CN105079778A - 一种谷胱甘肽微球的制备方法 - Google Patents

一种谷胱甘肽微球的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种谷胱甘肽微球的制备方法，涉及谷胱甘肽。1)将GSH溶解在SAL溶液中作为水相；油相为液体石蜡和石油醚混合物，混合物中含乳化剂，将烘干的SPG膜放入油相中超声，安装到SPG膜乳化器中，在氮气压力下水相通过SPG膜，进入到油相中，得SAL乳状液；2)将CaCl2溶液与步骤1)中的油相混合，搅拌超声后形成乳状液，再与步骤1)得到的SAL乳状液混合，搅拌后得乳白色乳状液，再离心，除去上清液，清洗，再除去上清液后，得到海藻酸钠-钙微球，抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂，然后将微球分散到O-CMC溶液中，得负载GSH的O-CMC-SAL微球，再抽滤，除去表面残留的O-CMC，干燥后即得谷胱甘肽微球。

Description

一种谷胱甘肽微球的制备方法
技术领域
本发明涉及谷胱甘肽，尤其是涉及一种谷胱甘肽微球的制备方法。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)属于含有巯基的小分子活性肽，广泛分布于机体中，是细胞内非蛋白硫氢基团主要的组成部分，在生物体内有着多种重要的生理功能，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用，具有延缓衰老、抗疲劳等作用，但是GSH极易被氧化，使其生理保健作用效果降低，微胶囊化GSH可以克服不同成分间的反应且可以对其起到保护作用，极大地保持谷胱甘肽的生理特性，提高其稳定性。
水凝胶体系是目前提高蛋白质以及多肽类药物体内稳定性以及实现肠道靶向释放的重要方法。水凝胶是一类具有亲水基团，能被水溶胀但不溶于水的具有三维网络结构的聚合物，能够感知外界刺激的微小变化，如温度、pH值、离子强度、电场、磁场等，通过体积的溶胀或收缩对刺激做出敏感性的相应。水凝胶的这一特点使它在生物医学领域、生物酶的固定等方面有广泛的应用前景。目前在蛋白质和多肽靶向输送中应用得最多的是pH敏感性水凝胶。壳聚糖-海藻酸钠水凝胶体系已被广泛用于蛋白质和多肽类药物的肠道靶向释放。
SPG膜乳化法主要用于制备尺寸均一的乳液、乳珠、微球、微胶囊等，可用于制备W/O、O/W、W/O/W、O/W/O不同乳液，实现乳液的尺寸均一性和可控性、微球表面功能的可控性和稳定性、多孔微球结构的可控性和稳定性；实现均一乳液大规模制备的可行性；多孔微球或缓释胶囊粒径的可控性等。SPG膜乳化法制备的微球，粒径范围为2～100μm，在各个领域都有广泛应用，在生物工程领域可以作为活性物质的分离介质，在药学领域可以作为控制药物释放的载体，在摄影领域可以作为固液态的调色剂等。其中药学和食品是膜乳化应用最广泛的领域，通过不同的制备方式将水溶性的抗癌药物包埋制备成微球或微囊，提高生物利用率，均一的乳液还可以有效保持食品风味和良好口感，掩盖住个别食品的刺激性气味等。
发明内容
本发明的目的是提供一种谷胱甘肽微球的制备方法。
本发明包括以下步骤：
1)将GSH溶解在SAL溶液中作为水相；油相为液体石蜡和石油醚混合物，所述混合物中含乳化剂，将烘干的SPG膜放入油相中超声，安装到SPG膜乳化器中，在氮气压力下水相通过SPG膜，进入到油相中，得SAL乳状液；
2)将CaCl2溶液与步骤1)中的油相混合，搅拌超声后形成乳状液，再与步骤1)得到的SAL乳状液混合，搅拌后，得乳白色乳状液，再离心，除去上清液，清洗，再除去上清液后，得到海藻酸钠-钙微球，抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂，然后将微球分散到O-CMC溶液中，得负载GSH的O-CMC-SAL微球，再抽滤，除去表面残留的O-CMC，干燥后即得谷胱甘肽微球。
在步骤1)中，所述SAL溶液可采用体积百分比为1.5％，pH为4.2的SAL溶液；所述油相中液体石蜡与石油醚的体积比可为7:5；所述乳化剂可采用PO-500乳化剂，所述乳化剂的含量按质量百分比可为液体石蜡和石油醚混合物的4％；所述超声的时间可为30min；所述SPG膜的孔径可为20μm；所制得的SAL乳状液为W/O型SAL乳状液，在SAL乳状液中水相与油相的体积比可为1∶10。
在步骤2)中，所述CaCl2溶液可采用体积百分比为2％，pH为6的CaCl2溶液；所述CaCl2溶液与油相的体积比可为1∶1；所述搅拌的条件可为300rmp下搅拌5h；所述清洗可采用石油醚离心清洗2次，离心的条件可为8000rmp下离心5min，20℃；所述抽滤清洗可采用去离子水抽滤清洗；所述O-CMC溶液的体积百分比浓度可为0.5％；所述再抽滤可采用去离子水抽滤；所述干燥可采用真空冷冻干燥24h。
本发明以海藻酸钠(sodiumalginate,SAL)和羧甲基壳聚糖(O-carboxymethylchitosan,O-CMC)为壁材，以CaCl2为交联剂,采用SPG膜乳化法制备谷胱甘肽微球，并对微球的形态结构及稳定性进行分析。
附图说明
图1为谷胱甘肽微球扫描电镜图。
图2为空微球、SGH微球的红外光谱图。
图3为微球的差示量热扫描图。
图4为GSH微球及空微球的热重分析图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
1.谷胱甘肽微球的制备
在室温(20℃)下，准确称取一定量的GSH，使其充分溶解在1.5％(v/w)pH4.2的SAL溶液中作为水相；油相为液体石蜡和石油醚7:5(v/v)混合物，其中含4％(w/w)的PO-500乳化剂。将烘干的SPG膜放入油相中超声30min，安装到SPG膜乳化器中。在氮气压力下50mL水相通过孔径20μm的SPG膜，进入到500mL油相中，形成W/O型SAL乳状液(水油体积比为1:10)。
