CN116430032A - 一种降钙素原的化学发光检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外检测技术领域，公开了一种降钙素原的化学发光检测试剂盒及其检测方法,本检测试剂盒采用了一步夹心法反应原理。该检测方法包括：1)R1试剂:用降钙素原单克隆第一抗体包被磁珠；2)R2试剂：用PCT单克隆第二抗体标记吖啶酯；3)以PCT重组抗原制备的校准品及质控品；4)样本或校准品中的降钙素原与R1试剂和R2试剂混合均匀并发生反应；5)经过一定的温育时间后清洗读数，即可计算样本中降钙素原的含量。本发明提供了一种降钙素原测定试剂盒，并且可以配合全自动化学发光分析仪对血清中降钙素原进行高通量快速化测定。其优点在于灵敏度高，特异性好，准确性高，精密度好，且样本无需预稀释，操作简单省时等。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，是一种体外诊断试剂，用于定量检测人血液或血清中降钙素原(PCT)的含量，具体涉及一种降钙素原的化学发光检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
细菌病毒等经由创面、泌尿道、呼吸道、消化道入侵，在创伤严重造成机体抵抗力差的条件下，会引起严重的感染症状，带来如脓毒症、败血症休克，多器官功能障碍症等多种临床并发症，严重情况下会造成死亡。在临床上细菌感染尤其是脓毒症感染的一个重要特异性指标就是降钙素原(procalcitonin，PCT)，与同类感染指标如白细胞分类和计数，血常规检查，IL-2，IL-6，IL-8，CRP和TNF-α相比，PCT作为特异性检测指标，误诊及漏诊的概率大大降低。PCT对脓毒症患者的全身炎症反应综合征(SIRS)患者的敏感性最高(85％)和特异性(91％)最高，因此可以作为诊断脓毒症和鉴别严重细菌感染的生物标志物。
PCT是无激素活性的降钙素前肽物质，来自定位于第11号染色体上(11p15,4)的单拷贝基因，该基因由280个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子。仅在甲状腺的C细胞受到激素性刺激时才产生，经酶切作用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116氨基酸的PCT，分子量约为13kD，PCT和降钙素具有一个相同的32个氨基酸的序列(60～91位)。PCT对于机体细菌感染的反馈十分灵敏，在2-4h内迅速升高，12-48h内即可达到峰值，在健康人的血清PCT质量浓度低于0.05ng/ml。即使在不足10％的特殊体质人群，老年人和慢性疾病患者体内，PCT含量也不会超过0.3ng/ml。临床表明当PCT为0.10-0.25ng/ml时，提示细菌感染的可能性不大，PCT为0.25-0.50ng/ml时，可能存在需要治疗的细菌感染，多数专家建议将0.50ng/ml作为脓毒症的诊断临界值，严重脓毒症和脓毒性休克患者PCT质量浓度波动在2～500ng/ml之间，超过10ng/ml时患者存在死亡风险。这也就决定了PCT的高特异性及高灵敏性，对于脓毒症和全身性细菌感染的辅助鉴别诊断预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值。
目前降钙素原的测定方法众多，如化学发光免疫分析法(CLIA)、放射性免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)。但在实际应用中逐渐反应出一些缺陷，如RIA有放射性元素的污染，检测耗时长，检测结果重复性差，而且标记物的货架期短。ELISA酶易失活且大分子标记容易产生位阻效应，导致其灵敏度不高线性范围窄、不易实现全自动化等。GICA的检测灵敏度低，并且只能做定性无法准确实验定量检测。CLIA是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势，近年来得到了广泛应用。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点。市售的PCT化学发光检测试剂盒大多包含链霉亲和素磁珠、生物素标记的PCT抗体和吖啶酯标记的PCT抗体等试剂，制备过程繁琐不易控制。且在将该试剂盒装载在化学发光免疫分析仪中进行测试时，化学发光免疫分析仪需要分别从四个试剂杯中吸取试剂加入反应杯中，以便进行检测，存在着试剂吸取程序较为复杂的问题。
