WO2018000900A1 - 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018000900A1
WO2018000900A1 PCT/CN2017/080404 CN2017080404W WO2018000900A1 WO 2018000900 A1 WO2018000900 A1 WO 2018000900A1 CN 2017080404 W CN2017080404 W CN 2017080404W WO 2018000900 A1 WO2018000900 A1 WO 2018000900A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sperm antibody
sperm
chemiluminescence immunoassay
immunoassay kit
antibody
Prior art date
Application number
PCT/CN2017/080404
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
何林
Original Assignee
深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 filed Critical 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
Publication of WO2018000900A1 publication Critical patent/WO2018000900A1/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the invention relates to the field of in vitro detection, and in particular to an anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit and a preparation method thereof.
  • Antisperm antibodies bind to sperm to produce an immune response that affects reproductive capacity.
  • Sperm is antigenic to males, while sperm is an allogeneic immune antigen to females.
  • the genital tract local and serum anti-sperm antibodies are products of the body's own or allogeneic immune response to sperm antigens and are the main cause of immune infertility.
  • the effect of antisperm antibodies on infertility is ubiquitous, and part of the infertility caused by anti-sperm immunity can be controlled by appropriate targeted technical measures, and it is very important to take necessary preventive measures.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay is widely used, but this method also has the following shortcomings: [0006] (1) using 12x8 type, 6x8 type, 8x12 type or whole plate type 96-hole special The microplate is used as an antigen coating device and a reaction container. It can only be divided into 12 batches, 6 batches, 8 batches or whole plates in use, and it is impossible to perform independent, single-person detection;
  • the detection reagent is in a space for the detection process, which easily causes cross-contamination between various reagents. Dyeing affects the accuracy of the test results;
  • the detection process is mostly manual operation, the addition amount of the reagent or the sample is not very precise, the operation process is extremely complicated and complicated, the operation error is easy to occur, and the accuracy and precision of the detection result are poor;
  • Chemiluminescence can be divided into direct chemiluminescence and enzymatic chemiluminescence according to the principle of illumination.
  • Enzymatic chemiluminescence mainly has two kinds of horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase, but all have certain limitations.
  • the main disadvantages of horseradish peroxidase are: Luminol is not spicy In the presence of root peroxidase, it is also oxidized by H 2 O 2 itself, the background is relatively high, affecting the signal-to-noise ratio, the reaction kinetics are complex, the influencing factors are many, the results are not stable enough, and the sensitivity is high and the platform is obtained. The long substrate is not easy.
  • the main disadvantages of alkaline phosphatase are: the substrate reaches the interstage length of the plateau, and the substrate cost is high, resulting in high detection cost and heavy burden on patients.
  • the direct chemiluminescence of acridinium ester as a label has a comparative advantage over enzymatic chemiluminescence, mainly in: the reaction does not require a catalyst, as long as the alkaline environment can be carried out, the reaction is rapid, the background luminescence is low, the signal-to-noise ratio High, less interference factors, good reagent stability, can be calibrated at two points, the system is simple, the cost of the stimulating solution is low, the acridine ester is easily linked to the protein, and the photon yield is not reduced after the coupling.
  • An anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit comprising: an anti-sperm antibody recombinant protein-coated carboxylated magnetic particle and an anti-human immunoglobulin-labeled chemiluminescent label.
  • the anti-human immunoglobulin-labeled chemiluminescent label, the anti-human immunoglobulin and the The ratio of luminescent markers is 50: 1 ⁇ 10.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the chemiluminescent label is luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit further includes a chemiluminescent substrate liquid, and the chemiluminescent substrate liquid includes a sputum liquid and a sputum liquid.
  • the liquid A is a H 2 O 2 solution
  • the liquid B is a NaOH solution.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit further includes an anti-sperm antibody calibrator.
  • the anti-sperm antibody calibration standards are 1 U / L, 10 U / L, 100 U / L, 500 U / L, 1000 U /
  • a preparation method of the above-mentioned anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit comprises the following steps: [0027] taking a suspension of carboxylated magnetic particles, magnetically separating the supernatant, and resuspending in MES buffer, Then join E
  • DC aqueous solution activate the surface carboxyl group of carboxylated magnetic particles, then add anti-sperm antibody recombinant protein, suspend for 2h ⁇ 10h at room temperature, remove the supernatant by magnetic separation, and resuspend in Tris buffer to obtain anti-sperm antibody recombinant protein coating.
