CN114791489A - 一种肺炎支原体抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肺炎支原体抗体检测试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。所述试剂盒包含肺炎支原体融合抗原工作液，其含有肺炎支原体融合抗原和稀释液；示踪物标记的抗体工作液，其含有抗体IgG、IgM或IgA和稀释液；其中，所述肺炎支原体融合抗原具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；所述稀释液为含有0.02～1wt％的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐的磷酸盐缓冲液。本发明试剂盒采用肺炎支原体融合抗原，特异性更强、灵敏度更高并且具有较好的热稳定性；此外，本发明在稀释液中加入硫酸酯盐型阴离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐，为融合抗原提供了稳定良好的微环境，进一步提高了试剂盒抗原的热稳定性。

Description

一种肺炎支原体抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种肺炎支原体抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是一种无细胞壁的原核细胞，能与宿主呼吸道粘膜上皮细胞的甘露糖胺丙酮酸受体结合并产生毒素，导致肺炎。经血清流行病学研究显示：在中国20.7％～38.9％的社区获得性肺炎患者由MP引起，居成人社区获得性肺炎病原体的首位。MP除导致呼吸道症状外，20％～25％的病例可出现脑膜炎、心肌炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜等肺外表现。及时有效的诊断可有效控制MP感染病情的加重，降低死亡率。因此，MP的准确诊断具有重要的临床意义。
目前，检测MP的主要方法是分离培养、PCR检测、血清特异性抗体检测等几个方面，各有优缺点。病原体分离培养被认为是疾病诊断的金标准，但培养要求条件很高，需要的时间较长(约6周)，故对于临床患者的治疗无实用性，所以很少有实验室通过培养来诊断患者是否感染MP。PCR方法检测MP的P1蛋白基因、16S rRNA及其他蛋白基因，但PCR方法操作复杂，实验人员必须经过专门的培训，所以在一些基层单位很难推广。血清学检测应用最广泛。其中ELISA和CLIA操作简便，可定量检测MP-IgM，但耗时长，整个反应时间需要1个小时以上，且ELISA无法满足随到随检需求。荧光免疫层析和胶体金免疫层析方法具有简单、快速的优势，但均以定性和半定量为主且灵敏度较差。全自动化学发光免疫分析是在酶免疫分析基础上结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，大大提高了检测灵敏度；由于使用全自动仪器及配套试剂，使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性。
稳定性作为体外诊断试剂保持产品安全有效的重要指标，对产品的生产、运输、保存和使用等环节具有重要的指导意义。体外诊断试剂本身就是生物试剂，一些活性基团会有不同的化学不稳定性趋向，容易发生水解、酶解和氧化等反应，从而影响到试剂的质量和稳定性。目前肺炎支原体试剂盒稳定性主要体现在MP抗原上，然而现有的试剂盒其抗原对热的稳定性较差，因此其保存难度较大，需要在较低温度下保存才能保证其中的活性成分不失效。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺炎支原体抗体检测试剂盒及其应用，以解决现有技术存在的肺炎支原体体外检测试剂对热的稳定性较差，保存难度大的问题。本发明试剂盒采用肺炎支原体融合抗原，在不影响融合抗原的高特异性、高灵敏度的情况下，进一步提高了抗原的耐热稳定性。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
在一个方面，本发明提供了一种肺炎支原体抗体检测试剂盒，包含：
肺炎支原体融合抗原工作液，其含有肺炎支原体融合抗原和稀释液；
示踪物标记的抗体工作液；其含有抗体IgG、IgM或IgA和稀释液；
其中，所述肺炎支原体融合抗原具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；所述稀释液为含有0.02～1wt％的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)的磷酸盐缓冲液。
与常用的P1M、P1C和MP全菌抗原不同，本发明试剂盒采用具有高热稳定性的融合抗原(P1M/P30A抗原)，包含P1M抗原片段(其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)与P30A抗原片段(其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)的融合蛋白(又称P1M/P30A抗原)(其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)。编码所述肺炎支原体融合抗原的核酸分子具有如SEQ ID No.6所示的DNA序列。经免疫血清学检测技术验证，与现有的肺炎支原体全菌抗原相比，其特异性更强、灵敏度更高并且具有较好的热稳定性。
同时，本发明在稀释液中加入硫酸酯盐型阴离子表面活性剂(优选脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES))后，进一步提高了抗原的热稳定性且不影响试剂盒的灵敏度和特异性。
在本发明的试剂盒中，所述示踪物标记的抗体工作液中的抗体为二抗，可根据带检测的抗体类型调整二抗的种类。例如抗人IgM抗体、抗人IgG抗体以及抗人IgA抗体。
特别地，当工作液中的AES浓度在一定范围内对融合抗原热稳定性的维持效果最优，试剂盒即便在7天37℃加速后，信号值偏差控制在5％以内。AES较优的浓度范围为0.02～1wt％，包括但不限于0.03、0.05、0.07、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1wt％，其中最优浓度为0.5wt％。
