WO2018000896A1 - 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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WO2018000896A1
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prostate
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antigen homologous
immunoassay kit
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何林
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Definitions

  • the present invention relates to the field of in vitro detection, and in particular to a prostate specific antigen homologue chemical luminescence immunoassay kit and a preparation method thereof.
  • Prostate cancer has become one of the most common tumors in the Western world. It is estimated that there are about 94,000 prostate cancer patients with new diseases every year in the world, and about 258,000 patients die from prostate cancer. In recent years, the incidence of prostate cancer in China has increased year by year. Early detection of prostate cancer is very important for the treatment of prostate cancer. At present, the gold standard for prostate cancer diagnosis is still a prostate biopsy.
  • PSA prostate cancer prediction.
  • the limitations of PSA have become increasingly prominent.
  • the defect of low specificity has led to clinical over-puncture and over-treatment, which has caused psychological burden for patients and caused economic burden for society. Therefore, efforts are being made to find new specific tumor markers for predicting prostate cancer.
  • many tumor-specific markers of prostate cancer have been discovered, and some have been used in clinical practice.
  • people have discovered prostate cancer risk genes. And look forward to genetic testing as a tool to initially screen high-risk groups of prostate cancer.
  • PSA precursor known as the prostate specific antigen homolog (p2PSA) was discovered, and studies have confirmed that P 2 PSA and its derivatives are significantly associated with prostate cancer in the European population. Clinically predicting prostate cancer is of great significance.
  • p2PSA prostate specific antigen homolog
  • Enzyme-linked immunosorbent assay is widely used, but this method also has the following shortcomings: [0008] (1) using 12x8 type, 6x8 type, 8x12 type or whole plate type 96-hole special Microplate as antigen coating device And the reaction vessel can only be divided into 12 batches, 6 batches, 8 batches or whole plates in use, and it is impossible to carry out independent, single-person testing;
  • the detection reagent is in a buffering space during the detection process, which easily causes cross-contamination between various reagents and affects the accuracy of the detection result;
  • the detection process is mostly manual operation, the addition amount of the reagent or the sample is not very precise, the operation process is extremely complicated and complicated, the operation error is easy to occur, and the accuracy and precision of the detection result are poor;
  • the radioimmunoassay method has large radioactive contamination, complicated sample loading steps, complicated operation, long operation time, unstable measurement results, short reagent storage time, low automation of the kit operation, and expensive instruments. .
  • the chemiluminescence method can be classified into direct chemiluminescence and enzymatic chemiluminescence according to the principle of illumination.
  • Enzymatic chemiluminescence mainly has two kinds of horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase, but all have certain limitations.
  • the main disadvantages of horseradish peroxidase are: Luminol is not spicy In the presence of root peroxidase, it is also oxidized by H202.
  • the background is relatively high, affecting the signal-to-noise ratio, the reaction kinetics are complex, the influencing factors are many, the results are not stable enough, and the sensitivity is high and the platform period is long.
  • the substrate is not easy.
  • the main disadvantages of alkaline phosphatase are: the substrate reaches the interstage length of the plateau, and the substrate cost is high, resulting in high detection cost and heavy burden on patients. technical problem
  • the direct chemiluminescence of acridinium ester as a label has a comparative advantage over enzymatic chemiluminescence, mainly in: the reaction does not require a catalyst, as long as the alkaline environment can be carried out, the reaction is rapid, the background illumination is low, the signal-to-noise ratio High, less interference factors, good reagent stability, can be calibrated at two points, the system is simple, the cost of the stimulating solution is low, the acridine ester is easily linked to the protein, and the photon yield is not reduced after the coupling. .
  • a prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit comprising: a prostate specific antigen homologous monoclonal antibody coated carboxylated magnetic particle and an inhibin monoclonal antibody marker Chemiluminescent label.
  • the prostate specific antigen-isolated monoclonal antibody is coated with carboxylated magnetic particles, the prostate specific antigen isomer monoclonal antibody and the carboxylated magnetic particle
  • the ratio is 1: 25 ⁇ 35.
  • the chemoluminescent label of the statin monoclonal antibody wherein the ratio of the prostate specific antigen homologous monoclonal antibody to the chemiluminescent label is 50:1 to 10.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the chemiluminescent label is luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester.
