KR101593313B1 - Kb 암세포 센싱용 lc 마이크로액적 발광체, 이를 이용하여 kb 암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 LC 마이크로액적 발광체에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로 설명하면, LC 마이크로액적 발광체의 특정 리간드와 이의 수용체를 갖는 암세포와의 결합(또는 접촉)에 의해 LC 마이크로액적 발광체 내 액정 배열 변화 및/또는 발광 변화를 확인함으로써, 암세포를 센싱할 수 있는 발명에 관한 것이다.

Description

KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체, 이를 이용하여 KB 암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서{Liquid crystal microdroplets photoluminescence for sensing of KB cancer cell, Sensing method of KB cancer cell using that and Biosensor using that}
본 발명은 특정 화합물을 리간드로 도입한 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체, 이를 이용하여 암세포를 센싱하는 방법 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.
액정 마이크로액적 또는 액정 마이크로캡슐(Liquid crystal microdroplets or microcapsules)의 배열 행태는 화학적 또는 생물학적 시약의 계면에서의 상호작용으로 인해서 상당한 관심을 끌어왔으며, 특정 종 또는 자극에 대한 액정 마이크로액적 내 액정의 배열 변화는 편광판을 이용하여 용이하게 검출할 수 있다.
액정 물질의 계면에서의 상호작용은 항체, 박테리아 및 바이러스와 결합하도록 특화되어 제조되는 연구가 최근에 진행되어 왔는데, 이러한 액정 물질의 화합물 및 생물분자와의 계면 상호작용은 수소결합, 전하-전하(charge-charge) 및 리간드-수용체 상호작용을 통해 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 상호작용은 액정 분자의 표면 자유 에너지에 영향을 주고 액정 분자의 배열 변화를 자극에 의한 것이다.
또한, 다양한 종류의 계면 상호작용을 센싱하는 것과 관련하여 폴리머가 분산된 액정 시스템에 대한 연구가 많이 이루어졌으나, 액정 마이크로액적 또는 액정 마이크로캡슐은 액정 마이크로 액적의 표면에서 생물분자와의 상호작용을 검출하기 위한 크기 및 표면에너지를 조절하는 액정 시스템을 설계하는데 더욱 유용하다.
이와 관련된 선행특허로서, 산화환원 가능한 관능성(functional) 화합물-도핑된(doped) 액정(liquid crystal)을 이용하여, 검출대상 미생물의 효소 또는 대사산물(metabolite)에 의해 화학적 변형을 통해, 상기 관능성 화합물의 화학적 변형에 의해 상기 액정은 방향성(orientation)이 변화에 따른 광학적 외관(optical appearance)을 통해 미생물을 센싱하는 액정-기반 바이오센서 등이 있다.
PCR, 면역조직화학(immunohistochemistry), 세포계수(flow cytometry)와 같은 종래의 연구들은 다양한 암세포의 검출에 민감하고 정확하다고 알려져 있으나, 시간이 많이 소요되고 비용이 많이 든다는 단점이 있다. 최근 양자점 검출법이 그 생체적합성 및 전기화학적 방법에서의 리간드 수용체 상호작용을 증폭시키는 능력으로 인하여 KB 암세포 등과 같은 종양세포의 면역측정 및 바이오센싱에 사용되고 있는데, 이러한 전기 화학적 방법은 2×103 cells/mL 의 낮은 검출 한계를 갖고 있으며, 액정 마이크로액적을 이용하여 암세포를 광학적으로 센싱하는 방법에 대해서는 거의 전무한 실정이며, 현재, 초기 단계에서의 암세포 검출은 용이하지 않고, 많은 암들이 인체의 중요 부위에 전이된 후에 비로소 진단, 검출되는 경우가 대다수인 실정인 바, 암세포를 표지 없이 효과적으로 검출 및 평가할 수 있는 시스템 개발이 시급한 실정이다.
1. 대한민국 공개특허 2013-0126322호(공개일 2013. 11. 20)
1. Size dependent ordering of liquid crystals observed in polymeric capsules with micrometer and smaller diameters. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 1652-1655.(Gupta, J.K.; Sivakumar, S.; Caruso, F.; and Abbott, N.L.) 2. Design of biomolecular interfaces using liquid crystal containing oligomeric ethylene glycol. Adv. Funt. Mater. 2008, 18, 2928-2938.( Hartono, D.; Bi, X,; Yang, K.L,;Yang, L.)
