JP6695280B2 - 改善されたアッセイ方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年5月15日出願の米国仮出願第61/993,581号;2014年6月18日出願の同第62/013,823号;2014年9月10日出願の同第62/048,489号;2014年9月12日出願の同第62/049,520号;および2014年9月25日出願の同第62/055,093号の利益を主張し、その全ての内容は参照によって本明細書に組み入れる。参照はまた、USSN14/206,284(公開番号US−2014/0272939);USSN14/208,040(公開番号US−2014/0274775);およびUSSN14/203,638(公開番号US−2014/0256588)について行われ、これらの開示もまた、参照によって本明細書に組み入れる。
よびそれらの組み合わせ。
さらなる実施形態を図7に図示する。パネル(a)のサンドイッチ免疫アッセイ複合体における各近接プローブの一部分が、各セグメントにハイブリダイズしたRNAの短鎖により一時的に保護される。RNA鎖は酵素で除去され、近接プローブの各々が互いにハイブリダイズし、鎖はビオチン化dNTPを使用して、ポリメラーゼ伸長により伸長する(パネル(b))。鎖に組み込まれた各ビオチン化塩基はそれぞれ、検出可能な標識で標識したストレプトアビジンに結合する(パネル(c))。
標的分析物に対する一対の検出抗体を、近接プローブ1および2を追加して以下のように修飾した:100uLバッファー中200ugの第1の検出抗体に、1.74uL、23mMのsulfo−SMCCを追加し、150mMリン酸緩衝液で希釈し、30分間室温でインキュベートした。遊離したsulfo SMCCはサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。検出抗体の最終濃度は2mg/mLまたはこれよりわずかに低かった。300uMのチオール修飾オリゴヌクレオチド(近接プローブ1および2)95uLを、100mMリン酸緩衝液中1mM DTTの5uL、0.5mM EDTA、pH8.4で室温で1時間還元した。近接プローブ1および2の配列は次の通りである:
チオール修飾近接プローブ1:SH−AAA AAA AAA AGA CGC TAA TAG TTA AGA CGC TTU UU(配列番号1;3つのU残基は2’O−メチルRNAである)。
チオール修飾近接プローブ2:SH−AAA AAA AAA ATA TGA CAG AAC TAG ACA CTC TT(配列番号2)。
環状化オリゴヌクレオチド1:リン酸−CTA TTA GCG TCC AGT GAA TGC GAG TCC GTC TAA GAG AGT AGT AGA GCA GCC GTC AAG AGT GTC TA(配列番号4)
環状化オリゴヌクレオチド2:リン酸−GTT CTG TCA TAT TTA AGC GTC TTA A(配列番号5)であった。
実施例2に記述したアッセイを繰り返したが、ここでは環状テンプレートを形成するために2つの別個のライゲーション部位を有する2つのコネクターオリゴヌクレオチドを使用する代わりに、ライゲーション部位を1つ有する単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを使用した。図11(a)に示すように、ライゲーション部位1またはライゲーション部位2で開いた単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを準備した。単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを両方とも、実施例1と2で使用したオリゴヌクレオチド、Circ−1とCirc−2との組合せと並行してテストした。実施例2に記述したプロトコルを用いて、さらに、単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドを3種類の濃度、125nM、62.5nMおよび31nMでテストし、一方、Circ−1とCirc−2のオリゴヌクレオチドの組合せを使用する標準アッセイを125nMでテストした。図11(b)に示すように、2つの単一線状コネクターオリゴヌクレオチドは、2種のコネクターオリゴヌクレオチド混合物(Circ−1とCirc−2)とおよそ同一の効率でRCA増幅産物に成功裡に組み込まれた。ライゲーション部位1で開いていた単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドは、信号強度、非特異的バックグラウンドおよび総合的な感度に基づいて、2種のコネクター混合物に匹敵する性能を有していた。予想した通り、ライゲーション部位2で開いていた単一の線状コネクターオリゴヌクレオチドは、非特異的なバックグラウンドがより高く、感度はより低かった。この後者のケースでは、ライゲーションとプライミングの両方が、近接プローブ#1の存在にのみ依存しており;したがって、近接増幅アプローチの特定の利点のうちのいくつかが損なわれた。
以下の試薬の代替セットを用いて、実施例1で概説したプロトコルを使用してアッセイを実施した:
(a)コード化粒子を使用する、ビーズベースの免疫アッセイフォーマット
アッセイ工程はすべて96ウェルフィルタープレートで実施した。真空マニホールドでプレートから液体を除去した(Hg10インチを超過せず)。プレートは反転させない。目詰まりが生じた場合、コニカルチューブ15mlの先端を使用して目詰まりしたウェルの下の区域をやさしく押し、次に、1mlのパスツールピペットのゴム球を使用するか、目詰まりしたウェルを親指でやさしく押して、詰まりを取り除く。最終の吸引工程後、ペーパータオルを重ねた上でプレートの底を軽く叩き、次に、フィルタープレートの底面をKimwipeで拭いて残留液/液滴を除去した。
