避光保存。

2.5.2胶体金颗粒的质量鉴定

将制备好的胶体金颗粒4℃避光保存2个月后，肉眼观察胶体金溶液的颜色，澄清度，有无杂质和沉淀等，透射电镜观察胶体金颗粒质量。

2.6信号增强型胶体金试纸条的建立

2.6.1待标记抗体的准备

将抗体浓度稀释到低于1mg/mL，以4℃5000r/min离心100min，取上清，去除大分子杂质，避免影响抗体的标记。

2.6.2抗体标记量的优化

如表1所示，按以下步骤在编号为1-8号的EP管中加入相应体积的液体，首先是稀释后的抗体100μL，之后是加入胶体金溶液1000μL，最后加入NaCl溶液，混匀后静置2h。第1管和第8管为对照组，观察结果。液体颜色保持红色不变的管中抗体浓度最低的一管，抗体浓度为最低稳定量，最佳标记蛋白浓度为最低稳定量的基础上再加30％。

表1抗体标记量优化

2.6.3胶体金标记抗体pH的优化

用0.2mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液pH值到7-10.5之间每隔0.5一个梯度，用精密pH试纸测试，第8管为对照组，在编号为1-8号的EP管中加入相应体积的液体，首先是稀释后的抗体100μL，之后是加入胶体金溶液1000μL，最后加入NaCl溶液100μL，混匀后静置2h。液体颜色仍然保持红色，且pH值最低的管为胶体金标记抗体最适pH值。

2.6.4金标抗体的制备

将经过质量鉴定后合格的自制的胶体金颗粒溶液，调节到优化后最适pH值。取出纯化后的BPV单克隆抗体稀释至最适浓度，调节pH到最适值。向胶体金溶液中，慢慢滴加BPV单克隆抗体，边加边混匀，静置15min；加入Tris-HC1缓冲液配制的1％BSA溶液，继续搅拌5min，静置15min，1500r/min 4℃离心20min，取上清，再12000r/min 4℃离心30min，得到可流动的棕红色液体，将得到的液体用金标抗体复溶液定容至原体积的10％，得到金标抗体溶液，4℃无菌避光保存。

2.6.5金标抗体的质量鉴定

采用一种简单的免疫层析技术，斑点免疫金染色法，对金标抗体的质量进行鉴定，具体操作如下：A组：用移液器在NC膜上加3μL山羊抗鼠IgG，在37℃干燥箱中完全干燥，37℃孵育箱中5％脱脂乳封闭0.5h，与制备好的10％金标抗体稀释液孵育10min，PBST缓冲液洗三次，每次5min，观察显色情况。B组：与A组不同之处是，在NC膜上点加3μL BPV多抗，NC膜最后与金标抗体和BPV细胞培养物1:1混合溶液孵育10min。观察NC膜显色情况，若A组出现红色斑点说明金标抗体质量合格，若B组出现红色斑点说明BPV多抗质量合格，若质量均合格则可用于制备胶体金试纸条。

2.6.6酶标抗体的制备与鉴定

将BPV单克隆抗体稀释至1mg/mL后按照抗体偶联辣根过氧化物酶(HRP)试剂盒说明书进行操作。采用ELISA鉴定抗体与HRP偶联的效果。根据P(检测样本的值)/N(阴性对照值)大于或者等于2.1样本为阳性的原则判定检测结果。

2.6.7胶体金标记酶标抗体的制备

制备酶标抗体与胶体金颗粒缀合物时将2.6.4中的BPV单克隆抗体更换为的2.6.6中制备酶标BPV单克隆抗体。其余方法同2.6.4。

酶标抗体与胶体金颗粒缀合物的鉴定方法同2.6.5，检测完成后滴加TMB显色液初步观察试纸条显色情况。

2.6.8胶体金垫处理液的选择

选用4种胶体金垫处理液A、B、C、D(配方见表2)，将胶体金垫分别在4种胶体金垫处理液中完全浸湿，在室温中晾干，完全干燥后，喷涂金标抗体，滴加样品处理液，用吸水垫吸出胶体金垫中的金标抗体，将各组释放效果拍照，并进行对比，选择释放效果最好的配方。