본 발명은 암세포의 수용체와 결합할 수 있는 리간드로서, 엽산을 도입한 발명으로서, 상기 블록 공중합체에 엽산을 고정시키고, 블록 공중합체의 측쇄에 FITC(Fluorescein isothiocyanate) 등과 같은 형광 화합물을 측쇄기로 도입하여, 액정 배열의 변화에 따른 발광 유무를 확인함으로써, 암세포의 존부, 나아가 특정 암세포를 효과적으로 센싱(seinsing)할 수 있는 발명에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 암세포 센싱할 수 있는 마이크로액적 발광체, 이를 이용한 암세포 센싱 방법 및 이를 이용한 바이오 센서를 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체에 관한 것으로서, 액정(liquid crystals); 엽산(folic acid) 리간드가 고정된 블록 공중합체; 및 계면활성제;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체에 있어서, 상기 블록 공중합체는 측쇄기로서, 이소시아네이트계 화합물을 형광화합물로서 포함할 수 있으며, 상기 이소시아네이트계 화합물은 FITC(Fluorescein isothiocyanate)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체발광체의 마이크로액적은 계면활성제에 의해 형성된 마이셀(micelle) 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체에 있어서, 상기 액정은 마이크로액적 내부에 존재하며, 상기 블록 공중합체의 일부는 마이크로액적 내부에 존재하고, 상기 엽산 리간드는 마이크로액적 외부에 도출되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명에 있어서, 상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'-헥실바이페닐 및 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명에 있어서, 상기 블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한, 상기 블록 공중합체는 중량평균분자량 6,500 ~ 12,000인 것을 특징으로 할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112014066538311-pat00001
상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 독립적인 것으로서, C1 ~ C5의 알킬렌이며, a + b + c는 15 ~ 25를 만족하는 유리수이고, d는 60 ~ 70을 만족하는 유리수이다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체는 엽산 리간드가 암세포의 수용체와 비접촉시에는 상기 액정이 방사형 배열(radial conformation)을 갖으며, 상기 엽산 리간드가 암세포의 수용체와 접촉시에는 상기 액정이 양극형 배열(bipolar conformation)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체는 상기 액정을 1×10-2 M ~ 5×10-2M로 포함하며, 상기 블록 공중합체를 1.5×10-2 M ~ 2×10-1 M로 포함하며, 상기 소듐 도데실 설페이트를 0.5 mM ~ 30 mM로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체에 있어서, 마이크로액적은 평균직경 5㎛ ~ 40㎛인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 상피암세포를 센싱할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 암세포 센싱용 바이오센서에 관한 것으로서, 앞서 설명한 다양한 형태의 상기 LC 마이크로액적 발광체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포 센싱용 바이오센서는 상기 LC 마이크로액적 발광체가 35℃ 미만의 온도를 유지하는 조건 하에서 암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 앞서 설명한 다양한 형태의 상기 LC 마이크로액적 발광체를 이용하여 암세포를 센싱하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포를 센싱하는 방법은 편광을 이용하여 LC 마이크로액적 발광체의 발광 여부를 확인하여 암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포를 센싱하는 방법은 35℃ 미만의 온도 하에서, 상기 LC 마이크로액적 발광체와 암세포를 접촉시켜서 LC 마이크로액적의 발광을 통해 암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포를 센싱하는 방법은 pH 7.0 ~ 7.6 하에서, 상기 마이크로액적 발광체와 암세포를 접촉시켜서 마이크로액적의 발광을 통해 암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 암세포를 센싱하는 방법에 있어서, 상기 센싱은 체외(in vitro)에서 암세포를 센싱하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체는 암세포에 대한 선택도 및 민감성이 높을 뿐만 아니라, 그 제조가 용이하고, 생체 외부(in vito)에서 암세포에 대한 센싱을 편광현미경 등을 통해 쉽게 센싱이 가능하다.
도 1은 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체 형태에 대한 개략도 및 KB 암세포와의 접촉 여부에 의해 액정의 배열 변화를 나타낸 모식도이다.
도 2는 공중합체(a), 엽산(b) 및 엽산이 도입된 공중합체(c)의 자외선 흡수스펙트럼을 나타낸 모식도이다.
도 3은 형광프로브(FITC)를 도입한 공중합체를 이용하여 제조한 마이크로액적의 형광현미경 사진을 나타낸 모식도이다.
도 4는 실험예 2에서 실시한 LC 마이크로액적 발광체의 백광 및 편광 현미경 측정 이미지이다.
도 5a ~ 도 5c는 실험예 3에서 실시한 KB 암세포, 섬유아세포, 조혈세포 각각과의 상호작용에 의한 LC 마이크로액적 발광체와의 상호작용에 의한 LC 마이크로액적 발광체 내 액정의 배열 변화를 측정한 백광 및 편광 현미경 이미지이다.
도 6 및 도 7은 실험예 4에서 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체의 선택도 및 민감도를 측정한 백광 및 편광 현미경 이미지이다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명을 한다.
지질, 단백질 및 핵산을 검출하기 위한 5CB 액정 기반의 시스템에 대해서는 이미 공개된 바 있으나, 암세포 특히, KB 암세포를 검출하기 위하여 사용되는 소듐 도데실 설페이트 등과 같은 계면활성제의 존재 하에서의 엽산 결합 블록 공중합체를 이용한 5CB 액정 마이크로액적 또는 마이크로액적 현탁액에 대해서는 알려진 바가 없었다. 이에 본 발명자들은 공지된 액정 마이크로캡슐을 이용한 검출 시스템에 대한 연구들을 생물학적 시스템 내에서 정상 세포의 존재 하에 암세포를 선택적으로 검출하기 위한 LC 마이크로액적을 아래와 같이 개발하였다.
