CN115919801B - 一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单宁酸‑锌配位的壳聚糖‑硒纳米颗粒的制备方法，属于纳米医药技术领域，本发明利用壳聚糖为分散剂，通过调整壳聚糖的含量以及亚硒酸钠和抗坏血酸的比例，充分控制颗粒粒径的大小，制备出粒径在50‑100纳米的硒颗粒；再将单宁酸和锌离子同时引入到体系中，使硒颗粒表面覆盖一层金属多酚的薄膜，形成一种单宁酸‑锌配位的壳聚糖‑硒纳米颗粒。本发明合成方法简单，原料便宜易得，制备的颗粒粒径均一，生物安全性好。
Description
技术领域
本发明属于纳米医药技术领域，尤其是涉及单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法。
背景技术
硒作为人体中必不可少的微量元素之一，主要有三种存在形式：有机硒、无机硒和单质硒，其中0价态的纳米硒由于生物相容性好、生物利用度高，兼具抗炎、抗氧化、抗癌的作用，成为了纳米医学里一种非常有潜力的材料。纳米硒的合成方法有三种，分别是：物理法、化学法和生物法，在生物医学领域内由于要合成毒性小，活性高的颗粒，因此，化学法和生物法是两种常见的方法。
化学合成法是指利用抗坏血酸或谷胱甘肽等还原剂将硒酸盐还原，得到纳米尺度的红色单质硒。该方法操作过程简单、制备速度快、成本价格低，因此是合成纳米硒最常用的方法之一。同时，在制备时加入一些生物分子(一般是多糖、蛋白质或多肽类)作为软模板，形成“纳米硒-软模板”结构的复合物，能够起到防止纳米硒团聚，且防止其转变成灰黑色单质硒的作用。
然而目前并没有将纳米硒和金属多酚这两种材料结合在一起的报道，为了克服纳米硒不稳定，易聚集的特点，我们利用壳聚糖分散纳米硒，并在纳米硒颗粒上包裹单宁酸-锌的金属多酚涂层，将两者较好地结合在一起，从而发挥更多的疗效功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1、配置壳聚糖5～40mg/ml，1％乙酸水溶液1体积份，搅拌至完全溶解；
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1体积份，常温过夜搅拌；
S3、配置20～80mM的抗坏血酸水溶液，加入1体积份，用超纯水补齐到10体积份，常温条件下搅拌反应，将混合溶液加入透析袋中，超纯水透析；
S4、待透析结束，取1.5体积份纳米硒溶液置于离心管中，加入24mM单宁酸水溶液0.5～1.5体积份，涡旋；再加入18.72mM硝酸锌水溶液0.5～1.5体积份，涡旋后超声；
S5、超声结束后的溶液进行离心，用超纯水洗涤沉淀，得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
进一步地，在步骤S3中，常温条件下于500rpm/min搅拌反应1～4小时。
进一步地，在步骤S3中，所述透析袋采用截留分子量为8-14kDa的透析袋。
进一步地，在步骤S3中，超纯水透析时间为24h。
进一步地，在步骤S4中，涡旋时间为5～30s，超声时间为3min。
进一步地，在步骤S5中，离心转速为14000～17000rpm，离心时间为4～7min。
进一步地，在步骤S5中，用超纯水洗涤沉淀洗2～5次。
进一步地，在步骤S1中，所述壳聚糖采用分子量为30000的壳聚糖。
可见，本发明利用壳聚糖为分散剂，通过调整壳聚糖的含量以及亚硒酸钠和抗坏血酸的比例，充分控制颗粒粒径的大小，制备出粒径在50-100纳米的硒颗粒；再将单宁酸和锌离子同时引入到体系中，使硒颗粒表面覆盖一层金属多酚的薄膜，形成一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒，合成方法简单，原料便宜易得，制备的颗粒粒径均一，生物安全性好。
其中，壳聚糖是自然界唯一的阳离子天然多糖，具有抗菌抗氧化、提高免疫力、抗炎抗癌的功能，由于其毒性小、可降解、带正电、具有一定的缓释功能被广泛用于纳米载体体系，壳聚糖可以作为软模板通过氧化还原反应制备出均一，分散、较为稳定的硒纳米颗粒，实现药物的靶向吸收和体内半衰期延长。
单宁酸又称鞣酸、丹宁，颜色呈淡黄色，易溶于水和乙醇，是一种广泛存在于植物中的多酚，其结构中富含的酚羟基可以和金属离子络合，并形成致密的膜。
本发明的优势在于：
1)提出无药物负载策略，首次在硒纳米颗粒上包覆金属多酚，制备出单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
2)合成过程简单方便，快捷易操作。
3)制备出的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的直径为100纳米左右，细胞毒性小，具有良好的生物相容性。
附图说明
下面通过参考附图并结合实例具体地描述本发明，本发明的优点和实现方式将会更加明显，其中附图所示内容仅用于对本发明的解释说明，而不构成对本发明的任何意义上的限制，在附图中：