现有技术，如公开号为CN113030497A公开了一种检测降钙素原的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒，该专利中的试剂盒的灵敏度只能达到0.2ng/ml，试剂盒特异性也较差、检测范围较窄。另外，中国专利CN105842458A以及CN106093416B公开的检测降钙素原的试剂盒，也存在着线性范围窄的问题，并且前者检测整体曲线斜率较低。另一中国专利CN109061186A公开了一种PCT酶促发光法检测试剂盒，该试剂盒的检测步骤十分复杂。与之有相同检测步骤繁琐问题的还有专利CN111175492A和CN107367626A报道的两种链霉亲和素试剂盒，并且上述两种试剂盒制备过程也较为复杂。中国专利CN104749367A和CN201510152340.0公开的降钙素原检测试剂盒中，校准品为冻干状态，存在冻干与复溶工艺的复杂及不可控风险。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提出一种检测血液中降钙素原的试剂盒，阐明了该降钙素原检测试剂盒的制备方法及降钙素原的检测方法，解决了校准品稳定性差，检测灵敏度低，特异性差，试剂成分复杂且制备可控性差等问题。
本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：
本发明提出的降钙素原化学发光检测试剂盒包括如下试剂：
1)R1试剂:用降钙素原单克隆第一抗体包被磁微粒。
2)R2试剂：用PCT单克隆第二抗体标记吖啶酯。
3)以PCT重组抗原制备的校准品及质控品。
所述PCT校准品、所述PCT质控品均为含有PCT抗原和质量百分含量0.5-5.0％(w/v)蛋白稳定剂、质量百分含量0.5-5.0‰(v/v)防腐剂。其中，所述PCT质控品抗原的浓度分别为0.1ng/mL、10.0ng/mL；所述PCT校准品抗原的浓度分别为0.1ng/mL、10.0ng/mL和40.0ng/mL。
所述R1试剂均为含有用降钙素原单克隆第一抗体包被磁微粒和质量百分含量0.5-5.0％(w/v)蛋白稳定剂、质量百分含量0.5-5.0‰(v/v)防腐剂、质量百分含量0.1-2.0％增敏剂的缓冲液。
所述R2试剂均为含有用降钙素原单克隆第二抗体标记吖啶酯和质量百分含量0.5-5.0％(w/v)蛋白稳定剂、质量百分含量0.5-5.0‰(v/v)防腐剂、质量百分含量0.1-2.0％增敏剂的缓冲液。
进一步地，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
进一步地，所述防腐剂为：叠氮化钠、苯酚和procline300中一种或多种。
进一步地，所述蛋白稳定剂为：山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、羧甲基纤维素、环糊精、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和牛血清白蛋白的一种或多种。
进一步地，所述增敏剂为：Bronidox、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、吐温20、吐温80、CTAB、IPTG或Poloxamer 188中一种或多种。
进一步地，所述磁微粒的粒径在0.5-5μm。
优选地，所述磁微粒与PCT第一单克隆抗体的包被过程由磁珠清洗，磁珠活化，抗体包被反应，磁珠封闭以及清洗收集组成。
具体包括如下使用步骤：
1)清洗磁珠：
将磁珠原液置于血液混匀仪上50-110r/min混匀至磁珠分散均匀无凝集，取50-500μL混匀后的磁珠原液加入到润洗后的玻璃瓶中，加入2-15mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，在血液混匀仪上50-110r/min混匀2-10min。静置磁吸1-5min，将磁力架与玻璃瓶同时上下颠倒2次以上，以将瓶盖与泡沫中的磁珠涮洗至液体中，静置磁吸1-5min，移弃上清，加入0.5-2.0mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集后，在血液混匀仪上50-110r/min混匀1-5min。重复清洗2次以上。
2)磁珠活化：
加入50-500μL Sulfo-NHS溶液(5-30mg/mL)，上下颠倒混匀10次，再加入50-500μLEDC(5-30mg/mL)，立即上下颠倒混匀10次，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上50-110r/min混匀活化10-70min。
3)抗体偶联及封闭：
静置磁吸1-5min，将磁力架与玻璃瓶同时上下颠倒2次以上，以将瓶盖与泡沫中的磁珠涮洗至液体中，静置磁吸2min，移弃上清，加入0.5-2.0mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集后，在血液混匀仪上50-110r/min混匀1-5min。重复清洗3-5次，最后1次移弃上清后加入0.5-2.0mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠。取0.02-2mg包被抗体，加入到重悬的磁珠中，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集后，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上50-110r/min混匀过夜孵育。反应结束，加入20-150μL浓度为0.5-15％的牛血清白蛋白溶液进行封闭，封闭时间0.2-2h。
