KR101964512B1 - 항원 검출용 lc 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법 - Google Patents

항원 검출용 lc 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 액정의 응집을 막아 안정성을 가질 수 있게 하며, 항체의 감도를 향상시켜 항원의 검출 한계 농도를 낮출 수 있고 검출 시간을 단축시킬 수 있으며, 안정성이 우수하여 효과적인 검출이 가능한 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원과의 비특이적 상호작용을 감소시켜 정확한 검출 및 유동액 내에서의 검출이 용이한 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

Description

항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법{LIQUID CRYSTAL MICRODROPLETS FOR SENSING OF ANTIGEN, BIOSENSOR USING THE SAME AND SENSING METHOD OF ANTIGEN USING THE SAME}
본 발명은 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 액정 마이크로액적을 slide cover glass에 고정화시키므로써 액적의 응집을 유발시키지 않은 채 오랫동안 안정성을 유지하여 필요할 때 즉시 이용할 수 있는 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다.
또한 LC 액적을 고정화 시키므로써 감도를 향상시켜 항원의 검출 한계 농도를 낮출 수 있고, 검출 시간을 단축시킬 수 있는 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법에 관한 것이다.
액정 마이크로액적 또는 액정 마이크로캡슐(Liquid crystal microdroplets or microcapsules)의 배열 형태는 화학적 또는 생물학적 시약의 계면에서의 상호작용으로 인해서 상당한 관심을 끌어왔으며, 특정 종 또는 자극에 대한 액정 마이크로액적 내 액정의 배열 변화는 편광판을 이용하여 용이하게 검출할 수 있다.
액정 물질의 계면에서의 상호작용은 항체, 박테리아 및 바이러스와 결합하도록 특화되어 제조되는 연구가 최근에 진행되어 왔는데, 이러한 액정 물질의 화합물 및 생물분자와의 계면 상호작용은 수소결합, 전하-전하(charge-charge) 및 리간드-수용체 상호작용을 통해 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 상호 작용은 액정 분자의 표면 자유 에너지에 영향을 주고 액정 분자의 배열 변화를 일으키는 바이오 시그널 역할을 한다.
또한, 다양한 종류의 계면 상호작용을 센싱하는 것과 관련하여 폴리머가 분산된 액정 시스템에 대한 연구가 많이 이루어졌으나, 액정 마이크로액적 또는 액정 마이크로캡슐은 액정 마이크로액적의 표면에서 생물분자와의 상호작용을 검출하기 위한 크기 및 표면에너지를 조절하는 액정 시스템을 설계하는데 더욱 유용하다.
이와 관련된 선행특허로서, 산화환원이 가능한 관능성(functional) 화합물이 도핑된(doped) 액정(liquid crystal)을 이용하여, 검출대상 미생물의 효소 또는 대사산물(metabolite)과 화학적 반응을 일으키도록 유도하여 액정 방향성(orientation)의 변화를 광학적 외관(optical appearance)을 통해 센싱하는 액정-기반 바이오센서 등이 있다.
다만 종래의 바이오센서들은 시간이 많이 소요되고 비용이 많이 드는 단점이 있었으며, 검출한계가 높아 효과적으로 검출할 수 없었다. 이에 본 발명자는 한국등록특허 10-1593313을 통해서 상술한 문제점들을 해결하고자 하였으나, 액정 마이크로액적이 매우 느린 속도로 움직이기 때문에 24시간 이상 지나게 되면 액적들이 서서히 응집되는 현상이 발생하여 저장 안정성이 다소 부족하였다. 뿐만 아니라 한국등록특허 10-15933131에서는 항원검출 시간 단축이 용이하지 않았으며, 바이오센서를 제조한 후 일정 시간 내에 검출해야만 효과적인 검출이 가능하였다. 이에 본 연구에서는 액적을 투명한 cover glass에 고정화시킴으로써 액적의 안정성을 획기적으로 개선할 수 있었을 뿐만 아니라 항원 검출 시간을 크게 단축시킬 수 있었다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명이 해결하려는 과제는 마이크로액적의 안정성을 유지한 채 항체의 감도를 향상시켜 항원의 검출 한계 농도를 낮출 수 있고 검출 시간을 단축시킬 수 있으며, 바이오센서를 제조한 후 긴 시간이 지난 후에도 효과적인 검출이 가능하고, 항원과의 비특이적 상호작용을 감소시켜 정확한 검출이 용이한 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법을 제공하는 데에 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 표면에 -OH기를 포함하는 유리기판; 액정(liquid crystals); 상기 액정과 결합하며 항체가 고정되어 있는 블록 공중합체; 및 상기 액정 표면에 물리적으로 흡착된 계면활성제;를 구비하는 LC 마이크로액적을 포함하며, 상기 마이크로액적은 링커에 의해 기판에 고정되되 상기 링커는 일측에 상기 유리기판의 -OH기와 결합가능한 작용기를 포함하고, 타측은 상기 블록공중합체와 결합가능한 아민기를 포함하는 항원 검출용 LC 마이크로액적(liquid crystal microdroplets)을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 마이크로액적은 계면활성제에 의해 형성된 마이셀(micelle) 구조로서, 상기 액정은 마이크로액적 내부에 존재하며, 상기 블록 공중합체의 소수성 부분은 마이크로액적 내부에 존재하고, 상기 항체는 상기 블록 공중합체의 친수성 부분과 결합하여 마이크로액적 외부에 노출되어 있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면 상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'헥실바이페닐 또는 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 블록공중합체는 친수성 부분에 카르복실기(-COOH)를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 항체는 이소티오시아네이트계 화합물을 형광화합물로서 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 링커는 상기 블록공중합체와의 화학결합을 통해 유리기판 상에 LC 마이크로액적(liquid crystal microdroplets)을 고정하며, 상기 링커가 유리 기판 상에 고정되는 경우 기판 표면과의 접촉각(contact angle)이 70 ~ 95°일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 링커는 하기 화학식 1의 구조를 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112017011655886-pat00001
-상기 식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1 ~ C20의 알킬기이며, R3는 카르복실기, 에스터기, 무수물, 아실클로라이드기, 클로로실란기 또는 알콕시실란기 중 어느 하나이고, m은 정수이고, 0 ≤ m ≤ 20 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 화학결합은 탈수축합반응에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 LC 마이크로액적은 상기 유리기판에 1200 ~ 2000개/cm2의 면적비율로 고정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면 상기 항체가 항원과 비결합시에는 상기 액정이 방사형 배열(radial conformation)을 가지며, 상기 항체가 항원과 결합 시에는 상기 액정이 양극성 배열(bipolar conformation)을 가질 수 있다.