在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲液还含有牛血清白蛋白、氯化钠、蔗糖以及proclin 300；所述牛血清白蛋白的浓度为0.01～5wt％，所述氯化钠的浓度为0.5～10wt％，所述蔗糖的浓度为1～5wt％以及所述proclin 300的浓度为0.05～0.5wt％。
在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲液中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)的浓度为0.5wt％，所述牛血清白蛋白的浓度为1wt％，所述氯化钠的浓度为8wt％，所述蔗糖的浓度为1wt％以及所述proclin 300的浓度为0.05wt％。
本发明在研究中发现，在融合抗原的工作液中加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)作为表面活性剂可以提高试剂盒的热稳定性，表明AES可保护P1M/P30A融合抗原的活性基团，使其在高热环境不易发生水解、酶解和氧化等反应。
在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的pH为6.0～8.0(包括但不限于6.5、7、7.5、8)，浓度为0.01～0.2mol/L，包括但不限于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15和0.2mol/L。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7，浓度为0.05mol/L。
在一个优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液中，含有1wt％的牛血清白蛋白、8wt％的氯化钠、1wt％的蔗糖、0.5wt％的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)、0.05wt％的proclin 300。
在一个实施方案中，所述肺炎支原体融合抗原工作液中，所述肺炎支原体融合抗原的浓度为0.2～1mg/L；所述示踪物标记的抗体工作液中，所述抗体的浓度为0.2～1mg/L。
在一个优选的实施方案中，所述肺炎支原体融合抗原工作液中，所述肺炎支原体融合抗原的浓度为0.5mg/L；所述示踪物标记的抗体工作液中，所述抗体的浓度为0.5mg/L。
所述肺炎支原体融合抗原工作液和所述示踪物标记的抗体工作液是用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)将融合抗原和示踪物标记的抗体分别稀释到一定浓度。
在一个实施方案中，所述示踪物为发光标记物或化学发光催化剂；
优选地，所述发光标记物选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物或三联吡啶钌中的任一种；
优选地，所述化学发光催化剂选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的任一种。
在一个实施方案中，还包括化学发光底物液；优选地，所述化学发光底物液包括NaOH和H2O2。
当示踪物为化学发光催化剂时，化学发光底物液中还包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种。
在一个实施方案中，所述化学发光底物液中，NaOH和H2O2发光体系，AMPPD为发光底物。
在一个实施方案中，所述肺炎支原体抗体试剂盒包括：肺炎支原体融合抗原(P1M/P30A抗原)工作液和示踪物标记的IgG、IgM或IgA抗体工作液。在一个优选的实施方案中，所述肺炎支原体抗体试剂盒包括：肺炎支原体融合抗原工作液、示踪物标记的抗体工作液以及磁性/磁珠微粒/磁珠工作液。
在一个实施方案中，所述肺炎支原体抗体试剂盒中，所述：肺炎支原体融合抗原工作液、示踪物标记的抗体工作液由含有脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)的磷酸盐缓冲液配制而成；所述磁性/磁珠微粒工作液由磷酸盐缓冲液配制而成。
在一个实施方案中，所述肺炎支原体融合抗原直接或间接包被在固体支持物上；更优选地，所述固体支持物包括磁性微球。
进一步地，磁性微球或微粒包括羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠或环氧基磁珠、甲苯磺酰基磁珠或环氧基磁珠等。
在一个实施方案中，所述肺炎支原体融合抗原为生物素标记的肺炎支原体融合抗原；所述试剂盒还包括链霉亲和素偶联的磁珠工作液。
优选地，所述链霉亲和素偶联的磁珠工作液由pH 6.0～8.0，0.01～0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制而成；
所述链霉亲和素磁珠的浓度为0.1～2mg/mL。
在一个优选的实施方案中，所述链霉亲和素偶联的磁珠工作液由pH 7.4，0.05mol/L磷酸盐缓冲液配制而成；所述链霉亲和素偶联的磁珠的浓度为0.5mg/mL。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含生物素标记的P1M/P30A抗原工作液，示踪物标记的IgG，IgM或IgA抗体工作液以及链霉亲和素偶联的磁珠工作液。检测中，将待检样本、生物素标记抗原与链霉亲和素偶联的磁珠混合，孵育和洗涤，再加入示踪物标记的抗体，形成磁珠-链霉亲和素-生物素-抗原-抗体-二抗复合物，进而通过发光强度实现对待测样品的检测。
在一个实施方案中，本发明对肺炎支原体抗体的检测采用全自动化学发光免疫分析，结合酶免疫和化学发光测定技术以及磁性微粒分离技术。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒适于检测的样本包括全血、血清或血浆。