  • the prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit further includes a chemical luminescent substrate liquid, and the chemiluminescent substrate liquid includes sputum and sputum.
  • the liquid A is a H 2 O 2 solution
  • the liquid B is a NaOH solution.
  • the prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit further includes a prostate specific antigen homologue calibrator.
  • the prostate specific antigen homologue calibrator is at a concentration of 0 pg/mL, 50 pg/mL, 20, respectively.
  • the prostate specific antigen homologue chemiluminescence immunoassay kit can detect prostate specific antigen homologues by using a fully automated chemiluminescence immunoassay analyzer as a detection tool.
  • Antigen isomer chemiluminescence immunoassay kit after detection, its detection sensitivity reaches lpg/mL, which is at least 10 times more sensitive than the detection method of traditional prostate specific antigen homologue.
  • the specific antigen homologue chemiluminescence immunoassay kit has high detection accuracy.
  • FIG. 1 is a flow chart showing a method of preparing a prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit according to an embodiment
  • FIG. 2 is a standard curve of prostate specific antigen homologs obtained in Example 3.
  • An embodiment of a prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit comprising: a prostate specific antigen homologous monoclonal antibody coated carboxylated magnetic particles and a monoclonal statin Antibody labeled chemiluminescent label.
  • the ratio of the prostate specific antigen homologous monoclonal antibody to the carboxylated magnetic particles is 1 : 25-35
  • the ratio of the prostate specific antigen homologous monoclonal antibody to the chemiluminescent label is 50:1 ⁇ 10.
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the chemiluminescent label can be luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester. Among them, the chemiluminescent label is preferably an acridinium ester.
  • the prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit further comprises a chemiluminescent substrate fluid.
  • the chemiluminescent substrate liquid includes mash and mash.
  • Solution A can be H 2 0 2 solution
  • B solution can be NaOH solution.
  • the liquid A is H 2 0 2 having a concentration of 0.1 mol/L.
  • Solution B is a NaOH solution with a concentration of 0.25 mol/L.
  • the prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit further comprises a prostate specific antigen homologue calibrator.
  • Prostate-specific antigen homologue calibrators are prostate-specific antigen homologs at concentrations of 0 pg/mL, 50 pg/mL, 200 pg/mL, 500 pg/mL, 1000 pg/mL, and 1600 pg/mL, respectively. Structure solution
  • the prostate specific antigen homologue calibrator can be formulated into a concentration of Opg/mL, 50 pg/mL, 200 pg/mL, respectively, using a standard buffer. , a solution of prostate specific antigen homologues of 500 pg/mL, 1000 pg/mL, and 1600 pg/mL.
  • This prostate specific antigen isomer chemiluminescence immunoassay kit is used for prostate specific antigen homologue detection ⁇ , using a fully automated chemiluminescence immunoassay for prostate specific antigen The homologous calibrator is tested and a standard curve is drawn, which is built into the computer software. Then the actual sample is tested, and the sample concentration is calculated according to the luminescence value of the sample. Finally, the fully chemoluminescence immunoassay of the prostate specific antigen isomer is performed. The system evaluates performance (sensitivity, linearity, precision, and interference).
  • the prostate specific antigen homologue chemiluminescence immunoassay kit can detect the prostate specific antigen homologue by using a fully automatic chemiluminescence immunoassay analyzer as a detection tool.
  • Antigen isomer chemiluminescence immunoassay kit after detection, its detection sensitivity reaches lpg/mL, which is at least 10 times more sensitive than the detection method of traditional prostate specific antigen homologue.
  • the specific antigen homologue chemiluminescence immunoassay kit has high detection accuracy.
  • prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit has the following advantages:
  • the chemiluminescence immunoassay system using acridinium ester has a wide linear range and can reach lpg/mL ⁇
  • the acridinium ester chemiluminescence immunoassay system has high repeatability, and the intra-assay and batch-to-batch difference are within 5%, which is difficult to achieve by other chemiluminescence immunoassay systems;
  • the chemiluminescence immunoassay system has achieved the quantification of the sample, through the built-in standard curve to the test software
  • the chemiluminescence immunoassay system can be fully automated, and the addition of reagents and samples is completed by the instrument, and the operation is simpler and the human error is reduced.