  • Carboxylated magnetic particles activate the surface carboxyl group of carboxylated magnetic particles, then add anti-sperm antibody recombinant protein, suspend for 2h ⁇ 10h at room temperature, remove the supernatant by magnetic separation, and resuspend in Tris buffer to obtain anti-sperm antibody recombinant protein coating.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit can detect the anti-sperm antibody by using a fully automatic chemiluminescence immunoassay analyzer as a detection tool, and the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit is tested.
  • the sensitivity is up to 1U/L, which is at least 10 times more sensitive than the traditional anti-sperm antibody detection method.
  • the detection accuracy of this anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit is high.
  • 1 is a flow chart of a method for preparing an anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit according to an embodiment.
  • 2 is a standard curve of an anti-sperm antibody obtained in Example 3.
  • An anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit comprising: an anti-sperm antibody recombinant protein-coated carboxylated magnetic particle and an anti-human immunoglobulin-labeled chemiluminescent label.
  • the anti-human immunoglobulin-labeled chemiluminescent label has a ratio of anti-human immunoglobulin to chemical luminescent label of 50:1 to 10.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the chemiluminescent label can be luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester. Among them, the chemiluminescent label is preferably an acridinium ester.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit further comprises a chemiluminescent substrate solution.
  • the chemiluminescent substrate liquid includes mash and mash.
  • Solution A can be H 2 0 2 solution
  • B solution can be NaOH solution.
  • the liquid A is H 2 0 2 having a concentration of 0.1 mol/L.
  • Solution B is a NaOH solution with a concentration of 0.25 mol/L.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescent immunoassay kit further comprises an anti-sperm antibody calibrator.
  • Antisperm antibody calibrators are 1 U/L, 10 U/L, 100 U/L, 500 U/L, 1000 U/L, and 2, respectively.
  • the anti-sperm antibody calibrator can prepare the anti-sperm antibody into a concentration by using a standard buffer. Do not use 1U/L, 10U/L, 100U/L, 500U/L, 1000U/L and 2000U/L antisperm antibody solutions
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit is used for anti-sperm antibody detection, using a fully automatic chemiluminescence immunoassay instrument to detect sperm antibody calibration products, drawing a standard curve, built in computer software; In the actual sample, the sample concentration is calculated based on the luminescence value of the sample; finally, the performance (sensitivity, linearity, precision, and interference) of the sperm antibody-based fully automated chemiluminescence immunoassay system is evaluated.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit can detect the anti-sperm antibody by using a fully automatic chemiluminescence immunoassay analyzer as a detection tool, and the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit is tested.
  • the sensitivity reaches 1U/L, which is at least 10 times more sensitive than the traditional anti-sperm antibody detection method.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit has higher detection accuracy.
  • the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit has the following advantages:
  • the chemiluminescence immunoassay system using acridine ester has a wide linear range and can reach 1U/L ⁇ 1000U/L, while the detection range of the traditional anti-sperm antibody detection method is 20U/L ⁇ 1000U/L. ;
  • the acridine ester chemiluminescence immunoassay system has high reproducibility, and the intra-assay and batch-to-batch difference are within 5%, which is difficult to achieve by other chemiluminescence immunoassay systems;
  • the chemiluminescence immunoassay system has achieved the quantification of the sample, through the built-in standard curve to the test software
  • the chemiluminescence immunoassay system can be fully automated, and the addition of reagents and samples is completed by the instrument, and the operation is simpler and the human error is reduced.
  • the preparation method of the above anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit shown in FIG. 1 includes the following steps:
  • the concentration of MES (2-(N-morpholine)ethanesulfonic acid) buffer was 0.02 M and the pH was 5.5.
  • the Tris buffer was at a concentration of 0.1 M and contained 2% BSA at a pH of 8.0.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the carbonate buffer has a concentration of 0.1 M and a pH of 9.0 9.5.
  • the impurity removal operation is desalting of the centrifugal desalting column, and the specific operation is as follows: First, the centrifugal desalting column is treated with pure water and TBS buffer (40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0), and finally A solution of the obtained anti-sperm antibody recombinant protein-coated carboxylated magnetic particles is added, and finally the liquid in the centrifuge tube is collected.
  • TBS buffer 40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0
  • the ratio of the anti-sperm antibody recombinant protein to the chemical luminescent label is 50:1 ⁇ 10.