4)清洗并保存：
静置磁吸1-5min，将磁力架与玻璃瓶同时上下颠倒2次以上，以将瓶盖与泡沫中的磁珠涮洗至液体中，静置磁吸1-5min，移弃上清，加入0.5-2.0mL磁珠稀释液重悬磁珠，在血液混匀仪上50-110r/min混匀3min，重复清洗10次，最后1次移弃上清后加入0.5-2.0mL磁珠稀释液重悬磁珠。
进一步地，所述的磁珠偶联缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
优选地，所述吖啶酯与PCT第二单克隆抗体的标记过程由抗体清洗，吖啶酯标记，吖啶酯封闭以及吖啶酯-抗体复合物清洗收集组成。
具体包括如下使用步骤：
1)抗体清洗
取一支50K规格的超滤管，加入200-600μL吖啶酯标记缓冲液，清洗3次以上，每离心一次弃去超滤管中液体。取PCT第二单克隆抗体0.02-0.3mg加入超滤管，用吖啶酯标记缓冲液清洗3次以上，每次定容到200-600μL，最后吸取底部剩余抗体溶液，转移至1.5mL的离心管中，用吖啶酯标记缓冲液定容至100-300μL。
2)吖啶酯标记
在离心管中加入1-10uL吖啶酯溶液。放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上50-150r/min避光混匀反应0.5-5h。
3)吖啶酯封闭
标记反应结束后，在离心管中加入0.5-5％(w/v)的赖氨酸溶液20-150μL，立即用移液器吹打混匀10次，在血液混匀仪上50-150r/min，避光混匀封闭10-60min。
4)吖啶酯-抗体复合物清洗收集
将封闭后的抗体溶液转移至超滤管内管中，离心1次弃去超滤管外管中液体。加入200-600uL吖啶酯纯化缓冲液，重复离心清洗3-10次，每离心一次弃去超滤管外管中液体。清洗过程结束后，将超滤管中收集的抗体标记液转移至洁净离心管中，加入吖啶酯纯化缓冲液定容至0.2-3.0mL。
进一步地，所述的吖啶酯标记缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
所述降钙素原化学发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：将PCT校准品、血清、血浆或全血作为样本加入反应杯中，并加入R1试剂和R2试剂，于25-40℃条件下温育5-30min，清洗后读取样本中降钙素原的含量。
优选的，所述的待测样本、所述的R1试剂和所述的R2试剂的体积比为1:0.5-2。0：0.5-2.0。
本发明是采用直接化学发光检测技术，测定人全血、血浆及血清样品中的降钙素原的定量体外诊断试剂盒，可以与其他临床信息联合用于诊断和鉴别诊断个体感染性疾病。本发明的试剂盒采用直接化学发光法测定标本中的PCT含量，具有特异性强、重复性好、灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明试剂盒检测线性性能评价。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
试剂盒的制备：
1.以PCT单克隆第一抗体包被磁珠：
将磁珠原液置于血液混匀仪上混匀至磁珠分散均匀无凝集，取200μL加入40mL玻璃瓶中，加入5mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，在血液混匀仪上混匀5min。静置磁吸后移弃上清，加入5mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，重复清洗4次后重悬备用。
加入200μL浓度为15mg/mL的Sulfo-NHS溶液和150μL浓度为7mg/mL的EDC，放在血液混匀仪上混匀活化50min。
静置磁吸后移弃上清，加入5mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集后，取PCT单克隆第一抗体0.5mg，加入到重悬的磁珠中，在血液混匀仪上混匀过夜孵育。反应结束，加入200μL浓度为15％的牛血清白蛋白溶液进行封闭，封闭时间1.5h。
静置磁吸后移弃上清，加入5mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集，重复清洗10次，最后1次移弃上清后加入5mL磁珠稀释液重悬磁珠；
2.以PCT单克隆第二抗体标记吖啶酯：
取一支50K规格的超滤管，加入750μL吖啶酯标记缓冲液，离心清洗3次，每离心一次弃去超滤管中液体。取PCT单克隆第二抗体0.2mg加入超滤管，用吖啶酯标记缓冲液清洗3次，每次定容到750μL，最后吸取底部剩余抗体溶液，转移至1.5mL的离心管中，用吖啶酯标记缓冲液定容至200μL。