表2胶体金垫处理液配方

2.6.9样品垫处理液的选择

选用4种样品垫处理液A、B、C、D(配方见表3)，初步裁剪购买的样品垫，将样品垫分别浸泡于4种处理液中，在室温中晾干，待样品垫完全干燥后，选择最大浓度的抗体分别包被检测线和质控线，组装试纸条，滴加阳性样品，观察条带的显色情况，选择显色情况最好的一组配方处理样品垫。

表3样品垫处理液配方

2.6.10抗体包被液的选择

选择3种常用于制备试纸条的包被液进行测试，分别为PBS缓冲溶液、0.01mol/LPB溶液、pH＝6.8的Tris-HCl溶液。NC膜分别用以上3种溶液包被抗体，划线后37℃烘干。组装试纸条，滴加阳性样品，选择最大浓度的抗体分别包被检测线和质控线，组装试纸条，滴加阳性样品，观察条带的显色情况，选显色情况最好的一组包被液，包被试纸条的检测线和质控线。

2.6.11 NC膜封闭液的选择

将抗体用合适的包被液包被在NC膜上，用0.01mol/L PB溶液配制4种封闭液(3％w/v BSA、5％w/v BSA、3％w/v脱脂乳、5％w/v脱脂乳)，封闭条件为，将NC膜完全浸于液体中，37℃，孵育1h，封闭包被好抗体的NC膜后用PBS缓冲液轻轻冲洗NC膜3次，室温晾干，选择最大浓度的抗体分别包被检测线和质控线，组装试纸条，滴加阳性样品，观察条带的显色情况和过程，选显色情况最好、背景颜色最浅、流动最顺畅的一组作为封闭液制备试纸条。

2.6.12检测线与质控线抗体浓度的选择

检测线上包被BPV兔多抗，将其稀释为10.52mg/mL、5.46mg/mL、2.73mg/mL、1.37mg/mL 4个稀释度，分别包被于检测线组装试纸条，滴加阳性样品，观察条带的显色情况。质控线上为山羊抗鼠IgG，将其浓度稀释为2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL 4个稀释度，分别包被于质控线组装试纸条，滴加阳性样品，观察条带的显色情况。选显色情况最好的一组作为抗体的包被浓度。

2.7信号增强型试纸条性能测试

2.7.1试纸条的组装

如图1所示，胶体金免疫层析试纸条由以下部分构成：PVC板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫。将各部分按照如下规格进行裁剪长度均为3cm，各部分宽度分别为，NC膜，2.5cm、胶体金垫：1.2cm、样品垫：1.4cm、吸水垫：1.6cm。首先在处理液中处理好的各部分和包被了检测线和质控线的NC膜，分别按上述规格裁减好，并将各部分按照图中的顺序粘贴在PVC底板上，再用切条机将拼装好的试纸条切割为2.95mm宽的试纸条，组装在塑料卡中。

2.7.2试纸条检测的操作方法结果判定

使用该试纸条进行测试时，首先将样品滴加在样品孔内，层析过程完成后，用200μL去离子水冲洗试纸条表面，再滴加四甲基联苯胺(TMB显色液)，观察试纸条显色情况。判定方法：质控线与检测线均出现条带，判定结果为阳性；只有质控线出现条带，判定结果为阴性；其他情况均为无效。

2.7.3灵敏度试验

将滴度为10⁵个TCID₅₀的BPV细胞毒做10、100、1000、10000倍比稀释，并用传统胶体金试纸条与信号增强型试纸条两种试纸条分别进行检测，测出试纸条的最低检出限度，即为试纸条的灵敏度。

2.7.4特异性试验

取BPV、BRV、BVDV、BRSV的细胞毒，用组装好的信号增强型试纸条进行测试，滴加PB溶液和BT细胞上清作为阴性对照，观察层析后出现的条带。

2.7.5重复性试验

对50组不同批的信号增强型试纸条进行重复性测试，分别滴加BPV、BRV、BVDV、BRSV的细胞毒和BT细胞上清、PB溶液样品进行检测，计各组的准确率(x)，并按照下方公式计算批间变异系数。对50组同一批次试纸条进行重复性测试，分别滴加各种细胞毒和BT细胞上清、PB溶液样品进行检测，计各组的准确率(x)，并按照下方公式计算批内变异系数。