  • the chemiluminescent label can be luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester. Among them, the chemiluminescent label is preferably an acridinium ester.
  • the above anti-sperm antibody chemiluminescent immunodetection kit can be obtained by combining the obtained anti-sperm antibody recombinant protein-coated carboxylated magnetic particles and an anti-human immunoglobulin-labeled chemical luminescent label.
  • This anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit requires a chemiluminescent substrate solution and an anti-sperm antibody calibrator in the use of hydrazine.
  • Chemiluminescent substrate fluids and anti-sperm antibody calibrators can be prepared by themselves.
  • the chemiluminescent substrate liquid includes a liquid A and a liquid B.
  • Solution A can be H 2 0 2 solution
  • B solution can be NaOH solution.
  • the liquid A is H 2 0 2 having a concentration of 0.1 mol/L.
  • Solution B is a NaOH solution with a concentration of 0.25 mol/L.
  • the anti-sperm antibody calibrator can be formulated into a concentration of 1 U/L, 10 U/L, 100 U/L, 500 U/L, 1000 U/L, and 2000 U/L by using standard buffer.
  • Anti-sperm antibody solution can be formulated into a concentration of 1 U/L, 10 U/L, 100 U/L, 500 U/L, 1000 U/L, and 2000 U/L by using standard buffer.
  • the preparation method of the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit is simple and convenient, and the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit has high detection sensitivity and has good application prospect.
  • Example 1 Preparation of anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit
  • the antisperm antibody was formulated to a concentration of 0 U/L, 10 U/L, 100 U/L, 500 U/L, using standard buffer (40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0). 1000U/L and 2000U/L, each bottle 0.
  • a fully automatic chemiluminescence immunoassay analyzer (YHLO, item number iFlash3000) is used as a detection tool, and the methodological mode is indirect immunization, that is, the instrument sequentially adds 50 samples, 50 anti-sperm antibody recombinant protein coated carboxylated Magnetic particles and 50 anti-sperm antibody treatment solution, after reacting for 20 min, add 50 anti-human immunoglobulin acridinium ester, react for 20 min, then perform magnetic separation, and the instrument will send the reaction mixture into the dark room, and then add the light-emitting bottom.
  • the liquid A (H 2 0 2 ) and the liquid B (NaOH) were subjected to a luminescence reaction, and finally the luminescence value was recorded.
  • Example 2 The method of Example 2 was used to detect the sperm antibody calibrator, and a standard curve was drawn as shown in FIG. 2 .
  • the sensitivity of the anti-sperm antibody chemiluminescence immunoassay kit was calculated by referring to the CLSI EP17-A document recommended experimental protocol, and the obtained sensitivity was 1 U/L.
  • Taking the mixed serum and adding the interference substance respectively includes: combining bilirubin, free bilirubin, hemoglobin, ascorbic acid, glyceride, and adding the ratio according to 1:20, separately measuring the mixed serum and adding various interferents and mixing The measured value of the serum is calculated as the deviation between the two, with an acceptable range of ⁇ 10%. the result shows The interference level meets the NCCLS document standard and can be used for accurate assessment of anti-sperm antibody status in clinical laboratories.