한편, 본 발명은 상기의 어느 한 항원 검출용 LC 마이크로액적을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 바이오센서는 PBS 용액 중 15 ~ 50 ng/ml 의 항원 농도에서 5 ~ 45 분 동안 40 ~ 100% 의 항원을 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면 상기 바이오센서는 10% 혈청 (FBS) 또는 10% 혈장 (Plasma) 용액 중 15 ~ 50 ng/ml 의 항원 농도에서는 20 ~ 90 분 동안 25 ~ 100%의 항원을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 어느 한 항원 검출용 LC 마이크로액적을 이용하여 항원을 센싱하는 방법을 제공한다.
본 발명은 액정마이크로액적의 저장 안정성을 보장하며 항원의 검출 시간을 단축시킬 수 있으며, 안정성이 우수하여 효과적인 검출이 가능한 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적의 형성과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 형광화합물이 결합된 항체를 고정화한 LC 마이크로액적의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 FITC (a), AIgG (b), FITC-고정된 AIgG (c)의 UV-vis 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적이 항원과 결합하기 전과 후의 내부의 액정의 배향 변화를 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 항원이 결합하기 전(좌측), 후(우측)의 편광 이미지이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 (a) 슬라이드 글래스에 고정화된 AIgG-LC 마이크로액적의 편광이미지(b), FITC-AIgG-LC 마이크로액적의 편광이미지 및 (c) FITC-AIgG-LC 마이크로액적의 형광이미지 이다.
도 7은 본 발명의 비교예 1에 따른 자유(free) LC 마이크로액적의 수용액상에서의 이동을 관측한 이미지이다.
도 8은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 슬라이드 커버 글래스에 고정화한 LC 마이크로액적의 수용액상에서의 이동을 관측한 이미지이다.
도 9는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 각각 10ng/ml, 25ng/ml, 50ng/ml의 IgG를 포함하는 PBS 용액에서 30분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이다.
도 10은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 50ng/ml의 IgG를 포함하는 PBS 용액에서 0, 5, 15, 30 분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이다.
도 11은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 각각 10ng/ml, 25ng/ml, 50ng/ml의 IgG를 포함하는 10% FBS용액에서 90분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이다.
도 12는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 50ng/ml의 IgG를 포함하는 10% FBS 용액에서 0, 30, 60, 90분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이다.
도 13은 본 발명의 바람직한 일실시예에 다른 LC 마이크로액적을 이용하여 50ng/ml의 IgG를 포함하는 10% 혈장수용액 (blood plasma solution)에서 0, 30, 60, 90분 동안 항원 검출한 후의 편광이미지이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 한편, 한국등록특허 10-1593313은 본 발명에 참조로써 삽입된다.
상술한 바와 같이 다만 종래의 바이오센서들은 시간이 많이 소요되고 비용이 많이 드는 단점이 있었으며, 검출한계가 높아 효과적으로 검출할 수 없었다. 이에 본 발명자는 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체, 이를 이용하여 암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서를 통해서 상술한 문제점들을 해결하고자 하였으나, LC 마이크로액적의 저장 안전성이 떨어지고 감도의 변화없이 검출 한계 농도를 낮추기가 어렵고, 검출 시간 단축이 용이하지 않으며, 바이오센서를 제조한 후 일정 시간 내에 검출해야만 효과적인 검출이 가능하고, 항원과의 비특이적 상호작용의 가능성이 높아 정확한 검출이 어려운 문제점이 있었다.
이에 본 발명은 표면에 -OH기를 포함하는 유리기판; 액정(liquid crystals); 상기 액정과 결합하며 항체가 고정되어 있는 블록 공중합체; 및 상기 액정 표면에 물리적으로 흡착된 계면활성제;를 구비하는 LC 마이크로액적을 포함하며, 상기 마이크로액적은 링커에 의해 기판에 고정되되 상기 링커는 일측에 상기 유리기판의 -OH기와 결합 가능한 작용기를 포함하고, 타측은 상기 블록공중합체와 결합 가능한 아민기를 포함하는 항원 검출용 LC 마이크로액적(liquid crystal microdroplets)을 제공한다.
구체적으로 도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적의 형성과정을 나타낸 개략도이다. 상기 도면을 통해 알 수 있듯이 본 발명은 -OH기를 포함하는 유리기판을 링커에 의해서 블록공중합체가 결합된 액정과 연결(linking)하고, 상기 액정에 결합된 블록공중합체에 항체를 고정하여 항원 검출용 LC 마이크로액적을 제공한다.
이를 통해 마이크로액적이 유리기판에 고정되어 있어 감도를 향상시켜 항원의 검출 한계 농도를 낮출 수 있고 검출 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 마이크로액적이 고정되어 이동하지 않으므로, 바이오센서를 제조한 후 보다 긴 시간이 지난 후에도 효과적인 검출이 가능하며, 유동액 내에서의 검출도 용이한 장점이 있다. 이와 동시에, 항원과의 비특이적 상호작용을 감소시킬 수 있고 물리적으로 흡착된 불순물을 쉽게 세척할 수 있어 검출의 정확도를 향상시킬 수 있다.
먼저, 표면에 -OH기를 포함하는 유리기판에 대해 설명한다. 본 발명은 표면 개질을 통하여, 표면에 -OH기를 포함하는 유리기판에 LC 마이크로액적을 형성한다. 이를 통해 상기 -OH기는 링커가 결합하여 LC 마이크로액적을 고정화하는 기능을 가지므로, 종국적으로 항원과 항체의 결합이 완료될 때까지 상당한 기간동안 LC 마이크로액적이 부동화 상태로 유지될 수 있으므로 검출 한계 농도 및 시간을 낮출 수 있고, 검출 정확도를 향상시킬 수 있다.
유리기판의 표면은 폴리스티렌 세포배양접시 등과 달리 많은 -OH기를 포함하고 있어 링커가 결합하기에 용이하다. 따라서, -OH기를 포함하는 유리기판을 사용하지 않는 경우, 기판의 표면에 링커가 결합하기가 용이하지 않아 본 발명이 목적하는 고정화에 따른 검출 한계 농도와 시간 감소 효과 및 검출 정확도 향상 효과를 달성할 수 없는 문제점이 발생할 수 있다.
