CN107271674A - 一种用于脂肪性肝炎检测的靶标志物gp73及检测应用方法 - Google Patents

一种用于脂肪性肝炎检测的靶标志物gp73及检测应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的新血清学靶标志物GP73及其检测应用方法。血清学靶标志物GP73及其应用可代替金标准肝穿刺鉴别诊断脂肪肝人群中的单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，降低患者检测痛苦，对于临床鉴别诊断脂肪肝人群中的单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，辅助单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的治疗具有极高的临床应用价值。

Description

一种用于脂肪性肝炎检测的靶标志物GP73及检测应用方法
技术领域
本发明涉及一种体外检测脂肪性肝炎的新标志物及检测方法，属于生物技术和体外诊断的细分领域。
背景技术
脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪异常堆积过多的病变。正常人肝组织中含有少量的脂肪，其重量约为肝重量的4％～5％，若脂肪量超过5％为轻度脂肪肝，超过10％为中度脂肪肝，超过25％为重度脂肪肝。脂肪肝是目前最常见的慢性肝脏疾病之一，在发达国家和部分发展中国家发病率达到30％以上，已成为一个重要的公共健康问题，严重威胁人民健康。脂肪肝包括单纯性脂肪变、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化等主要病理阶段；脂肪肝中的单纯性脂肪变是良性的，通过饮食、运动调控等可以逆转，不需要经过特异性治疗；而脂肪性肝炎如不及时治疗，将随着疾病的进展将进一步向肝纤、肝硬化、肝癌发展，报道显示脂肪性肝炎转化为肝纤肝硬化，直至肝癌的发病率与病毒性肝炎的发病率相当。脂肪性肝炎严重威胁人民的健康，目前，脂肪肝主要通过B超、CT、MRI等影像学手段检测，但是影像学检测无法区分单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，脂肪性肝炎的确诊仍依赖于肝穿刺检测，肝穿刺检测会给患者带来较大的身体和心里负担，不利于脂肪性肝炎的诊断确诊和日常检测。
高尔基体蛋白73(如无特殊说明，以下均简称GP73)是高尔基体糖蛋白， 2000年首先由Kladney等在研究成人巨细胞肝炎病原学时发现的一种新的跨膜糖蛋白，又称II型高尔基体膜蛋白(Golph 2)和高尔基体膜蛋白I(Golm 1)，相对分子量为73000kDa。GP73在正常的肝细胞内不表达或少量表达，近几年的研究发现，GP73在肝纤、肝硬化及肝癌等多种肝脏疾病中呈高表达状态，并可分泌进入血清，肝癌患者中的GP73升高最为明显，是肝癌早期诊断的优选标志物之一，其敏感性和特异性均优于AFP。
中国专利公布CN 101735319 A(北京热景生物技术股份有限公司,专利名称“一种抗GP73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用”)，公开了一种抗高尔基蛋白GP73的单克隆抗体，一种应用GP73的酶联免疫定量检测试剂盒和一种快速诊断试剂盒，并公开了正常人与肝病患者的GP73含量的临界值为 40ng/ml，良性肝病患者与恶性肝病患者的GP73含量的临界值为100ng/ml。
中国专利公布CN 101407544 A(专利名称：“抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用”)公开了一种抗GP73单克隆抗体及应用该单克隆体的肝癌检测的酶免试剂和免疫沉淀、免疫印迹、免疫组化等方面的应用。
中国专利公布CN 104215761 A(专利名称：“检测血清中抗GP73抗体的试剂盒”)公开了一种检测血清中抗GP73抗体检测的酶联免疫试剂盒，主要用于肝癌检测。
近年来，GP73及其相关应用研究主要集中在肝癌早期诊断领域，GP73 相关专利申请也主要集中在应用GP73及其抗体进行肝癌检测的体外诊断试剂盒领域，未见GP73用于脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的研究及应用的报道及相关专利申请。我们经过大量临床样本研究分析，充分证明GP73是在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的优秀血清学标志物，对于脂肪性肝炎人群的诊断和鉴别都有着重要的临床应用价值。
发明内容
目前临床上应用肝穿刺来诊断鉴别脂肪肝人群中的单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，给患者带来巨大痛苦，为了解决现有影像学检测技术和血清学检测技术无法在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的不足，本发明提供了一种在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的新血清学靶标志物GP73，并进一步提供了在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的检测GP73的检测试剂盒，检测方法及其判定标准。
本发明提供了一种用于在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的新血清学靶标志物GP73及其体外诊断的检测样本中GP73含量的方法。