将50mL2％(v/w)的pH＝6的CaCl2溶液与50mL上述的油相混合，搅拌超声后形成均一乳状液，再与SAL乳状液混合，为了保证形成均一的水凝胶微球，混合过程一定要缓慢进行。混合后300rmp搅拌5h，形成均一的乳白色乳状液，倒入离心管中离心后，除去上清液，再用石油醚离心清洗2次(8000rmp，5min，20℃)，除去上清液后，得到海藻酸钠-钙微球，用去离子水抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂；然后将微球分散到50mL0.5％(v/w)的O-CMC溶液中，300rmp搅拌1h，制备得到负载GSH的O-CMC-SAL微球，得到的微球用去离子水抽滤，除去表面残留的O-CMC，真空冷冻干燥24h，得到谷胱甘肽微球。
2.GSH微球包埋率的测定
2.1GSH标准曲线的绘制
用高效液相色谱法绘制谷胱甘肽标准曲线，具体步骤如下：准确称取GSH标准品适量，加入去离子水溶解成质量浓度为500mg/L的标准储备液，再按一定的比例稀释成25μg/L、125μg/L、250μg/L、375μg/L、500μg/L和625μg/L浓度的溶液，经0.22μm的滤膜过滤后，进样测定。色谱条件为：EclipseXDB-C18反相色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相乙腈∶水＝17∶83，其中水相中含有0.05％三氟乙酸(TFA)，超声脱气15min，进样流速为1.0mL/min，柱温保持30℃，检测波长为199nm，进样量为20μL。以谷胱甘肽标准溶液的浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标作线性回归方程，绘制谷胱甘肽标准曲线。
2.2微球表面GSH含量的测定
称取一定质量的冻干微球，加入1mL去离子水，离心1min，小心吸取上清液20μL，稀释10倍，经0.22μm滤膜过滤，取20μL进样，根据2.1中得到的GSH标准曲线计算微球表面的GSH含量，记为N。
2.3微球GSH总含量的测定
pH7.4缓冲液的配制：准确量取81mL0.2mol/LNa2HPO4溶液和19mL0.2mol/LNaH2PO4溶液混合，定容到1000mL，配制0.02mol/L的pH7.4磷酸缓冲液。
称取一定质量的冻干微球，加入1mLpH7.4的磷酸缓冲液，超声30min后使微球溶胀破裂，离心1min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，取20μL进样，根据2.1中得到的GSH标准曲线计算微球中GSH总含量，记为WB。
2.4GSH包埋率的测定
微球中GSH的包埋率按如下公式计算：
式中：N-微球表面GSH含量；
WB-微球GSH总含量。
2.5谷胱甘肽微球载药量的测定
GSH微球载药量按如下公式计算：
式中：WB-微球GSH总含量；
m-微球干重，5mg。
3.微球的表征
3.1微球粒径分析
采用激光粒度分析仪对SPG膜制得的微球粒径分布进行分析。平均粒径大小用MV表示，粒径分布用跨距(Span值)表示。
3.2微球超微结构观察
采用扫描电子显微镜(SEM)观察微球的表面形态，样品制备方法如下：取一层双面胶，分别将微球轻轻撒在上面并吹去多余的粉末，将双面胶贴在样品台上，然后在样品上喷金供SEM观察，电压为15kV，观察时间要求尽可能短，以避免电子束长时间照射引起电子损伤。
3.3FTIR分析
分别取少量经真空冷冻干燥后的微球粉末样品，加入一定量的KBr进行研磨，取少量研磨好的粉末，压片后置于中红外光谱仪上在波长4000～400cm-1范围内进行扫描分析，通过谱图分析官能团吸收峰的变化。
3.4DSC分析
采用DSC来测定微球的热变性温度，取5～10mg经真空冷冻干燥后的微球的粉末样品，加入到DSC样品盒中，以空白为参照，试样在氮气保护下，以5℃/min的速率从30℃加热至300℃，通过计算机记录加热过程中的差热曲线。
3.5TGA分析
采用TGA来测定微球的热分解规律。取5mg左右的经真空冷冻干燥后的微球的粉末样品，分别加入到热重仪样品盒中，以空白为参照，试样在空气氛围下，以10℃/min的速率从30℃加热至700℃，通过计算机记录加热过程中的热曲线。
4统计分析
每个试验重复3次，结果以表示。采用excel及SPSS数据处理软件进行统计分析，当P<0.05时认为差异显著。
实验结果：
制备的VLPVP微球经冷冻干燥后为白色粉末，微球的粒径分布主要集中在36.13～52.5μm，微球的平均粒径MV为42.17μm，粒径分布范围窄，粒径均匀，单分散性好。电镜下观察为圆球形颗粒(参见图1)。该微球的包埋率和载药量分别为98.3％和24.2％。
5.谷胱甘肽微球表征
5.1.FTIR分析
空微球、GSH微球的红外光谱图如图2所示。由图2可知，GSH微球的红外光谱图相比于空微球的红外光谱图，都在1450cm-1处出现了-CH3的特征吸收峰，2926cm-1出现了-CH2-的特征吸收峰，1650cm-1是肽键C＝O的C-H伸缩振动峰，2890cm-1是-CH-的特征吸收峰，GSH在微球制备过程中肽键的结构未受到影响。这表明，采用SPG膜乳化法制备负载GSH的微球时，不会改变负载多肽的性质，可以有效保持敏感性物质的稳定性。
5.2.DSC分析
采用差DSC来测定空微球、GSH微球的热变性温度，如图3所示。由图3中可以看出，2种微球的第一吸热峰均在80～100℃之间，这是由微球中的自由水受热蒸发引起的。空微球的第一吸热峰温度高载药微球的吸热峰，这可能是因为载药微球形成的网络结构中有一大部分负载着GSH，另一小部分包裹着自由水，而空微球的网络结构中绝大部分包裹着自由水，使得其第一吸热峰的温度高于两种载药微球。GSH微球的放热峰出现在270℃，但是放热峰不明显，这可能是微球中的GSH热分解造成的。
5.3TGA分析
图4分别是空微球和GSH微球微球的热重分析结果。由图4可知，2种微球的热分解过程几乎一致，分为三个阶段：第一步分解主要脱去所带的部分水分；第二步是在230～350℃，是微球氧化分解的结果，2种微球质量出现了明显的下降；此过程中GSH微球是失重率要大于空白微球，这可能是因为在微球氧化分解的同时，微球中的GSH也发生了氧化分解过程，这与DSC观察到的结果一致；第三步热分解出现在400℃以后，分解趋势变得缓慢，是微球进一步氧化分解造成的。
结合FTIR、DSC和TGA分析可知，微球中包埋的物质不会在制备过程中与微球的组分发生化学反应，只是被包裹在微球的网络结构中，对微球的热稳定性和氧化稳定性不会造成不利的影响。

