CN113289008B - 铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料及其制备方法与应用 - Google Patents

铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜掺杂血红蛋白‑聚多巴胺纳米材料及其制备方法与应用。所述制备方法包括：使包含血红蛋白、盐酸多巴胺、二价铜离子、氧化剂和溶剂的混合反应体系反应，制得铜掺杂血红蛋白‑聚多巴胺纳米材料。本发明制备的铜掺杂血红蛋白‑聚多巴胺纳米材料产率高，水溶性和分散性良好，将其用作抗菌剂，能在弱酸性环境下，利用该复合材料中二价铜离子与血红蛋白的芬顿催化产生羟基自由基活性氧，达到高效、协同抗菌的作用。

Description

铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于金属掺杂纳米材料技术领域，具体涉及一种铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料及其制备方法与应用。
背景技术
由于抗生素滥用导致的细菌耐药性及抗生素污染等问题，对人类健康及长久发展构成了严重威胁。多重耐药菌的感染使得以抗生素为主流的抗菌药物逐渐失去效力，更不幸的是，新抗生素的发掘速度远远落后于细菌耐药性的发展。目前，新型抗生素的发展已基本处于停滞状态，因此，研究非抗生素的抗菌体系对人类健康具有重大意义。
目前，非抗生素体系主要包括有机和无机抗菌剂两大类，其中以Ag+、Cu2+、Zn2+等离子/化合物为有效成分的无机抗菌剂具有高效的抗菌能力，有着越来越广泛的应用，但这些材料多存在着抗菌效果不持久的缺点。
近年来，随着纳米科学的发展，人们对于纳米材料抗菌剂的开发做出了大量探索。与传统抗生素对比，金属纳米颗粒、贵金属纳米颗粒、碳纳米材料(石墨烯、碳纳米管、富勒烯等)、TiO2纳米颗粒及阳离子聚合物等有着良好的抗菌性能且不容易引起细菌耐药性。但这类纳米材料多涉及贵金属，或制备条件较高且具有较高生物毒性。因而，开发合成简单、成本低、抗菌性能优异的纳米材料具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的制备方法，其包括：
使包含血红蛋白、盐酸多巴胺、二价铜离子、氧化剂和溶剂的混合反应体系反应，制得铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料包括聚多巴胺、血红蛋白以及二价铜离子，所述血红蛋白和二价铜离子(Cu(II))包覆于聚多巴胺中。
本发明实施例还提供了前述的铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料在制备抗菌剂中的用途。
本发明实施例还提供了一种抗菌方法，其包括：在弱酸性条件下，利用前述的铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料抑制细菌的生。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明以盐酸多巴胺、血红蛋白和二价铜离子为原料，通过简单的一步法合成了铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料，该纳米材料水溶性良好，并且在弱酸性环境下表现出类过氧化物酶催化活性，可以催化过氧化氢分解产生活性氧(羟基自由基)并且缓释出二价铜离子，有效抑制细菌的生长，解决了现有基于纳米材料的抑菌剂效果不持久，生物毒性高以及制备条件要求严格等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中制备的Cu@Hb-PDA的透射电镜表征图；
图2是本发明实施例1中制备的Cu@Hb-PDA与多巴胺、血红蛋白的紫外吸收对比图；
图3是本发明实施例1中制备的Cu@Hb-PDA与多巴胺、血红蛋白的红外对比图；
图4a-图4c为本发明实施例1中制备的Cu@Hb-PDA的类过氧化物酶催化性能表征图；
图5为本发明实施例1中制备的Cu@Hb-PDA与对比例1、2、3对金黄葡萄球菌处理后菌的增殖对比图；
图6为本发明实施例1中制备的Cu@Hb-PDA在水中的分散图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一个方面提供了一种铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的制备方法，其包括：
使包含血红蛋白、盐酸多巴胺、二价铜离子、氧化剂和溶剂的混合反应体系反应，制得铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：
将血红蛋白(Hb)、盐酸多巴胺与溶剂混合形成混合溶液，其中所述混合溶液的pH值为1.0～7.0：
以及，将二价铜离子与氧化剂加入所述混合溶液形成所述混合反应体系，并于0～40℃搅拌反应6～48h，制得所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(记为Cu@Hb-PDA)。
作为优选方案，采用酸性物质调节所述混合溶液的pH值为1.0～7.0，优选pH值为5.0。
作为优选方案，所述酸性物质包括稀盐酸，且不限于此。
作为优选方案，所述二价铜离子来源于氯化铜、硫酸铜、醋酸铜中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
作为优选方案，所述氧化剂包括过氧化氢、次氯酸钠、过硫酸铵中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
作为优选方案，所述溶剂包括水，且不限于此。
作为优选方案，所述血红蛋白与盐酸多巴胺的质量比为0.2～1∶1；
作为优选方案，所述氧化剂与盐酸多巴胺的摩尔比为1∶5～15。
作为优选方案，所述混合反应体系反应中二价铜离子的浓度为0.5～5.0mmol/L。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法还包括：在所述反应完成后，对所获混合物进行离心、洗涤、分离、干燥处理。
作为优选方案，在所述反应完成后，将所获铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料保存于弱酸性水溶液中。
在一些更为为具体的实施方案中，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的制备方法具体包括：
将盐酸多巴胺溶液、血红蛋白溶液与二价铜离子溶液混合得到第一混合物，在持续搅拌条件下缓慢滴加氧化剂溶液得到第二混合物；反应后体系离心处理并取沉淀，多次洗涤后冷冻干燥，即得到铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(记为Cu@Hb-PDA)。
进一步的，所述第一混合物的水溶液介质为去离子水，并用稀盐酸调节pH值至5。
进一步的，所述离心处理的转速为3000～13000rpm。
