RU2695525C1 - Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида - Google Patents
Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида Download PDFInfo
- Publication number
- RU2695525C1 RU2695525C1 RU2018124577A RU2018124577A RU2695525C1 RU 2695525 C1 RU2695525 C1 RU 2695525C1 RU 2018124577 A RU2018124577 A RU 2018124577A RU 2018124577 A RU2018124577 A RU 2018124577A RU 2695525 C1 RU2695525 C1 RU 2695525C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pseudotuberculosis
- wells
- serotype
- monoclonal antibodies
- side chains
- Prior art date
Links
- 208000025087 Yersinia pseudotuberculosis infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title abstract 2
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 claims abstract description 33
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 abstract description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 abstract description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 abstract 1
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 abstract 1
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 9
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 3
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 2
- 101000878441 Dichelobacter nodosus Type IV major fimbrial protein FimA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010048249 Yersinia infections Diseases 0.000 description 2
- 208000025079 Yersinia infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам обнаружения и идентификации псевдотуберкулезного микроба. Раскрыт способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза I серотипа, включающий сенсибилизацию лунок микропланшета кроличьими поликлональными антителами против Y. pseudotuberculosis, блокирование с помощью бычьего сывороточного альбумина, последовательное внесение исследуемой пробы, специфических моноклональных антител мыши против Y. pseudotuberculosis, конъюгата антимышиных антител с пероксидазой хрена, субстрата О-фенилендиамина и дальнейшее измерение оптической плотности при длине волны 492 нм, где положительным результатом для исследуемых проб является такой, когда оптическая плотность в опытных лунках превышает таковую в лунках с отрицательным контролем не менее чем на 0,15 единиц. При этом в качестве антител для сенсибилизации лунок планшета используют иммуноглобулины из поликлональной антисыворотки к инактивированным формальдегидом клеткам Y pseudotuberculosis I серотипа, выращенным при температуре 10 °С, а в качестве специфических моноклональных антител против Y. pseudotuberculosis используют моноклональные антитела к О-боковым цепям липополисахарида Y. pseudotuberculosis I серотипа. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность и специфичность выявления псевдотуберкулезного микроба I серотипа. 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам обнаружения и идентификации псевдотуберкулезного микроба, в том числе выявления обсемененности бактериями Yersinia pseudotuberculosis (Y. pseudotuberculosis) эпидемиологически значимых объектов.
На территории Российской федерации порядка 93÷98% от числа выделенных штаммов Y. pseudotuberculosis относятся к I сероварианту [Псевдотуберкулез / Г.П. Сомов [и др.]. М.: Медицина, 2001. - 256 с], поэтому актуальным является разработка диагностикума, направленного на выявление возбудителя именно этого серотипа.
Традиционно для диагностики псевдотуберкулеза используется бактериологический метод, который отличается трудоемкостью и длительностью исследования материала. В литературных источниках также имеется информация о различных иммунохимических методах идентификации псевдотуберкулезного микроба.
Так, известен диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный иммуноглобулиновый, основанный на использовании иммуноглобулинов класса G, выделенных из поликлональной псевдотуберкулезной агглютинирующей сыворотки. Диагностикум предназначен для выявления антигенов Y. pseudotuberculosis в сыворотке крови больных. Набор позволяет выявлять клетки Y. pseudotuberculosis в концентрации 800 тыс.м.к./мл, при этом, по данным авторов, отсутствуют перекрестные реакции с антигенами возбудителей дизентерии, сальмонелеза основных групп и кишечного иерсиниоза [Дулатова М.В., Антонов B.C., Головачева С.Н. и др. Опыт применения иммуноглобулинового эритроцитарного препарата для ранней лабораторной диагностики псевдотуберкулеза // Журн. микробиол. - 1992. - №4. - С. 55-57]. Диагностикум не проверялся на наличие перекрестных реакций с антигенами возбудителя чумы, наиболее близкородственного с псевдотуберкулезным микробом. Также при клинических испытаниях доля неспецифических реакций составила 15%. Данный диагностикум не проходил государственной сертификации.