变异系数的计算公式为：变异系数C〃V＝(标准偏差S/平均值Mean)×100％。

2.7.6临床样品的检测

本试验检测的220份粪便病料来源于黑龙江、吉林、辽宁三个省的不同的牛场。将粪便样品溶解于1mL的无菌PBS溶液中，1000r/min离心10min后，提取DNA，用PCR方法检测，上游引物序列为：5'-GCTGGCACTGCGGAGGT-3'，下游引物序列为5'-CTCCTCTATTTCCTCGGCTCT-3'目的片段长度为206bp。将粪便样品溶解于0.5mL的无菌PBS溶液中，1000r/min离心10min后，取上清用信号增强型胶体金试纸条对样品进行检测，计算符合率。

3结果

3.1兔抗BPV多克隆抗体鉴定结果

3.1.1 BPV多抗的SDS-PAGE鉴定结果

将BPV多抗血清纯化后，经SDS-PAGE鉴定，鉴定结果如图2，多抗纯化后显示明显的轻链和重链，且无其它杂蛋白带，微量紫外分光光度计测定浓度为10.52mg/mL。

3.1.2 BPV多抗的间接免疫荧光鉴定结果

将BPV接种BT细胞后，通过IFA鉴定纯化后的BPV多抗，兔阴性血清为阴性对照，结果显示，BPV多抗组(A组)可检测到较强的特绿色荧光，阴性对照无荧光(图3)。

3.2杂交瘤细胞株的筛选与建立结果

筛选阳性杂交瘤细胞，进行4次亚克隆后，采用间接ELISA法鉴定获得的6株分泌抗BPV特异性抗体的杂交瘤细胞(BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1)，结果如图4所示。

3.3 BPV单克隆抗体特性鉴定结果

3.3.1单抗亚类的鉴定结果

利用商品化单抗亚型试剂盒检测6株杂交瘤细胞(BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1)上清液，确定单克隆抗体的亚型。结果如图5，BPV-8C10为IgG2b亚型，BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1均为IgG1亚型。

3.3.2单抗特异性的鉴定结果

以BPV、BRV、BVDV和BRSV为抗原包被酶标板，一抗为6株杂交瘤细胞(BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1)培养上清液，进行间接ELISA检测。结果见表4，6株杂交瘤细胞分泌的BPV单克隆抗体，不与其他病毒发生交叉反应，表明6株杂交瘤细胞分泌的单抗特异性良好。

表4单抗特异性鉴定

3.3.3单抗的间接免疫荧光的鉴定结果

将BPV接种BT细胞后，通过IFA方法鉴定复苏后的6株杂交瘤细胞(BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1)培养上清液。结果如图6，阴性对照无荧光，6株杂交瘤细胞组均可见清晰的绿色荧光，表明6株杂交瘤细胞分泌的单抗均能与BPV特异性结合。

3.3.4单抗效价的测定结果

3个月后复苏杂交瘤细胞，用双抗体夹心ELISA方法检测BPV-8C10、BPV-10G10、BPV-2H2、BPV-3F11、BPV-7G11和BPV-5G1杂交瘤细胞上清液中抗体效价。试验结果显示(图7)，杂交瘤细胞可稳定分泌单克隆抗体，效价最高的是BPV-8C10细胞株，效价为1：800，该株细胞分泌的单抗亲和性最好。

3.4 BPV单克隆抗体腹水的制备与纯化

3.4.1 BPV单抗的SDS-PAGE的鉴定结果

用BPV-8C10杂交瘤细胞制备腹水，通过SDS-PAGE对纯化前后的产物进行鉴定。大小约为50KDa和25KDa的两条带，分别为单抗的重链和轻链，如图8所示。

3.4.2 BPV单抗的IFA鉴定结果

将BPV接种于BT细胞后，通过IFA方法进一步鉴定纯化后的BPV单抗。结果如图9所示，阴性对照无荧光，纯化前后的单克隆抗体组均可见特异性绿色荧光。

3.4.3双抗体夹心ELISA法测BPV单抗效价结果

通过双抗体夹心ELISA方法检测纯化后BPV单抗效价。结果如图10示，BPV单抗的效价为1：10⁵。

3.5胶体金颗粒的质量鉴定结果

对制备好的胶体金颗粒质量进行鉴定，胶体金稳定性好，如图11所示，避光保存2个月后，观察其性状无变化。电镜检测结果显示，制备的胶体金颗粒质量合格，分散度良好，直径约为20nm，纯净度良好(图12)。