(1)10xキャプチャービーズストックをボルテックス(30秒)および超音波分解(30秒)する。ホイルにくるんだチューブで、10xキャプチャービーズストック(ウェル当たり2.5μl)を洗浄溶液に希釈する(ウェル当たり25μl 約2,000〜5,000ビーズ/アッセイ)。より高度な多重化には、保持した10xキャプチャービーズストックの追加分の容積を調製できるよう洗浄溶液の容積を調整する。
(6)蛍光標識した検出抗体の1x混合物の調整:希釈剤(ウェル当たり100μl)で10x検出抗体混合物(ウェル当たり10μl)を希釈した。混合物は目的の分析物に特異的な一対の検出抗体を含み、1つはAlexa Fluor350(青色蛍光標識)で標識し、もう1つはAlexa Fluor594(赤色蛍光標識)で標識した(これらの各々の蛍光標識はLife Technologies, Grand Island、NY、www.lifetechnologies.comから入手可能)。より高度な多重化は、必要な10x抗体混合物の追加の容積を調製できるよう希釈剤の容積を調整する。吸引し洗浄溶液200μLで2回アッセイウェルを洗浄した。100μlの希釈検出抗体混合物を各アッセイウェルに追加した。プレートをカバーし、プレート振とう機で1時間インキュベートした(500〜600rpm)。
(8)吸引し洗浄溶液200μLで3回アッセイウェルを洗浄した。清潔なペーパータオルでフィルタープレートの底を乾かし、完全に全残留液滴を除去した。100μl洗浄溶液を各アッセイウェルに追加し、2〜3分間プレート振とう機(500〜600rpm)上にプレートを載せた。
実施例5(a)で概説したように、アッセイ工程はすべて96−ウェルフィルタープレートで実施した。実施例5(a)で記述したように、洗浄溶液およびアッセイの標準試料を調製し、実施例1で記述したように、標的分析物に対する一対の検出抗体を、近接プローブ1および2を追加して修飾した。分析物を実施例5(a)で記述したように捕捉ビーズ上で捕捉した。捕捉ビーズは固定部分を含むが、この固定部分は、BSA−オリゴヌクレオチド複合体としてビーズ表面に固定化され、オリゴヌクレオチドはローリングサークルのアンプリコンに特異的であるよう選択される。使用した固定オリゴヌクレオチドの配列は配列番号3である。
試料を25%ウシ血清(2〜4倍希釈)100ulで調製し、捕捉抗体でコートした500Kビーズ(常磁性2.7μm、場合によって蛍光コード化)を、試料に追加した。試料を23℃で約2時間インキュベートした。試料をPBS(5X、0.1%Tween−20)で3回洗浄し、標識した検出抗体の混合物を追加した(第1ビオチン化検出抗体およびハプテンコンジュゲート抗体を含む混合物)。混合物を23℃で約1時間インキュベートした。混合物をPBS(5X、0.1%Tween20)で3回洗浄し、酵素標識を追加し、ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ(40pM)、抗ハプテンコンジュゲート酵素も追加し、混合物を23℃で約30分間インキュベートした(またはSimoaアナライザーに3分間かけた)。この混合物を、PBS(5X、0.1%Tween 20)で7回洗浄し、酵素基質、レゾルフィン−ベータ−d−ガラクトピラノシド 15ul(ローディングバッファー内100uM)を追加した。
第1のインキュベーション:試料10ul、ビオチン化モノクローナル分析物特異的捕捉抗体(希釈標準溶液2.6mg/l)、およびそれぞれオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせたモノクローナル分析物特異抗体の混合物(0.3mg/lの希釈標準溶液)を反応させてサンドイッチ複合体を形成した。モノクローナル分析物特異抗体の混合物は実施例1の記述通りに調製し、混合物には、実施例1で上述したように、近接プローブ1および2にコンジュゲートした一対の抗体が挙げられる。
材料、方法および結果:
実施例1に記述した手順をHIV−1 p24を検出するために使用した。HIV−1 mixed titer performance panel(Seracare Life Sciences、www.seracarecatalog.comから入手可能)、HIV−1セロコンバージョンパネル(これもSeracare Life Sciencesから入手可能)、HIV抗体陽性試料(ProMedDx、LLC、www.promeddx.comから入手可能)および正常な対応試料(Bioreclamation、www.bioreclamation.comから入手可能)から入手した約64の血清または血漿試料を試験した。上述の手順に従って導出されたHIV−1 p24アッセイの検量線を図12に示す。アッセイのLODは、1.3fg/mLであることが見出され、LLOQは3.0fg/mL、ULOQは37、500fg/mLだった。25uL試料の検出限界1.3fg/mLはp24分子約650個に相当し、ウイルス粒子(分子)はそれぞれ、p24タンパク質の複製を約2000個生成する。