도 1의 모식도로 나타낸 바와 같이, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체는 소듐 도데실 설페이트(이하, SDS로 정의함) 등과 같은 계면활성제에 의해, 즉, O/W 에멀젼 시스템(Oil in water emulsion system)에 의해 마이셀(micelle) 구조가 형성되어 액적 형태를 갖게 되며, 상기 마이크로액적의 내부에는 액정을 포함하게 되고, 블록 공중합체의 비친수성 부위는 마이크로액적의 내부에 존재하게 되며, 블록 공중합체의 친수성 부위는 마이크로액적의 외부에 도출된 형태가 된다. 그리고, 상기 친수성 부위는 리간드를 포함하며, 본 발명은 상기 리간드로서 엽산을 도입하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 엽산 리간드가 암세포(바람직하게는 KB 암세포)의 리간드 수용체와 결합하기 전에는 액적 내의 액정(예를 들면, 5CB)이 방사형(radial conformation)으로 배열되어 있다가, 엽산 리간드와 암세포의 리간드 수용체가 결합을 하면, 액적 내의 액정이 양극형(bipolar conformation)으로 배열 변화가 일어나게 되며, 마이크로액적은 발광을 하게 되는 것이다.
이러한, 본 발명의 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체는 액정(liquid crystals); 엽산(folic acid) 리간드가 고정된 블록 공중합체; 및 계면활성제;를 포함할 수 있는데, 상기 블록 공중합체는 앞서 설명한 바와 같이 엽산이 고정되어 있으며, 블록 공중합체는 측쇄기로서, 이소시아네이트계 화합물을 형광화합물로서 포함할 수 있으며, 상기 이소시아네이트계 화합물은 FITC(Fluorescein isothiocyanate) 등을 포함할 수 있다. 그리고, 바람직하게는 상기 블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112014066538311-pat00002
상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 독립적인 것으로서, C1 ~ C5의 알킬렌, 바람직하게는 C2 ~ C3의 알킬렌이며, a + b + c는 15 ~ 25를 만족하는 유리수이고, d는 60 ~ 70을 만족하는 유리수이며, 바람직하게는 a + b + c는 18 ~ 23를, 그리고, d는 63 ~ 66을 만족하는 유리수이다. 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 중량평균분자량 6,500 ~ 12,000을, 바람직하게는 6,500 ~ 10,000을 갖을 수 있다. 이때, 중량평균분자량이 6,500 미만이면 마이크로액적 발광체의 발광 효율이 떨어지는 문제가 있을 수 있고, 중량평균분자량이 너무 크면 마이크로액적 발광체 내 함유량이 적게 되어 암세포에 대한 선택도 및/또는 민감도가 떨어지는 문제가 있을 수 있다.
그리고, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 상기 블록 공중합체를 1.5×10-2 M ~ 2×10-1 M로, 바람직하게는 2.0×10-2 M ~ 5×10-2 M로, 더욱 바람직하게는 2.0×10-2 M ~ 3.0×10-2 M로 포함할 수 있다.
본 발명의 LC 마이크로액적 발광체 내부에 존재하는 상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'-헥실바이페닐 및 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 4-시아노-4'-펜틸바이페닐을 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 상기 액정을 1×10-2 M ~ 5×10-2M로, 바람직하게는 1×10-2 M ~ 3×10-2로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1×10-2 M ~ 2.5×10-2 M로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 상기 소듐 도데실 설페이트를 0.5 mM ~ 30 mM로, 바람직하게는 2 mM ~ 25 mM로, 더욱 바람직하게는 8 mM ~ 20mM로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
발명의 이해를 돕기 위해서, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체를 제조하는 방법에 대한 일례로서 설명을 하며, 이에 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
LC 마이크로액적 발광체 제조에 사용되는 블록 공중합체는 하기 반응식 1의 반응을 통해서, 엽산이 고정된(또는 도입한) 블록 공중합체를 제조한 후, 반응식 2와 같은 반응을 통해서 형광물질 중 하나인 FITC를 블록 공중합체의 측쇄기로서 도입할 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112014066538311-pat00003
[반응식 2]
Figure 112014066538311-pat00004

그리고, 반응식 1 및 반응식 2를 통해서 제조한 블록 공중합체(PS-b-PAA-FA-FITC) 1.5×10-2 M ~ 2×10-1 M를 PBS(Phosphate buffer saline) 용액에 분산시킨 다음, 여기에 SDS(sodium dodecyl sulfate) 0.5 mM ~ 30 mM를 첨가한 후, 20 ~ 30시간 정도 충분히 교반시켜서 상기 블록 공중합체와 SDS를 균질하게 혼합시킨다. 다음으로 여기에 5CB(4-시아노-4'-펜틸바이페닐) 등과 같은 액정 물질을 1×10-2 M ~ 5×10-2 M, 바람직하게는 1×10-2 M ~ 3×10-2 M로 적가하여 에멀젼 형태의 혼합액을 제조한 다음, 균질화 및 액적의 입자 크기 조절을 위해 20 ~ 30시간 정도 충분히 교반을 시키면 이들 조성물 간의 반응에 의해 SDS가 마이셀 구조를 형성하고, 도 1에 나타낸 것과 같은 형태의 LC 마이크로액적 발광체를 얻을 수 있다. 다음으로, 에멀젼 상태의 혼합액을 원심분리를 수행하여 LC 마이크로액적 발광체를 분리하여 얻을 수 있다.
도 3에 공초점 레이져 주시 현미경(confocal laser scanning microscope) 이미지로 나타낸 바와 같이, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 평균직경 5㎛ ~ 40㎛을, 5㎛ ~ 35㎛를, 더욱 바람직하게는 10㎛ ~ 30㎛를 갖을 수 있다.