在离心管中加入10uL吖啶酯溶液。在血液混匀仪上50-150r/min避光混匀反应2h。
标记反应结束后，在离心管中加入1％(w/v)的赖氨酸溶液120μL，在血液混匀仪上避光混匀封闭40min。
将封闭后的抗体溶液转移至超滤管内管中，加入400uL吖啶酯纯化缓冲液，重复离心清洗6次，每离心一次弃去超滤管外管中液体。清洗过程结束后，将超滤管中收集的抗体标记液转移至洁净离心管中，加入吖啶酯纯化缓冲液定容至2mL。；
3.PCT校准品制备：
所述PCT校准品以抗原稀释液(30mmol/L Tris-HCl，1％BSA、0.9％NaCl、0.01％Proclin-300、0.2％Tween-20，pH8.0)将PCT抗原稀释至指定校准品浓度(0.1ng/mL、10.0ng/mL和40.0ng/mL)。
实施例2
本实施例提供了一种用于所述检测方法的试剂盒，其检测方法依照如下步骤进行：
下述检测步骤由全自动化学发光分析仪自动完成，也可手工操作完成。
将R1试剂和R2试剂加入到反应杯中，充分混匀后，将包括PCT校准品、血清、血浆或全血在内的样本加入反应杯中，并通过涡旋充分混匀，而后置于37℃的温育条件下反应15min，磁吸清洗5次后读取样本中降钙素原的含量。
实施例3
本发明检测试剂盒的试剂性能测试：
1.重复性评价：
使用0.5ng/mL、10ng/mL两个浓度的样本作为待测样本。按说明书的操作方法，用全自动化学发光仪分别对待测样本进行10次重复测定。按公式(1)计算重复性变异系数。
注：式中：
10次测定浓度的平均值；Xi：每次测定浓度值
实验结果如表1所示，重复性变异系数在2.5％以内。
表1
| 序号 | 0.5ng/mL | 10ng/mL |
| 1 | 0.561 | 10.279 |
| 2 | 0.555 | 9.871 |
| 3 | 0.554 | 9.756 |
| 4 | 0.567 | 9.79 |
| 5 | 0.559 | 10.133 |
| 6 | 0.558 | 10.341 |
| 7 | 0.549 | 10.214 |
| 8 | 0.572 | 10.084 |
| 9 | 0.561 | 10.366 |
| 10 | 0.568 | 9.866 |
| 平均值 | 0.56 | 10.07 |
| 变异系数 | 1.3％ | 2.3％ |
2.线性评价：
用接近线性范围上限的高浓度100ng/mL和接近线性范围下限的低浓度样品0ng/mL，混合成5个稀释浓度(混合方式及稀释浓度见表2)，每个浓度平行检测3次，将每个浓度测定结果的平均值与标识浓度进行直线拟合。
表2
| 样品组 | 原始浓度(ng/mL) | 稀释倍数 | 配制浓度(ng/mL) |
| 1 | 1000 | 10 | 100 |
| 2 | 100 | 2.5 | 40 |
| 3 | 40 | 4 | 10 |
| 4 | 10 | 20 | 0.5 |
| 5 | 0.5 | 5 | 0.1 |
| 6 | 0.1 | 5 | 0.02 |
实验结果如表3所示，线性整体相关系数R为0.9921，考虑正常人血清的浓度及相关疾病患者的浓度范围，再结合试剂本身线性范围的限制，综合考虑，本试剂盒测定范围定为0.02～70ng/mL。
表3
3.准确度评价：
配制浓度为0.5ng/mL的PCT标准溶液，在900μL的人血清中加入100μL浓度为0.5ng/mL的标准溶液，重复测定3次取均值，根据公式(2)计算回收率R，结果应符合2.4的要求。
注：式中R：回收率，％；V：加入标准溶液的体积；V0：人血清的体积；C：人血清加入标准溶液后的检测浓度；C0：人血清的检测浓度；CS：标准溶液的浓度。
实验结果如表4所示，正常人血清测值<0.02ng/ml，按0.02ng/ml进行的计算；回收率为91.8％-106.8％。
表4
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (22)
1.一种降钙素原化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：
1)R1试剂:用降钙素原单克隆第一抗体包被磁微粒；
2)R2试剂：用PCT单克隆第二抗体标记吖啶酯；
3)以PCT重组抗原制备的校准品及质控品。
2.根据权利要求1所述的降钙素原化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述PCT校准品、所述PCT质控品均为含有PCT抗原、质量百分含量0.5-5.0％(w/v)蛋白稳定剂、质量百分含量0.5-5.0‰(v/v)防腐剂；其中，所述PCT质控品抗原的浓度分别为0.1ng/mL、10.0ng/mL；所述PCT校准品抗原的浓度分别为0.1ng/mL、10.0ng/mL和40.0ng/mL。
