CN114045260B - 一种纳米硒微粒体系及其制备方法与应用、调节性免疫细胞及其预处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米硒微粒体系及其制备方法与应用、调节性免疫细胞及其预处理方法，属于生物材料技术领域。该纳米硒微粒体系包括纳米硒‑咖啡因复合物，纳米硒‑咖啡因复合物包括单质硒纳米粒子及荷载于单质硒纳米粒子上的咖啡因。其制备方法简单、易操作、得率高、咖啡因的荷载率高，微粒体系稳定性好。该纳米硒微粒体系可通过降低细胞内的免疫抑制性代谢物的产生，显著增强细胞毒类免疫细胞(包括NK细胞，γδT细胞和CD8⁺T细胞等)的免疫效应功能，达到增强抗肿瘤效应功能的最终目的。上述纳米硒微粒体系可用于免疫细胞的预处理，达到提高免疫细胞功效的作用，具有非常广阔的市场前景和产业化价值。

Description

一种纳米硒微粒体系及其制备方法与应用、调节性免疫细胞 及其预处理方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及一种纳米硒微粒体系及其制备方法与应用、调节性免疫细胞及其预处理方法。

背景技术

硒是一种对人体有益的且必需的微量元素，硒的缺乏会导致一系列疾病，如心肌病、心肌功能衰退、克山病、大骨节病、易感染、肝病加重、男性精子活力下降等。但是，化合态的硒(无机硒)，如亚硒酸钠(Na₂SeO₃)，对细胞的功能具有负面作用，包括影响细胞活性等，同时剂量较大时会引起中毒甚至致死。

有机硒，主要指与生物大分子以配位键或共价键等方式结合的硒(如市售的硒酵母片等属于此类)，不仅无毒，还有利于机体有效吸收。有机硒是目前关于补硒的主要方式，就是将无机硒添加在肥料中，用于种植食用作物，从而产出如富硒红薯、富硒大米等。

如今，NK细胞、γδT细胞和CD8⁺T细胞等的免疫细胞治疗已成为全世界医疗领域内对难治性疾病(如恶性肿瘤)治疗的新的、重要的医疗手段。但在回输免疫细胞前，目前还没有能够安全有效地进一步增强免疫细胞的效应功能的方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种纳米硒微粒体系，该纳米硒微粒体系能够安全有效地增强免疫细胞的效应功能。

本发明的目的之二在于提供一种上述纳米硒微粒体系的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种上述纳米硒微粒体系的应用，如用于对免疫细胞进行预处理。

本发明的目的之四在于提供一种使用上述纳米硒微粒体系进行免疫细胞预处理的方法。

本发明的目的之五在于提供一种经上述预处理方法得到的调节性免疫细胞。

本申请可这样实现：

第一方面，本申请提供一种纳米硒微粒体系，其包括纳米硒-咖啡因复合物，纳米硒-咖啡因复合物包括单质硒纳米粒子以及荷载于单质硒纳米粒子上的咖啡因。

在可选的实施方式中，纳米硒微粒的粒径为20-200nm，优选为20-130nm。

在可选的实施方式中，咖啡因在单质硒纳米粒子上的荷载率不低于50％，优选为50-90％。

在可选的实施方式中，纳米硒微粒体系为胶体形式。

在可选的实施方式中，纳米硒微粒体系中纳米硒-咖啡因复合物的浓度为11-15mmol/L。

在可选的实施方式中，纳米硒微粒体系的制备原料包括含有化合态硒的硒源、还原剂以及咖啡因；

其中，硒源包括亚硒酸钠，还原剂包括维生素C。

在可选的实施方式中，制备原料还包括分散稳定剂。

在可选的实施方式中，分散稳定剂包括壳聚糖、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠以及Pluronic F-127中的至少一种。

第二方面，本申请提供如前述实施方式任一项的纳米硒微粒体系的制备方法，包括以下步骤：将咖啡因荷载于单质硒纳米粒子上。

在可选的实施方式中，将含有化合态硒的硒源溶液、咖啡因溶液、还原剂溶液以及分散稳定剂溶液混合反应。

在可选的实施方式中，先将含有化合态硒的硒源溶液、咖啡因溶液以及分散稳定剂溶液混合，随后再与还原剂溶液混合反应。

在可选的实施方式中，混合反应于搅拌条件下进行。

在可选的实施方式中，反应于4-40℃的条件下进行12-48h。

在可选的实施方式中，含有化合态硒的硒源溶液中的硒源的浓度为5mmol/L-0.5mol/L，还原剂溶液中的还原剂的浓度为25mmol/L-1mol/L，咖啡因溶液中的咖啡因的浓度为1-100mmol/L；