  • the preparation method of the prostate specific antigen homology chemiluminescence immunoassay kit shown in FIG. 1 includes the following steps:
  • the concentration of MES (2-(N-morpholine)ethanesulfonic acid) buffer was 0.02 M and the pH was 5.5.
  • the Tris buffer has a concentration of 0.1 M and contains 2 ⁇ 3 ⁇ 4 BSA and a pH of 8.0.
  • the ratio of the prostate specific antigen homologous monoclonal antibody to the carboxylated magnetic microparticle is 1 : 25-35
  • the carboxylated magnetic particles have a particle diameter of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m.
  • the carbonate buffer has a concentration of 0.1 M and a pH of 9.0 9.5.
  • the impurity removal operation is desalting of the centrifugal desalting column, and the specific operation is as follows: First, the centrifugal desalting column is treated with pure water and TBS buffer (40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0), and finally A solution of the carboxylated magnetic particles coated with the obtained prostate specific antigen homologous monoclonal antibody is added, and finally the liquid in the centrifuge tube is collected.
  • TBS buffer 40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0
  • the ratio of the prostate specific antigen homologous monoclonal antibody to the chemiluminescent label in the chemoluminescent label labeled with the statin monoclonal antibody is 50:1 ⁇ 10.
  • the chemiluminescent label can be luminol, isoluminol, terpyridine or acridinium ester. Among them, the chemiluminescent label is preferably an acridinium ester.
  • the prostate-specific antigen homologous can be obtained by combining the obtained carboxylated magnetic microparticles coated with the prostate specific antigen homologous monoclonal antibody and the chemoluminescent label labeled with the inhibin monoclonal antibody. Chemiluminescence immunoassay kit.
  • Such a prostate specific antigen isomer chemiluminescence immunoassay kit requires a chemiluminescent substrate solution and a prostate specific antigen homologue calibrator in the use of hydrazine.
  • the chemiluminescent substrate solution and the prostate specific antigen homologue calibrator can be prepared by themselves.
  • the chemiluminescent substrate liquid includes a liquid A and a liquid B.
  • Solution A can be H 2 0 2 solution
  • B solution can be NaOH solution.
  • the liquid A is H 2 O 2 having a concentration of 0.1 mol/L.
  • Solution B is a NaOH solution with a concentration of 0.25 mol/L.
  • the prostate specific antigen homologue calibrator can be formulated into a concentration of 0 pg/mL, 50 pg/mL, 200 pg/mL, respectively, using a standard buffer. , a solution of prostate specific antigen homologues of 500 pg/mL, 1000 pg/mL, and 1600 pg/mL.
  • the preparation method of the prostate specific antigen homologue chemiluminescence immunoassay kit is simple and convenient, and the detection sensitivity of the prostate specific antigen homologous chemiluminescence immunoassay kit is high. Has a good application prospects.
  • a suspension containing 50 mg of carboxylated magnetic particles (MagnaBindTM, Cat. No. 21353) having a particle size of 0.05 ⁇ m to 1 ⁇ m was taken, and the supernatant was magnetically separated, resuspended in 0.02 M, pH 5.5 MES buffer, and added to 1 mL.
  • a new 10 mg/mL EDC aqueous solution was activated to activate the carboxyl group on the surface of the magnetic beads, and 4 mg of prostate specific antigen isomer monoclonal antibody (biorbyt, article number orb48780) was added, suspended at room temperature for 6 h, magnetic separation, and the supernatant was removed.
  • a monoclonal antibody against prostate specific antigen is added at a concentration of 25 mg/mL, and 150 ⁇ L of a 0.1 M carbonate buffer having a pH of 9.0 to 9.5 is added, mixed, and then added to 1.5.
  • acridinium ester solution at a concentration of 5 mg/mL, avoid the light reaction at room temperature, take it out after 1.5 hours, and desalinate with 2 mL of Zeba centrifugal desalting column. The desalting process is first treated with pure water and TBS buffer.
  • the obtained inhibin monoclonal antibody-labeled acridinium ester solution is added, and the liquid in the centrifuge tube is collected to the preservation tube to suppress
  • the acridinium ester labeled with the monoclonal antibody was stored in a 5 mL portion of each vial and stored at 4 ° C until use.