Abstract

一种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒包括：抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗精子抗体的检测。经过实验，其检测灵敏度达到1U/L，相对于传统的抗精子抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，检测精度较高。

Description

发明名称:抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 技术领域
[0001] 发明涉及体外检测领域， 尤其涉及一种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及 其制备方法。
背景技术
[0002] 抗精子抗体 (antisperm antibody , AsAb)能与精子结合产生免疫反应而影响生殖 能力。 精子对雄性具有抗原性， 而精子对雌性而言是同种异体免疫抗原。 生殖 道局部和血清抗精子抗体是机体对精子抗原产生自身或同种异体免疫反应的产 物， 是引起免疫性不孕的主要原因。 抗精子抗体对不育的影响普遍存在， 而相 当一部分由抗精子免疫导致的不孕可以通过适当的针对性技术措施加以防治， 并采取必要防治措施非常重要。
[0003] 目前临床检测抗精子抗体的常见方法有酶联免疫吸附法、 酶促化学发光法， 但 这些方法都存在着一些不足之处。
技术问题
[0004] 一、 酶联免疫吸附法
[0005] 酶联免疫吸附法 (ELISA)被广泛应用， 但该方法也存在着下述的不足之处： [0006] (1)使用 12x8型、 6x8型、 8x12型或整板型 96孔专用微孔板作为抗原包被用具 和反应容器， 在使用吋只能分成 12批次、 6批次、 8批次或整板一次使用， 无法 进行独立的、 单人份的检测；
[0007] (2)定量测定所用的试剂种类较多， 每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装， 并 且每使用一种试剂吋都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中， 不但试 剂瓶种类多， 加注试剂的操作也极为繁琐；
[0008] (3)缺少对检测信息的相应标注， 只能通过査看试剂盒外包装盒的标识才能了 解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息， 而且所知悉的信息在检测过程中 不受控， 具有很大的随意性；
[0009] (4)检测试剂在检测过程中处于幵放的空间， 容易引起各种试剂之间的交叉污 染而影响检测结果的准确性；
[0010] (5)检测过程多采用手工操作， 试剂或样本的加量不很精确， 操作过程极为繁 琐和复杂， 容易发生操作差错， 检测结果的准确度和精密度较差；
[0011] (6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数 X48/96人份， 如果需 要检测 10个项目， 则试剂的配置及使用数须为 10x48/96人份， 如果只有一份样 本需要检测 10个不同的项目， 也需要配置 10x48/96人份的试剂， 存在着不够经 济合理的缺点。
[0012] 二、 化学发光法
[0013] 化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。
[0014] 酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶 （HRP) 和碱性磷酸酶两种， 但都有一定 的局限性， 辣根过氧化物酶主要缺点为： 鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情 况下， 也会被 H 20 2氧化自身发光， 本底相对较高， 影响信噪比， 反应动力学复 杂， 影响因素多， 结果不够稳定， 要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。 碱性磷酸酶主要缺点为： 底物达到平台期的吋间长， 底物成本高， 导致检测成 本高， 患者负担重。
[0015] 吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势， 主要表现 在： 反应不需要催化剂， 只要碱性环境即可进行， 反应迅速， 背景发光低， 信 噪比高， 干扰因素少， 试剂稳定性好， 可以两点定标， 体系简单， 激发液成本 低， 吖啶酯易与蛋白质联结， 且联结后光子产率不减少。
问题的解决方案
技术解决方案
[0016] 基于此， 有必要提供一种检测灵敏度较高的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂 盒及其制备方法。
[0017] 一种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 包括： 抗精子抗体重组蛋白包被的 羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。
[0018] 所述抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中， 所述抗精子抗体重组蛋白 与所述羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=
[0019] 所述抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中， 所述抗人免疫球蛋白与所述化 学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0020] 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~ 1 μηι。
[0021] 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。
[0022] 所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒,还包括化学发光底物液， 所述化学 发光底物液包括 Α液和 Β液。
[0023] 所述 A液为 H 20 2溶液， 所述 B液为 NaOH溶液。
[0024] 所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒,还包括抗精子抗体定标品。
[0025] 所述抗精子抗体定标品为浓度分别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/
L和 2000U/L的抗精子抗体的溶液。
[0026] 一种上述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 包括如下步骤： [0027] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E
DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入抗精子抗体重组蛋白， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到抗精子抗体重组 蛋白包被的羧基化的磁微粒； 以及
[0028] 取抗人免疫球蛋白， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入化学发光标记物后混 匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物 发明的有益效果
有益效果
[0029] 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为 检测工具， 完成抗精子抗体的检测这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏度达到 1U/L， 相对于传统的抗精子抗体的检测方法灵敏 度至少提高了 10倍， 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高 对附图的简要说明
附图说明
[0030] 图 1为一实施方式的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流程图 [0031] 图 2为实施例 3得到的抗精子抗体标准曲线图。 本发明的实施方式
[0032] 为使本发明的上述目的、 特征和优点能够更加明显易懂， 下面结合附图和具体 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。 在下面的描述中阐述了很多具 体细节以便于充分理解本发明。 但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它 方式来实施， 本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进， 因此本发明不受下面公幵的具体实施的限制。
[0033] 一实施方式的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 包括： 抗精子抗体重组蛋 白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。
[0034] 优选的， 抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中， 抗精子抗体重组蛋白 与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=
[0035] 优选的， 抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中， 抗人免疫球蛋白与化学发 光标记物的比例为 50: 1~10。
[0036] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