Известен диагностикум латексный иммуноглобулиновый жидкий производства НИИ вакцин и сывороток, г. Санкт-Петербург [Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.Н. и др. Иммуноглобулиновые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов // Журн. микробиол. - 1993. - №6. - С.92-93]. Этот набор является сертифицированным и разрешенным к применению для выявления возбудителя псевдотуберкулеза. Диагностикум основан на применении иммуноглобулинов класса G из поликлональной агглютинирующей сыворотки, полученной к Y. pseudotuberculosis I серотипа. Препарат позволяет выявлять псевдотуберкулезный микроб в копрофильтратах путем реакции агглютинации латекса (РАЛ) на стекле. При этом диагностикуму присущи такие недостатки как невысокая чувствительность и относительно невысокая специфичность, что связано с использованием поливалентной сыворотки, а также высокая стоимость.
Известен также способ идентификации Y. pseudotuberculosis - диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклональный [патент на изобретение RU 2377308. Диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклониальный // Бывалов А.А., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В. МПК С12Р 21/08, G01N 33/554. Заявка №2008120443/13, 22.05.2008. Опубл. 27.12.2009 в бюл. №36]. Данный диагностикум основан на использовании формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных моноклональными антителами (МКАт). МКАт, использованные в этом диагностикуме являются специфичными в отношении липополисахарида, выделенного из клеток Y. pseudotuberculosis серотипа I. Набор предназначен для проведения реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и позволяет выявлять клетки псевдотуберкулезного микроба в концентрации 500 тыс.м.к./мл. При этом отсутствуют перекрестные реакции с клетками Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli в концентрации 100 млн м.к./мл. Большая специфичность анализа достигается за счет применения моноклональных антител. Недостатком диагностикума является относительно невысокая воспроизводимость анализа, определяемая нестандартностью отдельных серий носителя антител - эритроцитов барана.
Также известна иммунохроматографическая моноклональная тест-система для выявления Y. pseudotuberculosis [Н.В. Богачева, Г.Д. Елагин и др. Разработка иммунохроматографической моноклональной тест-системы для выявления Yersinia pseudotuberculosis серогруппы I // Пробл. особо опасных инф. - 2016. - №2. - С. 65-68.]. В диагностикуме использованы нитроцеллюлозные мембраны с нанесенными на них моноклональными антителами, полученными к «холодовому» липополисахариду псевдотуберкулезного микроба. Полученная тест-система показала свою специфичность в отношении псевдотуберкулезного микроба серогруппы I, не выявляя Y. pseudotuberculosis II серогруппы, а также Y. pestis, Y. enterocolitica и Е. coli в концентрации 100 млн. м.к./мл. Чуствительность диагностикума находится в пределах 500 тыс.м.к./мл до 4 млн. м.к./мл. Также тест-система позволяет быстро проводить анализ, время постановки анализа составляет 15 минут. Недостатками тест-системы являются трудоемкость способа изготовления, относительно высокая себестоимость анализа и субъективность оценки результатов при концентрациях микробных клеток в образцах, близких к пороговым значениям.