다음으로, LC 마이크로액적 내부에 존재하는 액정에 대해 설명한다. 본 발명은 액정을 포함하는 마이크로액적을 이용하여 선택적인 항원의 검출을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'헥실바이페닐 또는 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 4-시아노-4'-펜틸바이페닐을 사용할 수 있다. 상기의 화합물을 액정으로 사용하는 경우 (상기 성분을 액정으로 사용하는 경우의 장점)의 효과를 가진다.
또한, 본 발명의 LC 마이크로액적 내부에 상기 액정은 1x10-2M ~ 5x10-2
M로, 바람직하게는 1x10-2M ~ 3x10-2로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1x10-2M ~ 2.5x10-2M로 포함할 수 있다. 상기 범위 내로 액정이 포함되는 경우, LC 마이크로액적 내부에 적절한 비율로 액정이 포함될 수 있어 LC 마이크로액적의 효율을 향상시킬 수 있다.
다음으로, 상기 액정과 결합하며 항체가 고정되어 있는 블록공중합체에 대해 설명한다. 본 발명에서 블록공중합체는 마이크로액적 내부에서 액정과 결합하고 있으며, 항체가 고정되어 있고, 후술하는 바와 같이 링커와도 결합하여 LC 마이크로액적에서 각 구성요소들을 액정에 결합 또는 고정시키는 역할을 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 블록공중합체는 양 말단의 블록이 각각 친수성/소수성의 상이한 성질을 가지는 것이면 다양하게 이용할 수 있으며, 바람직하게는 친수성 부분에 카르복실기(-COOH)를 포함하는 이중블록공중합체를 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리(스티렌-b-아크릴산)(PS-b-PAA)일 수 있다. 이를 통해 상기 블록공중합체는 -COOH기를 이용하여 링커의 -NH2와 결합을 형성할 수 있고 계속해서 항체의 -NH2 기와 결합을 형성하여, 액정을 항체 및 링커와 결합시킬 수 있다. 만일 상기 블록공중합체가 카르복실기를 포함하지 않는 경우에는 항체 및 링커를 액정에 결합하는 것이 용이하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 상기 블록공중합체를 1.5x10-2M ~ 2x10-1M로, 바람직하게는 2.0x10-2M ~ 5x10-2M로, 더욱 바람직하게는 2.0x10-2M ~ 3.0x10-2M로 포함할 수 있다. 상기 범위 내로 블록공중합체를 포함하는 경우, 액정에 적절한 비율로 블록공중합체를 결합할 수 있어 LC 마이크로액적이 형성되는 효율을 향상시킬 수 있다.
다음으로, 상기 액정과 결합하며 항체가 고정되어 있는 블록공중합체에 대해 설명한다. 본 발명에서 블록공중합체는 마이크로액적 내부에서 액정과 결합하고 있으며, 항체가 고정되어 있고, 후술하는 바와 같이 링커와도 결합하여 LC 마이크로액적에서 각 구성요소들을 액정에 결합 또는 고정시키는 역할을 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 블록공중합체는 양 말단의 블록이 각각 친수성/소수성의 상이한 성질을 가지는 것이면 다양하게 이용할 수 있으며, 바람직하게는 친수성 부분에 카르복실기(-COOH)를 포함하는 이중블록공중합체를 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 폴리(스티렌-b-아크릴산)(PS-b-PAA)일 수 있다. 이를 통해 상기 블록공중합체는 -COOH기를 이용하여 링커의 -NH2와 결합을 형성할 수 있고 계속해서 항체의 -NH2 기와 결합을 형성하여, 액정을 항체 및 링커와 결합시킬 수 있다. 만일 상기 블록공중합체가 카르복실기를 포함하지 않는 경우에는 항체 및 링커를 액정에 결합하는 것이 용이하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 상기 블록공중합체를 1.5x10-2M ~ 2x10-1M로, 바람직하게는 2.0x10-2M ~ 5x10-2M로, 더욱 바람직하게는 2.0x10-2M ~ 3.0x10-2M로 포함할 수 있다. 상기 범위 내로 블록공중합체를 포함하는 경우, 액정에 적절한 비율로 블록공중합체를 결합할 수 있어 LC 마이크로액적이 형성되는 효율을 향상시킬 수 있다.
다음으로, 상기 액정 표면에 물리적으로 흡착된 계면활성제에 대해 설명한다. 상기 계면활성제, 즉 O/W 에멀젼 시스템(Oil in water emulsion system)에 의해 마이셀(micelle) 구조가 형성되어 액적 형태를 갖게 되며, 이러한 마이셀 구조에 따라 액정과 블록공중합체의 결합이 용이하게 형성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 마이크로액적의 내부에는 액정을 포함하게 되고, 블록 공중합체의 비친수성 부위는 마이크로액적의 내부에 존재하게 되며, 블록 공중합체의 친수성 부위는 마이크로액적의 외부에 노출될 수 있다. 이는 계면활성제에 의해 액정이 마이셀구조를 형성하게 되어, 블록공중합체와 액정의 결합이 용이하게 되기 때문이다.
상기 계면활성제는 LC 마이크로액적 내에서 액정이 마이셀 구조를 형성할 수 있어 블록공중합체와의 결합이 가능토록 하는 것이면 다양하게 사용할 수 있으나, 바람직하게는 소듐 도데실 설페이트(SDS)일 수 있다.
또한, 상기 계면활성제는 바람직하게는 LC 마이크로액적 내부에 0.5 mM ~ 30 mM로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 2 mM ~ 25 mM로, 더욱 바람직하게는 8 mM ~ 20 mM로 포함될 수 있다. 상기 범위 내로 계면활성제를 포함하는 경우, 본 발명의 액정이 마이셀 구조를 용이하게 형성할 수 있다.
한편, 상기 계면활성제(surfactants) 존재 하에서, 본 발명의 액정물질의 메소겐과의 π-π* 및 소수성-소수성 상호작용은 양극형(bipolar configuration) 배열 보다는 방사형(radial configuration)으로 액정물질이 배열된 LC 마이크로액적을 안정화시킬 수 있다. 이에 따라 본 발명의 액정은 상기 항체가 항원과 비결합시에는 방사형 배열(radial configuration)을 가지며, 상기 항체가 항원과 결합 시에는 양극성 배열(bipolar configuration)을 가질 수 있다.