本发明更进一步提供了在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的血清学体外诊断检测试剂盒，及其应用体外诊断检测试剂盒检测 GP73的方法及其判定标准。
在本发明的实施方案中，GP73检测方法原理为基于抗原抗体结合反应的免疫学检测方法原理，优选化学发光法、酶联免疫法、免疫层析法的任意一种。
在本发明的某些实施方案中，所述化学发光法为化学发光法、磁微粒化学发光法、电化学发光法、酶促化学发光法、时间分辨化学发光法的至少一种。
在本发明的某些实施方案中，所述酶联免疫法为酶联免疫法、免疫渗滤法、蛋白芯片法的至少一种。
在本发明的某些实施方案中，所述免疫层析法为上转发光免疫层析法、乳胶免疫层析法、胶体金免疫层析法、发光免疫层析法、量子点免疫层析法的至少一种。
在本发明的某些实施方案中，GP73的检测样本为脂肪肝人群的血液样本，所述血液样本检测结果用于在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎。
在本发明的某些实施方案中，GP73血清学体外诊断检测试剂盒在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的判定cutoff值为82.25ng/ml。
与现有技术相比，本发明在于提供一种在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的新血清学靶标志物GP73，并进一步提供了在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的检测GP73的方法及其判定标准，解决了现有的影像学检测技术和血清学检测技术无法在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的问题，为脂肪性肝炎的诊断和治疗提供依据，检测样本为血液样本，大幅度降低了肝穿刺检测脂肪性肝炎为患者带来的痛苦，对脂肪肝人群中鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎具有重要的临床诊断价值和临床意义。
附图说明
图1，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果绝对偏倚图。
图2，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果绝对偏倚图。
图3，200例GP73酶联免疫法检测试剂检测、GP73免疫层析法检测试剂检测结果绝对偏倚图
图4，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果相对偏倚图。
图5，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果相对偏倚图。
图6，200例GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果相对偏倚图。
图7，所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果线性相关性。
图8，所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果线性相关性。
图9，所述200例GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果线性相关性。
图10，ROC曲线分析图。
图11，GP73检测结果数据分布图。
图12，临床一致性分析图。
具体实施方式
以下结合附图和实施案例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所述的优选实施案例仅用于解释本发明，并不限定发明范围。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的实验方法、测定或测试方法，但是在本发明的实验、测定或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法或实验。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。
GP73靶标志物及其GP73检测方法、判定标准通过应用抗GP73蛋白抗体，制备成基于抗原抗体结合反应的免疫学检测方法原理的检测试剂，包括化学发光法、酶联免疫法、免疫层析法及其基于所述方法的改进方法的任意一种方法的定量检测试剂，应用所述定量试剂检测的样本为脂肪肝人群的血液样本，可以为血清、血浆、全血的任意一种，所述血液样本检测结果用于在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎。
本发明中测量GP73的方法包括使用试剂，所述试剂包括但不限于抗体。所述抗体具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及抗体片段，例如抗体中呈现期望生物学活性的可变结构域及其它部分。术语“单克隆抗体(mAb)”是指具有高度特异性且针对单一抗原决定簇(表位)的抗体。因此，术语“单克隆”指针对相同表位的抗体，且不应理解为需要借助任何特定方法来产生该抗体。应理解，单克隆抗体可借助业内已知的任何技术或方法来制备；包括(例如)融合瘤方法(Kohler等人，1975,Nature256:495)，或业内已知的重组DNA方法(例如，参见美国专利第4,816,567号)，或使用噬菌体抗体文库并使用以下文献中所述技术分离以重组方式产生的单克隆抗体的方法：Clackson等人，1991,Nature 352:624-628；及Marks 等人，1991,J.Mol.Biol.222:581-597。