Claims (10)

1.一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将GSH溶解在SAL溶液中作为水相；油相为液体石蜡和石油醚混合物，所述混合物中含乳化剂，将烘干的SPG膜放入油相中超声，安装到SPG膜乳化器中，在氮气压力下水相通过SPG膜，进入到油相中，得SAL乳状液；
2)将CaCl2溶液与步骤1)中的油相混合，搅拌超声后形成乳状液，再与步骤1)得到的SAL乳状液混合，搅拌后，得乳白色乳状液，再离心，除去上清液，清洗，再除去上清液后，得到海藻酸钠-钙微球，抽滤清洗，除去微球表面的有机溶剂，然后将微球分散到O-CMC溶液中，得负载GSH的O-CMC-SAL微球，再抽滤，除去表面残留的O-CMC，干燥后即得谷胱甘肽微球。
2.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述SAL溶液采用体积百分比为1.5％，pH为4.2的SAL溶液。
3.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述油相中液体石蜡与石油醚的体积比为7∶5。
4.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述乳化剂采用PO-500乳化剂，所述乳化剂的含量按质量百分比可为液体石蜡和石油醚混合物的4％。
5.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述超声的时间为30min。
6.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述SPG膜的孔径为20μm。
7.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤1)中，在SAL乳状液中水相与油相的体积比为1∶10。
8.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述CaCl2溶液采用体积百分比为2％，pH为6的CaCl2溶液。
9.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述CaCl2溶液与油相的体积比为1∶1。
10.如权利要求1所述一种谷胱甘肽微球的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述搅拌的条件为300rmp下搅拌5h；所述清洗可采用石油醚离心清洗2次，离心的条件可为8000rmp下离心5min，20℃；所述抽滤清洗可采用去离子水抽滤清洗；所述O-CMC溶液的体积百分比浓度可为0.5％；所述再抽滤可采用去离子水抽滤；所述干燥可采用真空冷冻干燥24h。
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