进一步的，所述洗涤处理包括：将离心后沉淀用pH值为5的稀盐酸溶液洗涤2～3次。
进一步的，所述干燥处理包括冷冻干燥，所述冷冻干燥处理的时间为12～48h。
进一步的，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的粒径为40～200nm。
本发明中铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的制备方法中弱酸性的合成环境保持二价铜离子的稳定性，并提高了二价铜离子掺杂量。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料包括聚多巴胺(PDA)、血红蛋白(Hb)以及二价铜离子(Cu(II))，所述血红蛋白和二价铜离子包覆于聚多巴胺中。
作为优选方案，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料中二价铜离子的含量为0.1％～5.0wt％。
作为优选方案，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的粒径为40～200nm。
作为优选方案，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料对金黄葡萄球菌(ATCC25923)具有良好的抗细菌性能。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料在制备抗菌剂中的用途。
作为优选方案，所述抗菌剂具有抗金黄葡萄球菌的功能。
本发明中，通过盐酸多巴胺的自聚合过程中将血红蛋白和二价铜离子包覆在一起形成复合纳米材料。
本发明中的铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料中引入的血红蛋白和二价铜离子作为芬顿反应试剂，在弱酸性条件下催化菌内源性过氧化氢分解产生活性氧致细菌死亡。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种抗菌方法，其包括：在弱酸性条件下，利用前述的铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料抑制细菌的生长。
进一步的，所述细菌包括金黄葡萄球菌，且不限于此。
多巴胺作为贻贝黏附蛋白的衍生物，由于其具有良好的生物相容性和自聚交联性可用于纳米药物载体的构建并达到药物缓释的效果，也有通过多巴胺子聚物理包埋实现材料表面抗菌改性的方法；血红蛋白是一种以铁卟啉结构为核心的生理氧运输金属蛋白，其铁卟啉结构使其成为天然的芬顿试剂，可以催化内源性的过氧化氢分解产生OH·自由基，用于选择性和有效性的癌症治疗。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1
称取40mg血红蛋白溶于5mL的去离子水中，再称取100mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的氯化铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加75mM的次氯酸钠溶液1mL，将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应12h后离心水洗三次，产物冻干定量得到黑色粉末，即铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(Cu@Hb-PDA)。
性能表征：
通过透射电镜、紫外分光光度计及傅里叶红外光谱仪进行材料表征：图1为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA的透射电镜表征图；图2为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA与多巴胺、血红蛋白的紫外吸收对比图；图3为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA与多巴胺、血红蛋白的红外对比图；图6为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA在水中不同浓度的分散图，可以看出实施例1制备的Cu@Hb-PDA有很好的水溶性；
对实施例1合成的Cu@Hb-PDA进行类过氧化物酶活性表征如图4a-4c所示(H2O2/TMB显色法)：图4a为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA的类过氧化物酶性能验证；图4b为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA在不同pH下的类过氧化物酶催化性能研究图；图4c为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA纳米粒子对不同浓度H2O2的催化显色-紫外吸收图。
对比例1
无铜掺杂的Hb-PDA纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
称取20mg血红蛋白溶于5mL的去离子水中，再称取100mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的氯化铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加1M的过氧化氢溶液100μL。将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应12h后离心水洗三次，冻干定量得到黑色粉末，产物记为Hb-PDA。
对比例2
无血红蛋白对比例：称取100mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的氯化铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加75mM的次氯酸钠溶液1mL，将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应12h后离心水洗三次，产物冻干定量得到黑色粉末，产物记为Cu@PDA。
对比例3
聚多巴胺对比例：称取100mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的氯化铜溶液并搅拌均匀，将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应12h；超滤并水洗3次，产物记为PDA。
抗菌性能测试：
以实施例1所制得的纳米粒子为样品，并以对比例1、2、3制备的纳米粒子作为对照组，采用平板计数法考察Cu@Hb-PDA纳米粒子及PDA、Hb-PDA、Cu@PDA纳米粒子的抗金黄葡萄球菌的效果。具体实施方案如下：