硒源溶液与还原剂溶液的体积比为1:1-5；咖啡因溶液的体积为硒源溶液及还原剂溶液总体积的0.1-1倍；咖啡因溶液及硒源溶液的总质量与分散稳定剂溶液的质量比为100：0.1-1。

在可选的实施方式中，还包括：将反应后的混合液进行透析。

在可选的实施方式中，还包括将透析后所得的溶液进行固液分离，收集固相物。

第三方面，本申请提供如前述实施方式任一项的纳米硒微粒体系的应用，纳米硒微粒体系用于对免疫细胞进行预处理。

第四方面，本申请提供一种免疫细胞的预处理方法，包括：用前述实施方式任一项的纳米硒微粒体系对免疫细胞进行预处理。

在可选的实施方式中，免疫细胞包括NK细胞、γδT细胞和CD8⁺T细胞中的至少一种。

在可选的实施方式中，预处理包括：将纳米硒微粒体系以及免疫细胞共同置于培养基中，并于37℃以及5vt％CO₂的条件下孵育6-24h。

在可选的实施方式中，纳米硒微粒体系在培养基中的浓度为1-50μmmol/L。

第五方面，本申请提供一种调节性免疫细胞，经前述实施方式的预处理方法处理得到。

本申请的有益效果包括：

本申请提供的纳米硒微粒体系通过将咖啡因荷载到硒纳米粒子上，使纳米硒微粒体系不但具有尺寸效应、易被细胞吞噬及无毒副作用等独特优势，而且还实现了单质硒和咖啡因对免疫细胞功能增强的双重作用，此外，还达到了补充微粒元素硒的效果。

该纳米硒微粒体系的制备方法简单、易操作、得率高，咖啡因的荷载率高，微粒系统的稳定性好。

所得的纳米硒微粒体系可以通过降低细胞内的免疫抑制性代谢物的产生，显著增强细胞毒类免疫细胞(包括NK细胞、γδT细胞和CD8⁺T细胞等)的免疫效应功能，达到增强抗肿瘤效应功能的最终目的。该技术可以用于免疫细胞的预处理，以提高免疫细胞的功效，具有非常广阔的市场前景和产业化价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请纳米硒微粒体系制备的化学反应机理图；

图2为试验例1中新鲜制备的纳米硒微粒体系的外观图；

图3为试验例1中新鲜制备的纳米硒微粒体系在4℃的条件下放置3个月后的外观图；

图4为试验例2中纳米硒微粒体系的粒径结果图；

图5为试验例5中纳米硒微粒体系的生物相容性测试结果图；

图6为试验例6中纳米硒微粒体系的适用浓度测试结果图；

图7为试验例7中纳米硒微粒体系对免疫细胞功效影响的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请提供的纳米硒微粒体系及其制备方法与应用、调节性免疫细胞及其预处理方法进行具体说明。

本申请提出一种纳米硒微粒体系，其包括纳米硒-咖啡因复合物，纳米硒-咖啡因复合物包括单质硒纳米粒子以及荷载于单质硒纳米粒子上的咖啡因。

可参考地，上述纳米硒微粒的粒径可以为20-200nm，优选为20-130nm。在此粒径范围内，一方面能够为咖啡因的荷载提供较多的荷载位点，使其具有合适的荷载量，另一方面能够具有较好的细胞相容性，利于细胞吸收。

较佳地，咖啡因在单质硒纳米粒子上的荷载率不低于50％，优选为50-90％，更优为80-90％。荷载率过低，起不到调节免疫细胞功能的作用，而荷载率超过90％则难以制备，对制备技术要求高。

本申请中，纳米硒微粒体系以胶体形式存在，该形式有利于在孵育过程中对细胞进行快速调节，提高细胞的功效。

较佳地，纳米硒微粒体系中纳米硒-咖啡因复合物的浓度为11-15mmol/L，如11mmol/L、11.5mmol/L、12mmol/L、12.5mmol/L、13mmol/L、13.5mmol/L、14mmol/L、14.5mmol/L或15mmol/L等，也可以为11-15mmol/L范围内的其它任意值。