에멀젼 상태 하의 LC 마이크로액적은 계면이 넓으면 엽산-암세포의 수용체 결합 가능성이 높아지고 LC 마이크로액적의 암세포에 대한 배열 변이 선택도가 높아질 수 있다. 엽산과 결합한 블록 공중합체가 도입되어 형성된 나노구조의 유동성 계면으로 인하여 LC 액적이 암세포의 엽산 수용체와 상호작용할 때에 나타나는 배열 변화에 충분한 계면 상호작용 에너지를 공급할 수 있게 된다. 또한, LC 마이크로액적은 KB 암세포와 상호작용하여 방사형에서 양극형으로 배열 변화를 갖게 되는데, 본 발명은 PBS 용액 하에서, LC 마이크로액적의 밀도가 2×106 microdroplets/mL로 낮은데, 이는 1×109 microdroplets/mL 로 높은 굽타(Gupta) 등의 연구와 비교해서 액정 액적의 밀도가 낮으며, 이러한 LC 마이크로액적 밀도의 차이는 굽타 등의 연구에서의 액정 액적의 크기(0 ~ 10㎛) 보다 큰 액적의 크기(0.5㎛ ~ 40㎛, 바람직하게는 5㎛ ~ 35㎛, 더욱 바람직하게는 10㎛ ~ 30㎛)의 차이에 기인하는 것이다.
그리고, 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 LC 마이크로 액적 제조시, 액정물질(5CB 등)을 엽산과 결합한 블록 공중합체 및 소듐 도데실 설페이트 용액에 첨가되며, 상기 액정 물질이 첨가되어 소듐 도데실 설페이트의 미셀라 나노구조가 변하고, LC 마이크로액적이 방사형으로 생성된다. 이와 관련하여, 이전 연구에 따르면, SDS가 1.0 mM인 경우 액적의 입자 크기가 10 ㎛ 일 때 까지만, 액적이 방사형 배열을 나타낸다고 하였으나, 본 발명은 LC 마이크로액적 제조시 SDS가 1 mM를 초과한 농도인 0.5 mM ~ 30 mM, 바람직하게는 2 mM ~ 25 mM에서도 방사형 배열을 갖는 LC 마이크로액적을 제조할 수 있고, 이는 1.0 mM 농도의 SDS에서 제조된 기존 액정 액적(최대 10 ㎛) 보다 휠씬 큰 LC 마이크로액적의 크기 때문이며, 액정물질, 블록 공중합체 및 SDS의 강하고 적절한 상호작용 때문인 것이다.
이를 도 1의 통해 구체적으로 설명하면, 블록 공중합체의 스티렌 벤젠(반응식 1 및 반응식 2 참조), SDS의 알킬 체인 및 액정물질(5CB)의 메소겐(mesogen)이 서로 상호작용함으로써, 액정물질의 방사성 배열이 안정화된 LC 마이크로 액적 형광체를 제공할 수 있는 것이다.
그리고, 계면활성제(surfactants) 존재 하에서, 이와 같은 액정물질의 메소겐과의 π-π* 및 소수성-소수성 상호작용은 양극형(bipolar conformation) 배열 보다는 방사형(radial conformation)으로 액정물질이 배열된 LC 마이크로액적을 안정화시킬 수 있다.
앞서 설명한 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체를 이용하여 암세포를 센싱할 수 있으며, 바람직하게는 상피암세포, 간암세포, 유방암세포 등을, 더욱 바람직하게는 상피암세포를 센싱할 수 있다. 그리고, 암세포의 수용체와 LC 마이크로액적 발광체의 리간드와 결합(또는 접촉)에 의해 마이크로액적 내 액정의 배열변화가 발광을 하게 되면, 육안, 편광 등을 이용하여 마이크로액적 발광체의 발광 여부를 확인할 수 있는 것이다. 그리고, 암세포를 효과적으로 센싱하기 위해서는 35℃ 미만의 온도 하에서, 상기 마이크로액적 발광체와 암세포를 접촉시켜서 센싱을 하는 것이 좋은데, 35℃ 이상에서는 비등방성 네마틱 상태인 액정물질이 등방성 상태로 변화기 때문이다. 그리고, pH가 7.0 ~ 7.6 하에서, 바람직하게는 pH 7.2 ~ 7.5 하에서, 더욱 바람직하게는 7.35 ~ 7.45 하에서 상기 마이크로액적 발광체와 암세포를 접촉시켜서 센싱을 하는 것이 좋은데, pH가 블록 공중합체에 고정되어 있는 엽산의 분해되거나, 액정의 배열에 영향을 줄 수 있으므로, 상기 pH범위 내에서 센싱을 하는 것이 좋다.
그리고, 상기 이러한 암세포 센싱은 체외(in vitro)에서 수행할 수 있으며, LC 마이크로액적 발광체를 이용하여 바이오 센서(및/또는) 광학센서를 제조할 수도 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
[ 실시예 ]
준비예 1 : 엽산이 고정된 폴리(스티렌-b-아크릴산)블록 공중합체( PS -b- PAA - FA )의 제조
5.80×10-4M의 폴리(스티렌-b-아크릴산)(이하, PS-b-PAA로 정의함, 시그마 알드리치사 제품, USA) 및 6.4×10-2 M의 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드(시그마 알드리치사 제품, USA)를 10 mL DMF가 들어 있는 둥근 바닥 플라스크에 용해하여 상기 PS-b-PAA의 카복실산기를 활성화시켰다. 다음으로, 여기에 엽산 에틸렌디아민(2.27×10-3 M)을 넣어 25℃에서 24 시간 동안 지속적으로 교반 및 반응시켰다. 이후, 회전식 진공 증발기를 이용하여 DMF를 제거하였다.