[0037] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。
[0038] 在其他的实施例中， 上述抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光 底物液。
[0039] 化学发光底物液包括 Α液和 Β液。 A液可以为 H 20 2溶液， B液可以为 NaOH溶液
[0040] 本实施例中， A液为浓度为 0.1mol/L的 H 20 2
溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。
[0041] 在其他的实施例中， 上述抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括抗精子抗 体定标品。
[0042] 抗精子抗体定标品为浓度分别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2
000U/L的抗精子抗体的溶液。
[0043] 具体的， 抗精子抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗精子抗体配制成浓度分 别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L的抗精子抗体的溶液
[0044] 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒用于抗精子抗体检测吋， 利用全自动 化学发光免疫分析仪对抗精子抗体定标品进行检测， 绘制标准曲线， 内置于电 脑软件； 接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度； 最后对抗精子抗 体全自动化学发光免疫分析系统进行性能 （灵敏度、 线性、 精密度、 干扰性） 的评价。
[0045] 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为 检测工具， 完成抗精子抗体的检测这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏度达到 1U/L， 相对于传统的抗精子抗体的检测方法灵敏 度至少提高了 10倍， 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高
[0046] 此外， 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点：
[0047] 1、 选择吖啶酯作为标记材料， 并应用于化学发光免疫分析系统， 该发光体系 为直接化学发光， 与传统的酶促化学发光相比， 该反应不需要酶的参与， 更加 节约成本；
[0048] 2、 选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽， 能达到 1U/L~ 1000U/L, 而传统的抗精子抗体的检测方法的检线性范围为 20U/L~ 1000U/L;
[0049] 3、 吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高， 批内及批间差均在 5%以内， 这是 其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
[0050] 4、 化学发光免疫分析系统已实现样本的定量， 通过内置标准曲线到测试软件
， 只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
[0051] 5、 化学发光免疫分析系统可以实现全自动化， 试剂及样本的添加全有仪器完 成， 操作更加简便， 减少了人为的误差。
[0052] 如图 1所示的上述抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 包括如下 步骤：
[0053] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入抗精子抗体重组蛋白， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到抗精子抗体重组 蛋白包被的羧基化的磁微粒。
[0054] MES (2-(N-吗啡啉)乙磺酸） 缓冲液的浓度为 0.02M， pH为 5.5。
[0055] Tris缓冲液的浓度为 0.1M并且含有 2%BSA， pH为 8.0。
[0056] EDC (1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺） 水溶液的浓度为 10mg/mL~20m g/mL, EDC与羧基化的磁微粒的比例为 0.05: 0.1-1 =
[0057] 优选的， 抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中， 抗精子抗体重组蛋白 与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35=
[0058] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
[0059] 取抗人免疫球蛋白， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入化学发光标记物后混 匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物
[0060] 碳酸盐缓冲液浓度为 0.1M， pH为 9.0 9.5，
[0061] 除杂的操作为离心脱盐柱脱盐， 具体操作为： 先分别用纯净水及 TBS缓冲液 ( 40 mM Tris-HCl， 0.5% BSA, l% NaCl, pH 8.0) 处理离心脱盐柱， 最后加入得 到的抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒的溶液， 最后收集离心管中的 液体。
[0062] 优选的， 抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中， 抗精子抗体重组蛋白与化 学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0063] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。
[0064] 得到的抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化 学发光标记物组合即可得到上述抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒。
[0065] 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒在使用吋， 还需要化学发光底物液和 抗精子抗体定标品。
[0066] 化学发光底物液和抗精子抗体定标品可以自行配制得到。
[0067] 化学发光底物液包括 A液和 B液。 A液可以为 H 20 2溶液， B液可以为 NaOH溶液 [0068] 本实施例中， A液为浓度为 0.1mol/L的 H 20 2
溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。
[0069] 具体的， 抗精子抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗精子抗体配制成浓度分 别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L的抗精子抗体的溶液
[0070] 这种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便， 制得的抗精子 抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高， 具有良好的应用前景。
[0071]
[0072] 以下为具体实施例。
[0073] 实施例 1 : 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备
[0074] (1) 抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒的制备：
[0075] 取含有 50mg粒径为 0.05μηι~1μιη的羧基化的磁微粒 （MagnaBind™, 货号 21353
) 悬浮液， 磁分离去上清， 用 0.02 M， pH为 5.5 MES缓冲液重悬， 加入 lmL新配 置的 10mg/mL的 EDC水溶液， 活化磁珠表面羧基， 加入 4mg抗精子抗体重组蛋白 (biorbyt, 货号 orb48780) ， 室温下混悬 6h， 磁分离， 去除上清， 用含 2<¾BSA 的 0.1M， pH为 8.0的 Tris缓冲液重悬到 lmg/mL， 得到抗精子抗体重组蛋白包被的 羧基化的磁微粒， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。
[0076] (2) 抗人免疫球蛋白标记的吖啶酯的制备：
[0077] 取 50μί浓度为 25mg/mL的抗人免疫球蛋白， 加入 150μί浓度为 0.1M、 pH为 9.0~
9.5的碳酸盐缓冲液， 混匀， 然后加入 1.5μί浓度为 5mg/mL的吖啶酯溶液混匀， 室温下避光反应， 1.5h后取出， 用 2mL的 zeba离心脱盐柱脱盐处理， 脱盐过程中 首先分别用纯净水及 TBS缓冲液进行处理， 最后加入得到的抗人免疫球蛋白标记 的吖啶酯溶液， 收集离心管中的液体至保存管得到抗人免疫球蛋白标记的吖啶 酯， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。
[0078] (3) 抗精子抗体定标品的制备：
[0079] 用标准品缓冲液 （40 mM Tris-HCl， 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0) 将抗精子 抗体配置成浓度为 0U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L, 每瓶 0.