HIVに感染して間もない患者は、この疾病の伝播の一因となる傾向がある。ウイルス負荷は感染後最初の数週間高く、新たに感染した患者は、自らの感染とともに、他者へ感染を拡大し得ることを自覚していない可能性が高い。したがって、急性HIV感染の早期発見は、公衆衛生上非常に重要である。PCR法は確立された感受性を有し;血清または血漿mL当たりわずか60のHIV RNA複製を検出できる(mL当たりウイルス粒子30個)。しかしながら、PCR法は複雑で費用が高く、したがって、すべての状況で適切とはならない。免疫アッセイはより単純でより安価であるが、現行の検出限界は、第四世代のp24免疫アッセイにおいてわずか約10pg/mL、または1mL当たり約2億5000万個のカプシドタンパク質となっている。ウイルス当たり約2,000個のp24カプシドタンパク質が存在するという事実にもかかわらず、これらの免疫アッセイは、ウイルスベースでPCR検査の数千倍分の一の感度である。
(a)実験の条件は、下記の表8(a)に示される:
IL−4についての3−AB RCA/PLAアッセイを、ダイナビーズの代わりにシリカビーズ(____から利用可能)を使用したこと以外は実施例7に記載されるように実行した。RCAおよび検出インキュベーションはMSDラージ・スポット・マルチ−ウェルアッセイプレート(MSD large spot multi−well assay plates;Meso Scale Discovery、ロックヴィル、メリーランド州から利用可能)、定常37℃で行った。ビーズにはアンカー試薬が含まれていなかった。ビーズはRCAインキュベーション工程の間、溶液容量に依存して、およその5〜8分間の沈降時間で、重力によりウェルの表面上にゆっくり沈降させた。プレートはプレートをスウィンギング・バケット遠心機内でプレートを回転させることにより洗浄した。予備的な試験においては、回転の後、ウェル表面に渡って僅かな勾配があるもののビーズは均一に分散したことが示された。
上述のように、実施例1において記載された手法を、TNFαモデルシステムを用いた架橋およびアイソタイピングIgアッセイ、Hepβ表面抗原を用いた架橋およびアイソタイピングIgアッセイおよびLyme C6を用いた架橋およびアイソタイピングIgアッセイにおいて使用した。この手法の改変を図19に示すが、ここで自己抗体(1901)を(i)PP2−修飾抗ヒトIg抗体(1902)および(ii)PP1−標識自己抗原(1903)、続いて実施例1に記載されるようなPLA−RCAを用いて検出した。図19に示された形式もまた、ターゲティング部分(1904)および自己抗原(1905)に結合したその相補体を捕捉部分と接着する手段、今回の場合、自己抗原と表面(1906)、として使用することを示している。
近接ライゲーションローリングサークル鋳型は生合成的に生成される。この方法ははじめに高度に精製され、十分に特徴付けられた鋳型を利用して、効率的な溶液−ベースのライゲーションおよびRCA反応系列におけるRCA生成物を生成する。このプロセスは、反応の感受性を増強するためにビーズ上で行うこともできる。
本明細書に記載された方法を、試料を分光的特徴の使用に基づいて、多重化するために使用した。試料を多重化することにより、ユーザーが内部較正およびコントロールを行うこと、コスト削減することならびに処理能力を上昇させることが可能となる。その分析物にコードされた空間的および分光的特徴に基づいた固有の特徴を利用することによる分析物を多重化させる能力は、試料を多重化させることにも使用することができる。
本明細書に記載される方法は例えば、HDLおよびLDLのようなリポタンパク質複合体に存在するタンパク質複合体のセットを検出し定量することに使用される。例えば、実施例1に記載される方法を用いて、3つの異なるタンパク質および/またはエピトープがリポタンパク質複合体内において検出され、それゆえ、患者のリポタンパク質内のタンパク質プロファイルを解析することができる。
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Claims (103)
- 試料中の目的の分析物を検出する方法であって、
a.該分析物を:(i)該分析物に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬;(ii)第1の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第1の検出試薬;ならびに(iii)第2の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第2の検出試薬に結合させ;それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第1および第2の検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させ、該表面はアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬をさらに含むこと;
b.該第1および第2のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第2のプローブを伸長して、該アンカーオリゴヌクレオチド配列に対して相補的であるアンカーオリゴヌクレオチド配列相補体を含む伸長配列を形成させること;
c.該アンカーオリゴヌクレオチド配列を該アンカーオリゴヌクレオチド配列相補体にハイブリダイズさせること;ならびに
d.該表面に結合した伸長配列の量を測定すること
を含み、
該分析物が、エクソソームであるか、または該分析物が、G−CDF、GM−CSF、IFNガンマ、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12/23p40、IL12p70、IL−17A、IL21、IL−22、IL−23、IL−31、IL−33、TNFα、TSLP、VEGF、複合体PSA、遊離PSA、Aβ42、Aβ40、Aβ38、tau、心筋トロポニンI、心筋トロポニンT、HIV p24、C−ペプチド、および/またはFGF21である前記方法。 - 捕捉試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項1に記載の方法。