Ближайшим аналогом (прототипом) заявляемого решения является способ, описанный в работах [Feodorova V.A., Sfmalija J.G., Devdariani Z.L. Heat-stable serogroup-specific proteins of Yersinia pseudotuberculosis // Journal of Medical Microbiology. - 2003. - Vol.52. - P. 1-7; Федорова В.А. и др. Моноклональные антитела для изучения роли антигенов белковой природы в серотипировании бактерий Yersinia pseudotuberculosis // Молекул, генетика. - 2001. - №3. - С. 28-35]. Данная методика, используемая для серотипирования Y. pseudotuberculosis, основана на использовании поликлональных и моноклональных антител к белковым эпитопам возбудителя в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа (ИФА). В процессе выполнения методики дно лунки планшета сенсибилизируют иммуногобулинами, выделенными из поликлональной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов бактериями Y. pseudotuberculosis I-VI сероваров. После стадий отмывки и блокировки лунок 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в них добавлялась суспензия бактериальных клеток в концентрации 1×109 м.к./мл. Лунки отмывались, после чего проводили инкубацию с меченными пероксидазой хрена моноклональными антителами, полученными авторами. После инкубации и отмывки в лунки добавлялся субстрат, содержащий 2,2'-азинобис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты), после инкубации с которым проводили измерение оптической плотности при длине волны 405 нм. Благодаря набору моноклональных антител, взаимодействующих с белковыми эпитопами, специфичными для различных серогрупп псевдотуберкулезного микроба, возможно проведение его серотипирования, а также дифференциации Y. pseudotuberculosis от других патогенных иерсиний. Недостатком данного метода является то, что методика направлена главным образом на серотипирование возбудителя псевдотуберкулеза с использованием бактериальных суспензий с высокой концентрацией клеток (1×109 м.к./мл), а не на его обнаружение и идентификацию. Сведений о чувствительности анализа авторами не представлено.
Рассмотренные тест-системы характеризуются либо невысокой чувствительностью выявления Y. pseudotuberculosis, либо высокой трудоемкостью изготовления и стоимостью одного анализа, либо относительно низкой воспроизводимостью, либо субъективностью учета результатов анализа.
Технический результат заключается в разработке иммуноферментного способа выявления возбудителя псевдотуберкулеза с высокой чувствительностью и специфичностью.
Достигается технический результат тем, что в заявляемом способе, включающем сенсибилизацию лунок планшета кроличьими поликлональными антипсевдотуберкулезными антителами, блокирование с помощью бычьего сывороточного альбумина, последовательное внесение исследуемой пробы, специфических моноклональных антител мыши, антимышиного иммунопероксидазного конъюгата, субстрата О-фенилендиамина, используют в качестве антител-сенситина иммуноглобулинов из поликлональной антисыворотки к инактивированным формальдегидом клеткам Y. pseudotuberculosis I серотипа, выращенным при температуре 10°С, а в качестве вторых антител используют моноклональных антител к О-боковым цепям липополисахарида Y. pseudotuberculosis I серотипа.
Используемые высокоспецифичные моноклональные антитела МКАт2 к О-боковым цепям липополисахарида Y. pseudotuberculosis, полученные с использованием ранее полученной гибридомы, характеризуются стабильными антителопродуцирующими и пролиферативными свойствами [Бывалов А.А., Дудина Л.Г. и др. Исследование поверхностных антигенных эпитопов Yersinia pseudotuberculosis с помощью моноклональных антител // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - №2. - С. 203-210.]. Тест-система предназначена для выявления возбудителя псевдотуберкулеза в пробах (смывы с объектов окружающей среды, копрофильтраты), предварительно прошедших «холодовое» обогащение в жидкой питательной среде на основе солянокислотного гидролизата казеина в течение 3 суток при температуре 8-12°C. Названное условие определяется психрофильностью Y. pseudotuberculosis, которая выражается в том числе резким повышением продукции О-боковых цепей липополисахарида при понижении температуры культивирования, что обеспечивает высокие чувствительность и специфичность иммуноферментного выявления возбудителя с помощью МКАт2.
Способ включает в себя:
1. Получение иммуноспецифических реагентов.
2. Постановку анализа.
1. Получение иммуноспецифических реагентов.
А. Получение асцитной жидкости, содержащей моноклональные антитела.
Гибридомы были получены способом, описанным в работе [Бывалов А.А., Дудина Л.Г. и др. Исследование поверхностных антигенных эпитопов Yersinia pseudotuberculosis с помощью моноклональных антител // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - №2. - С. 203-210.] и хранились до использования в жидком азоте. Культуру гибридом, продуцирующую МКАт2, вводят внутрибрюшинным способом мышам линии BALB/c в дозе 2-5 млн живых клеток на одно животное. Через 9-12 сут. у мышей с развитым асцитом после цервикальной дислокации брюшную полость промывают 5 мл фосфатного буферного раствора (ФБР), отсасывают содержимое брюшной полости, центрифугируют. Полученную надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр. Ее контролируют по показателю специфической активности в ИФА с использованием в качестве сенситина липополисахарида бактерий Y. pseudotuberculosis, выращенных при температуре 10°С. Асцитная жидкость признается кондиционной при ее титре в ИФА не ниже 1:51200.