3.6信号增强型胶体金试纸条的建立

3.6.1抗体标记量的优化结果

将抗体通过倍比稀释为不同浓度，检测抗体的最低标记量，进而计算出最适标记量，结果显示(图13)，从2-5号管与1号管的颜色几乎相同，但从6号开始到7号管胶体金溶液颜色由粉色逐渐变为蓝紫色。因此，确定抗体最低标记量为39.06μg/mL，再增加30％作为最适稳定量，即最适稳定量为50.78μg/mL。

3.6.2标记pH值的优化结果

胶体金标记抗体最适pH的测定结果如图14所示，4号管的颜色与8号对照管溶液颜色基本一致，其它管的颜色逐渐由粉红色变为紫色。因此确定胶体金标记抗体最适pH为8.5。

3.6.3金标抗体的质量鉴定结果

斑点免疫金染色法鉴定金标抗体，结果如图15所示，A出现明显红色斑点，说明金标抗体质量合格，可与山羊抗鼠IgG-HRP发生反应。B可见明显红色斑点，说明BPV多抗质量合格，可与BPV和金标抗体的结合物进行反应。

3.6.4酶标抗体的ELISA鉴定结果

以BPV作为抗原包被酶标板，通过直接ELISA试验检测HRP标记的BPV单克隆抗体，测定OD_450nm值。结果如图16，HRP标记的BPV单克隆抗体结果为阳性，可以进行酶标抗体与胶体金缀合物的制备。

3.6.5胶体金标记酶标抗体的鉴定结果

山羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上，与酶标抗体与胶体金颗粒缀合物反应10min，出现明显的红色斑点，去离子水冲洗后滴加TMB显色液，结果如图17所示，红色斑点变为紫红色，颜色加深，说明酶标抗体与胶体金颗粒缀合物可用，且视觉效果更明显。

3.6.6胶体金垫处理液的确定

在处理后的胶体金垫上滴加金标抗体，室温晾干后，滴加样品处理液，用吸水垫轻轻吸去胶体金垫中的金标抗体，观察胶体金垫结合金标抗体及释放金标抗体的效果。A组处理液(0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1w/v％BSA)的金标抗体处理液效果最好，释放金标抗体最均匀(图18)。

3.6.7样品垫处理液的确定

滴加阳性样品后，观察试纸条的层析情况和条带显色情况，如图19。配方为(0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5w/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA)的A样品垫处理液效果最好，背景清晰，条带清晰无拖尾现象出现。

3.6.8抗体包被液的确定

对3种包被液进行比较，结果如图20所示(A：0.01PB mol/L溶液；B：PBS溶液；C：pH＝6.8的Tris-HCl溶液)，与PBS溶液和Tris-HCl相比，0.01mol/L PB包被稀释液处理后效果最好，且质控线和检测线无中空现象，颜色鲜艳，条带清晰。

3.6.9封闭液的确定

将4种封闭液(3w/v％BSA、5w/v％BSA、3w/v％脱脂乳、5w/v％脱脂乳)分别进行测试，如图21所示，3w/v％BSA、5w/v％BSA溶液作为封闭液反应背景颜色较浅，且3w/v％BSA组的层析时间为9min，比5w/v％BSA组层析更快。

3.6.10检测线(T线)与质控线(C线)抗体浓度的确定

质控线抗体最佳工作浓度的检测结果如图22所示，山羊抗鼠IgG浓度分别为2.0mg/mL(A)；1.5mg/mL(B)；1.0mg/mL(C)；0.5mg/mL(D)，山羊抗鼠IgG浓度越大，显色条带越清晰，虽然0.5mg/mL也显色，但条带较弱。考虑试纸条需要长时间保存，选择浓度为1.0mg/mL山羊抗鼠IgG包被质控线。

检测线抗体最佳工作浓度的检测结果如图23所示，多抗包被浓度分别为10.52mg/mL(A)、5.46mg/mL(B)、2.73mg/mL(C)和1.37mg/mL(D)。BPV多抗浓度越高，检测线的条带颜色也越清晰，当浓度为1.37mg/mL时，检测线颜色非常浅。当浓度为2.73mg/mL时检测线有条带，但条带颜色较浅，故确定BPV多抗的最佳包被浓度为5.46mg/mL。

