CN115919801A - 一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种单宁酸‑锌配位的壳聚糖‑硒纳米颗粒的制备方法,属于纳米医药技术领域,本发明利用壳聚糖为分散剂,通过调整壳聚糖的含量以及亚硒酸钠和抗坏血酸的比例,充分控制颗粒粒径的大小,制备出粒径在50‑100纳米的硒颗粒;再将单宁酸和锌离子同时引入到体系中,使硒颗粒表面覆盖一层金属多酚的薄膜,形成一种单宁酸‑锌配位的壳聚糖‑硒纳米颗粒。本发明合成方法简单,原料便宜易得,制备的颗粒粒径均一,生物安全性好。
Description
技术领域
本发明属于纳米医药技术领域,尤其是涉及单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法。
背景技术
硒作为人体中必不可少的微量元素之一,主要有三种存在形式:有机硒、无机硒和单质硒,其中0价态的纳米硒由于生物相容性好、生物利用度高,兼具抗炎、抗氧化、抗癌的作用,成为了纳米医学里一种非常有潜力的材料。纳米硒的合成方法有三种,分别是:物理法、化学法和生物法,在生物医学领域内由于要合成毒性小,活性高的颗粒,因此,化学法和生物法是两种常见的方法。
化学合成法是指利用抗坏血酸或谷胱甘肽等还原剂将硒酸盐还原,得到纳米尺度的红色单质硒。该方法操作过程简单、制备速度快、成本价格低,因此是合成纳米硒最常用的方法之一。同时,在制备时加入一些生物分子(一般是多糖、蛋白质或多肽类)作为软模板,形成“纳米硒-软模板”结构的复合物,能够起到防止纳米硒团聚,且防止其转变成灰黑色单质硒的作用。
然而目前并没有将纳米硒和金属多酚这两种材料结合在一起的报道,为了克服纳米硒不稳定,易聚集的特点,我们利用壳聚糖分散纳米硒,并在纳米硒颗粒上包裹单宁酸-锌的金属多酚涂层,将两者较好地结合在一起,从而发挥更多的疗效功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
S1、配置壳聚糖5~40mg/ml,1%乙酸水溶液1体积份,搅拌至完全溶解;
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1体积份,常温过夜搅拌;
S3、配置20~80mM的抗坏血酸水溶液,加入1体积份,用超纯水补齐到10体积份,常温条件下搅拌反应,将混合溶液加入透析袋中,超纯水透析;
S4、待透析结束,取1.5体积份纳米硒溶液置于离心管中,加入24mM单宁酸水溶液0.5~1.5体积份,涡旋;再加入18.72mM硝酸锌水溶液0.5~1.5体积份,涡旋后超声;
S5、超声结束后的溶液进行离心,用超纯水洗涤沉淀,得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
进一步地,在步骤S3中,常温条件下于500rpm/min搅拌反应1~4小时。
进一步地,在步骤S3中,所述透析袋采用截留分子量为8-14kDa的透析袋。
进一步地,在步骤S3中,超纯水透析时间为24h。
进一步地,在步骤S4中,涡旋时间为5~30s,超声时间为3min。
进一步地,在步骤S5中,离心转速为14000~17000rpm,离心时间为4~7min。
进一步地,在步骤S5中,用超纯水洗涤沉淀洗2~5次。
进一步地,在步骤S1中,所述壳聚糖采用分子量为30000的壳聚糖。
可见,本发明利用壳聚糖为分散剂,通过调整壳聚糖的含量以及亚硒酸钠和抗坏血酸的比例,充分控制颗粒粒径的大小,制备出粒径在50-100纳米的硒颗粒;再将单宁酸和锌离子同时引入到体系中,使硒颗粒表面覆盖一层金属多酚的薄膜,形成一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒,合成方法简单,原料便宜易得,制备的颗粒粒径均一,生物安全性好。
其中,壳聚糖是自然界唯一的阳离子天然多糖,具有抗菌抗氧化、提高免疫力、抗炎抗癌的功能,由于其毒性小、可降解、带正电、具有一定的缓释功能被广泛用于纳米载体体系,壳聚糖可以作为软模板通过氧化还原反应制备出均一,分散、较为稳定的硒纳米颗粒,实现药物的靶向吸收和体内半衰期延长。
单宁酸又称鞣酸、丹宁,颜色呈淡黄色,易溶于水和乙醇,是一种广泛存在于植物中的多酚,其结构中富含的酚羟基可以和金属离子络合,并形成致密的膜。
本发明的优势在于:
1)提出无药物负载策略,首次在硒纳米颗粒上包覆金属多酚,制备出单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
2)合成过程简单方便,快捷易操作。
3)制备出的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的直径为100纳米左右,细胞毒性小,具有良好的生物相容性。
附图说明
下面通过参考附图并结合实例具体地描述本发明,本发明的优点和实现方式将会更加明显,其中附图所示内容仅用于对本发明的解释说明,而不构成对本发明的任何意义上的限制,在附图中:
图1是实施例1制备的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的透射电子显微镜照片(其中:A、C为壳聚糖分散的纳米硒透射电子显微镜照片,B、D为包裹上单宁酸-锌的纳米硒透射电子显微镜照片);
图2是实施例1单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒EDX能谱mapping图;(其中:A为明场,B为颗粒中Se元素的分布,C为颗粒中Zn元素的分布,D为颗粒中的混合分布);