Б. Получение поликлональной сыворотки.
В качестве первичных антител, адсорбируемых на дно лунок полистиролового планшета, использовали иммуноглобулины, выделенные из поликлональной кроличьей сыворотки. Поликлональные антитела получали путем гипериммунизации кроликов породы «Шиншилла», включающей трехкратное, с интервалом в один месяц, подкожное введение суспензии инактивированных формальдегидом бактерий Y. pseudotuberculosis I серотипа, выращенных при температуре 10°С, в нарастающих дозах: ~0.5⋅109, 1.0⋅109, 3.0⋅109 м.к. соответственно. В качестве адъюванта использовали неполный адъювант Фрейнда. Забор крови для получения сыворотки производили через 10 суток после заключительной инъекции. Сыворотка признается кондиционной, если ее титр в ИФА, проводимом как и в контроле асцитной жидкости, не ниже 1:12800.
В. Выделение иммуноглобулинов.
К асцитной жидкости, содержащей МКАт2, добавляли насыщенный раствор сульфата аммоний в объемном соотношении 1:1. Выдерживали смесь при комнатной температуре в течение 40 минут. Образовавшийся осадок отделяли при 5000 g в течение 15 минут на центрифуге Universal 320 R (Hettich, Германия). Осадок растворяли в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7.3, в объеме, равном объему надосадочной жидкости. К полученному раствору, содержащему антитела, добавляли насыщенный раствор сульфата аммония в объемном соотношении 1.5:1, выдерживали смесь при комнатной температуре в течение 40 минут. Образовавшийся осадок, содержащий иммуноглобулины, после центрифугирования (5000 g, 15 минут) ресуспендировали в ФБР. Антитела из кроличьей поликлональной сыворотки выделяли аналогичным методом.
У полученных препаратов иммуноглобулинов определяли содержание белка по Лоури и иммунохимическую активность в ИФА, используя в качестве сенситина лунок планшета препарат липополисахарида, выделенный из культуры бактерий Y. pseudotuberculosis серотипа I, выращенных при температуре 10°С.
2. Постановка анализа.
Сенсибилизацию лунок 96-луночного полистиролового планшета осуществляли 100 мкл разведенных в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9.5, поликлональных кроличьих иммуноглобулинов в концентрации 5 мкг/мл, которые выдерживали в лунках планшета в течение ночи при комнатной температуре. После инкубации лунки трижды отмывали 250 мкл буфера для разведения и отмывки (ЗФР, рН 7.3, содержащий 0.05% Твин-20), после чего вносили 250 мкл буфера для блокировки (1% БСА в буфере для разведения и отмывки). Планшет выдерживался на термошейкере при температуре 37°С и 250 встряхиваниях/мин в течение одного часа. Затем блокирующий буфер удаляли, в лунки приливали 250 мкл буфера для разведения и отмывки, выдерживали планшет 30 минут при комнатной температуре, после чего буфер удаляли.