- 第1の検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項1に記載の方法。
- 第2の検出試薬は抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エ
ピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項1に記載の方法。 - 捕捉試薬ならびに第1および第2の検出試薬は分析物に対する抗体である、請求項1に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチド配列は1本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 伸長配列は1つまたはそれ以上の検出配列をさらに含み、測定工程は伸長配列を1つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 伸長工程はプローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて、
a.分析物に関する捕捉試薬を含む表面であって、アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬をさらに含む表面;
b.第1の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第1の検出試薬;ならびに
c.第2の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第2の検出試薬を含む試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、
該分析物が、エクソソームであるか、または該分析物が、G−CDF、GM−CSF、IFNガンマ、IL−1ベータ、IL−2、IL−4、IL−5, IL−6、IL−10、IL−12/23p40、IL12p70、IL−17A、IL21、IL−22、IL−23、IL−31、IL−33、TNFアルファ、TSLP、VEGF、複合体PSA、遊離PSA、Abeta42、Abeta40、Abeta38、tau、心筋トロポニンI、心筋トロポニンT、HIV p24、C−ペプチド、および/またはFGF21である前記キット。 - 試料中の目的の分析物を検出する方法であって、
a.該試料を、第1の核酸プローブに連結された第1の検出試薬に結合した該分析物を含む分析物複合体を形成するために十分な条件下で濃縮すること;
b.工程(a)において形成された該分析物複合体を:(i)該分析物に関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬;ならびに(ii)第2の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第2の検出試薬に結合させ;それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第1および第2の検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させ、該表面はアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬をさらに含むこと;
c.該第1および第2のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第2のプローブを伸長して、該アンカーオリゴヌクレオチド配列に対して相補的であるアンカーオリゴヌクレオチド配列相補体を含む伸長配列を形成させること;
d.該アンカーオリゴヌクレオチド配列を該アンカーオリゴヌクレオチド配列相補体にハイブリダイズさせること;ならびに
e.該表面に結合した伸長配列の量を測定すること
を含む前記方法。 - 試料中の目的の分析物の検出のためのキットであって、1つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメントにおいて:
a.該分析物に関する捕捉試薬を含む表面であって、アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬をさらに含む表面;
b.第1の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第1の検出試薬;
c.第2の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第2の検出試薬;ならびに
d.該第1の核酸プローブの少なくとも一部に対して相補的なターゲティング因子を含む固相
を含む前記キット。 - 試料中の目的の分析物を検出する方法であって:
a.該分析物を:(i)該分析物に関する捕捉試薬を含む粒子上の該捕捉試薬;(ii)第1の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第1の検出試薬;ならびに(iii)第2の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第2の検出試薬に結合させ;それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第1および第2の検出試薬を含む表面上に複合体を形成させ、該表面はアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬をさらに含むこと;
b.該第1および第2のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第2のプローブを伸長して、該アンカーオリゴヌクレオチド配列に対して相補的であるアンカーオリゴヌクレオチド配列相補体を含む伸長配列を形成させることであって、ここで、前記伸長プロセスは粒子が重力によりマルチウェルプレートのウェルの表面上に沈降する間または後に実行される;
c.該アンカーオリゴヌクレオチド配列を該アンカーオリゴヌクレオチド配列相補体にハイブリダイズさせること;ならびに
d.粒子に結合した伸長配列の量を測定すること
を含む前記方法。 - 試料中の目的の分析物を検出する方法であって:
a.該分析物を:(i)該分析物に関する捕捉試薬を含む粒子上の該捕捉試薬;(ii)第1の核酸プローブに連結された、分析物に関する第1の検出試薬;ならびに(iii)第2の核酸プローブに連結された、該分析物に関する第2の検出試薬に結合させ;それにより、該捕捉試薬、該分析物ならびに該第1および第2の検出試薬を含む該表面上に複合体を形成させること;
b.該第1および第2のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第2のプローブを伸長して、アンカーオリゴヌクレオチド配列に対して相補的であるアンカーオリゴヌクレオチド配列相補体を含む伸長配列を形成させることであって、ここで、前記伸長プロセスは粒子が重力によりマルチウェルプレートのウェルの表面上に沈降する間または後に実行される;
c.粒子に結合した伸長配列の量を測定すること
を含む前記方法。 - 試料中のエクソソームを検出する方法であって:
a.該エクソソームを、(i)該エクソソームに関する捕捉試薬を含む表面上の該捕捉試薬;(ii)第1の核酸プローブに連結された、該エクソソームに関する第1の検出試薬;ならびに(iii)第2の核酸プローブに連結された、該エクソソームに関する第2の検出試薬に結合させ;それにより、捕捉試薬、該エクソソームならびに該第1および第2の検出試薬を含む表面上に複合体を形成させ、該表面はアンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬をさらに含むこと;
b.該第1および第2のプローブが近接されることを必要とする伸長プロセスを用いて、該第2のプローブを伸長して、該アンカーオリゴヌクレオチド配列に対して相補的であるアンカーオリゴヌクレオチド配列相補体を含む伸長配列を形成させること;
c.該アンカーオリゴヌクレオチド配列を該アンカーオリゴヌクレオチド配列相補体にハイブリダイズさせること;ならびに
d.該表面に結合した伸長配列の量を測定すること
を含む前記方法。 - 試料中の目的のエクソソームの検出のためのキットであって、1つまたはそれ以上のバイアル、容器、またはコンパートメント内に:
a.該エクソソームに関する捕捉試薬を含む表面であって、アンカーオリゴヌクレオチド配列を含むアンカー試薬をさらに含む表面;
b.第1の核酸プローブに連結された、該エクソソームに関する第1の検出試薬;ならびに
c.第2の核酸プローブに連結された、該エクソソームに関する第2の検出試薬
を含む、前記キット。 - 第1および第2の検出試薬は各々、相互作用しているエクソソームターゲット分子に結合する、請求項1に記載の方法。
- 相互作用しているエクソソームターゲット分子は、リガンド−受容体の対ならびに/またはmRNA分子およびRNA結合タンパク質を含む、請求項16記載の方法。
- 伸長プローブは、プローブの伸長後に表面上に局在化したままで残る、請求項1に記載の方法。
- 複合体は、伸長工程後に表面に結合したままで残る、請求項18に記載の方法。
- 伸長プローブは、表面上の複合体の位置の10〜100μm内の位置でアンカー試薬に結合される、請求項18に記載の方法。
- 伸長工程は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、SDA(鎖置換増幅)、3SR(自己持続合成反応)、または等温性の増幅方法を含む、請求項1に記載の方法。
- 伸長工程は等温性の増幅方法を含む、請求項21に記載の方法。
- 等温性の増幅法は、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅(RCA)である、請求項22に記載の方法。
- 伸長プロセスは、工程(a)において形成される複合体を、(i)第2のプローブに対して相補的な内部配列および(ii)第1のプローブの非オーバーラップ領域に相補的な2つの末端配列を含むコネクター配列と接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- コネクターオリゴヌクレオチドの2つの末端配列をライゲーションして、第1および第2のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 伸長プロセスは、工程(a)において形成される複合体を、第1のプローブの第1領域および第2のプローブの第1領域に対して相補的な第1コネクタープローブ配列を含む第1のコネクターオリゴヌクレオチド配列、ならびに第1のプローブの第2の非オーバーラップ領域および第2プローブの第2の非オーバーラップ領域に対して相補的な第2のプローブ配列を含む第2のコネクターオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 第1および第2のコネクターオリゴヌクレオチドをライゲーションして、第1および第