图1是实施例1制备的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的透射电子显微镜照片(其中：A、C为壳聚糖分散的纳米硒透射电子显微镜照片，B、D为包裹上单宁酸-锌的纳米硒透射电子显微镜照片)；
图2是实施例1单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒EDX能谱mapping图；(其中：A为明场，B为颗粒中Se元素的分布，C为颗粒中Zn元素的分布，D为颗粒中的混合分布)；
图3是实施例1单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的粒径、电位图(A为粒径图，B为电位图)；
图4是实施例1单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的细胞毒性图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图1至4说明如下：
实施例1：
S1、配置壳聚糖5mg/ml，1％乙酸水溶液1ml，搅拌至完全溶解；
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml，常温过夜搅拌；
S3、配置20mM的抗坏血酸水溶液，加入1ml，用超纯水补齐到10ml，常温条件下于500rpm/min搅拌反应1小时，将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中，超纯水透析24h；
S4、待透析结束，取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中，加入24mM单宁酸水溶液0.5mL，涡旋5s；加入18.72mM硝酸锌水溶液0.5mL，涡旋5s，接着超声3min；
S5、超声结束后，14000rpm离心4min，用超纯水洗涤沉淀2次，得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
将制备的纳米硒颗粒和单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒分别制样，透射电子显微镜观察形貌。
实施例2：
S1、配置壳聚糖10mg/ml，1％乙酸水溶液1ml，搅拌至完全溶解；
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml，常温过夜搅拌；
S3、配置80mM的抗坏血酸水溶液，加入1ml，用超纯水补齐到10ml，常温条件下于500rpm/min搅拌反应2小时，将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中，超纯水透析24h；
S4、待透析结束，取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中，加入24mM单宁酸水溶液0.75mL，涡旋10s；加入18.72mM硝酸锌水溶液0.75mL，涡旋10s，接着超声3min；
S5、超声结束后，15000rpm离心5min，用超纯水洗涤沉淀3次，得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
实施例3：
S1、配置壳聚糖20mg/ml，1％乙酸水溶液1ml，搅拌至完全溶解；
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml，常温过夜搅拌；
S3、配置40mM的抗坏血酸水溶液，加入1ml，用超纯水补齐到10ml，常温条件下于500rpm/min搅拌反应3小时，将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中，超纯水透析24h；
S4、待透析结束，取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中，加入24mM单宁酸水溶液1mL，涡旋20s；加入18.72mM硝酸锌水溶液1mL，涡旋20s，接着超声3min；
S5、超声结束后，16000rpm离心6min，用超纯水洗涤沉淀4次，得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒。
实施例4：
S1、配置壳聚糖40mg/ml，1％乙酸水溶液1ml，搅拌至完全溶解。
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1ml，常温过夜搅拌；
S3、配置60mM的抗坏血酸水溶液，加入1ml，用超纯水补齐到10ml，常温条件下于500rpm/min搅拌反应4小时，将混合溶液加入截留分子量为8-14kDa的透析袋中，超纯水透析24h；
S4、待透析结束，取1.5ml纳米硒溶液置于离心管中，加入24mM单宁酸水溶液1.5mL，涡旋30s；加入18.72mM硝酸锌水溶液1.5mL，涡旋30s，接着超声3min；