本申请中，纳米硒微粒体系的制备原料包括含有化合态硒的硒源、还原剂以及咖啡因。

其中，硒源包括亚硒酸钠。还原剂包括维生素C。

进一步地，上述制备原料还包括分散稳定剂，如包括壳聚糖、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠以及Pluronic F-127中的至少一种。分散稳定剂的作用在于：防止制备的纳米粒子聚集成团而沉淀，使纳米粒子以胶体状态稳定保存。

需说明的是，本申请提供的纳米硒微粒体系中，硒以单质态存在，其既没有无机硒的毒性，又没有有机硒的成分复杂性。而且单质硒容易装载其它具有功能的生物大分子，从而制备为具有符合功能的功能型硒纳米粒子。本申请提供的单质硒纳米粒子可以调节免疫细胞的效应功能，包括增强免疫细胞的细胞因子(如干扰素、穿孔素及颗粒酶等)分泌能力，提高细胞表面受体分子(如NKG2D分子、CD107a分子及CD16分子等)的表达水平，增强免疫细胞对靶细胞的杀伤能力等。

咖啡因可与腺苷受体直接结合但又不影响细胞的活化状态，从而使得腺苷的代谢受到抑制。其不仅可作为免疫细胞效应功能的正向调节剂，增强免疫细胞的功能，同时，其还可以抑制免疫细胞向具有抑制功能的负向调节免疫细胞的转换。

通过将咖啡因荷载到硒纳米粒子上，使纳米硒微粒体系不但具有尺寸效应、易被细胞吞噬及无毒副作用等独特优势，而且还实现了单质硒和咖啡因对免疫细胞功能增强的双重作用，此外，还达到了补充微粒元素硒的效果。

相应地，本申请还提供了上述纳米硒微粒体系的制备方法，例如可包括以下步骤：将咖啡因荷载于单质硒纳米粒子上。

具体的，将含有化合态硒的硒源溶液、咖啡因溶液、还原剂溶液以及分散稳定剂溶液混合反应，其化学反应机理如图1所示。

上述混合过程中，一方面含有化合态硒的硒源与还原剂发生氧化还原反应，从而被还原成硒单质；另一方面，咖啡因通过混合作用荷载于硒单质表面和内部，分散稳定剂则用于使各反应物在体系中分散均匀并保持反应体系的稳定性。

在一些优选的实施方式中，先将含有化合态硒的硒源溶液、咖啡因溶液以及分散稳定剂溶液混合，随后再与还原剂溶液混合反应。

按该混合顺序，可使得硒源溶液、咖啡因溶液以及分散稳定剂溶液先混合均匀，随后在还原剂的还原作用下，更利于咖啡因均匀荷载于还原生成的硒单质表面及其内部。

在可选的实施方式中，含有化合态硒的硒源溶液中的硒源的浓度为5mmol/L-0.5mol/L(如5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L或500mmol/L等)，还原剂溶液中的还原剂的浓度为25mmol/L-1mol/L(如25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L、600mmol/L、700mmol/L、800mmol/L、900mmol/L或1mol/L等)，咖啡因溶液中的咖啡因的浓度为1-100mmol/L (如1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、80mmol/L或100mmol/L等)。

可参考地，制备过程中，硒源溶液与还原剂溶液的体积比示例性但非限定性地为1:1-5，如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5等。咖啡因溶液的体积为硒源溶液及还原剂溶液总体积的0.1-1倍，如0.1倍、0.2倍、0.5倍、0.8倍或1倍等。咖啡因溶液及硒源溶液的总质量与分散稳定剂溶液的质量比为100：0.1-1，如100:0.1、100:0.2、100:0.5、100:0.8或100:1等。

在一些具体的实施方式中，硒源溶液可参照以下方式制备：准确称量8.647克亚硒酸钠(Na₂SeO₃)，溶解于1升超纯水，制备浓度为50毫摩尔(mM)浓度的亚硒酸钠溶液。

还原剂溶液(以维生素C溶液为例)可参照以下方式制备：准确称量维生素C(抗坏血酸)88.065克，溶解于1升超纯水，制备浓度为500毫摩尔(mM)浓度的维生素C溶液。

咖啡因溶液可参照以下方式制备：准确称量1.942克咖啡因(化学式：C₈H₁₀N₄O₂，分子量：194.194)，溶解于1升超纯水，制备浓度为10毫摩尔(mM)浓度的咖啡因溶液。