本发明中，“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于 Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子 (例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本发明所述的试剂还包括其它试剂。所述其它试剂的实例包括ABC 稀释液、TMB显色液、TMB终止液、洗涤液等。在某些实施方案中，任何上述物质之一可以与其他物质分离的状态单独存在分别存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用时它们能够相互接触即可。另外，优选地，任何两种以上的上述物质可混合作为混合物存在。
在某些实施方案中，所述其它试剂可分别以干燥粉末的形式提供，或以溶液形式提供，例如水溶液的状态存在。在以水溶液状态存在的情况下，这些物质的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，所述物质的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明中，测量GP73的试剂可被进一步制备为用于在患有脂肪肝的受试者中鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的诊断剂。所述诊断剂的形式或为诊断组合物、诊断试剂盒，或者多种单独存在的试剂组合使用的其他任何形式。
实施案例1：
抗GP73蛋白抗体制备：参考已有专利技术进行制备、或筛选自商品化的抗GP73蛋白抗体、或通过已有公知技术制备的抗GP73蛋白抗体，制备或筛选的单克隆抗体可用于脂肪肝人群血液样本中的GP73的精确定量检测及结果判定。
为更优的解释本发明，本发明某些实施方案中所述的抗GP73蛋白抗体优选使用北京热景生物技术股份有限公司的专利技术“一种抗GP73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用，CN 101735319B”中的抗GP73蛋白抗体制备方法制备的抗GP73蛋白抗体，所述制备抗GP73蛋白抗体的杂交瘤细胞株(3E12株)于2008年11月11日以保藏号CGMCC No.2742 保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。
制备单克隆抗体：成年BALB/c小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml，7-10天后，腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的3E12 株杂交瘤细胞株，每只小鼠5×105/0.2ml，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，采集腹水，每只小鼠约采 3ml腹水，将腹水2000r/min离心5分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，经重组proteinG预装层析柱纯化后即获得抗GP73单克隆抗体。
实施案例2：
化学发光法检测试剂制备：所述化学发光法为化学发光法、磁微粒化学发光法、电化学发光法、酶促化学发光法、时间分辨化学发光法及其改进方法的至少一种，不同化学发光法之间仅标记颗粒和分离方法之间存在差异，反应原理相同，经抗GP73蛋白抗体浓度优化处理后，均能达到精确定量检测鉴别脂肪肝人群中的单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，达到辅助诊断和治疗脂肪性肝炎的目的。GP73化学发光法的制备均来自成熟的化学发光法制备技术，并对该技术进行相关优化，使之达到优异的检测结果。
为更优的解释本发明，本发明某些实施方案中所述的化学发光法优选磁微粒化学发光法制备化学发光法检测试剂，磁微粒化学发光法检测试剂制备参照北京热景生物技术股份有限公司相关专利技术公开方法进行，所述抗体为实施案例1中所述的抗GP73蛋白抗体。
1、GP73磁微粒化学发光法检测试剂的GP73分离试剂制备：
所述GP73分离试剂制备概括为将磁性粒子与抗GP73蛋白抗体反应形成连接物，按一定浓度加入缓冲液中配制而成。主要步骤如下：
将磁珠混匀后加磁场去掉上清，用包被缓冲液清洗磁珠一次，然后加入活化剂(碳二亚胺)，常温震荡反应30min，然后去上清，加入包被缓冲液及适量抗GP73蛋白抗体，常温震荡3h，反应结束后加入封闭液并震荡，最后加清洗液，清洗完成后加入保存液过夜保存即可。
所述包被缓冲液为0.1mol/L的pH5.0的MES缓冲液。
所述活化剂碳二亚胺的终浓度为0.01-0.1g/ml。
所述抗GP73蛋白抗体的适宜浓度为10-100ug/mg磁珠。
包被结束后，加磁场弃上清，加入约10倍体积的封闭液，常温振荡至少1小时。
所述封闭液主要组成成分为：50mM的Tris缓冲液，1-5％BSA溶液， 0.1％防腐剂，pH7.4。
封闭结束后，加磁场弃上清，加入约10倍体积的清洗液清洗。
所述清洗液的主要组成成分为0.02M PBS、100nM氯化钠溶液， 0.5-1％的吐温-20溶液。
清洗结束后，加磁场弃上清，准确加入10倍体积的磁性颗粒保存液保存抗DCP单克隆抗体的磁性颗粒，即为GP73分离试剂。
所述保存液的主要组成成分为0.02-0.1M PBS溶液，1％-5％的BSA 溶液，0.1％的防腐剂，0.5-3％的甘氨酸溶液，pH7.4。
2、GP73磁微粒化学发光法检测试剂的检测试剂制备
