CN108562737A - 用阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

用阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法 Download PDF

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常津
潘惠卓
王汉杰
谌红彬
王天歌
张超楠
王镐锋
郝亚锋
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Abstract

本发明涉及用阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法。将钙黄绿素负载到介孔二氧化硅中；制备粒径均一的阳离子脂质体将阳离子脂质体包裹到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒外。本发明制备的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒，制备出的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径在80～130纳米之间，加入细胞后细胞存活率为80％～90％，用倒置荧光显微镜观察活细胞标记的效率约占90％～95％，通过观察纳米颗粒内钙黄绿素的分布情况来判断活细胞的位置，可实现高效的活细胞标记。

Description

用阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒 的制备方法
技术领域
本发明涉及一种可标记及定位活细胞的纳米颗粒的制备方法，属生物技术和医药技术领域。特别涉及用阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法。
背景技术
钙黄绿素通常被用在络合指示剂荧光指示剂等领域，由于其本身具有亲水性，使其不容易穿透细胞膜，加入细胞后停留在细胞间隙，因此无法用于活细胞标记。目前用钙黄绿素标记活细胞的方法是在钙黄绿素表面加强疏水修饰形成活细胞染料Calcein(钙黄绿素)-AM，其在疏水作用穿透活细胞膜后，活细胞内的酯酶会将其水解，使钙黄绿素停留在细胞内，发出强绿色荧光，从而实现活细胞标记。但这种染料价格昂贵，用于细胞实验需较多剂量；合成方法较繁琐，不适用于实验室常规制备。因此，需要改造一种制备简单、价格低廉且工作效率高的钙黄绿素活细胞标记方法，用于更广泛的研究。纳米颗粒通常被用于负载染料、药物等各种小分子物质，其中作用最广泛的是介孔二氧化硅纳米颗粒。但由于二氧化硅其本身具有一定毒性，加入细胞后会对细胞造成一定损伤。细胞吸收二氧化硅纳米颗粒通常要经过胞饮过程，但这种方法耗时长、效率低，在这个过程中，被二氧化硅纳米颗粒负载的药物存在泄漏等损耗，具有潜在毒性的同时也降低了药物功效。因此，研制出一种将钙黄绿素负载至介孔二氧化硅纳米颗粒，同时用阳离子脂质体包封颗粒表面的方法，能够增加细胞对颗粒的内吞效率，减少二氧化硅颗粒对细胞的毒性，实现对活细胞的标记。
发明内容
根据现有技术的不足，我们提出了具有活细胞标记率高、细胞毒性小等优势的可标记活细胞的新型纳米颗粒的制备方法。
本发明的技术方案如下：
用阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法；包括如下步骤：
(1)将钙黄绿素负载到介孔二氧化硅中；
(2)制备粒径均一的阳离子脂质体；
(3)将阳离子脂质体包裹到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒外。
所述步骤(1)制备方法是：将钙黄绿素与介孔二氧化硅纳米颗粒溶液混合均匀，避光磁力搅拌6～12小时，离心收集，沉淀用双蒸水重悬，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
优选用去离子水将钙黄绿素配置成浓度250～300微摩尔的溶液，加入质量比1:10～5介孔二氧化硅纳米颗粒，混合均匀。
优选避光磁力搅拌速度是300～400转/分钟，10000～15000转/分钟离心10～15分钟，离心收集，沉淀用双蒸水重悬定量至1～5毫克每毫升，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
所述步骤(2)制备方法是：称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺并加入三氯甲烷溶解；去除溶剂后，向反应器中加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液，超声30～40分钟，得到云雾状白色液体，为悬浮在磷酸盐缓冲液中的粒径不等的阳离子脂质体；将以上溶液用孔径100纳米的滤膜过滤，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
优选称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺加入三氯甲烷配制成浓度为2～10毫克每毫升的溶液溶解；将旋转蒸发仪的水浴锅温度设置至36～42℃，打开真空泵抽真空30～40分钟后，在反应器形成一层乳白色覆盖物，再加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液体。
步骤(2)得到云雾状白色液体用孔径为孔径100纳米的滤膜在15000～20000转/分钟下离心20～40分钟，重复5～10次，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
所述步骤(3)制备方法是：将粒径均一的阳离子脂质体及负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒按照体积比1:2～4的比例混合，超声3～5分钟后，离心去上清，沉淀用等体积磷酸盐溶液重悬，得到阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的可对活细胞进行标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。
优选超声后15000～20000转/分钟离心5～10分钟去上清，重复1～2遍。
本发明制备的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒，粒径在80～130纳米。具有较高的活细胞标记效率；具有较低的细胞毒性。简单廉价地改造钙黄绿素，实现其对活细胞的标记。
制备的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒，粒径在80～130纳米。
本发明的方法制备的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒加入细胞后，细胞存活率为80％～90％。
本发明制备的纳米颗粒对活细胞标记的效率约占90％～95％。
本发明可通过观察纳米颗粒内钙黄绿素的分布情况来判断活细胞的位置。