图3是实施例1单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的粒径、电位图(A为粒径图,B为电位图);
图4是实施例1单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的细胞毒性图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效,兹例举以下实施例,并配合附图1至4说明如下:
实施例1:
S1、配置壳聚糖5mg/ml,1%乙酸水溶液1ml,搅拌至完全溶解;
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml,常温过夜搅拌;
S3、配置20mM的抗坏血酸水溶液,加入1ml,用超纯水补齐到10ml,常温条件下于500rpm/min搅拌反应1小时,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,超纯水透析24h;
S4、待透析结束,取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中,加入24mM单宁酸水溶液0.5mL,涡旋5s;加入18.72mM硝酸锌水溶液0.5mL,涡旋5s,接着超声3min;
S5、超声结束后,14000rpm离心4min,用超纯水洗涤沉淀2次,得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
将制备的纳米硒颗粒和单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒分别制样,透射电子显微镜观察形貌。
实施例2:
S1、配置壳聚糖10mg/ml,1%乙酸水溶液1ml,搅拌至完全溶解;
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml,常温过夜搅拌;
S3、配置80mM的抗坏血酸水溶液,加入1ml,用超纯水补齐到10ml,常温条件下于500rpm/min搅拌反应2小时,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,超纯水透析24h;
S4、待透析结束,取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中,加入24mM单宁酸水溶液0.75mL,涡旋10s;加入18.72mM硝酸锌水溶液0.75mL,涡旋10s,接着超声3min;
S5、超声结束后,15000rpm离心5min,用超纯水洗涤沉淀3次,得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
实施例3:
S1、配置壳聚糖20mg/ml,1%乙酸水溶液1ml,搅拌至完全溶解;
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml,常温过夜搅拌;
S3、配置40mM的抗坏血酸水溶液,加入1ml,用超纯水补齐到10ml,常温条件下于500rpm/min搅拌反应3小时,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,超纯水透析24h;
S4、待透析结束,取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中,加入24mM单宁酸水溶液1mL,涡旋20s;加入18.72mM硝酸锌水溶液1mL,涡旋20s,接着超声3min;
S5、超声结束后,16000rpm离心6min,用超纯水洗涤沉淀4次,得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
实施例4:
S1、配置壳聚糖40mg/ml,1%乙酸水溶液1ml,搅拌至完全溶解。
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml,常温过夜搅拌;
S3、配置60mM的抗坏血酸水溶液,加入1ml,用超纯水补齐到10ml,常温条件下于500rpm/min搅拌反应4小时,将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中,超纯水透析24h;
S4、待透析结束,取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中,加入24mM单宁酸水溶液1.5mL,涡旋30s;加入18.72mM硝酸锌水溶液1.5mL,涡旋30s,接着超声3min;
S5、超声结束后,17000rpm离心7min,用超纯水洗涤沉淀5次,得到单宁酸-锌配位的纳米硒颗粒。
针对实施例1的结果,本发明进行如下分析:
如图1所示,进行形貌分析,可以明显观察到B、D电镜图中的颗粒表面覆盖一层薄膜,说明单宁酸、锌涂层成功络合上去,且颗粒大小均一,分散性较好。
如图2所示,通过D图可以发现Se和Zn元素均匀地分布在颗粒上,也是说明这两种元素都存在于颗粒当中。