블록 공중합체에 엽산을 넣는 비율을 최대화시키기 위해, 엽산이 과량으로 도입되었는 바, 회전식 진공 증발 후에 얻은 샘플을 투석하여 엽산이 고정된 블록 공중합체(이하, PS-b-PAA-FA로 칭함)를 정제하였다. 이때, 투석에 사용한 분리막은 MWCO(molecular weight cut off)이 2,000인 셀룰로즈 막이다. 그리고, 상기 PS-b-PAA-FA를 옅은 황색을 띠는 진공 데시케이터(vacuum desiccator)에 저장하였다.
그리고, 상기 PS-b-PAA, 엽산 및 PS-b-PAA-FA 각각을 pH 7.4로 조절된 PBS(Phosphate buffer saline)에 투입한 후, 이를 UV 스펙트럼(UV-VIS, Hitachi U-3000, Japan)을 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 살펴보면, 순수한 블록 공중합체인 PS-b-PAA (도 2의 (a))의 UV 스펙트럼에는 어떠한 흡수 밴드도 발견할 수 없으나, 엽산은 전이에 의하여 290 nm에서 흡수 밴드(도 2의 (b))를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
그리고, 엽산-블록 공중합체의 UV 스펙트럼(도 2의 (c))에 있어서 290 nm에서의 흡수 밴드의 존재를 확인할 수 있으며, 이를 통해 블록 공중합체에 엽산이 존재함을 확인할 수 있었다.
준비예 2 : 엽산 및 FITC 가 고정된 폴리(스티렌-b-아크릴산)블록 공중합체( PS -b-PAA-FA-FITC)의 제조
상기 준비예 1에서 제조한 PS-b-PAA-FA 및 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드(2.6×10-1M)를 10 mL DMF가 들어 있는 둥근 바닥 플라스크에 용해하여 상기 PS-b-PAA-FA의 카복실산기를 활성화시켰다.
다음으로, 여기에 pH 7.4에서 PBS 용액에 녹인 FITC 염료(2.5×10-3 M)의 DMSO용액을 투입한 후, 25℃에서 24시간 동안 지속적으로 교반 및 반응시켰다. 이후, 회전식 진공 증발기를 이용하여 DMF 및 DMSO 등을 제거하였다.
다음으로 회전식 진공 증발 후에 얻은 샘플을 투석하여 정제된 하기 화학식 1-1과 같은 엽산 및 FITC가 고정된 블록 공중합체(이하, PS-b-PAA-FA-FITC로 칭함)를 제조하였다.
[화학식 1-1]
Figure 112014066538311-pat00005
상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 C2의 알킬렌이며, a + b + c는 18 ~ 23를 만족하는 유리수이고, d는 63 ~ 66을 만족하는 유리수이며, 상기 블록 공중합체는 중량평균분자량 6,500 ~ 10,000이다.
실시예
20 mL PBS용액이 담긴 둥근 바닥 플라스크(100 ml용량)에 앞서 제조한 준비예 2의 상기 블록 공중합체(2.27×10-2 M)를 분산시키고, 소듐 도데실 설페이트(SDS) 17.3 mM를 첨가한 다음, 24시간 동안 지속적으로 교반시켜서 혼합액을 제조하였다. 이때, 혼합액은 옅은 불투명한 황색이었다.
다음으로 교반이 완료된 후에 상기 혼합액에 액정물질인 5CB(2.0×10-2 M)를 한방울씩 첨가하였으며, 24 시간 동안 교반을 LC 마이크로액적을 함유한 에멀젼을 제조하였다.
다음으로 교반이 완료된 후에 상기 에멀젼으로부터 LC 마이크로액적을 분리하기 위하여, PBS(Phosphate buffer saline) 용액 하에서 800 rpm으로 원심분리를 수행하였다. 다음으로, 상층액을 제거하여 LC 마이크로액적 발광체를 제조하였다.
실험예 1 : LC 마이크로액적 발광체의 입자 크기 분석 및 공초점 레이저 주시 현미경 측정
상기 실시예에서 제조한 LC 마이크로액적 발광체를 PBS에 다시 분산시킨 후, LC 마이크로액적 발광체의 크기 분포를 입자 크기 분석기(Beckman Coulter NS/LS-13320, USA)를 이용하여 측정하였다.
또한, 공초점 레이저 주사 현미경(Zeis LSM410, Zeiss, Oberkoshen Germany)를 이용하여 상기 실시예 1에서 제조한 LC 마이크로액적 발광체의 이미지를 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 통하여, 입경 크기 범위가 0.5㎛ ~ 40㎛로, 바람직하게는 전반적으로 5㎛ ~ 35㎛를 갖는 LC 마이크로액적이 잘 형성되어 있음을 확인할 수 있었다. 그리고, 이론적으로는 평균입경 30㎛를 갖는 LC 마이크로액적에는 5CB 분자를 3.4×1013까지 다량으로 축적할 수 있는 바, 실시예에서 제조한 LC 마이크로액적 발광체 내에 다량의 5CB 등과 같은 액정을 다량 포함할 수 있음을 추론할 수 있었다.