  • the prostate specific antigen homologues were formulated to a concentration of Opg/mL, 50 pg/mL, 200 pg/mL, using standard buffer (40 mM Tris-HCl, 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0). 500 pg / mL, lOOOOpg / mL and 1600pg / mL, 0.5 mL per bottle was lyophilized and stored at 4 ° C for later use.
  • the methodological mode is double antibody sandwich method, that is, the instrument sequentially adds 50 samples, 50 prostate specific antigen isomers Cloning antibody-coated carboxylated magnetic particles and 50 prostate-specific antigen isomer treatment solution, after reacting for 20 min, adding 50 prostate-specific antigen homologue-coated acridinium ester, reaction After 20 minutes, the magnetic separation was carried out, and the apparatus was sent to the dark room, and the luminescent substrate A (H 2 0 2 ) and the B liquid (NaOH) were sequentially added to carry out the luminescence reaction, and finally the luminescence value was recorded.
  • YHLO fully automatic chemiluminescence immunoassay analyzer
  • Example 3 Prostate Specific Antigen Isomer Chemiluminescence Immunoassay Kit Performance Evaluation [0089] The prostate specific antigen homologue calibrator was detected by the method of Example 2, The resulting standard curve is shown in Figure 2.
  • the sensitivity of the prostate specific antigen homologue chemiluminescence immunoassay kit was calculated by referring to the CLSI EP17-A document recommended experimental protocol, and the obtained sensitivity was lpg/mL.
  • the kit was specific for prostate specific antigen.
  • the linear range of homologous sample detection is lpg/ml ⁇ 1000pg/mL.
  • Taking the mixed serum and adding the interference substance respectively includes: combining bilirubin, free bilirubin, hemoglobin, ascorbic acid, glyceride, and adding the ratio according to 1:20, separately measuring the mixed serum and adding various interferents and mixing The measured value of the serum is calculated as the deviation between the two, with an acceptable range of ⁇ 10%.
  • the results show that the interference is up to the NCCLS document standard and can be used for accurate assessment of prostate specific antigen homologous status in clinical laboratories.
  • Example 4 Comparative Experiment of Prostate Specific Antigen Isomer Chemiluminescence Immunoassay Kit
  • concentration of 50 pg /mL was determined by chemiluminescence detection method and conventional enzyme-linked immunosorbent assay, respectively.
  • Prostate-specific antigen homologue samples at 200 pg / mL, 500 pg / mL, 1000 pg / mL, and 1600 pg / mL were tested. The sensitivity of the two methods was compared as shown in the following table:
  • the sensitivity of the chemiluminescence detection method is about 10 times higher than that of the enzyme-linked immunosorbent assay.

Abstract

一种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒包括：前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成前列腺特异性抗原同源异构体的检测这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1pg/mL，相对于传统的前列腺特异性抗原同源异构体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。

Description