2のプローブの両方にハイブリダイズする環状の標的配列を形成させることをさらに含む、請求項26に記載の方法。 - 試料は精製エクソソームを含む、請求項1に記載の方法。
- 測定工程は、表面上に存在するアンプリコンを画像化することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アンプリコンは、複数の蛍光プローブで標識化され、その次の前記測定工程は、エクソソームの蛍光染色、蛍光標識化アンプリコンおよび染色したエクソソームを画像化すること、ならびに前記画像化工程の結果について相互の関係を比較することを含む、請求項29に記載の方法。
- 第1および第2の検出試薬は各々、相互作用しているエクソソームターゲット分子に結合する、請求項9に記載のキット。
- 相互作用しているエクソソームターゲット分子は、リガンド−受容体の対ならびに/またはmRNA分子およびRNA結合タンパク質を含む、請求項31記載のキット。
- 試料は精製エクソソームを含む、請求項9に記載のキット。
- 捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含む、請求項9に記載のキット。
- 捕捉試薬は抗体を含む、請求項34に記載のキット。
- 第1の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含む、請求項9に記載のキット。
- 第1の検出試薬は抗体を含む、請求項36に記載のキット。
- 第2の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーを含む、請求項9に記載のキット。
- 第2の検出試薬は抗体を含む、請求項9に記載のキット。
- 表面は粒子を含む、請求項9に記載のキット。
- 表面はマルチウェルプレートのウェルを含む、請求項9に記載のキット。
- 表面は複数の別々の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の2つの別々の結合ドメインに結合されている、請求項9に記載のキット。
- ウェルは複数の別々の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内の2つの別々の結合ドメインに結合されている、請求項41に記載のキット。
- 表面は複数の別々の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬は表面上の同じ結合ドメインに結合されている、請求項9に記載のキット。
- ウェルは複数の別々の結合ドメインを含み、捕捉試薬およびアンカー試薬はウェル内の
同じ結合ドメインに結合されている、請求項41に記載のキット。 - 捕捉試薬およびアンカー試薬は、互いに10〜100nm以内で表面に結合されている、請求項9に記載のキット。
- 表面は電極を含む、請求項9に記載のキット。
- 捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項10に記載の方法。
- 第1の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項10に記載の方法。
- 第2の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項10に記載の方法。
- 捕捉試薬ならびに第1および第2の検出試薬は、分析物に対する抗体である、請求項10に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチド配列は1本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の方法。
- 伸長配列は1つまたはそれ以上の検出配列をさらに含み、測定工程は、伸長配列を、1つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含む、請求項10に記載の方法。
- 伸長工程は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、SDA(鎖置換増幅)、3SR(自己持続合成反応)、または等温性の増幅方法を含む、請求項10に記載の方法。
- 伸長工程は等温性の増幅方法を含む、請求項55に記載の方法。
- 等温性の増幅方法は、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅(RCA)である、請求項56に記載の方法。
- 表面は電極を含む、請求項10に記載の方法。
- 捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項11に記載のキット。
- 第1の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項11に記載のキット。
- 第2の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項11記載のキット。
- 捕捉試薬ならびに第1および第2の検出試薬は、分析物に対する抗体である、請求項11に記載のキット。
- アンカーオリゴヌクレオチド配列は、1本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載のキット。
- 表面は電極を含む、請求項11に記載のキット。
- 捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項12に記載の方法。
- 第1の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項12に記載の方法。