또한, 상기 블록공중합체에 고정되어 있는 항체는 이소티오시아네이트계 화합물을 형광화합물로서 포함할 수 있으며, 바람직하게는 FITC(Fluorescein isothiocyanate)를 포함할 수 있다. 상기 액정물질의 배열변화에 따라 형광화합물이 발광하게 되고, 이러한 발광 유무를 확인함으로써 항원을 효과적으로 검출할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
구체적으로 도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 형광화합물을 고정한 LC 마이크로액적의 개략도이다. 상기 도면을 통해서 알 수 있듯이 유리기판에 고정된 LC 마이크로액적에 항체를 고정하고, 항체는 형광화합물인 FITC를 포함할 수 있다. 이를 통해 항원 검출 여부를 효과적으로 확인할 수 있게 된다. 또한, 도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 FITC, AIgG, FITC-고정된 AIgG의 UV-Vis 스펙트럼이다. 상기 도면을 살펴보면, 본 발명에 따른 FITC가 고정된 AIgG는 FITC 및 AIgG의 특정 피크를 모두 포함하고 있어, 항체가 형광화합물을 포함하고 있음을 확인할 수 있다.
즉, 항원과 항체가 결합하면 액적 내의 액정이 방사형에서 양극형으로 배열이 변화함과 동시에 발광을 하게 되어 마이크로액적의 형광 이미지를 통해 항체가 액적에 확실히 결합되어 있음을 알 수 있게 된다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적 내부의 액정의 배향 변화를 나타낸 이미지이다. 또한, 도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 항원이 결합하기 전(좌측), 후(우측)의 편광 이미지이다. 상기 도면을 통해서 항체가 결합하기 전의 액적 내의 액정은 방사형의 배열을 가지나 항체가 결합한 후에는 양극형으로 배열이 변화함을 확인할 수 있다.
또한, 도 6은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 (a) AIgG가 고정된 LC 마이크로액적의 편광이미지와 (b) FITC-AIgG가 고정된 LC 마이크로액적의 편광이미지 그리고 (c) FITC-AIgG가 고정된 LC 마이크로액적의 형광이미지 이다. 상기 도면을 통해서 FITC가 고정된 항체를 이용하는 경우에는 그렇지 않은 경우보다는 항체의 고정부위의 저하로 인해 LC 마이크로액적에 대한 고정효율이 저하할 수 있다.
한편, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 본 발명의 LC 마이크로액적의 평균직경은 5㎛ ~ 40㎛ 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 5㎛ ~ 35㎛, 더욱 바람직하게는 10㎛ ~ 30㎛일 수 있다.
나아가, 상기 마이크로액적은 링커에 의해 기판에 고정된다. 상기 기판에 마이크로액적이 고정되면, 민감도가 향상되어 항원의 검출 한계 농도를 낮출 수 있고 검출 시간을 단축시킬 수 있다. 또한 마이크로액적이 고정되어 이동하지 않으므로, 안정성이 우수하여 마이크로액적을 제조한 후 보다 긴 시간이 지난 후에도 액적간의 응집이 일어나지 않아 효과적인 검출이 가능하다. 뿐만 아니라 유동액 내에서의 검출도 용이한 장점이 있다. 또한, 항원과의 비특이적 상호작용을 감소시킬 수 있고 물리적으로 흡착된 불순물을 쉽게 세척할 수 있어 검출의 정확도를 향상시킬 수 있다.
만일 상기 마이크로액적이 고정되어 있지 않다면, 비교적 감도가 저하되어 항원의 검출 한계 농도가 상대적으로 높게 나타나고 검출 시간도 상대적으로 길어진다. 또한 안정성이 낮아 마이크로액적을 제조한 후 일정 시간이 지난 후에는 액적간의 응집이 발생하여 효과적인 검출이 불가능하며, 비특이적 상호작용에 의해 검출의 정확도가 저하되는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 링커는 일측에 상기 유리기판의 -OH기와 결합 가능한 작용기를 포함하고, 타측은 상기 블록공중합체와 결합 가능한 아민기를 포함한다. 일측에 포함되는 -OH기와 결합 가능한 작용기가 있어야만 본 발명에 따른 유리기판에 포함되는 -OH기와 결합을 형성하여 기판에 안정적으로 고정될 수 있고, 상술한 고정화에 따른 효과를 달성할 수 있다.
또한, 상기 링커의 타측에는 블록공중합체와 결합가능한 아민기를 포함하여야 한다. 상기 아민기는 블록공중합체와 결합하여, 블록공중합체를 통해 액정과 결합하게 된다. 이를 통해 본 발명이 목적하는 링커에 의해 기판에 고정되는 마이크로액적을 얻을 수 있다. 또한 링커가 항체의 경우와 동일하게 아민기를 포함하도록 하여 단일한 블록공중합체, 바람직하게는 단일한 친수성 부분에 카르복시기를 포함하는 블록공중합체를 이용하여 링커 및 항체를 모두 액정과 용이하게 결합할 수 있는 효과가 있다.
만일 링커의 일측에 -OH기와 결합가능한 작용기가 없다면 유리기판의 -OH와 안정적인 화학결합을 통해 기판에 고정되지 못하는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 상기 링커의 타측에 아민기가 없다면 항체의 카르복시기와 반응을 할 수 없어 단일한 블록공중합체를 이용한 결합이 용이하지 않을 수 있어 공정이 복잡화될 수 있다.
구체적으로 도 7은 유리기판에 고정되지 않은 자유(free) LC 마이크로액적의 수용액상에서의 이동을 관측한 이미지이고, 도 8은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 유리기판에 고정된 LC 마이크로액적의 수용액상에서의 이동을 관측한 이미지이다. 상기 도면을 통해서 알 수 있듯이, 기판에 고정되지 않은 종래의 LC 마이크로액적은 11초 만에 약 90μm 이동하였으며 이를 통해 민감도 및 안정성이 저하되어 정확한 검출이 용이하지 않음을 알 수 있다. 반면, 도 8에 나타내는 바와 같이 본 발명에 따른 기판에 고정된 LC 마이크로액적은 시간이 흘러도 전혀 이동하지 않음을 알 수 있다. 즉, 링커를 통한 마이크로액적을 고정화함에 따라 민감도 및 안정성을 향상시켜 검출 정확도를 높일 수 있고, 검출 한계 농도를 낮출 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 링커는 상기 블록공중합체와의 화학결합을 통해 유리기판 상에 LC 마이크로액적(liquid crystal microdroplets)을 고정하며, 상기 링커가 유리 기판 상에 고정되는 경우 기판 표면과의 접촉각(contact angle)이 70 ~ 95°일 수 있다.
