CN111665361B - 一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法。本发明方法包括以下步骤：（1）将可溶性淀粉溶液加入Fe3+水溶液中，升温至80～90℃，分散均匀，得混合物溶液；搅拌条件下，将混合物溶液滴加至氨水溶液中，保持pH值为9～11，60℃下，搅拌反应，分离出固体，烘干，得磁性淀粉纳米颗粒；（2）将磁性纳米淀粉颗粒与赖氨酸静电结合，得到富含氨基的多聚氨酸淀粉纳米颗粒；（3）将多聚氨酸淀粉纳米颗粒与异硫氰酸荧光素混合，得到异硫氰酸荧光素标记的溶酶体磁性荧光淀粉纳米颗粒。本发明制备方法制备过程中易实现一步标记和分离磁性荧光淀粉纳米颗粒。本发明磁性荧光淀粉纳米颗粒具有磁分离特性，低细胞毒性。

Description

一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于材料领域，具体涉及一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
纳米技术是上世纪末迅速发展起来的一门高新技术，包括了微观世界（原子、分子）、微观与宏观的过渡区（纳米领域）和宏观世界，是在传统技术基础之上进行大胆创新的结果。首批研究成果因新颖、独特的思路，在学术研究领域引起了巨大的反响，并受到广泛关注，被称为21世纪的又一次工业革命。随着时代的发展，高精监测仪器的不断推陈出新，纳米技术得到了进一步的成熟和完善。作为纳米技术领域的典型代表，纳米颗粒因具有小尺寸效应，在食品、化工、医学等领域备受青睐。其中，纳米荧光探针作为药物载体材料应用于细胞内的标记及示踪是当今研究的热点项目。
荧光标记的生物大分子可用于活体荧光成像、蛋白与蛋白之间的相互作用及蛋白对细胞功能的影响等方面。能作为荧光纳米探针载体的材料有很多，但荧光标记物大部分是有机染料和合成高聚物上，存在不易降解、荧光寿命短、光化学稳定性差、激发光谱窄、光解产物对生物体有毒害等问题，在一定程度上限制了其在细胞生物领域的应用。因此，找到可生物降解、低毒性的生物载体材料成为一件刻不容缓的任务。纳米淀粉颗粒表面易功能化，可与抗原、抗体及多种蛋白质结合，从而在细胞分离、靶向药物、免疫测定等方面具有广阔的市场前景，但纳米淀粉颗粒本身并无发光基团，近年来，科研工作人员利用可生物降解的纳米颗粒与荧光分子结合制成荧光纳米颗粒，增强了荧光分子的光化学稳定性和生物相容性，减轻了细胞毒性和光漂白性，进一步拓展了荧光标记在活体视踪方面的研究，但荧光标记技术中的标记和分离总是研究的难点。
在细胞吞噬外来颗粒物的过程中，内吞物首先要经过细胞内一个极为重要的细胞器—溶酶体，才能进行下一步的运输与扩散。溶酶体是一个由单层膜围成的球状体，内含多种水解酶，由于这些酶的最适pH值为酸性，因而称为酸性水解酶，参与细胞内的物质消化。物质进入细胞后，溶酶体会将其消化分解为小分子物质扩散到胞质中，供机体各种生命活动的需要并观察内吞物在溶酶体中的定位情况。目前的溶酶体荧光探针大都是有机染料和合成高聚物，具有比较高的细胞毒性，将可生物降解、安全无毒的淀粉制备成磁性荧光淀粉纳米颗粒进入溶酶体内，可观察到磁性荧光淀粉纳米颗粒在细胞溶酶体中的定位情况，可以进一步了解细胞吞噬的过程及吞噬效果，有利于提高颗粒装载物的利用率。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，克服以上不足，提供一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法，本发明磁性淀粉纳米颗粒具有磁分离特性，低细胞毒性；本发明制备方法制备过程中易实现一步标记和分离磁性荧光淀粉纳米颗粒。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将可溶性淀粉溶液加入Fe3+水溶液中，升温至80～90℃，分散均匀，得混合物溶液；搅拌条件下，将混合物溶液滴加至氨水溶液中，保持pH值为9～11，60℃下，搅拌反应，分离出固体，烘干，得平均直径为200～300nm的磁性淀粉纳米颗粒；
（2）将磁性纳米淀粉颗粒与赖氨酸静电结合，得到富含氨基的多聚氨酸淀粉纳米颗粒；
（3）将多聚氨酸淀粉纳米颗粒与异硫氰酸荧光素混合，得到异硫氰酸荧光素标记的溶酶体磁性荧光淀粉纳米颗粒。