分散稳定剂溶液(以壳聚糖溶液为例)可参照以下方式制备：准确称量0.5克脱乙酰度为≥95％的壳聚糖，溶解于含100毫升1％醋酸的水溶液中，得到壳聚糖的母液。

需说明的是，在其它实施方式中，可根据制备的实际需要，按比例增多或减少原料的质量，以及需制备的溶液体积。

可参考地，上述混合反应于搅拌条件下进行。具体的，可以是手工搅拌，也可采用磁力搅拌器等仪器进行搅拌。

可参考地，上述反应示例性但非限定性地可以于4-40℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃等)的条件下进行12-48h(如12h、15h、18h、20h、25h、30h、35h、40h、45h或48h等)。在其它实施方式中，可根据所需纳米粒子得率以及粒径大小对反应温度和时间进行调整。

上述反应所得的纳米硒微粒体系呈红色或浅红色。

进一步地，还包括：将反应后的混合液进行透析。

具体的，透析过程可参照：将混合液放入孔目为8000-14000的透析袋，再将透析袋放置于装有超纯水的容器中透析24小时，透析过程中换超纯水4-6次。

进一步地，还可包括将透析后所得的溶液进行固液分离，收集固相物。

具体的，可参照：将透析后所得的溶液用超速离心(离心力≥10000g)的方法进行富集，收集离心管底部的沉淀物(纳米粒子)，丢弃上层溶液。将纳米粒子用pH值为7.0的缓冲液(5mL)进行稀释重选，以大幅度缩小所制备纳米硒微粒体系的总溶液体积，方便后续保存。

需说明的是，该纳米硒微粒体系在4℃条件下可至少保存3个月，长时间保存纳米粒子会稍有聚集，出现少量沉淀，使用时可将装有纳米硒微粒体系的试剂管放入超声仪的水面下，进行超声5-10秒，即可继续使用。

承上，本申请提供的纳米硒微粒体系的制备方法简单、易操作、得率高，咖啡因的荷载率高，微粒系统的稳定性好，生物相容性好。

此外，本申请还提供了纳米硒微粒体系的应用，如用于对免疫细胞进行预处理。

相应地，本申请还提供了一种免疫细胞的预处理方法，包括：用上述纳米硒微粒体系对免疫细胞进行预处理。

可参考地，上述免疫细胞包括NK细胞、γδT细胞和CD8⁺T细胞中的至少一种。

具体的，预处理可以包括：将纳米硒微粒体系以及免疫细胞共同置于培养基中，并于37℃以及5vt％CO₂的条件下孵育6-24h。孵育后的细胞通过无菌PBS离心洗2次后即可使用。

纳米硒微粒体系在培养基中的浓度可以为1-50μmmol/L，如1μmmol/L、2μmmol/L、5μmmol/L、10μmmol/L、15μmmol/L、20μmmol/L、25μmmol/L、30μmmol/L、35μmmol/L、40μmmol/L、45μmmol/L或50μmmol/L等，也可以为1-50μmmol/L范围内的其它任意值。

需说明的是，纳米硒微粒体系的浓度低于1μM，免疫细胞的功能增强不明显；高于50μM会增加细胞的凋亡的比例，凋亡的细胞比例将高于5％。

经上述预处理，纳米硒微粒体系可以通过降低细胞内的免疫抑制性代谢物的产生，显著增强细胞毒类免疫细胞(包括NK细胞、γδT细胞和CD8⁺T细胞等)的免疫效应功能，达到增强抗肿瘤效应功能的最终目的。

相应地，本申请还提供一种经上述预处理方法处理得到的调节性免疫细胞。

该调节性免疫细胞为免疫效应功能增强的免疫细胞，该类细胞对肿瘤细胞具有更强的杀伤功能，可用于后续体外、体内或临床相关研究。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种纳米硒微粒体系的制备方法，具体如下：

(1)各原料的制备：

A、制备硒源溶液：准确称量8.647克亚硒酸钠(Na₂SeO₃)，溶解于1升超纯水，制备浓度为50毫摩尔(mM)浓度的亚硒酸钠溶液。

B、制备还原剂溶液(以维生素C溶液为例)：准确称量维生素C(抗坏血酸)88.065克，溶解于1升超纯水，制备浓度为500毫摩尔(mM)浓度的维生素C溶液。

C、制备咖啡因溶液：准确称量1.942克咖啡因(化学式：C₈H₁₀N₄O₂，分子量：194.194)，溶解于1升超纯水，制备浓度为10毫摩尔(mM)浓度的咖啡因溶液。