发明名称：前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒 及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及体外检测领域， 尤其涉及一种前列腺特异性抗原同源异构体化学发 光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 前列腺癌已经成为西方世界发病率最高的肿瘤之一， 据估计， 每年全球新患病 的前列腺癌患者有约 914， 000人， 因为前列腺癌而死亡的患者约为 258， 000人 ， 近些年中国的前列腺癌发病例在逐年攀升。 早期发现前列腺癌对前列腺癌的 治疗十分重要， 目前， 前列腺癌诊断的金标准仍旧是前列腺穿刺活检。
[0003] 上世纪 80年代末， 人类发现了前列腺特异性抗原 (Prostate-specific Antigen,
PSA)是前列腺癌预测的重要标志物。 然而， 在多年的运用中， PSA的局限性也 日益凸显， 特异度较低的缺陷导致了临床上过度穿刺、 过度治疗的发生， 为病 人造成了心理负担， 为社会造成经济负担。 因此， 人们致力于寻找新的特异性 肿瘤标志物用于预测前列腺癌。 近年来， 随着分子生物学的飞速发展， 人们发 现了多种前列腺癌的肿瘤特异性标志物， 部分已应用于临床， 同吋随着人类基 因组学的发展， 人们相继发现了前列腺癌风险基因， 并期待将基因检测作为初 步筛査前列腺癌高危人群的工具。
[0004] 最近， 一种被称为前列腺特异性抗原同源异构体 （p2PSA) 的 PSA前体被发现 ， 研究证实 P2PSA及其衍生指标与前列腺癌在欧洲人群中有着显著的关联， 对于 临床上预测前列腺癌具有重要意义。
[0005] 目前临床检测 P2PSA的常见方法有酶联免疫吸附法、 放射免疫分析法、 酶促化 学发光法， 但这些方法都存在着一些不足之处。
[0006] 一、 酶联免疫吸附法
[0007] 酶联免疫吸附法 (ELISA)被广泛应用， 但该方法也存在着下述的不足之处： [0008] (1)使用 12x8型、 6x8型、 8x12型或整板型 96孔专用微孔板作为抗原包被用具 和反应容器， 在使用吋只能分成 12批次、 6批次、 8批次或整板一次使用， 无法 进行独立的、 单人份的检测；
[0009] (2)定量测定所用的试剂种类较多， 每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装， 并 且每使用一种试剂吋都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中， 不但试 剂瓶种类多， 加注试剂的操作也极为繁琐；
[0010] (3)缺少对检测信息的相应标注， 只能通过査看试剂盒外包装盒的标识才能了 解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息， 而且所知悉的信息在检测过程中 不受控， 具有很大的随意性；
[0011] (4)检测试剂在检测过程中处于幵放的空间， 容易引起各种试剂之间的交叉污 染而影响检测结果的准确性；
[0012] (5)检测过程多采用手工操作， 试剂或样本的加量不很精确， 操作过程极为繁 琐和复杂， 容易发生操作差错， 检测结果的准确度和精密度较差；
[0013] (6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数 X48/96人份， 如果需 要检测 10个项目， 则试剂的配置及使用数须为 10x48/96人份， 如果只有一份样 本需要检测 10个不同的项目， 也需要配置 10x48/96人份的试剂， 存在着不够经 济合理的缺点。
[0014] 二、 放射免疫分析法
[0015] 放射免疫分析方法放射性污染大、 加样步骤繁琐、 操作复杂、 操作吋间长、 测 定结果不稳定、 试剂保存吋间短、 试剂盒操作自动化程度低、 配套仪器价格昂 贵等不足之处。
[0016] 二、 化学发光法
[0017] 化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。
[0018] 酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶 （HRP) 和碱性磷酸酶两种， 但都有一定 的局限性， 辣根过氧化物酶主要缺点为： 鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情 况下， 也会被 H202氧化自身发光， 本底相对较高， 影响信噪比， 反应动力学复 杂， 影响因素多， 结果不够稳定， 要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。 碱性磷酸酶主要缺点为： 底物达到平台期的吋间长， 底物成本高， 导致检测成 本高， 患者负担重。 技术问题
[0019] 吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势， 主要表现 在： 反应不需要催化剂， 只要碱性环境即可进行， 反应迅速， 背景发光低， 信 噪比高， 干扰因素少， 试剂稳定性好， 可以两点定标， 体系简单， 激发液成本 低， 吖啶酯易与蛋白质联结， 且联结后光子产率不减少。 。
问题的解决方案
技术解决方案
[0020] 基于此， 有必要提供一种检测灵敏度较高的前列腺特异性抗原同源异构体化学 发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
[0021] 一种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒， 包括： 前列腺特 异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标 记的化学发光标记物。
[0022] 所述前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中， 所述 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25 ~35。
[0023] 所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中， 所述前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0024] 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~ 1 μηι。
[0025] 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。
[0026] 所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒， 还包括化学发 光底物液， 所述化学发光底物液包括 Α液和 Β液。
[0027] 所述 A液为 H 20 2溶液， 所述 B液为 NaOH溶液。
[0028] 所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒， 还包括前列腺 特异性抗原同源异构体定标品。
[0029] 所述前列腺特异性抗原同源异构体定标品为浓度分别为 0pg/mL、 50pg/mL、 20
Opg/mL、 500pg/mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的 溶液。
[0030] 一种上述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法 ， 包括如下步骤：
