CN110507809A - 一种谷胱甘肽脂质体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供一种谷胱甘肽脂质体的制备方法，涉及生物技术领域。该方法包括：将磷脂、胆固醇和磷脂酰甘油按照1～4：1：0.5～2混合，并按照质量比1：1～5将混合液与溶剂混合，得到类脂溶液；按质量百分比取70～80％的类脂溶液、5～15％的谷胱甘肽溶液和1～5％的葡萄糖溶液混合，得到W/O型乳化液；谷胱甘肽溶液的浓度为1～5g/L，葡萄糖溶液的浓度为1～5g/L；在W/O型乳化液中加入磷酸缓冲液，并在温度为20‑45℃的条件下水合0.5‑3h，得到谷胱甘肽脂质体的悬液，分离，得到谷胱甘肽脂质体。在制备过程中通过两次乳化，得到的谷胱甘肽脂质体包封率、脂质体载药量及脂质体稳定性均得到了显著提高。

Description

一种谷胱甘肽脂质体的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种谷胱甘肽脂质体的制备方法。

背景技术

谷胱甘肽是一种活性短肽，由三个氨基酸(L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸)经肽键缩合而成。谷胱甘肽主要以两种形态存在，即还原型(GSH)和氧化型(GSSG)。还原型谷胱甘肽的分子量(307.32)，外观为白色或无色的细长柱状透明晶体，易溶于水、液氨及稀醇，微溶或难溶于丙酮和96％的乙醇等有机溶剂。GSH水溶液极易被空气中的氧所氧化，固体GSH较为稳定。

基于GSH的结构特点，它可通过巯基与体内自由基的结合，减轻自由基对生物体重要器管的损害，因此具有解毒、抗氧化、促进肝酶活性、保护肝细胞膜等功能。在糖尿病治疗中，能治疗糖尿病引起的骨质疏松，保护成骨细胞的同时促进骨损失部位的修复。它还是许多酶反应的辅基，如通过参与机体内三羧酸循环过程及糖类的代谢起到消除疲劳、解毒和预防癌症、糖尿病等作用。GSH还可增强消化系统、呼吸系统、肝功能和新陈代谢以及迅速提高生物体免疫力等。在器官移植中GSH能降低排斥反应，增加器官移植的存活率。GSH也被发现有改善性功能和抑制艾滋病病毒的作用。GSH还能与其它物质结合形成保健或治疗类药物，如与治疗肿瘤的药物配合使用，可以降低抗癌药物对肝脏和肾脏的毒性和增强药物的作用效果。GSH不仅可广泛应用于医药领域，而且可广泛应用于化学、医学、生物学和生物化学的检测中。

GSH可起到提高运动能力、防止运动损伤和消除运动疲劳的作用，还可以提高生物体内血红蛋白的抗氧化力及含量、保护体内红细胞免受氧化性的损坏。因此，GSH可以治疗体育的运动损伤或作为体育保健品。在食品工业中，谷胱甘肽可作为营养调节剂，增强鱼、肉类的风味并延长其保鲜期；加入酸奶类产品中能起到抗氧剂的作用；加入酪蛋白、奶粉、水果蔬菜类食品能够有效地防止褐变，能保持原有的营养和风味；加入面制品中，能还原和强化氨基酸、提高面制品的新鲜度。它还能作为葡萄酒的起泡剂，延长啤酒的保鲜期。谷胱甘肽也能应用于水产养殖中。如将谷胱甘肽添加在饲料中，可促进细胞与组织的新陈代谢，使软骨和骨骼生长，从而对动物的生长发育产生积极的影响。也可以降低黄曲霉毒素、微囊藻毒素、重金属和过氧化物等有毒物质对水产生物的毒性，增强水产生物的抗氧化能力。

但是，谷胱甘肽是水溶性、小分子短肽。它在空气中易氧化、不易透过细胞膜、生物利用率低，在实际应用中，将其制为谷胱甘肽脂质体。然而，现有的谷胱甘肽脂质体由于包封率、脂质体载药量及脂质体稳定性差影响了其使用。

发明内容

本发明提供一种谷胱甘肽脂质体的制备方法，旨在解决现有的谷胱甘肽脂质体由于包封率、脂质体载药量及脂质体稳定性差影响其使用的问题。

本发明提供一种谷胱甘肽脂质体的制备方法，包括：

将磷脂、胆固醇和磷脂酰甘油按照1～4：1：0.5～2混合，并按照质量比1：1～5将混合液与溶剂混合，得到类脂溶液；

按质量百分比取70～80％的类脂溶液、5～15％的谷胱甘肽溶液和1～5％的葡萄糖溶液混合，得到W/O型乳化液；其中，谷胱甘肽溶液的浓度为1～5g/L，葡萄糖溶液的浓度为1～5g/L；

在W/O型乳化液中加入磷酸缓冲液，并在温度为20-45℃的条件下水合0.5-3h，得到谷胱甘肽脂质体的悬液，置于3～8℃的冰箱中。

本发明提供的一种谷胱甘肽脂质体的制备方法，在制备过程中通过两次乳化，得到的谷胱甘肽脂质体包封率、脂质体载药量及脂质体稳定性均得到了显著提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。