상술한 바와 같이 링커에 포함되는 -OH기와 결합 가능한 작용기 및 아민기는 각각 화학결합을 통해 유리기판 및 액정과 보다 강하게 결합될 수 있어, 안정성이 향상된 LC 마이크로액적을 얻을 수 있다.
구체적으로, 상기 화학결합은 링커의 아민기와 블록공중합체의 아민기와 결합 가능한 작용기 간의 화학반응에 의하여 형성될 수 있으며, 바람직하게는 링커의 아민기와 블록공중합체에 포함될 수 있는 카르복실기 간의 탈수축합반응에 의하여 형성될 수 있다. 또한, 생성되는 화학결합은 각각의 작용기 간의 반응형태에 따라 상이할 수 있지만 바람직하게는 펩티드결합이 형성될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 링커의 -OH기와 결합 가능한 작용기와 기판에 포함되는 -OH기간에도 화학반응에 의하여 화학결합을 형성할 수 있으며, 바람직하게는 -OH, -ROH 등을 이탈시키며 형성되는 화학결합일 수 있다.
또한, 본 발명의 링커는 일측에 아민기를 포함하는 소수성기를 포함하고 있어 링커가 유리기판 상에 고정되는 경우 기판 표면과의 물 접촉각이 70 ~ 95°로 나타날 수 있다. 이는 링커가 기판상에 고정되지 않은 경우의 접촉각이 30 ~ 55°로 나타남에 비해 현저히 향상된 값이다.
또한, 상기 링커는 하기 화학식 1의 구조를 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112017011655886-pat00002
상기 식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1 ~ C20의 알킬기이며, R3는 카르복실기, 에스터기, 무수물, 아실클로라이드기, 클로로실란기 또는 알콕시실란기 중 어느 하나이고, m은 정수이고, 0 ≤ m ≤ 20 일 수 있다.
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1 ~ C20의 알킬기라는 의미는 수소, 알킬기 및 헤테로알킬기를 모두 포함하는 것으로, 포화·불포화 알킬기를 모두 포함하며, 분지형, 직쇄형 또는 환형일 수 있고, 치환 또는 비치환 알킬을 모두 포함한다. 상기 각각 독립적으로 존재할 수 있다는 의미는, 서로 다른 치환단위인 R1 및 R2가 서로 상이한 치환기로 선택될 수 있음을 의미한다.
또한, 상기 R3는 카르복실기, 에스터기, 무수물, 아실클로라이드기, 클로로실란기 또는 알콕시실란기 중 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 카르복실기, 알콕시실란기 또는 클로로실란기 중 어느 하나일 수 있으며, 보다 바람직하게는 카르복실기 또는 알콕시실란기 일 수 있다. 상기 R3가 상기 치환기 중 어느 하나인 경우에는 유리기판 상에 포함되는 -OH기와의 화학결합을 통해 용이하게 기판에 고정될 수 있다. 따라서 -OH기와 결합이 가능한 작용기이며 본 발명의 마이크로액적이 항원을 검출함에 영향을 주지 않는 작용기이면 다양하게 사용이 가능하지만, -OH기와 결합이 비교적 용이한 상기의 작용기들을 포함하는 링커를 사용하는 것이 바람직하다.
상기의 R3를 포함하는 링커들은 기판에 포함되는 -OH기와 반응하여 H2O, ROH, RCOOH, CF3COOH, Cl- 등을 이탈시키면서 용이하게 화학결합을 형성할 수 있다. 특히, 알콕시실란기의 경우 좋은 이탈기(good leaving group)인 -OR기에 의해 화학결합이 용이하게 형성될 수 있어 링커의 본연의 역할에 유리한 장점이 있다.
또한, 상기 m은 정수이고, 0 ≤ m ≤ 20일 수 있으나, 링커가 기판의 -OH기와 블록공중합체와 결합하여 링커 본연의 역할을 다 할 수 있으면 이에 제한되지 않는다.
한편, 상기 링커는 바람직하게는 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)일 수 있다. 상기 화합물은 일측에는 좋은 이탈기(good leaving group)인 -OEt기를 포함하는 트릴에톡시실란기를 포함하고 있으며, 타측에는 아민기를 포함하고 있다. 이에 따라 트리에톡시실란기는 기판의 -OH와 용이하게 결합하여 EtOH를 이탈시키며 화학결합을 형성하고, 아민기는 블록공중합체의 작용기, 바람직하게는 카르복실기와 탈수축합반응의 화학반응을 통해 펩티드 결합을 형성할 수 있다. 결국, 상기의 화합물을 링커로 이용하는 경우 기판과 블록공중합체와의 용이한 결합을 통해 LC 마이크로액적을 기판에 고정화하는 링커 본연의 기능을 효율적으로 수행할 수 있다. 이를 통해 상술한 고정화에 따른 현저한 민감도 향상, 검출 한계 농도의 저하, 검출 시간의 단축, 안정성의 향상 및 검출 정확도의 향상 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 링커는 LC 마이크로액적 1개 당 1몰 분자 이상 포함될 수 있다. 상기 범위로 링커가 포함되면, 유리기판의 -OH기와 링커의 결합 효율을 현저히 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 LC 마이크로액적은 상기 유리기판에 1200 ~ 2000개/cm2의 면적비율로 고정되어 있을 수 있고, 바람직하게는 1400 ~ 1800개/cm2의 면적비율로 고정될 수 있다. 상기의 면적비율로 LC 마이크로액적이 고정되는 경우, 적절한 면적비율로 마이크로액적을 고정할 수 있어 액적간의 접근을 막아 편광이미지를 높은 감도로 용이하게 판독할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 검출될 수 있는 항원은 대응하는 항체가 이미 알려진 소동물 및 인간유래의 항원 또는 각종 바이러스면 제한없이 검출할 수 있다. 바람직하게는 IgG, IgM, IgE, IgA E 및 IgG 중 어느 하나 이상일 수 있다. 이를 통해 본 발명의 유리기판에 고정된 LC 마이크로액적에 항체를 결합하여 다양한 항원을 검출할 수 있어 바이오센싱 분야에서 폭넓게 활용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기의 어느 하나의 항원 검출용 LC 마이크로액적을 포함하는 항원 검출용 바이오센서를 제공한다. 본 발명의 항원 검출용 바이오센서는 LC 마이크로액적이 기판에 고정되어 있어, LC 마이크로액적을 통해 얻을 수 있는 효과 및 장점을 그대로 포함하면서, 고정화에 따른 효과도 가진다. 즉, 저장시간이 지속되더라도 LC 액적간의 응집이 유발되지 않고 현저한 민감도 향상, 검출 한계 농도의 저하, 검출 시간의 단축, 안정성의 향상 및 검출 정확도의 향상 효과를 얻을 수 있다.