[0031] 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 E DC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒； 以及
[0032] 取前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后 加入化学发光标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抑制素单克隆 抗体标记的化学发光标记物。
发明的有益效果
有益效果
[0033] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学 发光免疫分析仪为检测工具， 完成前列腺特异性抗原同源异构体的检测这种前 列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏 度达到 lpg/mL， 相对于传统的前列腺特异性抗原同源异构体的检测方法灵敏度 至少提高了 10倍， 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒 的检测精度较高。
对附图的简要说明
附图说明
[0034] 图 1为一实施方式的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的 制备方法的流程图；
[0035] 图 2为实施例 3得到的前列腺特异性抗原同源异构体标准曲线图。
本发明的实施方式
[0036] 为使本发明的上述目的、 特征和优点能够更加明显易懂， 下面结合附图和具体 实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。 在下面的描述中阐述了很多具 体细节以便于充分理解本发明。 但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它 方式来实施， 本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进， 因此本发明不受下面公幵的具体实施的限制。
[0037] 一实施方式的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒， 包括： 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克 隆抗体标记的化学发光标记物。
[0038] 优选的， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35
[0039] 优选的， 抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中， 前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体与化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0040] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
[0041] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。
[0042] 在其他的实施例中， 上述前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂 盒还包括化学发光底物液。
[0043] 化学发光底物液包括 Α液和 Β液。 A液可以为 H 20 2溶液， B液可以为 NaOH溶液
[0044] 本实施例中， A液为浓度为 0.1mol/L的 H 20 2
溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。
[0045] 在其他的实施例中， 上述前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂 盒还包括前列腺特异性抗原同源异构体定标品。
[0046] 前列腺特异性抗原同源异构体定标品为浓度分别为 0pg/mL、 50pg/mL、 200pg/ mL、 500pg/mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的溶液
[0047] 具体的， 前列腺特异性抗原同源异构体定标品可以采用标准品缓冲液将前列腺 特异性抗原同源异构体配制成浓度分别为 Opg/mL、 50pg/mL、 200pg/mL、 500pg/ mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的溶液。
[0048] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒用于前列腺特异性 抗原同源异构体检测吋， 利用全自动化学发光免疫分析仪对前列腺特异性抗原 同源异构体定标品进行检测， 绘制标准曲线， 内置于电脑软件； 接着测试实际 样本， 根据样本发光值计算样本浓度； 最后对前列腺特异性抗原同源异构体全 自动化学发光免疫分析系统进行性能 （灵敏度、 线性、 精密度、 干扰性） 的评 价。
[0049] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学 发光免疫分析仪为检测工具， 完成前列腺特异性抗原同源异构体的检测这种前 列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒， 经过实验， 其检测灵敏 度达到 lpg/mL， 相对于传统的前列腺特异性抗原同源异构体的检测方法灵敏度 至少提高了 10倍， 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒 的检测精度较高。
[0050] 此外， 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒还具有以下 优点：
[0051] 1、 选择吖啶酯作为标记材料， 并应用于化学发光免疫分析系统， 该发光体系 为直接化学发光， 与传统的酶促化学发光相比， 该反应不需要酶的参与， 更加 节约成本；
[0052] 2、 选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽， 能达到 lpg/mL~
1000pg/mL, 而传统的前列腺特异性抗原同源异构体的检测方法的检线性范围为 10pg/mL~ 1000pg/mL;
[0053] 3、 吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高， 批内及批间差均在 5%以内， 这是 其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
[0054] 4、 化学发光免疫分析系统已实现样本的定量， 通过内置标准曲线到测试软件
， 只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
[0055] 5、 化学发光免疫分析系统可以实现全自动化， 试剂及样本的添加全有仪器完 成， 操作更加简便， 减少了人为的误差。
[0056] 如图 1所示的上述前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制 备方法， 包括如下步骤：