在另一个方面，本发明提供了所述试剂盒在用于非疾病诊断目的的体外肺炎支原体抗体检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中提供的肺炎支原体抗体检测试剂盒，采用肺炎支原体融合抗原(P1M/P30A抗原)，该融合抗原较其他抗原类型(如MP全菌抗原、P1M抗原或P1C抗原)具有更高检测的特异性和灵敏度且热稳定性较高，本发明在融合抗原和抗体(二抗)的工作液中加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)作为表面活性剂，进一步提高了试剂盒的热稳定性。本发明极大提高了试剂盒的稳定性和检测结果的可靠性，同时可以实现肺炎支原体抗体的定量检测。
本发明利用示踪物标记的抗体与融合抗原、测试样品中的抗体形成抗体-抗原-二抗的复合物，并且通过示踪物引发底物的发光性能，由仪器检测发光值，进而计算测试样品中抗体的浓度，由于采用化学发光免疫分析法，节约了成本，检测时间短，同时具有操作简便、精密度高等优点。
本发明试剂盒适用广泛，尤其是将试剂盒用于全自动化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实验自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置校准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的肺炎支原体抗体，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.原料：融合抗原
本发明采用的肺炎支原体抗原为肺炎支原体融合抗原(P1M/P30A抗原)。
采用抗原表位P1M(residues 1341-1518)(SEQ ID No.1)和P30抗原的抗原表位P30A(residues 170-182)(SEQ ID No.2)，并用短肽连接形成P1M/P30A抗原融合抗原(SEQID No.3)。具体的制备方法已在公开的专利文献中报道。
WLVGQLPSTSDGNTSSTNNLAPNTNTGNDVVGVGRLSESNAAKMNDDVDGIVRTPLAELLDGEGQTADTGPQSVKFKSPDQIDFNRLFTHPVTDLFDPVTMLVYDQYIPLFIDIPASVNPKMVRLKVLSFDTNEQSLGLRLEFFKPDQDTQPNNNVQVNPNNGDFLPLLTASSQGPQT(SEQ ID No.1)。
RTGFPPQPGMAPR(SEQ ID No.2)。
WLVGQLPSTSDGNTSSTNNLAPNTNTGNDVVGVGRLSESNAAKMNDDVDGIVRTPLAELLDGEGQTADTGPQSVKFKSPDQIDFNRLFTHPVTDLFDPVTMLVYDQYIPLFIDIPASVNPKMVRLKVLSFDTNEQSLGLRLEFFKPDQDTQPNNNVQVNPNNGDFLPLLTASSQGPQTLQRTGFPPQPGMAPR(SEQ ID No.3)。
本发明采用大肠杆菌偏好性密码子反向翻译本发明的抗原氨基酸序列，获得由大肠杆菌偏好性密码子组成的重组抗原基因核酸分子。该核酸分子可以完整、准确地表达本发明的肺炎支原体融合抗原。
核酸分子优选为SEQ ID No.6所示的DNA序列：
TGGCTGGTTGGCCAGCTGCCGAGCACCAGCGATGGTAACACCAGCAGCACCAACAACCTGGCGCCGAACACCAACACCGGCAACGACGTGGTTGGTGTGGGCCGTCTGAGCGAAAGCAACGCGGCGAAAATGAACGATGACGTGGACGGTATCGTTCGTACCCCGCTGGCGGAGCTGCTGGATGGCGAGGGTCAGACCGCGGACACCGGTCCGCAGAGCGTGAAGTTTAAAAGCCCGGATCAAATCGACTTCAACCGTCTGTTTACCCACCCGGTTACCGACCTGTTCGACCCGGTGACCATGCTGGTTTACGATCAGTATATTCCGCTGTTTATCGACATTCCGGCGAGCGTTAACCCGAAGATGGTGCGTCTGAAAGTTCTGAGCTTCGATACCAACGAGCAAAGCCTGGGTCTGCGTCTGGAGTTCTTCAAACCGGATCAAGACACCCAGCCGAACAACAACGTGCAGGTTAACCCGAACAACGGTGACTTTCTGCCGCTGCTGACCGCGAGCAGCCAAGGTCCGCAGACCCTGCAGCGTACCGGTTTTCCGCCGCAGCCGGGTATGGCGCCGCGTTAA(SEQ ID No.6)。
上述SEQ ID No.6所示的DNA序列中，编码所述P1M抗原片段的DNA序列为：
TGGCTGGTTGGCCAGCTGCCGAGCACCAGCGATGGTAACACCAGCAGCACCAACAACCTGGCGCCGAACACCAACACCGGCAACGACGTGGTTGGTGTGGGCCGTCTGAGCGAAAGCAACGCGGCGAAAATGAACGATGACGTGGACGGTATCGTTCGTACCCCGCTGGCGGAGCTGCTGGATGGCGAGGGTCAGACCGCGGACACCGGTCCGCAGAGCGTGAAGTTTAAAAGCCCGGATCAAATCGACTTCAACCGTCTGTTTACCCACCCGGTTACCGACCTGTTCGACCCGGTGACCATGCTGGTTTACGATCAGTATATTCCGCTGTTTATCGACATTCCGGCGAGCGTTAACCCGAAGATGGTGCGTCTGAAAGTTCTGAGCTTCGATACCAACGAGCAAAGCCTGGGTCTGCGTCTGGAGTTCTTCAAACCGGATCAAGACACCCAGCCGAACAACAACGTGCAGGTTAACCCGAACAACGGTGACTTTCTGCCGCTGCTGACCGCGAGCAGCCAAGGTCCGCAGACC(SEQ ID No.4)。
上述SEQ ID No.6所示的DNA序列中，编码所述P30A抗原片段的DNA序列为：
CGTACCGGTTTTCCGCCGCAGCCGGGTATGGCGCCGCGT(SEQ ID No.5)。
2.标记生物素的P1M/P30A抗原的制备:
(1)0.1mol/L的碳酸缓冲液(透析液)的配制：
在5000mL烧杯中加入Na2CO3 14.31g，NaHCO3 26.46g，加水定容至4500mL，即得0.1mol/L的碳酸缓冲液(透析液)；上述配制好的透析液置于磁力搅拌器上备用。