5 mL分装冻干， 4 °C保存备用。 [0080]
[0081] 实施例 2: 抗精子抗体化学发光免疫检测方法
[0082] 以全自动化学发光免疫分析仪 （YHLO， 货号 iFlash3000) 为检测工具， 方法学 模式为间接免疫法， 即仪器依次加入 50 的样品、 50 的抗精子抗体重组蛋白 包被的羧基化的磁微粒以及 50 的抗精子抗体处理液， 反应 20 min后， 再加 50 的抗人免疫球蛋白吖啶酯， 反应 20 min后， 进行磁分离， 仪器将反应混合物送 入暗室， 依次加入发光底物 A液 （H 20 2) 及 B液 （NaOH) 进行发光反应， 最后 记录发光值。
[0083]
[0084] 实施例 3: 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0085] 采用实施例 2中的方法对抗精子抗体定标品进行检测， 得到绘制标准曲线如图 2 所示。
[0086] 接着对接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度。
[0087] 灵敏度的检测：
[0088] 参照 CLSI EP17-A文件推荐实验方案， 计算抗精子抗体化学发光免疫检测试剂 盒的灵敏度， 求得的灵敏度为 1U/L。
[0089] 线性的检测：
[0090] 对浓度为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L标准品做线性 分析， 计算线性相关系数， r=0.9996， 另外， 该试剂盒对抗精子抗体样品检测的 线性范围为 1U/L ~1000U/L。
[0091] 精密度测定：
[0092] 取浓度为 50U/L及 500U/L两个抗精子抗体样品， 每个样本每个浓度各做 3个平行 ， 用三批试剂盒进行检测， 计算试剂盒批内及批间差， 结果表明该试剂盒批内 及批间差均小于 5%。
[0093] 干扰性实验：
[0094] 取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、 游离胆红素、 血红蛋白、 抗坏 血酸、 甘油酯， 添加比例按照 1 : 20进行， 分别测定混合血清及添加了各种干扰 物后混合血清的测值， 计算二者之间的偏差， 以 ±10%为可接受范围。 结果表明 ， 干扰性均达到 NCCLS的文件标准， 可用于临床实验室抗精子抗体状况的准 确评估。
[0095]
[0096] 实施例 4、 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
[0097] 分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为 0、 50U/L的抗精子 抗体样品做检测， 两种方法检测灵敏度相比， 数据如下表所示：
[]
Figure imgf000011_0001
[0098]
[0099] 由上表可以看出， 化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了 10倍以 上。 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但 并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改 进， 这些都属于本发明的保护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。

Claims

权利要求书
一种抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征在于， 包括： 抗精 子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学 发光标记物。
根据权利要求 1所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 所述抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒中， 所述抗精 子抗体重组蛋白与所述羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35= 根据权利要求 1所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 所述抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物中， 所述抗精子抗 体重组蛋白与所述化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
根据权利要求 1所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
根据权利要求 1所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶 酯。
根据权利要求 1所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 还包括化学发光底物液， 所述化学发光底物液包括 Α液和 Β液
[权利要求 7] 根据权利要求 6所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 所述 A液为 H 20 2溶液， 所述 B液为 NaOH溶液。
[权利要求 8] 根据权利要求 1所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 还包括抗精子抗体定标品。
[权利要求 9] 根据权利要求 8所述的抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 所述抗精子抗体定标品为浓度分别为 1U/L、 10U/L、 100U/L、 500U/L、 1000U/L和 2000U/L的抗精子抗体的溶液。
[权利要求 10] 一种根据权利要求 1~9中任一项所述的抗精子抗体化学发光免疫检测 试剂盒的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接 着加入 EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入抗精 子抗体重组蛋白， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲 液重悬， 得到抗精子抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒； 以及 取抗人免疫球蛋白， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后加入化学发光标 记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抗人免疫球蛋白标 记的化学发光标记物。
PCT/CN2017/080404 2016-06-30 2017-04-13 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 WO2018000900A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610512714.X 2016-06-30