[0057] 羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接着加入 EDC 水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入前列腺特异性抗原同源异 构体单克隆抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得 到前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒。
[0058] MES (2-(N-吗啡啉)乙磺酸） 缓冲液的浓度为 0.02M， pH为 5.5。
[0059] Tris缓冲液的浓度为 0.1M并且含有 2<¾BSA， pH为 8.0。
[0060] EDC (1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺） 水溶液的浓度为 10mg/mL~20m g/mL, EDC与羧基化的磁微粒的比例为 0.05: 0.1-1 =
[0061] 优选的， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中， 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35
[0062] 优选的， 羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη。
[0063] 取前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混匀， 然后 加入化学发光标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂， 得到抑制素单克隆 抗体标记的化学发光标记物。
[0064] 碳酸盐缓冲液浓度为 0.1M， pH为 9.0 9.5，
[0065] 除杂的操作为离心脱盐柱脱盐， 具体操作为： 先分别用纯净水及 TBS缓冲液 ( 40 mM Tris-HCl， 0.5% BSA, l% NaCl, pH 8.0) 处理离心脱盐柱， 最后加入得 到的前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的溶液， 最后收集离心管中的液体。
[0066] 优选的， 抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中， 前列腺特异性抗原同源 异构体单克隆抗体与化学发光标记物的比例为 50: 1~10。
[0067] 化学发光标记物可以为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。 其中， 化学 发光标记物优选为吖啶酯。
[0068] 得到的前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制 素单克隆抗体标记的化学发光标记物组合即可得到上述前列腺特异性抗原同源 异构体化学发光免疫检测试剂盒。
[0069] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒在使用吋， 还需要 化学发光底物液和前列腺特异性抗原同源异构体定标品。
[0070] 化学发光底物液和前列腺特异性抗原同源异构体定标品可以自行配制得到。 [0071] 化学发光底物液包括 A液和 B液。 A液可以为 H 20 2溶液， B液可以为 NaOH溶液
[0072] 本实施例中， A液为浓度为0.1mol/L的H 2O 2
溶液， B液为浓度为 0.25mol/L的 NaOH溶液。
[0073] 具体的， 前列腺特异性抗原同源异构体定标品可以采用标准品缓冲液将前列腺 特异性抗原同源异构体配制成浓度分别为 0pg/mL、 50pg/mL、 200pg/mL、 500pg/ mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的溶液。
[0074] 这种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方 便， 制得的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏 度较高， 具有良好的应用前景。
[0075]
[0076] 以下为具体实施例。
[0077] 实施例 1 : 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的制备
[0078] (1) 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的制备
[0079] 取含有 50mg粒径为 0.05μηι~1μιη的羧基化的磁微粒 （MagnaBind™, 货号 21353 ) 悬浮液， 磁分离去上清， 用 0.02 M， pH为 5.5 MES缓冲液重悬， 加入 lmL新配 置的 10mg/mL的 EDC水溶液， 活化磁珠表面羧基， 加入 4mg前列腺特异性抗原同 源异构体单克隆抗体 （biorbyt, 货号 orb48780) ， 室温下混悬 6h， 磁分离， 去除 上清， 用含 2%BSA的 0.1M， pH为 8.0的 Tris缓冲液重悬到 lmg/mL， 得到前列腺特 异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒， 每瓶 5mL分装保存于 4 °C备用。
[0080] (2) 抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯的制备：
[0081] 取 50μί浓度为 25mg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体， 加入 150μ L浓度为 0.1M、 pH为 9.0~9.5的碳酸盐缓冲液， 混匀， 然后加入 1.5μί浓度为 5mg/ mL的吖啶酯溶液混匀， 室温下避光反应， 1.5h后取出， 用 2mL的 zeba离心脱盐柱 脱盐处理， 脱盐过程中首先分别用纯净水及 TBS缓冲液进行处理， 最后加入得到 的抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯溶液， 收集离心管中的液体至保存管得到抑 制素单克隆抗体标记的吖啶酯， 每瓶 5mL分装保存于 4°C备用。
[0082] (3) 前列腺特异性抗原同源异构体定标品的制备：
[0083] 用标准品缓冲液 （40mMTris-HCl， 0.5% BSA, 1% NaCl, pH 8.0) 将前列腺 特异性抗原同源异构体配置成浓度为 Opg/mL、 50pg/mL、 200pg/mL、 500 pg /mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL， 每瓶 0.5 mL分装冻干， 4°C保存备用。
[0084]
[0085] 实施例 2: 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测方法
[0086] 以全自动化学发光免疫分析仪 （YHLO， 货号 iFlash3000) 为检测工具， 方法学 模式为双抗体夹心法， 即仪器依次加入 50 的样品、 50 的前列腺特异性抗原 同源异构体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒以及 50 的前列腺特异性抗原同 源异构体处理液， 反应 20min后， 再加 50 的前列腺特异性抗原同源异构体包 被的吖啶酯， 反应 20min后， 进行磁分离， 仪器将反应混合物送入暗室， 依次加 入发光底物 A液 （H202) 及 B液 （NaOH) 进行发光反应， 最后记录发光值。