(2)选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1～2mgP1M/P30A抗原用透析液调整到1～2mL，放入透析液中，室温搅拌透析2～3小时；
将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与P1M/P30A抗原的摩尔比为5:1～20:1的比例将二者混合，37℃反应2小时；再将反应后的液体用0.1mol/L PBS于4℃透析24小时，即制成标记生物素的P1M/P30A抗原溶液。
(3)以G-25凝胶柱纯化上述反应得到的标记生物素的P1M/P30A抗原。
3.包被链霉亲和素的磁性微球的制备：
(1)配制pH为3.6的醋酸缓冲液：称取2.55g三水合乙酸钠用4500mL纯化水溶解后再加入14mL乙酸混匀后，定容至5000mL，即得pH为3.6的醋酸缓冲液。
(2)磁性微球连接(磁性微球连接CMC法)：
往磁性微球中加入包被体积等量的上述pH 3.6醋酸缓冲液悬浮，其中磁性微球浓度为20mg/mL，再加入浓度为10mg/mL的1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，按1mg磁性微球加入12μg链霉亲和素(SA)，组成反应体系。将上述反应体系放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时。
(3)磁性微球的清洗：
磁珠清洗液的配制：在0.05M pH7.4的PBS中溶入BSA，使BSA浓度为0.5g/mL，即为磁珠清洗液。
清洗：将反应好的反应体系倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁珠清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液。
(4)磁性微球的悬浮：
磁珠悬浮液的配制：在0.05M pH 7.4的PBS中溶入BSA和甲基纤维素(MC)，使BSA的浓度为0.5g/mL，MC的浓度为0.4g/mL，即为磁珠悬浮液。清洗完毕后，加入包被体积的磁珠悬浮液，悬浮浓度为20mg/mL，即得到包被链霉亲和素的磁性微球溶液。
4.酶标IgG、IgM或IgA抗体的制备方法，包括以下步骤：
A：将1mL的10～15mg/mL NaIO4水溶液与1mL的5mg/mL ALP(碱性磷酸酶)或HRP(辣根过氧化物酶)水溶液于2～8℃混合反应30～60min，制成活化的ALP或HRP溶液；
然后，向所述活化的ALP或HRP溶液中加入0.5mL的90％(V/V)乙二醇水溶液室温避光反应30～60min，得到ALP或HRP混合溶液；
B：将经过0.05～0.1moL/L pH为8.5～9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的IgG、IgM或IgA抗体与步骤A得到的ALP或HRP混合溶液按质量比1:1～1:2进行混合，于2～8℃透析过夜，得到透析好的IgG、IgM或IgA抗体；
C：向步骤B得到的所述透析好的IgG、IgM或IgA抗体中加入2～8mg/mL的NaBH4溶液80～120μL，2～8℃反应2～4h，然后装入透析袋中，于10～50mM，pH为7.4PBS溶液中2～8℃透析过夜；
D：在搅拌下，向步骤C得到的抗体溶液中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置2～8℃反应1～2h；于3000～5000rpm，30～40min离心弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次；然后将沉淀物溶于1mL 10～50mM的PBS溶液；将上述溶液于10～50mM的PBS溶液中透析后，10000～12000rpm离心，去除沉淀，取上清液即为酶标IgG、IgM或IgA抗体。
5.试剂盒配制
在本发明的一种优选方案中，肺炎支原体抗体试剂盒包括：生物素标记的P1M/P30A抗原工作液，链霉亲和素偶联的磁性微球工作液，示踪物标记的IgG，IgM或IgA抗体工作液。优选地，示踪物标记的IgG、IgM或IgA抗体工作液为碱性磷酸酶标记的IgM抗体。
生物素标记的P1M/P30A抗原工作液、示踪物标记的IgG、IgM或IgA抗体工作液分别采用pH为6.0～8.0，浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液配制而成。所述磷酸盐缓冲液中含有0.01～5wt％的牛血清白蛋白、0.5～10wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～0.5wt％的proclin 300、0.02～1wt％的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)。其中P1M/P30A抗原的工作浓度为25～5000ng/mL，IgG、IgM或IgA抗体的工作浓度为50～5000ng/mL。
标记物体系中，标记示踪物工作浓度优选5-500ng/mL，IgG，IgM或IgA抗体的工作浓度优选50-5000ng/mL。可根据具体情况调整。磁性微球体系中，磁性微球的工作浓度优选0.1～2mg/mL。将各试剂成分的浓度设定在此范围内，既能避免由于浓度过低导致光信号低，影响试剂检测的灵敏度；又能避免浓度过高所造成的成本浪费。
链霉亲和素偶联的磁性微球工作液采用pH为6.0～8.0，浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液配制而成。优选，采用pH为7.4，浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液配制为0.5mg/mL。
本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。例如，是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。所使用的磁性微球应能满足直径为0.1～5μm，磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2、修饰链霉亲和素等。本发明所用标记示踪物包括以下几种：