실험예 2 : LC 마이크로액적 발광체의 광학적 특성 실험
실시예에서 제조한 LC 마이크로액적 발광체의 광학적 특성을 확인하기 위하여, 형광 현미경(Olympus IX 71)을 이용하여, LC 마이크로액적 발광체의 백광(bright light) 및 편광(polarized light) 현미경 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 4의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
실험은 LC 마이크로액적 발광체를 PBS에 분산시킨 후, 이를 1.0 ml를 취한 다음, 2.0 ㎝ 직경의 광학적 셀에 넣은 후, 상기 현미경의 옵티컬 벤치에 놓은 다음 광학적 행태를 관찰하였다. 이때, pH에 따른 액적 상태 변화를 방지하기 위하여, pH 7.4에서 수행하였다. 그리고, LC 마이크로액적 발광체가 35℃ 이상에서는 비등방성 네마틱 상태인 액정물질이 등방성 상태로 변화기 때문에, 30℃에서 관찰을 수행하였다.
도 4의 (a)는 백광 현미경 이미지이고, 도 4의 (b)는 편광 현미경 이미지이며, 도 4의 (a) 및 (b)를 살펴보면, LC 마이크로액적 발광체 내부의 액정이 방사형 배열을 갖는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3 : LC 마이크로액적 발광체의 광학적 특성 실험 2
LC 마이크로액적 발광체의 암세포에 대한 선택도를 확인하기 위하여, KB 암세포, 섬유아세포(FB 세포) 및 조혈세포(OB 세포) 각각과 LC 마이크로액적 발광체와의 상호작용에 의한 LC 마이크로액적 발광체 내 액정의 배열 변화를 확인하는 실험을 수행하였다.
배양에 사용된 LC 마이크로액적 발광체는 PBS 용액(pH 7.4)에 1 mL의 LC 마이크로액적 발광체를 취한 후, 넣어서 LC 마이크로액적 발광체 에멀젼을 준비하였다.
그리고, KB 암세포, 섬유아세포 및 조혈세포는 세포은행으부터 구한 후, 이를 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
KB 암세포 및 섬유아세포 각각의 배양은 이를 37℃의 온도에서 10% FBS(Fetal Bovine Serum, GIBCO), 펜실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, 각각 50 lU/ml and 50 Mg/ml, GIBCO) 및 글루타민(glutamine, GIBCO)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle medium, GIBCO) 및 5% CO2(v/v) 하에서 조직 배양 접시에서 배양하였다.
그리고, 조혈세포는 MEM(minimum essential medium), 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% PGS를 포함하는 미디엄에서 배양하였다.
다음으로, 배양한 KB 암세포, 섬유아세포 및 조혈세포 각각을 5×10-2 cells/ml 취한 후, 이를 상기 LC 마이크로액적 발광체 에멀젼 10 mL와 함께 pH 7.4 및 30℃에서 3시간 동안 각각 배양하였으며, 미디엄(medium)의 mL 당 KB 세포(섬유아세포, 조혈세포)의 수는 사이토미터를 이용하여 측정하였고, 미디엄 (5×104 cells/mL)을 포함하는 세포의 측량된 부피는 PBS 용액(pH 7.4) 내의 LC 마이크로액적 발광체 에멀젼과 함께 세포 밀도 8000 cells/mL 를 유지하도록 하였다.
또한, 섬유아세포 및 조혈세포 각각을 메틸렌 블루(MB)로 염색시킨 후에 염색된 섬유아세포 및 조혈세포 각각을 5×10-2 cells/ml 취한 후, 이를 상기 LC 마이크로액적 발광체 에멀젼 10 mL와 함께 pH 7.4 및 30℃에서 3시간 동안 각각 배양하였으며, PBS 용액(pH 7.4) 내의 LC 마이크로액적 발광체 에멀젼과 함께 세포 밀도 8,000 cells/mL 를 유지하도록 하였다.
다음으로, 광학적 특성에 사용한 현미경은 상기 실험예 2에서 사용한 동일한 형광 현미경을 사용하였으며, 백광 및 편광 현미경 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 5a ~ 도 5c에 각각 나타내었다.
세포밀도 8,000 cells/mL의 KB 암세포는 3시간 동안 배양된 액정 미세방울 5% 용액 내에서 배열변화를 나타내었는데, 도 5a의 왼쪽 이미지의 하얀색 네모 표시 부분은 KB 암세포와 LC 마이크로액적 발광체와 결합된 것이다. 그리고, 도 5a의 오른쪽 이미지를 보면, 네모 표시 부분의 LC 마이크로액적 발광체의 액정 배열은 양극형(bipolar conformation)으로 변화하였으나, 네모 표시 부분 밖의 3개의 비접촉 LC 마이크로액적 발광체의 액정 배열은 방사형 배열(radial conformation)을 유지하는 것을 확인할 수 있다(도 4와 비교 참조). KB 암세포와 접촉한 후에 LC 마이크로액적 발광체에서의 액정 배열 변화를 통해서, KB 암세포와 액정물질의 상호작용이 액정물질의 계면 자유에너지를 충분히 변화시킨다는 것을 알 수 있다. 이때, 상기 계면 자유에너지는 액정 미세입자가 방사형에서 양극형 배열로 전이하는데 필요한 것이다.