이하 상술한 바와 중복되는 내용을 제외하고 상세히 설명한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 바이오센서는 PBS 용액 중 15 ~ 50 ng/ml 의 항원 농도에서 5 ~ 45 분 동안 40 ~ 100% 의 항원을 검출할 수 있고, 10% 혈청 (FBS) 또는 10% 혈장 (Plasma) 용액 중 15 ~ 50 ng/ml 의 항원 농도에서는 20 ~ 90 분 동안 25 ~ 100%의 항원을 검출할 수도 있다.
즉, 비교적 낮은 항원의 농도범위에서 짧은 시간 동안 높은 비율로 항원을 검출할 수 있는 것이다. 이는 기판에 LC 마이크로액적을 고정화함에 따른 검출 한계 농도의 저하 및 검출 시간의 단축에 따른 효과로서, 고정되어 있지 않은 LC 마이크로액적에 비하여 현저히 높은 검출 감도 및 검출 속도 및 저장안정성을 가진다.
구체적으로 도 9는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 각각 10ng/ml, 25ng/ml, 50ng/ml의 IgG를 포함하는 PBS 용액에서 30분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이고, 도 10은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 50ng/ml의 IgG를 포함하는 PBS 용액에서 0, 5, 15, 30분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이다.
또한, 도 11은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 각각 10ng/ml, 25ng/ml, 50ng/ml의 IgG를 포함하는 10% FBS용액에서 90분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이며, 도 12는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 50ng/ml의 IgG를 포함하는 10% FBS 용액에서 0, 30, 60, 90분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지이다. 상기 도면들을 통해 알 수 있듯이 본 발명의 LC 마이크로액적은 PBS 용액의 경우뿐 만 아니라, FBS(Fetal bovine serum) 용액의 경우에도 항원의 농도가 50ng/ml의 경우에는 검출시간이 90분 이면 항원을 완전히 검출할 수 있다. 또한, FBS 용액의 경우에는 60분의 검출시간에도 절반 이상의 높은 비율로 항원을 검출할 수 있다. 뿐만 아니라 PBS 용액의 경우에는 30분이라는 현저히 짧은 검출 시간으로 항원을 완전히 검출할 수 있어 검출 효과가 현저히 뛰어남을 알 수 있다.
또한, 도 13은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적을 이용하여 각각 50ng/ml의 IgG를 포함하는 10% 혈장단백질 용액에서 0 - 90분 동안 항원 검출한 후의 편광 이미지 이다. 상기 도면들을 통해 알 수 있듯이 본 발명의 LC 마이크로액적은 10% 혈장 용액에서도 항원의 농도가 50ng/ml인 경우에는 검출시간이 90분 이면 100%의 항원을 검출할 수 있다. 또한, 30분 이라는 현저히 짧은 시간에도 25% 이상의 항원을 검출할 수 있어 우수한 바이오센싱 기능을 가짐을 알 수 있다.
나아가, 본 발명의 LC 마이크로액적은 50ng/ml의 절반인 25ng/ml의 항원 농도 조건 하에서도 90분이라는 짧은 검출 시간만으로 절반 이상의 항원을 검출할 수 있음을 도 9 및 도 11을 통해 확인할 수 있다. 즉, 본 발명은 LC 마이크로액적을 유리기판에 고정함으로써 검출 한계 농도를 현저히 낮출 수 있음과 동시에 짧은 검출 시간만으로 검출할 수 있어 현저히 우수한 검출 효율을 발현할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 어느 하나의 항원 검출용 LC 마이크로액적을 이용하여 항원을 검출하는 방법을 제공한다. 이를 통해서 상술한 바와 같이 다양한 항원을 비교적 낮은 농도로, 높은 정확도로 검출할 수 있다. 또한, 상기 검출은 체외(in vitro)에서 수행할 수 있다.
상기 검출은 바람직하게는 32℃이하의 온도 범위 및 pH 7.0 ~ 7.6 조건에서 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 7.2 ~ 7.5, 더욱 바람직하게는 7.35 ~ 7.45 에서 상기 마이크로액적과 항원을 접촉시켜서 검출할 수 있다. 상기 pH 범위 내에서 검출하는 경우, 블록공중합체에 고정되어 있는 항체의 분해 및 액정의 배열에 대한 영향을 저하시킬 수 있어 검출 정확도를 향상시키는 효과가 있다.
결국, 본 발명은 항원 검출용 LC 마이크로액적 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용하여 항원을 검출하는 방법을 제공하며, 이는 LC 마이크로액적이 유리기판 상에 고정되어 있어 항체의 감도를 향상시켜 항원의 검출 한계 농도를 낮출 수 있고 검출 시간을 단축시킬 수 있으며, 안정성이 우수하여 효과적인 검출이 가능하므로 다양한 항원의 검출에 효과적으로 활용될 수 있다.
실시예 1
(1) LC 마이크로액적의 제조
LC 마이크로액적을 제조하기 위해서, 100mL 둥근 바닥 플라스크에 20 mg (2.8 μmol) 블록공중합체(PS-b-PA)가 용해된 PBS 용액(20 mL)에 20mg(70 μmol)의 소듐도데실설페이트(sodium dodecylsulfate)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 5000rpm으로 약 1시간 동안 자기적으로 교반하여 SDS를 완전히 혼합하고 SDS와 양친성 블록공중합체(PS-b-PA)의 균질 혼합물을 수득하였다. LC 마이크로액적 에멀젼을 제조하기 위해 4-시아노-4'-펜틸비페닐(5CB)액정 (98% 네마틱상) 100mg(400μmol)을 상기 PS-b-PA의 균질액 및 SDS에 적가하여 준비하였다. 상기 생성된 혼합물을 11,000 rpm에서 20초 동안 연속적으로 교반하여 균일하게 분산된 LC 마이크로액적을 수득하였다. 미량의 5CB, SDS 및 PS-b-PA로부터 LC 마이크로액적을 분리하기 위해, LC 마이크로액적 에멀젼을 PBS용액(pH7.4)에서 800rpm으로 원심 분리하였다. 작은 크기의 마이크로액적은 10 mL PBS 용액에 원심 분리된 LC 마이크로액적을 현탁시켜 제거하고, 원심 분리 후 상등액에 남아있는 작은 크기의 LC 마이크로액적을 제거하기 위해 원심 분리하였다. 상기 원심 분리된 LC 마이크로액적을 20mL PBS 용액에 현탁시키고 PBS 용액 중의 AlgG와 접합시킨 후 슬라이드 커버 글라스에 고정시키기 위해 보존하였다. 또한, 상기 슬라이드 커버 글라스에 고정된 LC 마이크로액적은 PBS 및 10% FBS 및 10단백질을 함유하는 혈액과 매우 유사한 미디어에서 IgG와의 상호 작용을 연구하는데 사용하였다.