所述检测试剂制备：概括为碱性磷酸酶标记的抗GP73蛋白抗体按照一定浓度加入到缓冲液中配制而成。
为更优的解释本发明，并于包被抗体对应，碱性磷酸酶标记抗体优选抗GP73蛋白抗体；该制备方法仅为更好的解释本发明，不作为标记抗体的制备及使用的限制条件。
取与抗GP73蛋白抗体质量比为1/4～1/1的碱性磷酸酶，加入与碱性磷酸酶溶液等体积的NaIO4(12.8mg/ml，4℃现配)，4℃避光反应30分钟，然后加入与碱性磷酸酶溶液等体积的乙二醇溶液4℃避光反应45分钟；加入抗GP73蛋白抗体，再加入混合液1/40～1/10体积的CBS标记缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)置4℃避光透析过夜，最后加入硫酸铵溶液，反应2小时，离心，弃去上清，沉淀用0.01mol/L的PBS溶解后置4℃避光透析过夜，透析完后加等体积甘油混匀，-20℃保存。
按比例(推荐浓度≥1:1000)将碱性磷酸酶标记的抗GP73蛋白抗体加入保存液中，混匀即得GP73标记抗体，即为检测试剂制备。
3、GP73磁微粒化学发光法检测试剂的清洗液制备：
所述清洗液主要组成为：0.1M Tris缓冲液，0.1-1％吐温溶液、0.1％防腐剂。
4、GP73磁微粒化学发光法检测试剂的定标液制备：
所述GP73定标液制备概括为将检验合格的GP73抗原加入定标生产稀释液中配制冻干而成。
所述定标生产稀释液包括1-5％BSA溶液、1-5％的海藻糖溶液、 10-50％新生牛血清溶液。将高值GP73抗原冻干液进行梯度稀释稀，释至适宜浓度，检测完后放入冻干机冻干，预冻时间为2h，抽真空时间为 16-24h。
5、GP73磁微粒化学发光法检测试剂制备：
将GP73分离试剂、GP73检测试剂、GP73清洗液、GP73底物液按照工艺规程或说明书要求分装至相应大小的试剂瓶内，或条装试剂的试剂条的相应孔位，然后密封。分装后的试剂与定标液、耗材反应槽、一次性取样头等组成GP73磁微粒化学发光法检测试剂，所述试剂适配北京热景生物技术股份有限公司MQ60系列自动免疫分析仪使用。
实施案例3：
GP73酶联免疫法检测试剂(96人份)制备：所述酶联免疫法为酶联免疫法为酶联免疫吸附法、斑点免疫渗滤法、磁颗粒酶联免疫法分析、酶联免疫荧光测量法和蛋白芯片法的至少一种或酶联免疫相应改进方法的至少一种，不同酶联免疫法之间仅承载载体之间存在差异，反应原理相同，经抗GP73蛋白抗体浓度优化处理后，均能达到精确定量检测鉴别脂肪肝人群中的单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，达到辅助诊断和治疗脂肪性肝炎的目的。GP73酶联免疫法的制备均来自成熟的酶联免疫法制备技术，并对该技术进行相关优化，使之达到优异的检测结果。
为更优的解释本发明，本发明某些实施方案中所述的酶联免疫法优选酶联免疫吸附法制备的检测试剂，酶联免疫法制备的检测试剂的制备参照北京热景生物技术股份有限公司相关专利技术公开方法进行，所述抗体为实施案例1中所述的抗GP73蛋白抗体。
GP73酶联免疫法检测试剂(96人份)组成包括：GP73标准品5瓶；抗GP73蛋白抗体包被板(96孔)1块；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗 GP73蛋白抗体1瓶，10ml/瓶；显色液A、显色液B各1瓶，各5ml/瓶；终止液1瓶，5ml/瓶；洗液(20×浓缩)1瓶，50ml/瓶。
1.GP73酶联免疫法检测试剂的标准品制备：
将高值GP73抗原按0，20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml的不同浓度稀释于2％的BSA溶液中，加入防腐剂procline 300至最终浓度 0.1％，过滤除菌，并在无菌的条件下分装入1.5ml小管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
2.抗GP73蛋白抗体包被板(96孔)制备：
酶标板采用12×8或8×12可拆条酶标板，将抗GP73蛋白抗体用 0.05mol/L，pH9.5的碳酸盐缓冲液稀释为10-50μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液(PBST溶液，包含20mmol/LPBS，0.5％Tween-20，pH7.4)洗板，再用每孔120μl封闭液缓冲液(2％BSA，稀释于PBST溶液中)封闭过夜，弃去封闭液，晾干，即获得抗GP73蛋白抗体包被板(96孔)，铝箔袋真空封闭包装备用。
3.辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GP73蛋白抗体制备(全过程避光处理)。
称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；称取NaIO4 5mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度；往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌，将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟。取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，HRP终浓度为10mg/ml，室温静置30分钟。
调整抗GP73蛋白抗体浓度为5mg/ml左右，将抗GP73蛋白抗体与HRP按1:4混合，于50mmol/L pH9.5碳酸盐缓冲液中透析6小时以上，头两个小时换液一次。