그러나, 암세포가 아닌 정상세포(FB 세포 및 OB세포)로 실험을 수행한 이미지 사진인 도 5b 및 도 5c(하얀 네모 표시 부분)를 살펴보면, 정상세포들의 경우, LC 마이크로액적 발광체와 결합을 했음에도 불구하고, 3 시간 동안 액정 배열의 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 이는 FB 세포 및 OB 세포는 LC 마이크로액적 발광체의 리간드인 엽산을 수용할 수 있는 수용체가 없어서, LC 마이크로액적 발광체의 액정 배열 변화를 일으키지 못한 것으로 판단된다.
또한, 본 실험시, KB 세포(8,000 cells/mL)의 75%(6,000 cells/mL)는 LC 마이크로액적 발광체와 성공적으로 접촉하였고 모든 접촉 KB 세포는 액정 미세방울 현탁액에서 방사형에서 양극형으로 배열 변화가 있었다. 그러나, FB 세포는 LC 마이크로액적 발광체와 25%(2,000 cells/mL)만 접촉하였으며, OB 세포는 LC 마이크로액적 발광체와 75%(6,000 cells/mL)의 접촉이 있었다. 이러한, 접촉 차이는 이는 KB 암세포, 섬유아세포 및 조혈세포 사이의 세포크기 및 인테그린 등의 차이에 기인한 것을 판단된다.
상기 실험을 통하여, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체의 암세포에 대한 높음 반응성을 확인할 수 있었다.
실험예 4 : LC 마이크로액적 발광체의 선택도 및 민감도 측정 실험
(1) 정상세포 메틸렌 블루 염색 후 측정
정상세포의 존재 하에서 KB 암세포의 검출을 위한 LC마이크로액적 발광체의 선택도를 확인하기 위하여, LC 마이크로액적 발광체를 섬유아세포 및 조혈세포의 혼합물 및 KB 암세포와 함께 PBS 용액(pH 7.4) 에서 5% CO2 하에서 3시간 동안 30?의 온도로 배양하였다. 그리고, 동일한 세포 밀도를 유지하기 위하여 KB 암세포, 섬유아세포 및 조혈세포를 1:1:1의 비율로 넣어 최종 세포밀도가 8,000 cells /mL로 혼합하여 액정 미세방울 현탁액을 3시간 동안 배양하였다. 그리고, 이때, 상기 섬유아세포 및 조혈세포는 배양 전에 메틸렌 블루로 염색을 시켰으며, KB 암세포는 염색시키지 않았다.
다음으로, 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 형광 현미경을 사용하였으며, 백광 및 편광 현미경 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 (a) 백광 현미경 이미지를 살펴보면, 파란색으로 염색되어 있는 세포는 정상세포(FB 세포 및 OB 세포)이며, 염색되어 있지 않는 세포는 KB 암세포이다. 그리고, 도 6의 (a)의 왼쪽 상단 원 표시 부분은 LC 마이크로액적 발광체와 결합(또는 접촉)한 KB 암세포이고, 오른쪽 하단 원 표시 부분은 LC 마이크로액적 발광체와 결합(또는 접촉)한 정상세포이다.
그리고, 도 6의 (b)의 편광 현미경 이미지를 살펴보면, 왼쪽 상단 원 표시 부분의 LC 마이크로액적 발광체는 양극형으로 배열 변화가 일어난 것을 확인할 수 있으며, 오른쪽 하단 원 표시 부분의 LC 마이크로액적 발광체는 방사형 배열을 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, KB 암세포 및 정상세포와 함께 LC 마이크로액적 발광체를 배양한 경우, KB 암세포가 없을 시(실험예 3의 도 5b 및 도 5c)에 접촉한 것보다 5% 정도까지 LC 마이크로액적 발광체의 수가 감소하였다(134 cells/mL). KB 암세포의 존재 하에 정상세포의 접촉 밀도가 5%(134 cells/mL)까지 감소하는 것은 KB암세포가 존재하고 정상세포의 수가 적기 때문인 것으로 판단된다.
그리고, KB 암세포를 검출하는데 있어서 엽산과 결합한 LC 마이크로액적 발광체의 선택도 및 민감도는 다른 정상세포의 존재에 의해 영향받지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
(2) KB 암세포만 메틸렌 블루 염색 후 측정
상기 실험에서 KB 암세포와 결합한 LC 마이크로액적 발광체의 배열변화가 MB 염색에 의한 것일 수도 있는 바, 이를 확인하기 위하여, 아래와 같은 실험을 수행하였다.
정상세포의 존재 하에서 KB 암세포의 검출을 위한 LC 마이크로액적 발광체의 선택도를 확인하기 위하여, LC 마이크로액적 발광체를 섬유아세포 및 조혈세포의 혼합물 및 KB 암세포와 함께 PBS 용액(pH 7.4) 에서 5% CO2 하에서 3시간 동안 30?의 온도로 배양하였다. 그리고, 동일한 세포 밀도를 유지하기 위하여 KB 암세포, 섬유아세포 및 조혈세포를 1:1:1의 비율로 넣어 최종 세포밀도가 8000 cells /mL로 혼합하여 액정 미세방울 현탁액을 3시간 동안 배양하였다. 그리고, 이때, 상기 KB 암세포는 배양 전에 메틸렌 블루로 염색을 시켰으며, 섬유아세포 및 조혈세포는 염색시키지 않았다.