3.根据权利要求2所述的校准品及质控品稀释液，其特征在于：所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
4.根据权利要求2所述的校准品及质控品稀释液，其特征在于：所述防腐剂为：叠氮化钠、苯酚和procline300中一种或多种。
5.根据权利要求2所述的校准品及质控品稀释液，其特征在于：所述蛋白稳定剂为：山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、羧甲基纤维素、环糊精、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和牛血清白蛋白的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的降钙素原化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述R1试剂均为含有用降钙素原单克隆第一抗体包被磁微粒、质量百分含量0.5-5.0％(w/v)蛋白稳定剂、质量百分含量0.5-5.0‰(v/v)防腐剂、质量百分含量0.1-2.0％增敏剂的缓冲液。
7.根据权利要求6所述的R1试剂，其磁珠稀释液特征在于：所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
8.根据权利要求6所述的R1试剂，其磁珠稀释液特征在于：所述防腐剂为：叠氮化钠、苯酚和procline300中一种或多种。
9.根据权利要求6所述的R1试剂，其磁珠稀释液特征在于：所述蛋白稳定剂为：山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、羧甲基纤维素、环糊精、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和牛血清白蛋白的一种或多种。
10.根据权利要求6所述的R1试剂，其磁珠稀释液特征在于：所述增敏剂为：Bronidox、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、吐温20、吐温80、CTAB、IPTG或Poloxamer 188中一种或多种。
11.根据权利要求6所述的R1试剂，其特征在于：所述磁微粒的粒径在0.5-5μm。
12.根据权利要求6所述的R1试剂，其特征在于：所述磁微粒与PCT第一单克隆抗体的包被过程由磁珠清洗，磁珠活化，抗体包被反应，磁珠封闭以及清洗收集组成。
具体包括如下使用步骤：
1)清洗磁珠：
将磁珠原液置于血液混匀仪上50-110r/min混匀至磁珠分散均匀无凝集，取50-500μL混匀后的磁珠原液加入到润洗后的玻璃瓶中，加入2-15mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，在血液混匀仪上50-110r/min混匀2-10min。静置磁吸1-5min，将磁力架与玻璃瓶同时上下颠倒2次以上，以将瓶盖与泡沫中的磁珠涮洗至液体中，静置磁吸1-5min，移弃上清，加入0.5-2.0mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集后，在血液混匀仪上50-110r/min混匀1-5min。重复清洗2次以上。
2)磁珠活化：
加入50-500μL Sulfo-NHS溶液(5-30mg/mL)，上下颠倒混匀10次，再加入50-500μL EDC(5-30mg/mL)，立即上下颠倒混匀10次，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上50-110r/min混匀活化10-70min。
3)抗体偶联及封闭：
静置磁吸1-5min，将磁力架与玻璃瓶同时上下颠倒2次以上，以将瓶盖与泡沫中的磁珠涮洗至液体中，静置磁吸2min，移弃上清，加入0.5-2.0mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集后，在血液混匀仪上50-110r/min混匀1-5min。重复清洗3-5次，最后1次移弃上清后加入0.5-2.0mL磁珠偶联缓冲溶液重悬磁珠。取0.02-2mg包被抗体，加入到重悬的磁珠中，摇动混匀至肉眼观测不到磁珠沉淀和聚集后，放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上50-110r/min混匀过夜孵育。反应结束，加入20-150μL浓度为0.5-15％的牛血清白蛋白溶液进行封闭，封闭时间0.2-2h。
4)清洗并保存：
静置磁吸1-5min，将磁力架与玻璃瓶同时上下颠倒2次以上，以将瓶盖与泡沫中的磁珠涮洗至液体中，静置磁吸1-5min，移弃上清，加入0.5-2.0mL磁珠稀释液重悬磁珠，在血液混匀仪上50-110r/min混匀3min，重复清洗10次，最后1次移弃上清后加入0.5-2.0mL磁珠稀释液重悬磁珠。