用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应，摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次。
用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4 储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜，换液一次。
完成HRP标记的抗GP73蛋白抗体溶液用饱和硫酸铵溶液透析过夜，然后用超滤管12000rpm离心，得到浓缩纯化的HRP标记的抗GP73蛋白抗体。
HRP标记的抗GP73蛋白抗体用含10％胎牛血清的缓冲液(20mmol/L PBS)稀释至合适的工作浓度，推荐稀释浓度≥1:500，按10ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.显色液A配制：用磷酸-柠檬酸缓冲液(50mmol/L，PH5.0)配制3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装。
5.显色液B配制：TMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装。
6.终止液配制：2mol/L H2SO4，按5ml/瓶分装。
7.洗液(20倍浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按50ml/ 瓶分装。
将GP73标准品，抗GP73蛋白抗体包被板，HRP标记的抗GP73 蛋白抗体，显色液A，显色液B，终止液1瓶，洗液(20×浓缩)按照要求组装成GP73酶联免疫法检测试剂(96人份)。
实施案例4：
GP73酶联免疫法检测试剂(96人份)的使用方法，所述使用方法主要步骤如下：
1、清洗缓冲液配制：将浓缩缓冲液加纯化水20倍稀释备用。
2、准备标准品：标准品包括5个不同浓度，分别为0、20ng/ml、 40ng/ml、100ng/ml、250ng/ml。
3、抗原-抗体反应：在抗体包被板的微孔中分别加入100μl样本稀释液，然后加入不同浓度的标准品或待测血清样品各10μl，37℃孵育30分钟，然后用清洗缓冲液洗板4次。
4、酶联反应：每孔加入100μl HRP标记的抗GP73蛋白抗体溶液， 37℃孵育30分钟，然后用清洗缓冲液洗板4次。
5、显色反应：每孔依次加入显色液A、显色液B各50μl，37℃孵育 10分钟，每孔再加入50μl终止液结束反应。
6、比色：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD 平均值；记录各孔吸光值；计算双孔标准品OD值的平均值。
7、结果计算：
1)标准曲线的绘制：以标准品浓度为横坐标、标准品测定的平均OD 值为纵坐标，绘制本次测定的标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当 R2≥0.98时，本次实验有效。
2)计算待测样品浓度：根据待测样本的OD值，从标准曲线计算出 GP73浓度。
实施案例5：
免疫层析法为上转发光免疫层析法、乳胶免疫层析法、胶体金免疫层析法、发光免疫层析法、量子点免疫层析法的至少一种。
GP73免疫层析法检测试剂制备：所述免疫层析法为上转发光免疫层析法、乳胶免疫层析法、胶体金免疫层析法、发光免疫层析法、量子点免疫层析法或免疫层析法相应改进方法的至少一种，不同免疫层析法之间仅标记颗粒之间存在差异，反应原理相同，经抗GP73蛋白抗体浓度优化处理后，均能达到精确定量检测鉴别脂肪肝人群中的单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，达到辅助诊断和治疗脂肪性肝炎的目的。GP73免疫层析法的制备均来自成熟的免疫层析法制备技术，并对该技术进行相关优化，使之达到优异的检测结果。
为更优的解释本发明，本发明某些实施方案中所述的免疫层析法优选上转发光免疫层析法制备的检测试剂，上转发光免疫层析法制备的检测试剂的制备参照北京热景生物技术股份有限公司相关专利技术公开方法进行，所述抗体为实施案例1中所述的抗GP73蛋白抗体。
GP73免疫层析法检测试剂制备：
1、包被：
将抗GP73蛋白抗体稀释到2mg/ml，作为T线包被液，将羊抗鼠IgG 稀释到2mg/ml，作为C线包被液，通过喷膜机，将T线包被液和C线包被液包被到硝酸纤维素膜上，晾干，即获得单克隆抗体包被膜条。
2、上转化发光颗粒(UCP)标记抗体：
称取10mg UCP颗粒置于锥形瓶中，加入10ml pH＝7.2的0.20M PB 溶液，制备成UCP颗粒悬浊液，然后加入0.5-2mg抗GP73蛋白抗体，再加入无水戊二醛至终浓度1％，37℃搅拌过夜；12000rpm，4℃，离心 15min，弃上清；UCP沉淀物中加入10ml pH＝7.2的0.20M PB溶液，吹打混匀；12000rpm，4℃，离心15min，弃上清，收集UCP沉淀物待用。
3、GP73免疫层析法检测试剂的冻干结合垫制备：
用50ml pH＝7.2的0.20M PB溶液将UCP沉淀物重悬，制备成UCP 标记物悬浊液，12000rpm，4℃，离心30min，弃上清；加入45ml的冻干液(pH＝7.20.20M PB，含2％BSA，3％蔗糖)；将UCP标记物悬浊液按2-5cm2/ml加于玻璃纤维上，真空冻干11h；将冻干的结合垫裁剪成 1cm宽的长条，即为GP73免疫层析法检测试剂的冻干结合垫。
4、组装试纸条：
依次将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫贴到底板上，切成 4.0mm宽的纸条，然后装到塑料卡底壳中，盖上塑料卡上壳，压紧，加入干燥剂，密封包装。