实验组：从平板挑取一个单菌落到3mL的LB培养基中，37℃恒温摇床180rpm过夜培养18h，然后将上述菌液取100μL至稀释到3mL的LB培养基中，37℃恒温摇床180rpm震荡4h活化菌落，通过OD值标定细菌浓度为108CFU/mL。进一步将上述细菌稀释102与Cu@Hb-PDA纳米粒子(20μg/mL)+H2O2(50μM)混合，37℃孵育3h(HAc/NaAc，pH＝5/10mM)。取孵育后的菌液用LB培养基稀释102倍置于37℃恒温摇床中180rpm孵育，6h后测定菌液OD600吸收，用于绘制增殖对比图。对照组设置为缓冲对照组：PBS(10mM，pH＝7.4)、HAc/NaAc(10mM，pH＝5)；单因素对照组：H2O2(50μM)、Cu@Hb-PDA(20μg/mL)；三组纳米材料对照组：PDA纳米粒子(20μg/mL)+H2O2(50μM)，Hb-PDA纳米粒子(20μg/mL)+H2O2(50μM)，Cu@PDA纳米粒子(20μg/mL)+H2O2(50μM)。
图5为实施例1中制备的Cu@Hb-PDA与对比例1、2、3对照组对金黄葡萄球菌处理后菌的增殖对比图(通过OD600定量)，可看出实施例制备的Cu@Hb-PDA抗菌性能更为优异。
实施例2
改变氧化剂类型：称取20mg血红蛋白溶于5mL的去离子水中，再称取100mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的氯化铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加1M的过氧化氢溶液100μL。将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应12h后离心水洗三次，产物冻干定量得到黑色粉末，即铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(Cu@Hb-PDA)。
实施例3
改变血红蛋白与盐酸多巴胺的质量比：称取20mg血红蛋白溶于5mL的去离子水中，再称取40mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的氯化铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加75mM的次氯酸钠溶液1mL。将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应12h后离心水洗三次，产物冻干定量得到黑色粉末，即铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(Cu@Hb-PDA)。
实施例4
改变铜源与氧化剂类型：称取40mg血红蛋白溶于5mL的去离子水中，再称取100mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的醋酸铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加1M的过氧化氢溶液100μL。将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应12h后离心水洗三次，产物冻干定量得到黑色粉末，即铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(Cu@Hb-PDA)。
实施例5
称取40mg血红蛋白溶于5mL的去离子水中，再称取40mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的硫酸铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加75mM的过硫酸铵溶液1mL，将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应6h后离心水洗三次，产物冻干定量得到黑色粉末，即铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(Cu@Hb-PDA)。
实施例6
称取40mg血红蛋白溶于5mL的去离子水中，再称取100mg盐酸多巴胺溶于10mL的去离子水中，混合均匀并用0.5M盐酸调节pH至5；加入300μL的100mM的醋酸铜溶液并搅拌均匀，再缓慢滴加75mM的次氯酸钠溶液1mL，将上述混合物置于磁力搅拌器上750rpm搅拌反应48h后离心水洗三次，产物冻干定量得到黑色粉末，即铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料(Cu@Hb-PDA)。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料在制备抗菌剂中的用途，其特征在于：所述抗菌剂具有抗金黄色葡萄球菌的功能；所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料由聚多巴胺、血红蛋白以及二价铜离子组成，所述血红蛋白和二价铜离子包覆于聚多巴胺中；所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料中二价铜离子含量为0.1%~5.0wt%；所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的粒径为40~200nm；
其中，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的制备方法包括：
将血红蛋白、盐酸多巴胺与溶剂混合形成混合溶液，其中所述混合溶液的pH值为1.0~7.0；
以及，将二价铜离子与氧化剂加入所述混合溶液形成所述混合反应体系，并于0~40℃搅拌反应6~48h，制得铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料；
所述溶剂为水；所述血红蛋白与盐酸多巴胺的质量比为0.2~1:1；所述氧化剂与盐酸多巴胺的摩尔比为1:5~15；所述混合反应体系反应中二价铜离子的浓度为0.5~5.0mmol/L。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：采用酸性物质调节所述混合溶液的pH值为1.0~7.0，其中，所述酸性物质为盐酸。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述二价铜离子来源于氯化铜、硫酸铜、醋酸铜中的任意一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述氧化剂选自过氧化氢、次氯酸钠、过硫酸铵中的任意一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的制备方法还包括：在所述反应完成后，对所获混合物进行离心、洗涤、分离、干燥处理。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料的制备方法还包括：在所述反应完成后，将所获铜掺杂血红蛋白-聚多巴胺纳米材料保存于弱酸性水溶液中。
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