评估本发明制备的纳米材料对活细胞标记能力实验技术如下：
(1)种植海拉细胞至96孔培养板，细胞密度8000个/孔，铺板24小时后，细胞达到70％-90％的汇合率时，将孔内的培养基吸出，更换为100微升DMEM培养基，对细胞进行饥饿处理6～8小时。
(2)将阳离子脂质体包裹的纳米颗粒用含血清的DMEM培养基稀释至0.00625～0.0125毫克每毫升，加入孔中以替代原不含血清培养基。
(3)在37℃，5％CO2培养箱环境下孵育4～6小时后，固定，并用DAPI染料将细胞核染色，在荧光倒置显微镜下(488纳米通道观察钙黄绿素标记的纳米颗粒，405纳米通道观察DAPI染料)观察制备的纳米颗粒的活细胞标记效率。
本发明的效果是：制备出的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径在80～130纳米之间，加入细胞后细胞存活率为80％～90％，用倒置荧光显微镜观察活细胞标记的效率约占90％～95％，通过观察纳米颗粒内钙黄绿素的分布情况来判断活细胞的位置，可实现高效的活细胞标记。
附图说明
图1：制备的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的扫描电子显微镜照片(形貌分析)。
图2：制备的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒粒径分布图片。
图3：不同浓度阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒对海拉细胞毒性的结果。
图4a：DAPI染料标记的细胞核。
图4b：488nm通道下钙黄绿素对细胞的标记。
图4c：纳米颗粒在海拉细胞中与细胞核的共定位情况。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明做进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1:
(1)负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：用去离子水将钙黄绿素配置成浓度250微摩尔的溶液，加入质量比1:5介孔二氧化硅纳米颗粒，混合均匀后，避光400转/分钟磁力搅拌12小时，15000转/分钟离心15分钟，小心弃上清，沉淀用双蒸水重悬定量至5毫克每毫升，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(2)粒径均一的阳离子脂质体的制备：称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺并加入三氯甲烷配制成浓度为2毫克每毫升的溶液。将旋转蒸发仪的水浴锅温度设置至36℃，打开真空泵抽真空30分钟后，在圆底烧瓶底部形成一层乳白色覆盖物，即为单层阳离子脂质体。向圆底烧瓶中加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液，超声40分钟，得到云雾状白色液体，为悬浮在磷酸盐缓冲液中的粒径不等的阳离子脂质体。将以上溶液用孔径为孔径100纳米的滤膜在20000转/分钟下离心20分钟，重复5次，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
(3)阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将上述粒径均一的阳离子脂质体及负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒按照体积比1:2的比例混合，超声3分钟后，15000转/分钟离心5分钟，去上清，重复1遍，沉淀用等体积磷酸盐溶液重悬，即得到阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的可对活细胞进行标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(4)种植海拉细胞8000个/孔至96孔培养板，24小时后，细胞达到70％-90％的汇合率时，将孔内的培养基更换为100微升DMEM培养基，对细胞进行饥饿处理6小时。将步骤(3)中制备的纳米颗粒用含血清的DMEM培养基稀释至0.0125毫克每毫升，加入孔中以替代原不含血清培养基。在37℃，5％CO2培养箱环境下孵育4小时后，固定并用DAPI染料将细胞核染色，在荧光倒置显微镜下(488纳米通道观察钙黄绿素标记的纳米颗粒，405纳米通道观察DAPI染料)观察制备的纳米颗粒的活细胞标记效率。
实施例2:
(1)负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：用去离子水将钙黄绿素配置成浓度260微摩尔的溶液，加入质量比1:8介孔二氧化硅纳米颗粒，混合均匀后，避光350转/分钟磁力搅拌10小时，12000转/分钟离心13分钟，小心弃上清，沉淀用双蒸水重悬定量至3毫克每毫升，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(2)粒径均一的阳离子脂质体的制备：称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺并加入三氯甲烷配制成浓度为8毫克每毫升的溶液。将旋转蒸发仪的水浴锅温度设置至40℃，打开真空泵抽真空35分钟后，在圆底烧瓶底部形成一层乳白色覆盖物，即为单层阳离子脂质体。向圆底烧瓶中加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液，超声35分钟，得到云雾状白色液体，为悬浮在磷酸盐缓冲液中的粒径不等的阳离子脂质体。将以上溶液用孔径为孔径100纳米的滤膜在17000转/分钟下离心30分钟，重复8次，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
(3)阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将上述粒径均一的阳离子脂质体及负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒按照体积比1:3的比例混合，超声4分钟后，17000转/分钟离心8分钟，去上清，重复2遍，沉淀用等体积磷酸盐溶液重悬，即得到阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的可对活细胞进行标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(4)种植海拉细胞8000个/孔至96孔培养板，24小时后，细胞达到70％-90％的汇合率时，将孔内的培养基更换为100微升DMEM培养基，对细胞进行饥饿处理4小时。将步骤(3)中制备的纳米颗粒用含血清的DMEM培养基稀释至0.00625毫克每毫升，加入孔中以替代原不含血清培养基。在37℃，5％CO2培养箱环境下孵育4小时后，固定并用DAPI染料将细胞核染色，在荧光倒置显微镜下(488纳米通道观察钙黄绿素标记的纳米颗粒，405纳米通道观察DAPI染料)观察制备的纳米颗粒的活细胞标记效率。