5、样本稀释液配制：
样本稀释液成分为pH＝7.2的0.20M PB溶液，加入1％Tween20。
6、组装的GP73免疫层析法检测试剂条和样本稀释液共同组成GP73 免疫层析法检测试剂，适配北京热景生物技术股份有限公司的UPT-3A系列上转发光免疫分析仪使用。
实施案例6：
GP73定量检测样本的准备，所述检测样本均来自临床样本，具有明确临床诊断背景，临床诊断均为脂肪肝背景。
所述临床确诊为脂肪肝背景的样本总计200例，包括确诊为脂肪性肝炎背景的肝病进程样本(包括脂肪性肝炎引起的肝纤维化样本和肝硬化样本，不包含肝癌患者样本，以下简称脂肪型肝炎样本)的血清/血浆样本 63例，单纯脂肪变的脂肪肝样本137例。
全血样本不易长期保存，不适宜建立长期队列样本进行检测分析，在本发明所述实施案例中未做分析，但依据本发明改进的适宜于全血检测 GP73用于在脂肪肝人群中诊断鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的检测 GP73的方法及其判定标准的标准仍视为在本发明的保护范围内。
实施案例7：
分别用GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂等三种方法的定量检测试剂检测200例临床确诊为脂肪肝背景的样本，分别对检测结果分别进行汇总分析。
不同方法学检测结果分析：
统计分析GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂三种试剂检测结果的绝对偏倚、相对偏倚和线性相关性，判断不同方法学之间的偏差情况。
a、绝对偏倚分析，根据“方法对比及偏差评估方法NCCLS EP9-A”相关规定的方法和标准，计算所有样本绝对偏差：
所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果最大绝对偏差为20.08,小于200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果的平均绝对偏差的4倍，即20.22。详见图1，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果绝对偏倚图。
所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果最大偏差为20.92,小于200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果的平均绝对偏差的4倍，即 20.10。详见图2，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果绝对偏倚图。
所述200例GP73酶联免疫法检测试剂检测、GP73免疫层析法检测试剂检测结果最大绝对偏差为17.43,小于GP73酶联免疫法检测试剂检测、 GP73免疫层析法检测试剂检测结果的平均绝对偏差的4倍，即19.03。详见图3，200例GP73酶联免疫法检测试剂检测、GP73免疫层析法检测试剂检测结果绝对偏倚图。
依据上述分析结果，GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂三种试剂的检测结果的绝对偏差均在NCCLS EP9-A规定范围内，三种方法学之间无明显偏差。
b、相对偏倚分析，根据“方法对比及偏差评估方法NCCLS EP9-A”相关规定的方法和标准，计算所有样本相对偏差：
所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果最大相对偏差为30.89％,小于200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果的平均相对偏差的4 倍，即32.36％。详见图4，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73 酶联免疫法检测试剂检测结果相对偏倚图。
所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果最大相对偏差为33.91％,小于200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果的平均相对偏差的4 倍，即33.98％。详见图5，200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73 免疫层析法检测试剂检测结果相对偏倚图。
所述200例GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果最大相对偏差为30.48％,均小于GP73酶联免疫法检测试剂、 GP73免疫层析法检测试剂检测结果的平均相对偏差的4倍，即30.55％。详见图6，200例GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果相对偏倚图。
依据上述分析结果，GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂三种试剂的检测结果的相对偏差均在NCCLS EP9-A规定范围内，三种方法学之间无明显偏差。
c、线性相关性分析：
将所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂检测结果采用Graphpad Prism 4.0软件进行相关系数的计算： R2＝0.9927。详见图7，所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73 酶联免疫法检测试剂检测结果线性相关性。