图1是本发明制备的谷胱甘肽脂质体溶液的直观图；

图2是本发明制备的谷胱甘肽脂质体溶液显微镜测试图；

图3是本发明制备的谷胱甘肽脂质体溶液的粒径测试图；

图4是本发明制备的谷胱甘肽脂质体在4℃下保存4周后的显微镜测试图；

图5是本发明制备的谷胱甘肽脂质体在4℃下保存4周的浊度变化图；

图6是本发明制备的谷胱甘肽脂质体在4℃下保存4周的粒径变化图；

图7是本发明制备的谷胱甘肽脂质体在4℃下保存4周的泄漏率变化图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的谷胱甘肽脂质体的制备方法，该方法包括：

步骤一、将磷脂、胆固醇和磷脂酰甘油按照1～4：1：0.5～2混合，并按照质量比1：1～5将混合液与溶剂混合，得到类脂溶液；

步骤二、按质量百分比取70～80％的类脂溶液、5～15％的谷胱甘肽溶液和1～5％的葡萄糖溶液混合，得到W/O型乳化液；

其中，谷胱甘肽溶液的浓度为1～5g/L，葡萄糖溶液的浓度为1～5g/L；

步骤三、在W/O型乳化液中加入磷酸缓冲液，并在温度为20-45℃的条件下水合0.5-3h，得到谷胱甘肽脂质体的悬液，分离，得到谷胱甘肽脂质体。

本发明提供的一种谷胱甘肽脂质体的制备方法，在制备过程中通过两次乳化，得到的谷胱甘肽脂质体包封率、脂质体载药量及脂质体稳定性均得到了显著提高。

具体地，磷脂包括：质量百分比为50～90％的卵磷脂和合成类磷脂(PC类)，10～50％的负电荷磷脂。优选地，卵磷脂的质量百分比为80～90％，负电荷磷脂的质量百分比为10～15％

具体地，负电荷磷脂为磷脂酰甘油、、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或磷脂酸中的至少一种。需要说明的是，本发明中的磷脂酰甘油为PG类磷脂。

具体地，磷酸缓冲液包括质量比分别为0.5～2:1～5：50～1000的赖基酸、蔗糖和磷酸。优选地，质量比为1～2:1～3：100～500。

具体地，磷脂酰甘油的质量百分比浓度为10～50％，其中，磷脂酰甘油可以由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或磷脂酸替换。需要说明的是，本发明中的磷脂酰甘油为PG类磷脂。

进一步地，该方法还包括：

将谷胱甘肽脂质体的悬液加入到凝胶微柱，再用PBS缓冲液冲洗，得到乳白色的谷胱甘肽脂质体。

具体地，溶剂为乙醇、乙醚、甲苯、氯仿、甲烷、醋酸甲酯、吡啶或丙酮中的任意一种。

优选地，磷脂、胆固醇和磷脂酰甘油按照质量比2～4：1：1～2。

优选地，谷胱甘肽溶液的质量百分比为10～15％。

一、实验方法

1、制备谷胱甘肽脂质体

将磷脂、胆固醇和磷脂酰甘油按照质量比1～4：1：0.5～2混合，并按照质量比1：1～5将混合液与氯仿/甲醇混合，得到类脂溶液，其中，磷脂包括：质量百分比为70～90％的卵磷脂和10～20％的负电荷磷脂，例如，二油酸-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)和二棕榈酸-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)，磷脂酰甘油的浓度为10～50％。

将100～2000mg的类脂溶液、50mg浓度为1～5g/L的谷胱甘肽溶液和2-10mg浓度为1～5g/L的葡萄糖溶液混合，超声50min，得到稳定的W/O型乳化液。

加入浓度为50mM的磷酸缓冲液(其中，赖基酸5-20mg，蔗糖10-50mg，pH为5.2-7.2)，超声40min，得到W/O/W型乳化剂。将乳化剂在旋转蒸发仪上，并在温度为20-45℃的条件下水合0.5-3h。其溶液定容到20mL，得到谷胱甘肽脂质体的悬液，并置于4℃冰箱保存。

2、谷胱甘肽脂质体的分离、纯化

利用Sephadex G-25凝胶微柱分离谷胱甘肽脂质体和游离的谷胱甘肽溶液。先用去离子水冲洗凝胶柱中，用0.1-0.5M NaOH活化凝胶柱，经水或缓冲液冲洗。取空白脂质体加入凝胶柱SephadexG-25饱和，再用PBS缓冲液冲洗，直至有乳白色的脂质体液体流出。经过柱后，脂质体回收率可达98％。

取GSH-脂质体溶液过凝胶柱，分离洗脱，收集含脂质体的乳液和含游离谷胱甘肽的洗脱液。

3、GSH脂质体的裂解

用10％Triton X‐100(曲拉通)处理GSH脂质体样品，完全裂解脂质体，并使其包封的GSH药物释放。

利用磷脂定量试剂盒和Ellman’S方法，分别测定脂质体含量和还原型谷胱甘肽含量。根据标准曲线计算出脂质体包封的GSH量和游离的GSH量，根据以下公式计算出包封率：