13.根据权利要求12所述的包被工艺，其特征在于：所述的磁珠偶联缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
14.根据权利要求1所述的降钙素原化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述R2试剂均为含有用降钙素原单克隆第二抗体标记吖啶酯、质量百分含量0.5-5.0％(w/v)蛋白稳定剂、质量百分含量0.5-5.0‰(v/v)防腐剂、质量百分含量0.1-2.0％增敏剂的缓冲液。
15.根据权利要求14所述的R2试剂，其吖啶酯稀释液特征在于：所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
16.根据权利要求14所述的R2试剂，其吖啶酯稀释液特征在于：所述防腐剂为：叠氮化钠、苯酚和procline300中一种或多种。
17.根据权利要求14所述的R2试剂，其吖啶酯稀释液特征在于：所述蛋白稳定剂为：山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、羧甲基纤维素、环糊精、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和牛血清白蛋白的一种或多种。
18.根据权利要求14所述的R2试剂，其吖啶酯稀释液特征在于：所述增敏剂为：Bronidox、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、吐温20、吐温80、CTAB、IPTG或Poloxamer 188中一种或多种。
19.根据权利要求14所述的R2试剂，其吖啶酯稀释液特征在于：所述吖啶酯与PCT第二单克隆抗体的标记过程由抗体清洗，吖啶酯标记，吖啶酯封闭以及吖啶酯-抗体复合物清洗收集组成。
具体包括如下使用步骤：
1)抗体清洗
取一支50K规格的超滤管，加入200-600μL吖啶酯标记缓冲液，清洗3次以上，每离心一次弃去超滤管中液体。取0.02-0.3mg抗体加入超滤管，用吖啶酯标记缓冲液清洗3次以上，每次定容到200-600μL，最后吸取底部剩余抗体溶液，转移至1.5mL的离心管中，用吖啶酯标记缓冲液定容至100-300μL。
2)吖啶酯标记
在离心管中加入1-10uL吖啶酯溶液。放入生化培养箱中25℃血液混匀仪上50-150r/min避光混匀反应0.5-5h。
3)吖啶酯封闭
标记反应结束后，在离心管中加入0.5-5％(w/v)的赖氨酸溶液20-150μL，立即用移液器吹打混匀10次，在血液混匀仪上50-150r/min，避光混匀封闭10-60min。
4)吖啶酯-抗体复合物清洗收集
将封闭后的抗体溶液转移至超滤管内管中，离心1次弃去超滤管外管中液体。加入200-600uL吖啶酯纯化缓冲液，重复离心清洗3-10次，每离心一次弃去超滤管外管中液体。清洗过程结束后，将超滤管中收集的抗体标记液转移至洁净离心管中，加入吖啶酯纯化缓冲液定容至0.2-3.0mL。
20.根据权利要求19所述的标记工艺，其特征在于：所述的吖啶酯标记缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、吗啉乙磺酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种；其pH为5.0-9.0。
21.权利要求1所述降钙素原化学发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：将PCT校准品、血清、血浆或全血作为样本加入反应杯中，并加入R1试剂和R2试剂，于25-40℃条件下温育5-30min，清洗后读取样本中降钙素原的含量。
22.权利要求21所述降钙素原化学发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的待测样本、所述的R1试剂和所述的R2试剂的体积比为1:0.5-2.0：0.5-2.0。
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| CN202211657901.9A CN116430032A (zh) | 2022-12-22 | 2022-12-22 | 一种降钙素原的化学发光检测试剂盒及其检测方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118033151A (zh) * | 2024-04-11 | 2024-05-14 | 江西省转化医学研究院 | 环肽发光耦合分子构建的均相化学发光降钙素原检测试剂 |
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2022
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