实施例3:
(1)负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：用去离子水将钙黄绿素配置成浓度300微摩尔的溶液，加入质量比1:10介孔二氧化硅纳米颗粒，混合均匀后，避光300转/分钟磁力搅拌6小时，10000转/分钟离心10分钟，小心弃上清，沉淀用双蒸水重悬定量至1毫克每毫升，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(2)粒径均一的阳离子脂质体的制备：称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺并加入三氯甲烷配制成浓度为10毫克每毫升的溶液。将旋转蒸发仪的水浴锅温度设置至42℃，打开真空泵抽真空40分钟后，在圆底烧瓶底部形成一层乳白色覆盖物，即为单层阳离子脂质体。向圆底烧瓶中加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液，超声30分钟，得到云雾状白色液体，为悬浮在磷酸盐缓冲液中的粒径不等的阳离子脂质体。将以上溶液用孔径为孔径100纳米的滤膜在15000转/分钟下离心40分钟，重复10次，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
(3)阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将上述粒径均一的阳离子脂质体及负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒按照体积比1:4的比例混合，超声5分钟后，20000转/分钟离心10分钟，去上清，重复2遍，沉淀用等体积磷酸盐溶液重悬，即得到阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的可对活细胞进行标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(4)种植海拉细胞8000个/孔至96孔培养板，24小时后，细胞达到70％-90％的汇合率时，将孔内的培养基更换为100微升DMEM培养基，对细胞进行饥饿处理6小时。将步骤(2)中制备的纳米颗粒用含血清的DMEM培养基稀释至0.025毫克每毫升，加入孔中以替代原不含血清培养基。在37℃，5％CO2培养箱环境下孵育4小时后，固定并用DAPI染料将细胞核染色，在荧光倒置显微镜下(488纳米通道观察钙黄绿素标记的纳米颗粒(如图4b)，405纳米通道观察DAPI染料(如图4a)，观察制备的纳米颗粒在海拉细胞中与细胞核共定位情况(如图4c所示)。
实施例4:
(1)负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：用去离子水将钙黄绿素配置成浓度300微摩尔的溶液，加入质量比1:9介孔二氧化硅纳米颗粒，混合均匀后，避光380转/分钟磁力搅拌6小时，10000转/分钟离心10分钟，小心弃上清，沉淀用双蒸水重悬定量至1毫克每毫升，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(2)粒径均一的阳离子脂质体的制备：称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺并加入三氯甲烷配制成浓度为10毫克每毫升的溶液。将旋转蒸发仪的水浴锅温度设置至42℃，打开真空泵抽真空40分钟后，在圆底烧瓶底部形成一层乳白色覆盖物，即为单层阳离子脂质体。向圆底烧瓶中加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液，超声30分钟，得到云雾状白色液体，为悬浮在磷酸盐缓冲液中的粒径不等的阳离子脂质体。将以上溶液用孔径为孔径100纳米的滤膜在15000转/分钟下离心40分钟，重复10次，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
(3)阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将上述粒径均一的阳离子脂质体及负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒按照体积比1:4的比例混合，超声5分钟后，20000转/分钟离心10分钟，去上清，重复2遍，沉淀用等体积磷酸盐溶液重悬，即得到阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的可对活细胞进行标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(4)种植人肾上皮细胞8000个/孔至96孔培养板，24小时后，细胞达到70％-90％的汇合率时，将孔内的培养基更换为100微升DMEM培养基，对细胞进行饥饿处理6小时。将步骤(2)中制备的纳米颗粒用含血清的DMEM培养基稀释至0.025毫克每毫升，加入孔中以替代原不含血清培养基。在37℃，5％CO2培养箱环境下孵育4小时后，固定并用DAPI染料将细胞核染色，在荧光倒置显微镜下(488纳米通道观察钙黄绿素标记的纳米颗粒，405纳米通道观察DAPI染料)观察制备的纳米颗粒的活细胞标记效率。
实施例5:
MTT法测试制备的不同浓度阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒对海拉细胞的毒性：
(1)种植海拉细胞8000个/孔至96孔培养板，24小时后，细胞达到70％-90％的汇合率时，将孔内的培养基更换为100微升DMEM培养基，对细胞进行饥饿处理6小时。
(2)将颗粒用含血清的DMEM培养基稀释至0.025毫克每毫升、0.0125毫克每毫升和0.00625毫克每毫升三个浓度，加入孔中以替代原不含血清培养基。在37℃，5％CO2培养箱环境下孵育24小时后，向每个孔中加入10微升MTT溶液，继续放回培养箱环境下继续孵育4小时后，吸取每孔培养基，向每孔内加入100微升DMSO，室温摇床震荡反应10分钟。使用酶联免疫检测仪在570纳米波长处检验每孔样品吸光值A，按下面公式计算细胞存活率，每组设8个平行，计算其平均值。
(3)细胞存活率(％)＝实验组细胞吸光值(A2)/空白组细胞吸光值(A1)*100％(如图3所示)。
实施例6:
形态观察、粒径及其分布测定：
(1)取纳米颗粒溶液经离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于玻璃片上制样，喷金后在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到介孔二氧化硅纳米基因载体呈不规则球形粒子，其直径在80～130纳米范围内可控。所制得的纳米粒子如图1所示。
(2)取阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒溶液经离心分离后，取出沉淀物，加磷酸盐缓冲盐2毫升使分散在塑料比色皿中，在粒度仪中测量颗粒大小与分布。结果表示其直径在80～130纳米范围内，所得的纳米颗粒粒径分布(如图2所示)。