1、化学发光免疫分析使用的能够直接发光的标记物，如鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物、吖啶酯及其衍生物和三联吡啶钌等；
2、化学发光酶免疫分析使用的配合相应底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶(ALP)或辣根过氧化物酶(HRP)等。
与上述发光标记物配合的氧化系统包括H2O2-微过氧化物酶、H2O2-过氧化氢酶、H2O2-乳过氧化物酶、H2O2-次氯血红素、H2O2-氯化血红素、次氯酸盐-CoCl2、过硫酸盐、过氧化钾、高碘酸钠、H2O2-K3Fe(CN)6、黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶、叔丁醇钾、三丙胺中的至少一种。
化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶，过氧化物酶。使用时，配合相应的化学发光底物即可发光被定量检测，所述化学发光底物包括NaOH和H2O2，还包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种。
优选地，生物素标记的P1M/P30A抗原工作液和碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液采用pH为7.4，浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液配制，其中，所述磷酸盐缓冲液中，含有1wt％的牛血清白蛋白、8wt％的氯化钠、1wt％的蔗糖、0.05wt％的proclin 300、0.5wt％的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)。用所述磷酸盐缓冲液将所述生物素标记的P1M/P30A抗原和所述碱性磷酸酶标记的IgM抗体分别稀释到0.5mg/L。
检测原理：
在一个实施方案中，可以将待测样品、生物素标记的融合抗原工作液和链霉亲和素偶联的磁珠工作液混合孵育，再加入示踪物标记的抗体工作液孵育；也可以将链霉亲和素偶联的磁珠工作液与生物素标记的融合抗原工作液混合孵育，再加入待测样品孵育，再加入示踪物标记的抗体工作液孵育。当样本中存在肺炎支原体的抗体时，则形成磁珠-链霉亲和素-生物素-抗原-抗体-二抗复合物，通过二抗上示踪物标记的信号物读取待测样本的发光强度数值。
实施例1
本实施例中使用链霉亲和素包被磁性微球和生物素标记P1M/P30A抗原的反应体系。
生物素标记P1M/P30A抗原：生物素的工作浓度为100ng/mL，P1M/P30A抗原的工作浓度500ng/mL，标记抗原过程中，取1.5mgP1M/P30A抗原用透析液调整到1.5mL，室温搅拌透析3小时，生物素与P1M/P30A抗原的摩尔比为10：1，按前述标记生物素的P1M/P30A抗原的制备工艺进行标记。
链霉亲和素包被磁性微球：其中磁性微球直径为1μm，工作浓度0.5mg/mL，链霉亲和素的工作浓度10μg/mL，按前述包被链霉亲和素的磁性微球的制备的工艺进行包被。
本实施例中采用碱性磷酸酶(ALP)标记的抗人IgM抗体，NaOH和H2O2发光体系，AMPPD发光底物。
其中ALP工作浓度100ng/mL，抗人IgM抗体的工作浓度500ng/mL。
ALP标记IgM抗体工艺如下：
A：将1mL的10mg/mL NaIO4水溶液与1mL的5mg/mL ALP(碱性磷酸酶)水溶液于2～8℃混合反应60min，制成活化的ALP溶液；然后，向所述活化的ALP溶液中加入0.5mL的90％(V/V)乙二醇水溶液室温避光反应60min，得到ALP混合溶液；
B：将经过0.1moL/L pH为9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液透析得到的IgM抗体与步骤A得到的ALP混合溶液按质量比1:2进行混合，于2～8℃透析过夜，得到透析好的抗原；
C：向步骤B得到的所述透析好的抗原中加入5mg/mL的NaBH4溶液100μL，2～8℃反应4h，然后装入透析袋中，于25mM，pH为7.4PBS溶液中2～8℃透析过夜；
D：在搅拌下，向步骤C得到的抗体溶液中逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，置2～8℃反应2h；于3000rpm，30min离心弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次；然后将沉淀物溶于1mL 20mM的PBS溶液；将上述溶液于10～50mM的PBS溶液中透析后，12000rpm离心，去除沉淀，取上清液即为酶标IgM抗体。
链霉亲和素包被磁珠工作液采用pH为7.4，0.05mol/L PBS缓冲液配制为磁珠的浓度为0.5mg/mL。生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液制备：配制pH为7.4，浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液中含有1wt％的牛血清白蛋白、8wt％的氯化钠、1wt％的蔗糖、0.5wt％的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)、0.05wt％的proclin 300。然后用该磷酸盐缓冲液将生物素标记P1M/P30A抗原，碱性磷酸酶标记的IgM抗体分别稀释到0.5mg/L。
实施例2
将实施例1中抗原和抗体工作液中的AES浓度改为0.02wt％，其余条件与实施例1相同。
实施例3
将实施例1中抗原和抗体工作液中的AES浓度改为1wt％，其余条件与实施例1相同。
对比例1
将实施例1中的生物素标记的P1M/P30A抗原替换为生物素标记的MP全菌抗原，抗原和抗体工作液中的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)去除，其余条件与实施例1相同。
对比例2
将实施例1中生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)去除，其余条件与实施例1相同。
对比例3