将所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果采用Graphpad Prism 4.0软件进行相关系数的计算： R2＝0.9916。详见图8，所述200例GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73 免疫层析法检测试剂检测结果线性相关性。
将所述200例GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测检测试剂检测结果采用Graphpad Prism 4.0软件进行相关系数的计算： R2＝0.9904。详见图9，所述200例GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂检测结果线性相关性。
根据绝对偏倚分析、相对偏倚分析和线性相关性分析结果，GP73用于脂肪肝样本检测分析时，GP73磁微粒化学发光法检测试剂、GP73酶联免疫法检测试剂、GP73免疫层析法检测试剂三种方法学对于脂肪肝样本的检测结果具有良好的一致性。
检测结果cut-off值设定及临床一致性分析：
a、cut-off值设定：
以GP73磁微粒化学发光法检测试剂检测结果分析，根据200例临床背景为依据,根据ROC曲线分析，GP73在用于脂肪肝人群中鉴别诊断单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的cut-off值为82.25ng/ml.详见图10，ROC曲线分析图；图11，GP73检测结果数据分布图。
b、临床一致性分析：
与已知临床背景结果(单纯性脂肪变137例，脂肪性肝炎63例)对比分析，以GP73含量为82.25ng/ml作为在脂肪肝人群中鉴别诊断单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的cut-off值，检测结果单纯性脂肪变符合率均为 86.86％,脂肪性肝炎符合率均为85.71％，总符合率为86.50％，详见图12，临床一致性分析图。临床背景与检测结果不符合的偏差样本主要集中在靶值82.25ng/ml的±20％之间。
根据本发明实施案例分析，血清学靶标志物GP73及其应用可以作为在脂肪肝人群中鉴别诊断单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的优秀血清学靶标志物，以GP73含量为82.25ng/ml作为在脂肪肝人群中鉴别诊断单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的cut-off值，特异性为86.86％，敏感性为85.71％，不同检测方法之间的检测结果一致性好。
血清学靶标志物GP73及其应用对于临床鉴别诊断脂肪肝人群中的单纯性脂肪变和脂肪性肝炎，辅助单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的治疗具有极高的临床应用价值。
上述实施案例描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解为对本发明的解释，而非局限于本发明实施案例披露的形式，不应看做是对其他实施例的排除，而可以用于各种其他形式的组合、修改，并能够在本发明的构思范围内改动。本领域人员所进行的改动和变化在本发明构思及范围内的，都应在本发明所附权利要求保护范围内。

Claims (9)

1.一种在患有脂肪肝的受试者中鉴别单纯性脂肪变和脂肪性肝炎的方法，其包括测量来自所述受试者的待测样品中的靶标志物GP73的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述待测样品中的靶标志物GP73的含量与其标准含量比较的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中当所述待测样品中的靶标志物GP73的含量小于所述标准含量时，将所述受试者鉴别为患有单纯性脂肪变；或当所述待测样品中的靶标志物GP73的含量大于所述标准含量时，将所述受试者鉴别为患有脂肪性肝炎。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述测量通过免疫学方法进行，且选自化学发光法、酶联免疫法和免疫层析法组成的组中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述化学发光法为磁微粒化学发光法、电化学发光法、时间分辨化学发光法、标记增强化学发光法和酶促化学发光法中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述酶联免疫法为酶联免疫吸附法、斑点免疫渗滤法、磁颗粒酶联免疫法分析、酶联免疫荧光测量法和蛋白芯片法中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫层析法为上转发光免疫层析法、乳胶免疫层析法、胶体金免疫层析法、发光免疫层析法、量子点免疫层析法中的至少一种。
8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述待测样品为脂肪肝背景人群的血液样本，优选血清或血浆样本中的一种。
9.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述标准含量为cutoff值82.25ng/ml。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111537719A (zh) * 2020-06-04 2020-08-14 复旦大学附属中山医院 血清Sparcl1蛋白在非酒精性脂肪性肝炎诊断中的应用