Claims (10)

1.用阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法；其特征是包括如下步骤：
(1)将钙黄绿素负载到介孔二氧化硅纳米颗粒中；
(2)制备粒径均一的阳离子脂质体；
(3)将阳离子脂质体包裹到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒外。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)制备方法是：将钙黄绿素与介孔二氧化硅纳米颗粒溶液混合均匀，避光磁力搅拌6～12小时，离心收集，沉淀用双蒸水重悬，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是用去离子水将钙黄绿素配置成浓度250～300微摩尔的溶液，加入质量比1:10～5介孔二氧化硅纳米颗粒，混合均匀。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是避光磁力搅拌速度是300～400转/分钟磁力搅拌6～12小时，10000～15000转/分钟离心10～15分钟，离心收集，沉淀用双蒸水重悬定量至1～5毫克每毫升，得到负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(2)制备方法是：称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺并加入三氯甲烷溶解；去除溶剂后，向反应器中加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液，超声30～40分钟，得到云雾状白色液体，为悬浮在磷酸盐缓冲液中的粒径不等的阳离子脂质体；将以上溶液用孔径100纳米的滤膜过滤，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是称取(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺加入三氯甲烷配制成浓度为2～10毫克每毫升的溶液溶解；将旋转蒸发仪的水浴锅温度设置至36～42℃，打开真空泵抽真空30～40分钟后，在反应器形成一层乳白色覆盖物，再加入质量分数50％的磷酸盐缓冲液体。
7.如权利要求5所述的方法，其特征是得到云雾状白色液体用孔径为孔径100纳米的滤膜在15000～20000转/分钟下离心20～40分钟，重复5～10次，得到的澄清稳定液体即为粒径均一的阳离子脂质体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)制备方法是：将粒径均一的阳离子脂质体及负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒按照体积比1:2～4的比例混合，超声3～5分钟后，离心去上清，沉淀用等体积磷酸盐溶液重悬，得到阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的可对活细胞进行标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是超声后15000～20000转/分钟离心5～10分钟去上清，重复1～2遍，沉淀用等体积磷酸盐溶液重悬。
10.如权利要求1方法制备的阳离子脂质体包裹负载钙黄绿素的介孔二氧化硅纳米颗粒，粒径在80～130纳米。
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