- 第2の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項12に記載の方法。
- 捕捉試薬ならびに第1および第2の検出試薬は、分析物に対する抗体である、請求項12に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチド配列は、1本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項12の方法。
- 伸長配列は、1つまたはそれ以上の検出配列をさらに含み、測定工程は、伸長配列を、1つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含む、請求項12に記載の方法。
- 伸長工程は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、SDA(鎖置換増幅)、3SR(自己持続合成反応)、または等温性の増幅方法を含む、請求項12に記載の方法。
- 伸長工程は等温性の増幅方法を含む、請求項72に記載の方法。
- 等温性の増幅法は、ヘリカーゼ依存的な増幅またはローリングサークル増幅(RCA)である、請求項73に記載の方法。
- 表面は電極を含む、請求項12に記載の方法。
- 捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項13に記載の方法。
- 第1の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項13に記載の方法。
- 第2の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項13に記載の方法。
- 捕捉試薬ならびに第1および第2の検出試薬は、分析物に対する抗体である、請求項13に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチド配列は、1本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 伸長配列は、1つまたはそれ以上の検出配列をさらに含み、測定工程は、伸長配列を、1つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含む、請求項13に記載の方法。
- 伸長工程は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、SDA(鎖置換増幅)、3SR(自己持続合成反応)、または等温性の増幅方法を含む、請求項13に記載の方法。
- 伸長工程は等温性の増幅方法を含む、請求項83に記載の方法。
- 等温性の増幅方法は、ヘリカーゼ依存性増幅またはローリングサークル増幅(RCA)である、請求項84に記載の方法。
- 表面は電極を含む、請求項13に記載の方法。
- 捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項14に記載の方法。
- 第1の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項14に記載の方法。
- 第2の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項14に記載の方法。
- 捕捉試薬ならびに第1および第2の検出試薬は、分析物に対する抗体である、請求項14に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチド配列は、1本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 伸長配列は、1つまたはそれ以上の検出配列をさらに含み、測定工程は、伸長配列を、1つまたはそれ以上の検出配列に対して相補的な複数の標識プローブと接触させることをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 伸長工程は、プローブを鋳型核酸配列に結合させること、環状の核酸鋳型を形成させること、および環状の鋳型をローリングサークル増幅によって伸長させることを含む、請求項14に記載の方法。
- 伸長工程は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、SDA
(鎖置換増幅)、3SR(自己持続合成反応)、または等温性の増幅方法を含む、請求項14に記載の方法。 - 伸長工程は等温性の増幅方法を含む、請求項94に記載の方法。
- 等温性の増幅方法は、ヘリカーゼ依存性増幅またはローリングサークル増幅(RCA)である、請求項95に記載の方法。
- 表面は電極を含む、請求項14に記載の方法。
- 捕捉試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項15に記載の方法。
- 第1の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項15に記載の方法。
- 第2の検出試薬は、抗体、抗原、リガンド、受容体、オリゴヌクレオチド、ハプテン、エピトープ、ミミトープ、またはアプタマーである、請求項15に記載の方法。
- 捕捉試薬ならびに第1および第2の検出試薬は、分析物に対する抗体である、請求項15に記載の方法。
- アンカーオリゴヌクレオチド配列は、1本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の方法。
- 表面は電極を含む、請求項15に記載の方法。
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