D、制备分散稳定剂溶液(以壳聚糖溶液为例)：准确称量0.5克脱乙酰度为≥95％的壳聚糖，溶解于含100毫升1％醋酸的水溶液中，得到壳聚糖的母液。

(2)先将100mL的上述硒源溶液、20mL的上述咖啡因溶液以及50mL的上述分散稳定剂溶液混合，随后再与100mL的上述还原剂溶液于4℃的条件下混合反应24h。上述咖啡因溶液及硒源溶液的总质量与分散稳定剂溶液的质量比为100：0.5。

(3)将反应后的混合液放入孔目为8000-14000的透析袋，再将透析袋放置于装有超纯水的容器中透析24小时，透析过程中换超纯水6次。

(4)将透析后所得的溶液用超速离心(离心力≥10000g)的方法进行富集，收集离心管底部的沉淀物(纳米粒子)，丢弃上层溶液。将纳米粒子用pH值为7.0的缓冲液(5mL)进行稀释重选，以大幅度缩小所制备纳米硒微粒体系的总溶液体积，保存备用。

实施例2

含有化合态硒的硒源溶液中的硒源的浓度为0.5mol/L，所述还原剂溶液中的还原剂的浓度为1mol/L，所述咖啡因溶液中的咖啡因的浓度为100mmol/L。

硒源溶液与还原剂溶液的体积比为1:3。咖啡因溶液的体积为硒源溶液及还原剂溶液总体积的0.5倍。咖啡因溶液及硒源溶液的总质量与分散稳定剂溶液的质量比为100：0.1。

反应于20℃的条件下进行48h。

实施例3

含有化合态硒的硒源溶液中的硒源的浓度为5mmol/L，所述还原剂溶液中的还原剂的浓度为25mmol/L，所述咖啡因溶液中的咖啡因的浓度为1mmol/L。

硒源溶液与还原剂溶液的体积比为1:5。咖啡因溶液的体积为硒源溶液及还原剂溶液总体积的1倍。咖啡因溶液及硒源溶液的总质量与分散稳定剂溶液的质量比为100：1。

反应于40℃的条件下进行12h。

试验例1

纳米硒微粒体系颜色和状态观测：

实施例1反应完后所得(新鲜制备所得)的纳米硒微粒体系的外观如图2所示；将该纳米硒微粒体系在4℃的条件下放置3个月后，其外观如图3所示。

由图2和图3可以看出，无论是刚制备所得还是放置3个月后的纳米硒微粒体系均呈红色或浅红色。刚制备所得的纳米硒微粒体系均匀，无沉淀；放置3个月后，纳米粒子稍有聚集，出现少量沉淀。

试验例2

纳米硒微粒体系的粒径检测：

用扫描电子显微镜观察实施例1制备所得的纳米硒微粒体系的粒径，其结果如图4所示，显示粒径分布在20-130nm之间。

试验例3

纳米硒微粒体系得率(或产率)分析：

利用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)对实施例1制备所得的纳米硒微粒体系进行测定、计算，结果表明纳米硒微粒体系的得率(产率)达到91.5％。

试验例4

纳米硒微粒体系中咖啡因荷载率分析：

利用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)对实施例1反应后溶液中残余的咖啡因进行检测、计算，表明咖啡因在单质硒纳米粒子上的荷载率为85.6％。

试验例5

纳米硒微粒体系的生物相容性测试：

在不同处理时间的条件下，对实施例1制备所得的纳米硒微粒体系的生物相容性检测、分析。

利用制备的纳米硒微粒体系分别处理三种免疫细胞(NK细胞、γδT细胞和CD8+T细胞)，处理时间为0小时(不处理)、6小时、12小时、24小时和72小时。纳米硒微粒体系在细胞培养基中的浓度为10μM。

其结果如图5所示，表明：活细胞比例均在95％以上，说明该纳米硒微粒体系具有良好的生物相容性。

试验例6

纳米硒微粒体系的适用浓度测试：

在不同浓度的条件下，对实施例1制备所得的纳米硒微粒体系的生物相容性检测、分析。

利用制备的纳米硒微粒体系处理γδT细胞(示例细胞)，处理时间24小时，粒子的浓度分别为0(不处理)、10μM、20μM、50μM及100μM。

其结果如图6所示，表明：当纳米硒微粒体系的浓度高于50μM时，活细胞比例将低于总细胞的90％，说明细胞的活力受到了负面影响。因此，该数据说明该纳米硒微粒体系的使用浓度应该保持在50μM以下。