다음으로, 상기 실험예 4의 (1)과 동일한 방법으로 형광 현미경을 사용하여, 백광 및 편광 현미경 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다
도 6(왼쪽 이미지)과 달리 도 7의 왼쪽 이미지에서, 파란색으로 염색된 세포가 KB 암세포이고, 염색되어 있지 않은 세포가 정상세포이다. 그리고, 도 7의 (a)의 왼쪽 상단 원 표시 부분은 LC 마이크로액적 발광체와 결합(또는 접촉)한 정상세포이고, 오른쪽 하단 원 표시 부분은 LC 마이크로액적 발광체와 결합(또는 접촉)한 KB 암세포이다.
그리고, 도 7의 (b)의 편광 현미경 이미지를 살펴보면, 왼쪽 상단 원 표시 부분의 LC 마이크로액적 발광체는 방사형으로 배열을 갖는 것을 확인할 수 있으며, 오른쪽 하단 원 표시 부분의 LC 마이크로액적 발광체는 양극형 배열을 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해서, KB 암세포와 결합한 LC 마이크로액적 발광체의 액정 배열 변화가 메틸렌 블루 염색에 의해 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다.
그리고, 실험예 4-(1)의 MB 염색된 정상세포 및 실험예 4-(2)의 염색되지 않은 정상세포, 실험예 4-(1)의 염색되지 않은 KB 암세포 및 실험예 4-(2)의 MB 염색된 KB 암세포의 접촉밀도, 즉, MB 염색된 세포 및 염색되지 않은 세포와 LC 마이크로액적 발광체와의 접촉 밀도를 비교할 때, MB 염색된 세포의 접촉밀도가 미염색 세포 보다 접촉밀도가 감소하였는데, 이는 MB 염색에 의한 입체 장해(steric hindrances)에 의한 것으로 판단된다.
상기 실험예 4를 통하여, MB 염색이 LC 마이크로액적 발광체와 세포와의 결합(또는 접촉)에 부정적인 영향을 끼칠 수 있다는 점을 확인할 수 있었으며, 또한, KB 암세포와 결합(또는 접촉)한 LC 마이크로액적 발광체의 액정 배열이 MB 염색에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명의 LC 마이크로액적 발광체는 KB 암세포 등과 같은 암세포에 대한 상호작용이 매우 민감하고 선택적인 것을 확인할 수 있었으며, LC 마이크로액적 발광체의 액정 배열 변화를 통해, 용이하게 암세포를 센싱할 수 있는 고감도 바이오센서(및/또는 광학센서)를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.

Claims (15)

  1. 액정(liquid crystals);
    엽산(folic acid) 리간드가 고정된 블록 공중합체; 및
    계면활성제;를 포함하며,
    상기 블록 공중합체는 측쇄기로서, 이소시아네이트계 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적(Liquid crystal microdroplets) 발광체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발광체의 마이크로액적은 계면활성제에 의해 형성된 마이셀(micelle) 구조로서,
    상기 액정은 마이크로액적 내부에 존재하며,
    상기 블록 공중합체의 일부는 마이크로액적 내부에 존재하고, 상기 엽산 리간드는 마이크로액적 외부에 도출되어 있는 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 액정은 4-시아노-4'-펜틸바이페닐, 4-시아노-4'-헥실바이페닐 및 4-시아노-4'-(2-메틸부틸)바이페닐 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체;
    [화학식 1]
    Figure 112015082061063-pat00006

    상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 독립적인 것으로서, C1 ~ C5의 알킬렌이며, a + b + c는 15 ~ 25를 만족하는 유리수이고, d는 60 ~ 70을 만족하는 유리수이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 블록 공중합체는 중량평균분자량 6,500 ~ 12,000인 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 엽산 리간드가 암세포의 수용체와 비접촉시에는 상기 액정이 방사형 배열(radial conformation)을 갖으며, 상기 엽산 리간드가 암세포의 수용체와 접촉시에는 상기 액정이 양극형 배열(bipolar conformation)을 갖는 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암세포는 상피암세포인 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 액정을 1×10-2 M ~ 5×10-2M로 포함하며, 상기 블록 공중합체를 1.5×10-2 M ~ 2×10-1 M로 포함하는 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 마이크로액적은 평균직경 5㎛ ~ 40㎛인 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 LC 마이크로액적 발광체.
  10. 제1항 내지 제9항 중에서 선택된 어느 한 항의 마이크로액적 발광체를 포함하는 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 바이오센서.
  11. 제10항에 있어서, 상기 마이크로액적 발광체가 35℃ 미만의 온도를 유지하는 조건에서 암세포를 센싱하는 것을 특징으로 하는 KB 암세포 센싱용 바이오센서.
  12. 35℃ 미만의 온도 하에서, 제1항 내지 제9항 중에서 선택된 어느 한 항의 마이크로액적 발광체와 KB 암세포를 접촉시켜서 마이크로액적의 발광을 통해 KB 암세포를 센싱하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 편광을 이용하여 마이크로액적 발광체의 발광 여부를 확인하여 KB 암세포를 센싱하는 방법.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서, pH 7.0 ~ 7.6 하에서, 상기 마이크로액적 발광체와 암세포를 접촉시켜서 마이크로액적의 발광을 통해 KB 암세포를 센싱하는 방법.
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