(2) 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)에 의한 슬라이드 커버 글라스의 표면 개질
슬라이드 커버 글라스의 표면 개질을 위해, 아세톤으로 세척된 현미경 슬라이드 커버 글라스를 피라니아 용액(1:3, 30% H2O2 : 3H2SO4)으로 약 30분 동안 처리하여 슬라이드 커버 글라스 표면에 실라놀기를 생성하였다. 과량의 미사용 피라니아 용액을 증류수로 세정한 후, 피라니아 처리된 슬라이드 커버 글라스를 95 % 아세톤에 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)이 포함된 용액과 pH 11.2 하에서 3 분간 반응시켰다. 마지막으로, 슬라이드 커버 글라스를 에탄올로 3회 세척하고 진공 하에 건조시켰다.
(3) 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)에 의해 변형된 슬라이드 커버 글라스에 LC 마이크로액적을 고정
LC 마이크로액적과 IgG의 민감성 및 상호 작용을 향상시키기 위해 정제된 LC 마이크로액적(15-20M)을 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)에 의해 변형된 슬라이드 커버 글라스에 고정하였다. LC 마이크로액정을 슬라이드 커버 글라스에 고정하기 위해, LC 마이크로액적 내부에 존재하는 양친성 블록공중합체의 카르복실기 그룹을 200mg(640μmol)의 NHS 및 200㎎(1740 μmol)의 EDC가 용해된 PBS 20mL 용액을 포함하는 둥근 바닥 플라스크에 1.0 ㎖의 LC 마이크로액적 에멀젼(18x103 마이크로액적/mL)을 적가하여 활성화하였다. 상기 용액에서 슬라이드 커버 글라스 및 그에 따른 결과 혼합물을 5로 밤새 유지하였다. 12 시간 후, 슬라이드 커버 글라스를 활성화된 혼합물로부터 분리하고 증류수로 세척하여 반응하지 않은 시약 및 LC 마이크로액적을 제거하였다. 세척 후, LC 마이크로액적을 고정한 슬라이드 커버 글라스를 PBS (용액 pH 7.4)에서 보존 하여, AlgG를 고정하고 슬라이드 커버 글라스에 고정된 LC 마이크로액적 내의 5CB 분자의 배향 상태를 특성화하였다.
(4) 고정된 LC 마이크로액적에 대한 AIgG 고정
상기 고정된 LC 마이크로액적의 항원 특이적 선택성을 위하여, 고정된 LC 마이크로액적 내부에 양친매성 PS-b-PA 블록공중합체의 유리된 카르복실 그룹 상에 AlgG를 고정하였다. 고정된 LC 마이크로액적에 AIgG를 고정하기 위해, 상기 라이드 커버 글라스에 고정된 LC 마이크로액적을 5℃에서 200㎎(640μmol)의 NHS 및 200㎎(1740μmol)의 EDC가 용해된 20mL PBS 용액을 포함하는 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 침지하였다. 상기 용액에, 50μg(34pmol)의 AlgG를 함유하는 5 mL의 PBS 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 5에서 하룻밤 동안 유지하였다. 12 시간 후, 상기 AIgG가 고정된 LC 마이크로액적이 고정된 슬라이드 커버 글라스를 활성화 혼합물로부터 분리하고 증류수로 세척하여 미사용된 AIgG 및 다른 시약을 제거하였다.
(5) 고정된 LC 마이크로액적에 대한 AlgG-FITC-접합체의 고정
고정된 LC 마이크로액적에 대한 AlgG의 고정은 LC 마이크로액적에 형광성 AlgG-FITC-접합체를 고정시킴으로써 확인할 수 있다. 고정된 LC 마이크로액적에 AIgG-FITC-접합체를 고정시키기 위해, 각각 200 mg을 함유하는 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 50μg(34pmol)의 AIgG를 함유하는 10mL PBS 용액을 적가하여 AIgG를 활성화시켜 FITC와 접합시켰다. 상기 용액에 10mL의 FITC(50μg)가 포함된 10mL DMSO 용액을 첨가하고, 혼합물을 5℃ 어두운 조건에서 8시간 동안 방치하였다. 상기 반응 혼합물을 재생 셀룰로스 아세테이트 멤브레인(MWCO, 12000) 및 PBS 용액을 사용하여 투석하였다. 마지막으로, AIgG-FITC-접합체를 PBS 용액으로 세척하고 동결 건조하여 분말상의 백색 고체를 얻었다.
(6) 슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-고정 마이크로액적을 이용한 IgG 검출
AIgG-고정된 LC 마이크로액적의 PBS (pH, 7.4) 용액에서의 IgG 검출 반응을 평가하기 위해서 슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-고정된 LC 마이크로액적을 상온에서 50ng/mL 농도의 IgG의 1.0 ㎖ 용액을 함유하는 2.0cm 직경의 원형 접시에 LC 마이크로액정이 고정된 슬라이드 커버 글라스를 유지함으로써 PBS(pH, 7.4) 용액에서의 IgG 검출 반응을 평가하였다. 슬라이드 커버 글라스에 고정된 AIgG 가 고정된 LC 마이크로액적의 검출 시간을 최적화하기 위해, IgG 용액을 서로 다른 시간 간격 동안 LC 마이크로액적과 상호 작용하도록 하고 LC 마이크로액적 내의 5CB 분자의 배향 상태를 5.0 분 간격으로 측정하였다.