试验例7

纳米硒微粒体系预处理的免疫细胞的功能变化情况分析：

用实施例1制备所得的纳米硒微粒体系对免疫细胞进行预处理，可以提高免疫细胞对癌细胞的杀伤能力。核心方法包括：将纳米硒微粒体系加入含有免疫细胞的培养基中，使粒子与免疫细胞共孵育。共孵育的条件为37℃，5％CO₂，时间12小时，粒子浓度为5μM。将纳米粒子预处理的免疫细胞与癌细胞(选白血病癌细胞系K562为例)按5:1的比例进行共同作用，然后使用流式细胞仪检测癌细胞的死亡比例。其中，癌细胞的培养、免疫细胞的培养以及免疫细胞杀伤癌细胞的具体步骤参照现有技术，在此不做过多赘述。

其结果如图7所示，表明：纳米硒微粒体系预处理，可以使三种免疫细胞对K562癌细胞的杀伤能力提高约0.66倍(γδT细胞和CD8⁺T细胞)和约0.76倍(NK细胞)。

综上所述，本申请提供的纳米硒微粒体系的制备方法简单、易操作、得率高，咖啡因的荷载率高，微粒系统的稳定性好。所得的纳米硒微粒体系可以通过降低细胞内的免疫抑制性代谢物的产生，显著增强细胞毒类免疫细胞(包括NK细胞、γδT细胞和CD8⁺T细胞等)的免疫效应功能，达到增强抗肿瘤效应功能的最终目的。该技术可以用于免疫细胞的预处理，以提高免疫细胞的功效，具有非常广阔的市场前景和产业化价值。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种纳米硒微粒体系，其特征在于，所述纳米硒微粒体系包括纳米硒-咖啡因复合物，所述纳米硒-咖啡因复合物包括单质硒纳米粒子以及荷载于所述单质硒纳米粒子上的咖啡因，所述纳米硒微粒体系为胶体形式；

所述纳米硒微粒的粒径为20~130nm；

所述咖啡因在所述单质硒纳米粒子上的荷载率不低于50%；

所述纳米硒微粒体系中所述纳米硒-咖啡因复合物的浓度为11~15mmol/L；

所述纳米硒微粒体系的制备方法包括：先将含有化合态硒的硒源溶液、咖啡因溶液以及分散稳定剂溶液混合，随后再与还原剂溶液混合反应；

混合反应于搅拌条件下进行；

反应于4~40℃的条件下进行12~48h；

所述含有化合态硒的硒源溶液中的硒源的浓度为5mmol/L~0.5mol/L，所述还原剂溶液中的还原剂的浓度为25mmol/L~1mol/L，所述咖啡因溶液中的咖啡因的浓度为1~100mmol/L；

所述硒源溶液与所述还原剂溶液的体积比为1:1~5；所述咖啡因溶液的体积为所述硒源溶液及所述还原剂溶液总体积的0.1~1倍；所述咖啡因溶液及所述硒源溶液的总质量与所述分散稳定剂溶液的质量比为100：0.1~1；

所述硒源包括亚硒酸钠，所述还原剂包括维生素C；

所述分散稳定剂为壳聚糖、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠或Pluronic F~127中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的纳米硒微粒体系，其特征在于，所述咖啡因在所述单质硒纳米粒子上的荷载率为50~90%。

3.根据权利要求1~2任一项所述的纳米硒微粒体系，其特征在于，制备方法中还包括：将反应后的混合液进行透析；

将透析后所得的溶液进行固液分离，收集固相物。

4.如权利要求1~3任一项所述的纳米硒微粒体系的应用，其特征在于，所述纳米硒微粒体系用于体外对免疫细胞进行预处理。

5.一种免疫细胞的预处理方法，其特征在于，包括：用权利要求1~3任一项所述的纳米硒微粒体系体外对免疫细胞进行预处理。

6.根据权利要求5所述的免疫细胞的预处理方法，其特征在于，所述免疫细胞为NK细胞、γδT细胞或CD8⁺T细胞中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的免疫细胞的预处理方法，其特征在于，预处理包括：将所述纳米硒微粒体系以及所述免疫细胞共同置于培养基中，并于37℃以及5%CO₂的条件下孵育6~24h。

8.根据权利要求7所述的免疫细胞的预处理方法，其特征在于，所述纳米硒微粒体系在所述培养基中的浓度为1~50μmmol/L。