将实施例1中生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)替换为相同浓度的十八烷基三甲基氯化铵(阳离子表面活性剂)，其余条件与实施例1相同。
对比例4
将实施例1中生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)替换为相同浓度的烷基磷酸单酯盐(磷酸酯盐类阴离子表面活性剂)，其余条件与实施例1相同。
对比例5
将实施例1中生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)替换为相同浓度的吐温20(非离子表面活性剂)，其余条件与实施例1相同。
对比例6
将实施例1中的生物素标记的P1M/P30A抗原替换为生物素标记的P1M抗原，生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)去除，其余条件与实施例1相同。
对比例7
将实施例1中的生物素标记的P1M/P30A抗原替换为生物素标记的P1M抗原，其余条件与实施例1相同。
对比例8
将实施例1中的生物素标记的P1M/P30A抗原替换为生物素标记的P1C抗原，生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)去除，其余条件与实施例1相同。
对比例9
将实施例1中的生物素标记的P1M/P30A抗原替换为生物素标记的P1C抗原，其余条件与实施例1相同。
对比例10
将实施例1中生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的AES浓度改为0.015wt％，其余条件与实施例1相同。
对比例11
将实施例1中生物素标记的P1M/P30A抗原工作液以及碱性磷酸酶标记的IgM抗体工作液中的AES浓度改为3wt％，其余条件与实施例1相同。
配制实施例1和对比例1、2中的试剂盒，检测广东某医院收集的50例肺炎支原体IgM阳性样本(编号为P1-P50)和50例健康人阴性样本(编号为N1-N50)比较3种试剂盒的灵敏度和特异性。
表1.实施例1试剂盒测定结果与临床样本灵敏度、特异性分析
Figure BDA0003614143100000171
结果分析:
灵敏度46/50；92.00％，置信区间(80.77％～97.78％)；
特异性49/50；98.00％，置信区间(89.35％～99.95％)。
表2.对比例1试剂盒测定结果与临床样本灵敏度、特异性分析
Figure BDA0003614143100000181
结果分析：
灵敏度40/50；80.00％，置信区间(66.28％～89.97％)；
特异性46/50；92.00％，置信区间(80.77％～97.78％)。
表3.对比例2试剂盒测定结果与临床样本阴阳性符合率分析
Figure BDA0003614143100000182
结果分析：
灵敏度46/50；92.00％，置信区间(80.77％～97.78％)；
特异性49/50；98.00％，置信区间(89.35％～99.95％)。
通过表1、2、3的对比分析，结果表明：MP全菌抗原与阴阳性临床样本的灵敏度为80％、特异性为92％，P1C/P30A抗原的灵敏度为92％、特异性为98％，说明本发明提供的P1M/P30A融合抗原具有更高的特异性和灵敏度。且AES不影响P1M/P30A融合抗原与抗体特异性结合和试剂盒的检测结果。
配制实施例1-3和对比例1-11中的试剂盒各2套，分别放于2～8℃冷藏环境和37℃高热环境，保存7天后对比测试MP纯化抗体浓度依次增加的三支样本L1、L2、L3，比较信号升降程度。
表4. 14种试剂盒2-8℃冷藏和37℃热加速后对比分析
Figure BDA0003614143100000183
Figure BDA0003614143100000191
结果表明：通过实施例1、对比例1和对比例2信号值升降偏差可知，P1M/P30A融合抗原的热稳定性优于MP全菌抗原，加速后信号值偏差均值由-33.81％升高至-18.21％，信号值偏差降低了46.1％。在P1M/P30A融合抗原的工作液中加入AES可进一步提高试剂盒的热稳定性，信号值偏差均值由-18.21％提升至-1.33％，信号值偏差降低了92.70％，产生了预料不到的技术效果，说明AES可保护P1M/P30A融合抗原的活性基团，使其在高热环境不易发生水解、酶解和氧化等反应。
通过实施例1、对比例3、对比例4和对比例5信号值升降偏差可知，对比例3中所使用的十八烷基三甲基氯化铵(阳离子表面活性剂)降低了试剂盒的热稳定性，信号值偏差均值由-18.21％降低至-51.41％，信号值偏差提高了182.3％；对比例4中所使用的烷基磷酸单酯盐(磷酸酯盐类阴离子表面活性剂)提升了试剂盒的热稳定性，信号值偏差均值由-18.21％提高至-15.14％，信号值偏差降低了16.86％，效果不明显；对比例5中所使用的吐温20(非离子表面活性剂)提升了试剂盒的热稳定性，信号值偏差均值由-18.21％提高至-17.13％，信号值偏差降低了5.96％，效果不明显；实施例1中使用的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐AES(硫酸酯盐型阴离子表面活性剂)提高试剂盒的热稳定性，信号值偏差均值由-18.21％提升至-1.33％，信号值偏差降低了92.70％，产生了预料不到的技术效果。对比例3～5与实施例1相比可推测：只有硫酸酯盐型阴离子表面活性剂AES对P1M/P30A融合抗原的热稳定性有明显的提升，其他种类的阴离子表面活性剂(磷酸酯盐类)，非离子表面活性剂对P1M/P30A融合抗原的热稳定性未有明显改善。而阳离子表面活性剂破坏蛋白活性基团导致P1M/P30A融合抗原热稳定变差。
通过实施例1、对比例2、对比例6、对比例7、对比例8和对比例9信号值升降偏差可知，P1M抗原在使用了AES后，降低了试剂盒的热稳定性，信号值偏差均值由-32.31％降低至-34.27％，信号值偏差提升了6.07％，效果不明显；P1C抗原在使用了AES后，降低了试剂盒的热稳定性，信号值偏差均值由-39.82％降低至-41.55％，信号值偏差提升了4.34％，效果不明显；因此推测，AES仅可提升P1M/P30A融合抗原的热稳定性，对其他MP抗原P1C和P1M的热稳定性没有明显效果。说明AES可特异性的提高P1M/P30A融合抗原热稳定性，对其他肺炎支原体抗原未必产生此效果。