优选的，所述步骤（2）具体为：将1 mg磁性淀粉纳米颗粒分散于1mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，摇匀，倒入0.1 mg/mL多聚赖氨酸（PLL）的PBS溶液中，在40℃、400r/min摇床震荡条件下反应2 h，反应完毕后，离心，弃去上清液，用蒸馏水多次洗涤沉淀，冷冻干燥，得到富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒；
优选的，所述步骤（3）具体为：将1mg富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒分散于1mL的PBS缓冲液中，加入0.01～0.1mg异硫氰酸荧光素，在室温条件下，100r/min摇床振荡4h后，加入无水乙醇，有沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水反复溶解，再一次用乙醇醇沉，重复3次，洗涤沉淀，产物为异硫氰酸荧光素标记的磁性荧光淀粉纳米颗粒。
优选的，步骤（1）中，每毫摩尔Fe3+加入 0.02～0.04g可溶性淀粉，所述可溶性淀粉溶液的为质量百分浓度1～3%的可溶性淀粉水溶液，所述Fe3+水溶液的摩尔浓度为0.02～0.03mol/L。研究发现，Fe3+与可溶性淀粉的量之比对磁性纳米颗粒的形成影响亦较大，仅有当每毫摩尔Fe3+加入 0.02～0.04g可溶性淀粉，可溶性淀粉才能完整的包裹Fe3O4磁性颗粒，保证磁性纳米颗粒在具有磁性，且被淀粉完全包裹，进而在后续的步骤形成细胞毒性小的、易被内吞的荧光探针。
优选的，步骤（1）中，所述氨水溶液为5M NH3·H2O，氨水溶液的体积与Fe3+水溶液体积比为3～5:5，所述搅拌的转速为100r/min；优选的，氨水溶液的体积与Fe3+水溶液体积比为3:5。研究发现，氨水溶液以及搅拌速度，对磁性纳米颗粒的形成亦有较大影响，当这些参数位于此范围时，才能保证磁性纳米颗粒形貌完整和平均粒径。
优选的，步骤（1）中，所述磁性纳米淀粉颗粒的平均粒径为200nm。当淀粉纳米颗粒的平均粒径为200nm时，后续制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒被内吞的量大，细胞毒性小。
优选的，步骤（1）中，步骤（1）中，每毫摩尔Fe3+加入0.03g可溶性淀粉，所述可溶性淀粉溶液的为质量百分浓度2 %的可溶性淀粉水溶液，所述Fe3+水溶液的摩尔浓度为0.03mol/L。
本发明制备方法制备的溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明方法制备的溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒可被Hela细胞吞噬，并于红色荧光的溶酶体在HeLa细胞中基本重合，显示出了黄色荧光，成功标记Hela细胞，可作为新型溶酶体标记材料，且Hela细胞对其吞噬量大，细胞毒性小；本发明方法制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒华具有磁分离功能，在外加磁场下便于富集和分离，可以进一步应用于细胞、蛋白、DNA等生物分子的分离和分析；相较于普通荧光淀粉纳米颗粒，本发明磁性荧光纳米颗粒的取代度更高，在溶酶体中荧光更为稳定有效，能够较长时间的保持荧光性。
（2）本发明制备方法简单，易操作，原料廉价易得，适宜规模化生产。
附图说明
图 1是实施例1制备的磁性淀粉纳米颗粒和磁性荧光淀粉纳米颗粒的荧光图，其中左图是磁性淀粉纳米颗粒，右图是磁性荧光淀粉纳米颗粒；
图2是对比例1制备的荧光淀粉纳米颗粒和实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒在溶酶体中的荧光图，其中，左图为对比例1制备的荧光淀粉纳米颗粒；实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明进行进一步的说明。
以下实施例采用的试剂和材料若无特殊说明，均是通过常规市售渠道获得。
实施例1：
本实施例包括以下步骤：