CN201610512714.XA CN106198958A (zh) 2016-06-30 2016-06-30 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018000900A1 true WO2018000900A1 (zh) 2018-01-04

Family

ID=57464154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2017/080404 WO2018000900A1 (zh) 2016-06-30 2017-04-13 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN106198958A (zh)
WO (1) WO2018000900A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106198958A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN113358868A (zh) * 2021-05-24 2021-09-07 迪瑞医疗科技股份有限公司 精子顶体酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103175952A (zh) * 2011-12-22 2013-06-26 兰风华 一种用于检测免疫不育相关自身抗体的新型抗原
CN104897901A (zh) * 2015-05-12 2015-09-09 西安金磁纳米生物技术有限公司 一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测he4的方法
CN105548565A (zh) * 2015-12-30 2016-05-04 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备和应用
CN106198958A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102680456B (zh) * 2011-03-16 2015-07-08 北京联众泰克科技有限公司 一种电化学发光免疫测定方法
CN102980994B (zh) * 2012-11-16 2015-01-07 天津市宝坻区人民医院 分泌型抗精子抗体检测试剂盒及使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103175952A (zh) * 2011-12-22 2013-06-26 兰风华 一种用于检测免疫不育相关自身抗体的新型抗原
CN104897901A (zh) * 2015-05-12 2015-09-09 西安金磁纳米生物技术有限公司 一种基于金磁微粒的吖啶酯化学发光免疫学检测he4的方法
CN105548565A (zh) * 2015-12-30 2016-05-04 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备和应用
CN106198958A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106198958A (zh) 2016-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10732111B2 (en) Automated immunoanalyzer system for performing diagnostic assays for allergies and autoimmune diseases
US20190323969A1 (en) Zinc transporter 8 antibody chemiluminescence immunoassay kit and preparation method thereof
WO2018000902A1 (zh) 25-羟基维生素d化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
TW201812300A (zh) 心肌肌鈣蛋白之測定方法及測定試藥
JP2008216237A (ja) 非特異反応を減少させた免疫診断薬
JP2009098138A (ja) 高感度免疫測定方法
WO2018000897A1 (zh) 人甲胎蛋白异质体3化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
WO2018000903A1 (zh) 抗心磷脂抗体 IgG 化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
WO2018000899A1 (zh) 抗β2糖蛋白I抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
WO2018000900A1 (zh) 抗精子抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
WO2018000446A1 (zh) 抑制素b化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
KR101548284B1 (ko) 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출키트
JPH08503071A (ja) 化学発光ラベル及びビオチン結合リガンドによる抗体の２サイトイムノアッセイ
WO2018000896A1 (zh) 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
JP2014228385A (ja) 免疫試験方法および免疫試験キット
KR101675412B1 (ko) 면역 분석 방법 및 그것을 위한 시약
WO2018000901A1 (zh) 呼吸道合胞病毒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN106404754A (zh) 一种肺炎衣原体IgM化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN106248943A (zh) 抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN111548416B (zh) 检测抗双链dna抗体的试剂盒、组合物及用途
CN107807238A (zh) 抗心磷脂抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
JP2015184125A (ja) 非特異的反応を抑制した免疫学的測定方法
CN114599976A (zh) 选择性检测不同待测物质的免疫分析仪、方法及试剂盒
WO2023243694A1 (ja) ポリヌクレオチドを用いた被検物質の検出方法
JP2009085703A (ja) 高感度免疫測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17818897

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 03/05/2019)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17818897

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1