通过实施例1、对比例10、对比例11、实施例2、实施例3信号值升降偏差可知，实施例2和实施例3的试剂盒与实施例1的试剂盒7天37℃加速后，信号值偏差均在5％以内。对比例10和对比例11的试剂盒检测结果信号值偏差超过10％，说明AES较优的浓度范围为0.02～1wt％，其中最优浓度为0.5wt％。
本发明利用链霉亲和素-生物素的信号放大系统，采用高热稳定性P1M/P30A融合抗原替代MP全菌抗原，加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐(AES)表面活性剂后，进一步提高P1M/P30A融合抗原的热稳定性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海丽珠试剂股份有限公司
<120> 一种肺炎支原体抗体检测试剂盒及其应用
<130> PA22005097
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 178
<212> PRT
<213> P1M
<400> 1
Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr Ser Ser
1 5 10 15
Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val Val Gly
20 25 30
Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp Asp Val
35 40 45
Asp Gly Ile Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly Glu Gly
50 55 60
Gln Thr Ala Asp Thr Gly Pro Gln Ser Val Lys Phe Lys Ser Pro Asp
65 70 75 80
Gln Ile Asp Phe Asn Arg Leu Phe Thr His Pro Val Thr Asp Leu Phe
85 90 95
Asp Pro Val Thr Met Leu Val Tyr Asp Gln Tyr Ile Pro Leu Phe Ile
100 105 110
Asp Ile Pro Ala Ser Val Asn Pro Lys Met Val Arg Leu Lys Val Leu
115 120 125
Ser Phe Asp Thr Asn Glu Gln Ser Leu Gly Leu Arg Leu Glu Phe Phe
130 135 140
Lys Pro Asp Gln Asp Thr Gln Pro Asn Asn Asn Val Gln Val Asn Pro
145 150 155 160
Asn Asn Gly Asp Phe Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ser Ser Gln Gly Pro
165 170 175
Gln Thr
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> P30A
<400> 2
Arg Thr Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 193
<212> PRT
<213> P1M/P30A
<400> 3
Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr Ser Ser
1 5 10 15
Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val Val Gly
20 25 30
Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp Asp Val
35 40 45
Asp Gly Ile Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly Glu Gly
50 55 60
Gln Thr Ala Asp Thr Gly Pro Gln Ser Val Lys Phe Lys Ser Pro Asp
65 70 75 80
Gln Ile Asp Phe Asn Arg Leu Phe Thr His Pro Val Thr Asp Leu Phe
85 90 95
Asp Pro Val Thr Met Leu Val Tyr Asp Gln Tyr Ile Pro Leu Phe Ile
100 105 110
Asp Ile Pro Ala Ser Val Asn Pro Lys Met Val Arg Leu Lys Val Leu
115 120 125
Ser Phe Asp Thr Asn Glu Gln Ser Leu Gly Leu Arg Leu Glu Phe Phe
130 135 140
Lys Pro Asp Gln Asp Thr Gln Pro Asn Asn Asn Val Gln Val Asn Pro
145 150 155 160
Asn Asn Gly Asp Phe Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ser Ser Gln Gly Pro
165 170 175
Gln Thr Leu Gln Arg Thr Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro
180 185 190
Arg
<210> 4
<211> 534
<212> DNA
<213> 编码所述P1M抗原片段的DNA序列
<400> 4
tggctggttg gccagctgcc gagcaccagc gatggtaaca ccagcagcac caacaacctg 60
gcgccgaaca ccaacaccgg caacgacgtg gttggtgtgg gccgtctgag cgaaagcaac 120
gcggcgaaaa tgaacgatga cgtggacggt atcgttcgta ccccgctggc ggagctgctg 180