3.7信号增强型试纸条的性能测试

3.7.1灵敏度试验结果

分别在两种试纸条加样孔中滴加阳性样品，观察检测结果，结果如下图24、25所示，信号增强型胶体金试纸条显色强度深，更利于进行可视化检测。传统试纸条的检测灵敏度为10³个TCID₅₀，而信号增强型试纸条检测灵敏度为10²个TCID₅₀，与传统胶体金试纸条相比信号增强型胶体金试纸条的灵敏度提高了10倍，达到了放大检测信号的目的。

3.7.2试纸条的特异性试验结果

用组装好的信号增强型试纸条对BPV、BRV、BVDV、BRSV细胞毒进行检测，阴性对照样品为：BT细胞上清、PB溶液，结果如图26所示，BPV组检测线出现清晰条带，其他组检测线无条带，且所有组的质控线均有条带，表明信号增强型胶体金试纸条具有良好的特异性。

3.7.3试纸条的重复性试验结果

将检测胶体金试纸条进行批内和批间重复性试验，用BPV细胞毒作为阳性样品，BRV、BVDV、BRSV的细胞毒和BT细胞上清、PB溶液作为阴性对照。批间检测变异系数为7.4％，批内检测变异系数为5.5％，均小于10％，显示具有良好的重复性，测试结果如表5、图27。

表5纸条的重复性试验

3.7.4临床样品的检测结果

将220份牛粪样提取DNA后，进行PCR检测，如图28所示(2：H-41号；3：H-61号；4：H-36号；5：H-52号；6：H-6号；7：H-5号；8：H-3号；9：H-66号；10：H-50号；11：L-36号；12：J-8号；13：J-6号；14：H-10号；)，检测出13份阳性粪便样品。用试纸条对病料进行检测，共检出阳性样品11份，如图29所示(1：H-10号；2：H-41号；3：H-36号；4：H-52号；5：H-6号；6：H-5号；7：H-66号；8：H-50号；9：L-36号；10：J-8号；11：J-6号)，与PCR方法检测结果的总符合率为99.09％(表6)。

表6试纸条法与PCR法的临床样品检测结果对比

Claims

1.一种检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述的胶体金垫上吸附有胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上具有兔抗牛细小病毒多克隆抗体包被的检测线，以及山羊抗鼠IgG包被的质控线，样品垫提供了待测样品加入的位置；

其中，所述的抗牛细小病毒单克隆抗体由分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为8C10，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)，菌种保藏编号为：CGMCC NO.23880。

2.如权利要求1所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体是通过先用辣根过氧化物酶标记抗牛细小病毒单克隆抗体，然后将二者的偶联物标记胶体金后得到的。

3.如权利要求2所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，胶体金和辣根过氧化物酶共同标记的抗牛细小病毒单克隆抗体是通过以下方法制备得到的：

4.如权利要求3所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，每1mL的胶体金溶液中加入100μL浓度为50.78μg/mL的抗体溶液。

5.如权利要求3所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述的金标抗体复溶液为含有1w/v％BSA、15w/v％蔗糖、0.5v/v％Tween-20的0.01mol/L pH＝7.2的PBS溶液，4℃保存备用。

6.如权利要求1所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，组装试纸条前，使用胶体金垫处理液完全浸湿胶体金垫，在室温中晾干，完全干燥后，喷涂金标抗体，所述的胶体金垫处理液为含有0.1v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.1w/v％PVA、1w/v％BSA的0.1mol/L的PB溶液。

7.如权利要求1所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，组装试纸条前，将样品垫浸泡于样品垫处理液中，在室温中晾干，待样品垫完全干燥后，分别包被检测线和质控线，组装试纸条，所述的样品垫处理液为含有0.05v/v％Tween-20、5w/v％蔗糖、0.5v/v％Triton X-100、0.5w/v％BSA的0.1mol/L的PB溶液。

8.如权利要求1所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，抗体包被液使用0.01mol/L PB溶液，硝酸纤维素膜封闭液使用3w/v％BSA溶液。

9.如权利要求1所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，包被质控线的山羊抗小鼠IgG浓度为1.0mg/mL，包被检测线的兔抗牛细小病毒多克隆抗体浓度为5.46mg/mL。

10.权利要求1-9任一项所述的检测牛细小病毒的信号增强型胶体金免疫层析试纸条在制备检测牛细小病毒的试剂中的用途。