[0087]
[0088] 实施例 3: 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒性能评价 [0089] 采用实施例 2中的方法对前列腺特异性抗原同源异构体定标品进行检测， 得到 绘制标准曲线如图 2所示。
[0090] 接着对接着测试实际样本， 根据样本发光值计算样本浓度。
[0091] 灵敏度的检测：
[0092] 参照 CLSI EP17-A文件推荐实验方案， 计算前列腺特异性抗原同源异构体化学 发光免疫检测试剂盒的灵敏度， 求得的灵敏度为 lpg/ mL。
[0093] 线性的检测：
[0094] 对浓度为 50pg/mL、 200pg/mL、 500pg/mL、 1000pg/mL、 1600pg/mL标准 品做线性分析， 计算线性相关系数， r=0.9996， 另外， 该试剂盒对前列腺特异性 抗原同源异构体样品检测的线性范围为 lpg/ml ~ 1000pg/mL。
[0095] 精密度测定：
[0096] 取浓度为 10pg/mL及 100pg/mL两个前列腺特异性抗原同源异构体样品， 每个样 本每个浓度各做 3个平行， 用三批试剂盒进行检测， 计算试剂盒批内及批间差， 结果表明该试剂盒批内及批间差均小于 5%。
[0097] 干扰性实验：
[0098] 取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、 游离胆红素、 血红蛋白、 抗坏 血酸、 甘油酯， 添加比例按照 1 : 20进行， 分别测定混合血清及添加了各种干扰 物后混合血清的测值， 计算二者之间的偏差， 以 ±10%为可接受范围。 结果表明 ， 干扰性均达到 NCCLS的文件标准， 可用于临床实验室前列腺特异性抗原同源 异构体状况的准确评估。
[0099]
[0100] 实施例 4、 前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒的对比实验 [0101] 分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为 50 pg /mL、 200pg /mL、 500 pg /mL、 1000 pg /mL、 1600 pg /mL的前列腺特异性抗原同源异构体样 品做检测， 两种方法检测灵敏度相比， 数据如下表所示：
[0102]
[0103]
Figure imgf000013_0001
[0104] 由上表可以看出， 化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约 10倍
[0105] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但 并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改 进， 这些都属于本发明的保护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。

Claims

权利要求书
一种前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检测试剂盒， 其特征 在于， 包括： 前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体包被的羧基化 的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
根据权利要求 1所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒， 其特征在于， 所述前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗 体包被的羧基化的磁微粒中， 所述前列腺特异性抗原同源异构体单克 隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为 1 : 25-35= 根据权利要求 1所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒， 其特征在于， 所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记 物中， 所述前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体与所述化学发光 标记物的比例为 50: 1~10。
根据权利要求 1所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒， 其特征在于， 所述羧基化的磁微粒的粒径为 0.05μηι~1μιη
根据权利要求 1所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒， 其特征在于， 所述化学发光标记物为鲁米诺、 异鲁米诺、 三联吡啶钌或吖啶酯。
根据权利要求 1所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒， 其特征在于， 还包括化学发光底物液， 所述化学发光底物 液包括 Α液和 Β液。
根据权利要求 6所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒， 其特征在于， 所述 A液为 H 20 2溶液， 所述 B液为 NaOH溶 液。
根据权利要求 1所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检
[权利要求 9] 根据权利要求 8所述的前列腺特异性抗原同源异构体化学发光免疫检 测试剂盒， 其特征在于， 所述前列腺特异性抗原同源异构体定标品为 浓度分别为 0pg/mL、 50pg/mL、 200pg/mL、 500pg/mL、 lOOOpg/mL和 1600pg/mL的前列腺特异性抗原同源异构体的溶液。
[权利要求 10] —种根据权利要求 1~9中任一项所述的前列腺特异性抗原同源异构体 化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 取羧基化的磁微粒的悬浮液， 磁分离去上清后用 MES缓冲液重悬， 接 着加入 EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基， 接着加入前列 腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体， 室温下混悬 2h~10h， 磁分离去 除上清后用 Tris缓冲液重悬， 得到前列腺特异性抗原同源异构体单克 隆抗体包被的羧基化的磁微粒； 以及
取前列腺特异性抗原同源异构体单克隆抗体， 加入碳酸盐缓冲液后混 匀， 然后加入化学发光标记物后混匀， 室温下避光反应 lh~2h后除杂 ， 得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
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