（1）将4.5mL 2%可溶性淀粉添加到50mL包含0.03MFe3+的水溶液里，在90oC温度下保持搅拌30min，使两者分散均匀；然后在100 r/min的搅拌下，将混合物溶液缓慢滴加到30mL 5M NH3·H2O溶液里，保持溶液pH值为10，在60oC温度下保持搅拌30min，沉淀离心洗涤烘干，得到平均粒径为200nm的Fe3O4磁性淀粉纳米颗粒；
（2）称取1 mg磁性淀粉纳米颗粒分散于1mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，摇匀，倒入多聚赖氨酸溶液（多聚赖氨酸/PBS，0.1 mg/mL）中，在40℃条件下反应2 h，400r/min摇床震荡，反应完毕后，离心，弃去上清液，用蒸馏水多次洗涤沉淀，冷冻干燥，得到富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒；
（3）将1mg富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒分散于1mL的PBS缓冲液中，加入少量0.01mg异硫氰酸荧光素，在室温条件下，100r/min摇床振荡4 h后，向反应物中加入无水乙醇，有沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀加水反复溶解，再一次用乙醇醇沉，重复3次，洗涤沉淀，产物为异硫氰酸荧光素标记的磁性荧光淀粉纳米颗粒（其纳米颗粒的荧光图如图1所示）；
采用荧光胺实验检测本实施例制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒表面是否带有伯氨基。取200μL 100μg/mL磁性荧光淀粉纳米颗粒溶于荧光胺甲醇溶液中，以荧光胺甲醇溶液为对照，在激发波长为450nm处测定荧光强度。结果表明，磁性荧光淀粉纳米颗粒产生最大激发波长在490 nm附近，最大发射波长520 nm附近，这与纯异硫氰酸荧光素的最大激发波长和发射波长相近。
然后本实施例将磁性荧光淀粉纳米颗粒配制成100µg/mL的溶液，利用荧光分光光度计测定荧光强度，带入异硫氰酸荧光素的标准曲线中，计算荧光取代度。磁性淀粉纳米颗粒的荧光取代度是1.86μg/100μg(每100 μg淀粉含有FITC的量)，Zeta电位仪分析结果为22.4 mv，带有正电荷磁性荧光淀粉纳米颗粒的荧光强度稳定，放置72h以内荧光强度基本没有变化。
将实施例1制备的磁性荧光纳米颗粒分散于超纯水中，过滤灭菌。取融合度为70%的Hela细胞用0.25%胰蛋白酶消化，以1×104个细胞/孔的密度接种于细胞96孔板内，每孔200μL，加入90μL的完全培养基，在37℃CO2细胞培养箱中培养24 h，用移液枪吸除上清液。各样品分别加入含不同浓度的已灭菌的培养基200μL，使样品终浓度中分别为50、100、200、400、500μg/mL，每个浓度设有5个平行孔，以加入无任何样品的培养基为对照孔，之后将96孔板置于37℃CO2培养箱中培养24h，吸出培养基，每孔加入20μL 、噻唑蓝（MTT，1mg/m L），然后 37℃孵育4h，从培养箱中取出，每孔加入100μL的二甲基亚砜（DMSO），摇床振荡15min，在波长为570nm处用酶标仪测量吸光度A，可通过下列公式计算荧光淀粉对细胞生长的抑制率，以实验室制得的大米淀粉对细胞的致死率为对照。
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结果表明，当磁性荧光淀粉纳米颗粒在培养基中的浓度为0.06 mg／mL时，细胞致死率接近0，可见磁性荧光淀粉纳米颗粒在低浓度时几乎无生物毒性。当浓度增加到0.2mg／mL时，细胞致死率为3.2％，与作为对照的淀粉的致死率接近(2 ％)。
实施例2：
本实施例包括以下步骤：
（1）将4.5mL 2%可溶性淀粉添加到50mL 0.03M Fe3+的水溶液里，在90oC温度下保持搅拌30min，使两者分散均匀；然后在100 r/min的搅拌下，将混合物溶液缓慢滴加到30mL5M NH3·H2O溶液里，保持溶液pH值为10，在60oC温度下保持搅拌30min，沉淀离心洗涤烘干，得到平均粒径为200nm的Fe3O4磁性淀粉纳米颗粒；