WO2021179106A1 (zh) * 2020-03-08 2021-09-16 北京舜景生物医药技术有限公司 一种gp73抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114858890B (zh) * 2022-04-21 2023-08-18 桂林电子科技大学 基于RGO-CMCS-Hemin/Pt@Pd NPs比色传感器检测GP73的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101735319A (zh) * 2008-11-20 2010-06-16 北京热景生物技术有限公司 一种抗gp73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE60237455D1 (de) * 2001-07-12 2010-10-07 Kyowa Medex Co Ltd Verfahren zur quantifizierung von denaturiertem lipoprotein
CA3021449C (en) * 2005-05-05 2021-12-14 Drexel University Diagnosis of liver pathology through assessment of protein glycosylation
US20100184049A1 (en) * 2007-04-27 2010-07-22 Steve Goodison Glycoprotein Profiling of Bladder Cancer
WO2009090882A1 (ja) * 2008-01-18 2009-07-23 The University Of Tokyo 非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法
JP5322556B2 (ja) * 2008-09-19 2013-10-23 株式会社Ｍｃｂｉ 新規非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法
CN101407544B (zh) 2008-11-05 2011-12-07 曹伯良 抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用
WO2012105590A1 (ja) * 2011-02-01 2012-08-09 アステラス製薬株式会社 非アルコール性脂肪肝炎の鑑別マーカー及び当該マーカーを指標とした非アルコール性脂肪肝炎の診断方法
AU2013333882B2 (en) * 2012-10-17 2019-05-16 Enterome Gene signatures of inflammatory disorders that relate to the liver
US9469686B2 (en) * 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
CN103499692B (zh) * 2013-09-26 2015-10-14 江苏福隆生物技术有限公司 高尔基体蛋白gp73定量测定试剂盒及其检测方法
CN104215761B (zh) 2014-08-27 2016-04-20 广西医科大学 检测血清中抗gp73抗体的试剂盒
CN106153934B (zh) * 2015-03-26 2018-06-19 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种高效定量检测高尔基体73的试剂盒
CN106290872A (zh) * 2015-05-21 2017-01-04 天津金虹生物科技开发有限公司 一种高尔基体蛋白gp73定量测定试剂盒及其检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101735319A (zh) * 2008-11-20 2010-06-16 北京热景生物技术有限公司 一种抗gp73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
冯志刚等: "GP73在酒精性肝病中的临床意义", 《国际检验医学杂志》 *
周爱国等: "酒精性肝病与非酒精性脂肪肝患者血清GP73水平差异及意义", 《中华实验和临床病毒学杂志》 *
邓拥军等: "C反应蛋白对单纯性脂肪肝与脂肪性肝炎鉴别诊断的作用", 《中西医结合肝病杂志》 *
魏红山等: "肝细胞脂肪变对血清糖蛋白GP73水平的影响", 《中华实验和病毒学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021179106A1 (zh) * 2020-03-08 2021-09-16 北京舜景生物医药技术有限公司 一种gp73抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用
CN111537719A (zh) * 2020-06-04 2020-08-14 复旦大学附属中山医院 血清Sparcl1蛋白在非酒精性脂肪性肝炎诊断中的应用
CN111537719B (zh) * 2020-06-04 2022-10-04 复旦大学附属中山医院 血清Sparcl1蛋白在非酒精性脂肪性肝炎诊断中的应用

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