EE＝(Ce/Ct)x 100％

其中，EE为GSH脂质体包封率；Ce为包封的GSH量；Ct为GSH总含量＝包封的GSH量+游离的GSH量。

载药量：脂质体内包含谷胱甘肽的重量/脂质体总重量x 100％。

4、脂质体稳定性评估

将制备的谷胱甘肽脂质体在4℃下保存30天，测定保存期间脂质体的粒径、浊度、载药量变化，研究谷胱甘肽脂质体的稳定性。

二、结果与讨论

1、本发明所采用的方法中，采用低浓度的谷胱甘肽溶液(1g/L)，制备谷胱甘肽脂质体的包封率可达80％-93％。采用谷胱甘肽5-15mg，获得的谷胱甘肽脂质体包封率可达85％-93％，载药量0.1％-1％。提高谷胱甘肽与磷脂的比值(2000mg的类脂溶液、50mg浓度为5g/L的谷胱甘肽溶液混合)谷胱甘肽脂质体的包封率可达58％-85％，载药量5％-20％。说明在制备过程中，通过提高谷胱甘肽的含量可以提高包封率和药载量。

2、谷胱甘肽脂质体的质量评估

1)、制备得到的脂质体溶液为乳白色，将GSH脂质体乳液用磷酸缓冲液(pH 5.2-7.2)稀释，如图1所示，可见乳液清澈透明，透光性好，未见杂质或沉淀。

2)、在光学显微镜下观察谷胱甘肽脂质体，如图2所示，谷胱甘肽脂质体呈球形，大小均匀，分散性好，未见脂质体的聚集。

3)、将GSH脂质体悬液稀释，采用纳米粒度检测仪检测脂质体的粒径，如图3所示，可知谷胱甘肽脂质体粒径主要范围为200-400nm，粒径平均值为300nm。

3、谷胱甘肽脂质体的稳定性检测

将谷胱甘肽脂质体置于4℃保存4周，期间检测脂质体的泄露率、浊度、粒径等的变化。先通过肉眼观察脂质体乳液是否有明显的变化。经4℃保存的谷胱甘肽脂质体乳液并没有明显变化，无明显沉淀或分层现象；将其稀释，透光可见谷胱甘肽脂质体乳液仍呈清澈透明，透光性好，无明显杂质或沉淀。

1)、显微镜检测将保存在4℃的GSH脂质体进行显微镜观察。如图4所示，脂质体在4℃下保存4周后，其脂质体形状、大小未见明显变化，也未见聚集的脂质体。

2)、浊度变化将保存在4℃的GSH脂质体稀释，测定它们的OD400。如图5所示，在4℃保存4周的GSH脂质体溶液的浊度未发生明显改变。

3)粒径检测将保存在4℃的GSH脂质体取出并稀释，在粒度检测仪上测脂质体粒径，如图6所示，在4℃下保存4周的脂质体平均粒径变化不大。

以上表明，在4℃条件下保存的谷胱甘肽脂质体有较好的稳定性。

4、GSH脂质体泄漏率

将谷胱甘肽脂质体保存在4℃条件下4周，通过凝胶柱分离、脂质体裂解处理，间隔时间取样，测定谷胱甘肽脂质体包封量，并计算出4周期间内的脂质体药物泄露率。如图7所示，由图7可知，4℃保存4周的GSH脂质泄露率为3％-7％；表明4℃条件是保存谷胱甘肽脂质体的适宜温度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种谷胱甘肽脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括：

将磷脂、胆固醇和磷脂酰甘油按照质量比1～4：1：0.5～2混合，并按照质量比1：1～5将混合液与溶剂混合，得到类脂溶液；

按质量百分比取70～80％的类脂溶液、5～15％的谷胱甘肽溶液和1～5％的葡萄糖溶液混合，得到W/O型乳化液；其中，谷胱甘肽溶液的浓度为1～5g/L，葡萄糖溶液的浓度为1～5g/L；

在W/O型乳化液中加入磷酸缓冲液，并在温度为20-45℃的条件下水合0.5-3h，得到谷胱甘肽脂质体的悬液，分离，得到谷胱甘肽脂质体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂包括：质量百分比为50～90％的卵磷脂和合成类磷脂，10～50％的负电荷磷脂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述负电荷磷脂为磷脂酰甘油(PG类磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或磷脂酸中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸缓冲液包括质量比分别为0.5～2:1～5：50～1000的赖基酸、蔗糖和磷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂酰甘油的质量百分比浓度为10～50％，其中，磷脂酰甘油可以由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或磷脂酸替换。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括：

将谷胱甘肽脂质体的悬液加入到凝胶微柱，再用PBS缓冲液冲洗，得到乳白色的谷胱甘肽脂质体。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，溶剂为乙醇、乙醚、甲苯、氯仿、甲烷、醋酸甲酯、吡啶或丙酮中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，磷脂、胆固醇和磷脂酰甘油按照质量比2～4：1：1～2。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，谷胱甘肽溶液的质量百分比为10～15％。