（2）称取1 mg磁性淀粉纳米颗粒分散于1mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，摇匀，倒入多聚赖氨酸溶液（多聚赖氨酸/PBS，0.1 mg/ml）中，在40℃条件下反应3 h，400r/min摇床震荡，反应完毕后，离心，弃去上清液，用蒸馏水多次洗涤沉淀，冷冻干燥，得到富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒；
（3）将1mg富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒分散于1mL的PBS缓冲液中，加入少量0.01mg异硫氰酸荧光素，在室温条件下，100r/min摇床振荡4 h后，向反应物中加入无水乙醇，有沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀加水反复溶解，再一次用乙醇醇沉，重复3次，洗涤沉淀，产物为异硫氰酸荧光素标记的磁性荧光淀粉纳米颗粒。
采用实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒进行标记：
将磁性荧光淀粉纳米颗粒（实施例2制备），在37℃与无血清的HeLa细胞培养基中培育6h且磁性荧光淀粉纳米颗粒在培养基中浓度为200μg/mL的条件下，HeLa细胞吞噬荧光纳米淀粉颗粒量最大。此时绿色荧光的纳米淀粉颗粒与红色荧光的溶酶体染料在HeLa细胞中基本重合，显示出了黄色荧光。
然后本实施例将磁性荧光淀粉纳米颗粒配制成100µg/mL的溶液，利用荧光分光光度计测定荧光强度，带入异硫氰酸荧光素的标准曲线中，计算荧光取代度。实施例2的磁性淀粉纳米颗粒的荧光取代度是2.13μg，Zeta电位仪分析结果为31.6mv，带有正电荷磁性荧光淀粉纳米颗粒的荧光强度稳定，放置72h以内荧光强度基本没有变化。
采用实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒进行溶酶体标记。
将对数生长期的HeLa细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，以密度为1×105/cm2个/孔接种于含无菌盖玻片的6孔细胞板中，在37℃CO2细胞培养箱中培育，当细胞融合度达50%时，弃培养基，更换为含有200nm级无菌磁性荧光淀粉颗粒(实施例2制备，200µg/m L)的DMEM新鲜无血清培养基。培育2h后，弃培养基，PBS洗涤，加入配制好的含溶酶体荧光探针的DMEM新鲜无血清培养基，在培养箱中培育30min进行细胞溶酶体的染色，经 PBS洗涤后，轻轻取出盖玻片，调整荧光倒置显微镜的光圈，进行荧光观察。经观察，绝大部分的磁性荧光淀粉纳米颗粒所发出的绿色荧光与溶酶体染料所发出的红色荧光基本重合，显示出了重合后的黄色荧光，说明荧光纳米淀粉颗粒可以定位在细胞的溶酶体中。将溶酶体标记后的细胞培养皿的侧面放置一块磁铁时，在外加磁场的作用下，HeLa细胞均向磁铁发生了移动，细胞均富集在右边，由此可见，标记后的细胞可在磁场的作用下进行富集和分离。
通过检测发现，实施例2的磁性荧光淀粉纳米颗粒对细胞的致死率均随其浓度的增加而升高，当浓度为0.08 mg／mL时，细胞致死率在0.87%左右，可见被异硫氰酸标记的磁性纳米淀粉在低浓度时几乎无细胞毒性。当磁性纳米淀粉颗粒浓度高于200µg/mL时，细胞对纳米淀粉颗粒吞噬量的增加速度放缓，纳米淀粉颗粒浓度在500µg/mL和600µg/mL时，吞噬量分别为317.7µg/mg和316.5µg/mg，无明显差异，基本达到饱和状态。纳米淀粉颗粒浓度继续增加，细胞对纳米淀粉颗粒的吞噬量几乎不再发生变化，此时吞噬效率降低，不会随纳米淀粉颗粒浓度的增加而有太大的改变，但却开始造成细胞死亡。
对比例 1
本对比例1的步骤与实施例2的制备方法步骤（2）和（3）相同，其中步骤（2）中采用的磁性纳米淀粉颗粒改用为平均粒径为200nm的纳米淀粉颗粒，制备得到荧光纳米淀粉。