실시예 2
25ng/mL농도의 IgG의 1.0 ㎖ 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 3
10ng/mL농도의 IgG의 1.0 ㎖ 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 4
슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-고정된 LC 마이크로액적을 상온에서 50ng/mL 농도의 IgG의 1.0 ㎖ FBS 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 5
슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-고정된 LC 마이크로액적을 상온에서 25ng/mL 농도의 IgG의 1.0 ㎖ FBS 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 6
슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-고정된 LC 마이크로액적을 상온에서 10ng/mL 농도의 IgG의 1.0 ㎖ FBS 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 7
슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-LC 마이크로액적을 상온에서 50ng/mL농도의 IgG의 1.0 ㎖ 10% 혈장 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 8
슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-LC 마이크로액적을 상온에서 25ng/mL농도의 IgG의 1.0 ㎖ 10% 혈장 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실시예 6
슬라이드 커버 글라스에 고정화된 AIgG-LC 마이크로액적을 상온에서 10ng/mL농도의 IgG의 1.0 ㎖ 10% 혈장 용액을 이용하여 IgG를 검출한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
비교예 1
LC 마이크로액적을 슬라이드 커버 글라스에 고정하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
비교예 2
LC 마이크로액적에 AIgG를 고정하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
실험예 1
상기 실시예 1 ~ 9 및 비교예 1 ~ 2를 통해 제조된 LC 마이크로액적을 이용하여 IgG를 검출하고, 편광 이미지를 관측하였다. 편광 이미지를 통해 액정의 배향변화를 관찰하여 하기 표 1에 나타내었다.
실험예 2
상기 실시예 1 ~ 9 및 비교예 1 ~ 2를 통해 제조된 LC 마이크로액적의 용액상에서의 이동속도를 관측하여 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112017011655886-pat00003
상기 표 1을 통해서 알 수 있듯이, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 LC 마이크로액적은 PBS 용액의 경우뿐 만 아니라, FBS 용액의 경우에도 항원의 농도가 50ng/ml의 경우에는 검출시간이 90분 이상이면 항원을 100% 검출할 수 있다. FBS 용액의 경우에는 60분의 검출시간에 69%라는 높은 비율로 항원을 검출할 수 있다. 뿐만 아니라, 10% 혈장용액에서도 FBS 용액과 유사하게 높은 비율로 항원을 검출할 수 있다. 실시예 7을 통해 알 수 있듯이, 항원의 농도가 50ng/ml의 경우에는 검출시간이 60분 이상이면 절반 이상의 항원을 검출할 수 있고, 90분 이상의 검출시간 동안에는 100%의 항원을 검출할 수 있어 검출 효율이 현저히 우수함을 확인할 수 있다.
특히 PBS 용액의 경우에는 30분이라는 현저히 짧은 검출 시간으로 100%의 항원을 검출할 수 있어 검출 효과가 현저히 뛰어남을 알 수 있다. 이와 같이 검출 시간이 짧아진 것은 FBS용액에서는 혈청단백질이 존재하여 항원이 항체를 찾아가는 것을 방해하기 때문에 60분의 검출시간이 필요한 반면 PBS에서는 항원이 항체를 찾아가는데 방해요인이 되는 단백질이 없어 짧은 시간에 항원-항체 반응이 일어났기 때문이다.
또한, 실시예 2 및 실시예 4를 통해서 50ng/ml의 절반인 25ng/ml의 항원 농도 조건 하에서도 90분이라는 현저히 짧은 검출 시간만으로 50% 이상의 항원을 검출할 수 있음을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명은 LC 마이크로액적을 유리기판에 고정함으로써 액적의 안정성을 확보할 수 있었고, 검출 한계 농도를 현저히 낮출 수 있음과 동시에 짧은 검출 시간만으로 검출할 수 있어 현저히 우수한 검출 효율을 발현할 수 있다.

Claims (14)

  1. -NH2기를 포함하는 링커에 의해 유리기판에 고정된 항원 검출용 LC 마이크로액적(liquid crystal microdroplets)을 포함하는 항원 검출용 바이오센서에 있어서,
    상기 LC 마이크로액적은 액정(liquid crystals); 소수성 부분 및 친수성 부분을 가지는 블록 공중합체; 및 계면활성제; 를 포함하고, 상기 유리기판에 1200 ~ 2000개/cm2의 면적비율로 고정되어 있으며,
    상기 LC 마이크로액적은 계면활성제에 의해 형성된 마이셀(micelle) 구조로서,
    상기 액정은 마이셀(micelle) 구조의 내부에 존재하고,
    상기 블록 공중합체의 소수성 부분은 마이셀(micelle) 구조의 내부에서 액정과 결합하고 있고, 친수성 부분은 마이셀(micelle) 구조의 외부에서 각각 링커의 -NH2기 및 -NH2기를 포함하는 항체의 -NH2기와 결합하고 있으며,
    상기 항체는 에소티오시아네이트계 화합물을 형광화합물로서 포함하고,
    상기 바이오센서는 PBS 용액 중 15 ~ 50 ng/ml 의 항원 농도에서 5~ 45분 동안 40 ~ 100%의 항원을 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 항원 검출용 바이오 센서.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'헥실바이페닐 또는 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 검출용 바이오 센서.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 상기 블록공중합체와의 화학결합을 통해 유리기판 상에 LC 마이크로액적(liquid crystal microdroplets)을 고정하며,
    상기 링커가 유리 기판 상에 고정되는 경우 기판 표면과의 접촉각(contact angle)이 70 ~ 95°인 것을 특징으로 하는 항원 검출용 바이오 센서.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 링커는 하기 화학식 1의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 검출용 바이오 센서.
    [화학식 1]
    Figure 112018097253908-pat00004

    -상기 식에서
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1 ~ C20의 알킬기이며,
    R3는 카르복실기, 에스터기, 무수물, 아실클로라이드기, 클로로실란기 또는 알콕시실란기 중 어느 하나이고,
    m은 정수이고, 0 ≤ m ≤ 20 이다.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 화학결합은 탈수축합반응에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 항원 검출용 바이오 센서.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 항원과 비결합시에는 상기 액정이 방사형 배열(radial configuration)을 가지며, 상기 항체가 항원과 결합 시에는 상기 액정이 양극성 배열(bipolar configuration)을 갖는 것을 특징으로 하는 항원 검출용 바이오 센서.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항, 제3항, 제6항, 제7항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 항원 검출용 바이오 센서를 이용하여 항원을 센싱하는 방법.
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