Исследуемые образцы микробных культур разводили в буфере для разведения и отмывки. В лунки вносили по 100 мкл исследуемых образцов. На этой стадии в лунки, служащие отрицательным контролем, вносили по 100 мкл буфера для разведения и отмывки. Планшет инкубировали 1 час при температуре 37°С на термошейкере при 250 встряхиваниях/мин. После инкубации лунки четырежды отмывали 250 мкл буфера для разведения и отмывки. Затем в лунки добавляли по 100 мкл раствора иммуноглобулинов МКАт2 в разведении 1:2000 в буфере для разведения и отмывки, выдерживали в течение 1.5 часов при температуре 37°С на термошейкере при 250 встряхиваний/мин, после чего лунки четырежды отмывали 250 мкл буфера для разведения и отмывки. После этого в лунки вносили конъюгат антимышиных антител с пероксидазой хрена (Anti-Mous IgG (Fab specific) - Peroxidase antibody produced in goat, Sigma aldrich (США)), в рабочем разведении (1:2000) в буфере для разведения и отмывки, с добавлением 0.5% БСА, инкубировали 1 час при температуре 37°С на термошейкере при 250 встряхиваниях/ мин и затем четырежды отмывали описанным выше способом. В чистой стеклянной посуде готовили раствор субстрата, растворяя навеску ортофенилендиамина, требуемую для получения концентрации 0.04%, в буфере для приготовления субстрата (0.05% перекиси водорода в цитрат-фосфатном буфере, рН 4.8). В лунки вносили по 100 мкл раствора субстрата и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Для остановки реакции в каждую лунку добавляли по 50 мкл 1 н раствора серной кислоты. Измерение оптической плотности осуществляли при длине волны 492 нм. Положительным результатом для исследуемых проб считали такой, когда оптическая плотность в опытных лунках превышала таковую в лунках с отрицательным контролем не менее чем на 0.15 единиц.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примером.
В соответствии с изложенной выше процедурой осуществления заявляемого способа были приготовлены три серии иммуноферментной моноклональной тест-системы, результаты оценки чувствительности и специфичности которой представлены ниже.
Для определения специфичности тест-системы использовали бактерии нескольких видов энтеробактерий, включая генетически наиболее близкие псевдотуберкулезному микробу Yersinia pestis и Yersinia enterocolitica. Анализ проводили описанным выше методом ИФА. Результаты представлены в таблице 1.
Представленные в таблице 1 данные, свидетельствуют о высокой специфичности ИФА на основе приготовленных серий тест-системы. Ни в одном из опытов не было зарегистрировано положительного сигнала при анализе всех бактериальных культур, взятых в концентрации 100 млн м.к./мл.
Результаты лабораторного изучения чувствительности тест-системы представлены в таблице 2.
Как видно из приведенных в таблице 2 данных, чувствительность тест-системы была не ниже 400 тыс.м.к./мл и ~1000 тыс.м.к./мл для культур, выращенных при температурах 10 и 37°С соответственно.
Таким образом, иммуноферментная тест-система, основанная на использовании моноклональных антител к О-боковым цепям липополисахарида (МКАт2) в качестве вторых антител является видоспецифической и высокочувствительной для выявления возбудителя псевдотуберкулеза.
Примечание. В качестве антигена использовали разводки суспензии клеток Y. pseudotuberculosis 1b (штамм депонирован в коллекции ФКУЗ РосНИИПЧИ «Микроб», кат. №474), выращенных на плотной питательной среде на основе БТН-агара («Биотехновация», Россия).
Claims (1)
- Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза I серотипа на основе моноклональных антител к О-боковым цепям липополисахарида, включающий сенсибилизацию лунок микропланшета кроличьими поликлональными антителами против Y. pseudotuberculosis, блокирование с помощью бычьего сывороточного альбумина, последовательное внесение исследуемой пробы, специфических моноклональных антител мыши против Y. pseudotuberculosis, конъюгата антимышиных антител с пероксидазой хрена, субстрата О-фенилендиамина, отличающийся использованием в качестве антител для сенсибилизации лунок планшета иммуноглобулинов из поликлональной антисыворотки к инактивированным формальдегидом клеткам Y pseudotuberculosis I серотипа, выращенным при температуре 10°С, а в качестве специфических моноклональных антител против Y. pseudotuberculosis - моноклональных антител к О-боковым цепям липополисахарида Y. pseudotuberculosis I серотипа, измерение оптической плотности при длине волны 492 нм, положительным результатом для исследуемых проб является такой, когда оптическая плотность в опытных лунках превышает таковую в лунках с отрицательным контролем не менее чем на 0,15 единиц.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018124577A RU2695525C1 (ru) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018124577A RU2695525C1 (ru) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2695525C1 true RU2695525C1 (ru) | 2019-07-23 |