经检测，实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒的荧光取代度是2.13 μg/100μg(每100 μg淀粉含有FITC的量)，而对比例1制备的荧光纳米淀粉颗粒的荧光取代度是0.71μg/100μg，在实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒和对比例1制备的荧光纳米淀粉颗粒进入HeLa细胞的溶酶体中72小时之后，观察纳米颗粒的荧光情况，结果如图2所示，图2中左图荧光淀粉纳米颗粒在细胞的溶酶体中难以检测到荧光，右图磁性荧光淀粉纳米颗粒仍然能检测到较强的荧光强度，表明本发明方法制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒在溶酶体中能够长时间保持荧光稳定，避免被淬灭。溶酶体是一种非常重要的细胞器，几乎存在于所有的真核细胞中，它的p H值约为4.5～5.5，呈酸性。异硫氰酸荧光素对pH敏感，在酸性环境里与氨基结合不稳定，导致荧光信号不稳定或难以检测，本发明制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒不仅具有磁性，还通过强电磁吸引克服了这个缺点，赋予了荧光纳米淀粉在溶酶体具有较强和稳定的荧光信号及磁性。

Claims (8)

1.一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将可溶性淀粉溶液加入Fe3+水溶液中，每毫摩尔Fe3+加入 0.02～0.04g可溶性淀粉，升温至80～90℃，分散均匀，得混合物溶液；搅拌条件下，将混合物溶液滴加至氨水溶液中，保持pH值为9～11，60℃下，搅拌反应，分离出固体，烘干，得平均直径为200～300nm的Fe3O4磁性淀粉纳米颗粒；
（2）将Fe3O4磁性纳米淀粉颗粒与赖氨酸静电结合，得到富含氨基的多聚氨酸淀粉纳米颗粒；
（3）将多聚氨酸淀粉纳米颗粒与异硫氰酸荧光素混合，得到异硫氰酸荧光素标记的溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：将1 mg磁性淀粉纳米颗粒分散于1mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，摇匀，倒入0.1 mg/mL多聚赖氨酸（PLL）的PBS溶液中，在40℃、400r/min摇床震荡条件下反应2 h，反应完毕后，离心，弃去上清液，用蒸馏水多次洗涤沉淀，冷冻干燥，得到富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）具体为：将1mg富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒分散于1mL的PBS缓冲液中，加入0.01～0.1mg异硫氰酸荧光素，在室温条件下，100r/min摇床振荡4 h后，加入无水乙醇，有沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水反复溶解，再一次用乙醇醇沉，重复3次，洗涤沉淀，产物为异硫氰酸荧光素标记的磁性荧光淀粉纳米颗粒。
4.根据权利要求1～3任一项所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述可溶性淀粉溶液的为质量百分浓度1～3%的可溶性淀粉水溶液，所述Fe3+水溶液的摩尔浓度为0.02～0.03mol/L。
5.根据权利要求4所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氨水溶液为5M NH3·H2O，氨水溶液的体积与Fe3+水溶液体积比为3～5:5，所述搅拌的转速为100r/min。
6.根据权利要求5所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述磁性纳米淀粉颗粒的平均粒径为200nm。
7.根据权利要求6所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，每毫摩尔Fe3+加入0.03g可溶性淀粉，所述可溶性淀粉溶液的质量百分浓度为2 %的可溶性淀粉水溶液，所述Fe3+水溶液的摩尔浓度为0.03mol/L。
8.一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒，其特征在于，由权利要求1～7任一项所述制备方法制备获得。
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