S5、超声结束后，17000rpm离心7min，用超纯水洗涤沉淀5次，得到单宁酸-锌配位的纳米硒颗粒。
针对实施例1的结果，本发明进行如下分析：
如图1所示，进行形貌分析，可以明显观察到B、D电镜图中的颗粒表面覆盖一层薄膜，说明单宁酸、锌涂层成功络合上去，且颗粒大小均一，分散性较好。
如图2所示，通过D图可以发现Se和Zn元素均匀地分布在颗粒上，也是说明这两种元素都存在于颗粒当中。
如图3所示，A图纵坐标为平均粒径，B图纵坐标为ZETA电位，从图中可看出纳米硒颗粒粒径在80nm左右，电位为+30mV左右，最终的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒具有110nm左右的粒径，+5mV的电位，便于被细胞内吞更好地发挥作用，具有良好的生物相容性。
MTT法测试单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的细胞毒性：
(1)取处于对数生长期的小鼠单核巨噬细胞，消化完后对细胞进行计数，使其浓度为5×104/m1，植入96孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
(2)24h后弃掉旧培养基，加入200μl含有不同硒浓度(5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、125μM、150μM)的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒溶液加入到新鲜培养基中，并在37℃，5％CO2培养箱中共培养24h。
(3)24h后弃掉旧培养基，向每个孔中加入100μl MTT溶液，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后，小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，锡纸包裹置于摇床上摇动10min，使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。
(4)将上述含DMSO的96孔板置于酶标仪中，选择滤光片(570nm)。测定各孔的吸光值，计算各组相对Control组的细胞存活率。
细胞存活率(％)＝实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100％。
可见，本发明采用MTT法测试该颗粒对RAW264.7细胞的毒性，评价单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的生物安全性。
如图4所示，根据不同浓度硒(横坐标)细胞组计算的存活率(纵坐标)做出纳米颗粒细胞毒性分析柱状图。
结果表明，CS-Se-TA-Zn NPs的浓度与其对RAW264.7细胞的细胞毒性基本呈线性关系。虽然浓度越高，对细胞的毒性越大，但当Se浓度达到150μM(较高浓度)时，RAW264.7细胞存活率仍然保持在80％左右，说明本发明具有良好的生物相容性。
从上述实例中看出，我们已经成功制备出了分散性好、颗粒均一的、生物相容性好，直径为110纳米左右的单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒(同时，单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒具有多种功能，例如可以清除ROS，抗炎抗氧化)。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
Claims (1)
1.一种单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、配置壳聚糖5～40mg/ml，1%乙酸水溶液1体积份，搅拌至完全溶解；
S2、加入20mM亚硒酸钠水溶液1体积份，常温过夜搅拌；
S3、配置20～80mM的抗坏血酸水溶液，加入1体积份，用超纯水补齐到10体积份，搅拌反应后，将混合溶液加入透析袋中，超纯水透析；
S4、待透析结束，取1.5体积份纳米硒溶液置于离心管中，加入24mM单宁酸水溶液0.5～1.5体积份，涡旋；再加入18.72mM硝酸锌水溶液0.5～1.5体积份，涡旋后超声；
S5、超声结束后将溶液进行离心，用超纯水洗涤沉淀，得到单宁酸-锌配位的壳聚糖-硒纳米颗粒；
在步骤S3中，常温条件下于500rpm/min搅拌反应1～4小时；
在步骤S3中，所述透析袋采用截留分子量为8-14kDa的透析袋；
在步骤S3中，超纯水透析时间为24h；
在步骤S4中，涡旋时间为5～30s，超声时间为3min；
在步骤S5中，离心转速为14000~17000 rpm，离心时间为4～7min；在步骤S5中，用超纯水洗涤沉淀洗2～5次；
在步骤S1中，所述壳聚糖采用分子量为30000的壳聚糖。
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