gatggcgagg gtcagaccgc ggacaccggt ccgcagagcg tgaagtttaa aagcccggat 240
caaatcgact tcaaccgtct gtttacccac ccggttaccg acctgttcga cccggtgacc 300
atgctggttt acgatcagta tattccgctg tttatcgaca ttccggcgag cgttaacccg 360
aagatggtgc gtctgaaagt tctgagcttc gataccaacg agcaaagcct gggtctgcgt 420
ctggagttct tcaaaccgga tcaagacacc cagccgaaca acaacgtgca ggttaacccg 480
aacaacggtg actttctgcc gctgctgacc gcgagcagcc aaggtccgca gacc 534
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 编码所述P30A抗原片段的DNA序列
<400> 5
cgtaccggtt ttccgccgca gccgggtatg gcgccgcgt 39
<210> 6
<211> 582
<212> DNA
<213> 编码肺炎支原体融合抗原的DNA序列
<400> 6
tggctggttg gccagctgcc gagcaccagc gatggtaaca ccagcagcac caacaacctg 60
gcgccgaaca ccaacaccgg caacgacgtg gttggtgtgg gccgtctgag cgaaagcaac 120
gcggcgaaaa tgaacgatga cgtggacggt atcgttcgta ccccgctggc ggagctgctg 180
gatggcgagg gtcagaccgc ggacaccggt ccgcagagcg tgaagtttaa aagcccggat 240
caaatcgact tcaaccgtct gtttacccac ccggttaccg acctgttcga cccggtgacc 300
atgctggttt acgatcagta tattccgctg tttatcgaca ttccggcgag cgttaacccg 360
aagatggtgc gtctgaaagt tctgagcttc gataccaacg agcaaagcct gggtctgcgt 420
ctggagttct tcaaaccgga tcaagacacc cagccgaaca acaacgtgca ggttaacccg 480
aacaacggtg actttctgcc gctgctgacc gcgagcagcc aaggtccgca gaccctgcag 540
cgtaccggtt ttccgccgca gccgggtatg gcgccgcgtt aa 582

Claims (10)

1.一种肺炎支原体抗体检测试剂盒，其特征在于，包含：
肺炎支原体融合抗原工作液，其含有肺炎支原体融合抗原和稀释液；
示踪物标记的抗体工作液；其含有抗体IgG、IgM或IgA和稀释液；
其中，所述肺炎支原体融合抗原具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；所述稀释液为含有0.02～1wt％的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液还含有0.01～5wt％的牛血清白蛋白、0.5～10wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖以及0.05～0.5wt％的proclin300。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐的浓度为0.5wt％；所述牛血清白蛋白的浓度为1wt％，所述氯化钠的浓度为8wt％，所述蔗糖的浓度为1wt％以及所述proclin 300的浓度为0.05wt％。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肺炎支原体融合抗原工作液中，所述肺炎支原体融合抗原的浓度为0.2～1mg/L；所述示踪物标记的抗体工作液中，所述抗体的浓度为0.2～1mg/L。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪物为发光标记物或化学发光催化剂；
优选地，所述发光标记物选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物或三联吡啶钌中的任一种；
优选地，所述化学发光催化剂选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的任一种。
6.根据权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括化学发光底物液；优选地，所述化学发光底物液包括NaOH和H2O2。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肺炎支原体融合抗原直接或间接包被在固体支持物上；优选地，所述固体支持物包括磁性微球。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肺炎支原体融合抗原为生物素标记的肺炎支原体融合抗原，所述试剂盒还包括链霉亲和素偶联的磁珠工作液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素偶联的磁珠工作液由pH6.0～8.0，0.01～0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制而成；
优选地，所述链霉亲和素偶联的磁珠的浓度为0.1～2mg/mL。
10.根据权利要求1-9任一项所述的试剂盒在用于非疾病诊断目的的体外肺炎支原体抗体检测中的应用。
CN202210441506.0A 2022-04-25 2022-04-25 一种肺炎支原体抗体检测试剂盒及其应用 Pending CN114791489A (zh)

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