Family
ID=67512212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018124577A RU2695525C1 (ru) | 2018-07-04 | 2018-07-04 | Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2695525C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2377308C1 (ru) * | 2008-05-22 | 2009-12-27 | Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" | Диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклональный |
-
2018
- 2018-07-04 RU RU2018124577A patent/RU2695525C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2377308C1 (ru) * | 2008-05-22 | 2009-12-27 | Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" | Диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклональный |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FEDOROVA V.A. et al. Heat-stable serogroup-specific proteins of Yersinia pseudotuberculosis // Journal of Medical Microbiology, 2003, V.52, pp.389-395. * |
| БЫВАЛОВ А.А. и др. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ Б-АНТИГЕНА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2015, N 2, стр.32-38. * |
| БЫВАЛОВ А.А. и др. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕННЫХ ЭПИТОПОВ Yersinia pseudotuberculosis C ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ // Прикладная биохимия и микробиология, 2014, Т.50, N 2, стр.203-210. * |
| БЫВАЛОВ А.А. и др. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕННЫХ ЭПИТОПОВ Yersinia pseudotuberculosis C ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ // Прикладная биохимия и микробиология, 2014, Т.50, N 2, стр.203-210. БЫВАЛОВ А.А. и др. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ Б-АНТИГЕНА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2015, N 2, стр.32-38. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10550175B2 (en) | Mycoplasma pneumoniae immunological detection method and kit | |
| Luk et al. | Rapid and sensitive detection of Salmonella (0: 6, 7) by immunomagnetic monoclonal antibody-based assays | |
| JPH03504412A (ja) | カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法 | |
| US20230357372A1 (en) | Immunological detection method and kit for mycoplasma pneumoniae | |
| Adams et al. | The gp135 of caprine arthritis encephalitis virus affords greater sensitivity than the p28 in immunodiffusion serology | |
| US20180002407A1 (en) | Immunological detection method and kit for mycoplasma pneumoniae | |
| Devi et al. | A new serum hydatid antigen detection test for diagnosis of cystic echinococcosis | |
| Barbuddhe et al. | Immunodetection of bacteria causing brucellosis | |
| Ren et al. | A brief review of diagnosis of small ruminants brucellosis | |
| Dharakul et al. | Rapid identification of Burkholderia pseudomallei in blood cultures by latex agglutination using lipopolysaccharide-specific monoclonal antibody. | |
| Boraker et al. | BrucELISA: an enzyme-antibody immunoassay for detection of Brucella abortus antibodies in milk: correlation with the Brucella ring test and with shedding of viable organisms | |
| RU2695525C1 (ru) | Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида | |
| US11307202B1 (en) | Antibody binding detection method for detecting MERS-CoV | |
| US6489148B1 (en) | Immunoassay for equine protozoal myeloencephalitis in horses | |
| US20030092086A1 (en) | Method for detecting streptococcus sobrinus and antibody therefor | |
| KR101894489B1 (ko) | Igm 반정량적 렙토스피라증 진단 키트 | |
| NO317151B1 (no) | Pavisning av antistoffproduksjon | |
| KR102124258B1 (ko) | 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 황색 포도알균 장독소 b 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 | |
| US20010026922A1 (en) | Method of diagnosing Crohn's disease | |
| Wienecka et al. | Detection of Giardia antigen in stool samples by a semi-quantitative enzyme immunoassay (EIA) test | |
| Lehman | Immunodiagnosis of Infectious Diseases | |
| RU2794855C1 (ru) | Способ диагностики туберкулеза | |
| JP4022005B2 (ja) | 簡易抗体検査方法及び検査用キット | |
| Wongratanacheewin et al. | Retrospective study on the diagnostic value of IgG ELISA, dot immunoassay and indirect hemagglutination in septicemic melioidosis | |
| Sathar et al. | Detection of Entamoeba histolytica immunoglobulins G and M to plasma membrane antigen by enzyme-linked immunosorbent assay |