如图3所示,A图纵坐标为平均粒径,B图纵坐标为ZETA电位,从图中可看出纳米硒颗粒粒径在80nm左右,电位为+30mV左右,最终的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒具有110nm左右的粒径,+5mV的电位,便于被细胞内吞更好地发挥作用,具有良好的生物相容性。
MTT法测试单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的细胞毒性:
(1)取处于对数生长期的小鼠单核巨噬细胞,消化完后对细胞进行计数,使其浓度为5×104/m1,植入96孔板中,在37℃,5%CO2培养箱中培养24h。
(2)24h后弃掉旧培养基,加入200μl含有不同硒浓度(5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、125μM、150μM)的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒溶液加入到新鲜培养基中,并在37℃,5%CO2培养箱中共培养24h。
(3)24h后弃掉旧培养基,向每个孔中加入100μl MTT溶液,在37℃,5%CO2培养箱中继续培养4h后,小心吸取培养孔中的培养基,向每个孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液,锡纸包裹置于摇床上摇动10min,使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。
(4)将上述含DMSO的96孔板置于酶标仪中,选择滤光片(570nm)。测定各孔的吸光值,计算各组相对Control组的细胞存活率。
细胞存活率(%)=实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100%。
可见,本发明采用MTT法测试该颗粒对RAW264.7细胞的毒性,评价单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的生物安全性。
如图4所示,根据不同浓度硒(横坐标)细胞组计算的存活率(纵坐标)做出纳米颗粒细胞毒性分析柱状图。
结果表明,CS-Se-TA-Zn NPs的浓度与其对RAW264.7细胞的细胞毒性基本呈线性关系。虽然浓度越高,对细胞的毒性越大,但当Se浓度达到150μM(较高浓度)时,RAW264.7细胞存活率仍然保持在80%左右,说明本发明具有良好的生物相容性。
从上述实例中看出,我们已经成功制备出了分散性好、颗粒均一的、生物相容性好,直径为110纳米左右的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒(同时,单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒具有多种功能,例如可以清除ROS,抗炎抗氧化)。
以上对本发明的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
Claims (8)
1.一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1、配置壳聚糖5~40mg/ml,1%乙酸水溶液1体积份,搅拌至完全溶解;
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1体积份,常温过夜搅拌;
S3、配置20~80mM的抗坏血酸水溶液,加入1体积份,用超纯水补齐到10体积份,搅拌反应后,将混合溶液加入透析袋中,超纯水透析;
S4、待透析结束,取1.5体积份纳米硒溶液置于离心管中,加入24mM单宁酸水溶液0.5~1.5体积份,涡旋;再加入18.72mM硝酸锌水溶液0.5~1.5体积份,涡旋后超声;
S5、超声结束后将溶液进行离心,用超纯水洗涤沉淀,得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:在步骤S3中,常温条件下于500rpm/min搅拌反应1~4小时。
3.根据权利要求1所述的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:在步骤S3中,所述透析袋采用截留分子量为8-14kDa的透析袋。
4.根据权利要求1所述的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:在步骤S3中,超纯水透析时间为24h。
5.根据权利要求1所述的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:在步骤S4中,涡旋时间为5~30s,超声时间为3min。
6.根据权利要求1所述的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:在步骤S5中,离心转速为14000~17000rpm,离心时间为4~7min。
7.根据权利要求1所述的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:在步骤S5中,用超纯水洗涤沉淀洗2~5次。
8.根据权利要求1所述的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法,其特征在于:在步骤S1中,所述壳聚糖采用分子量为30000的壳聚糖。
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