CN104490764B - 一种喜树碱纳米凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以PLGA包裹抗银屑病药物喜树碱作为纳米系统的核，将PAMAM包裹在PLGA表面作为纳米系统的壳，采用乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米系统，并用油酸(OA)进行修饰，得到经表面改性的核壳纳米给药系统。并且进一步地，以羟丙甲基纤维素(HPMC)为基质，制备喜树碱纳米凝胶(CPT‑PPO gel)。经过油酸修饰的CPT‑PPO gel可以显著提高药物皮肤吸收和滞留，而不增加皮肤渗透量，从而不增加药物进入血液循环的量，能有效降低药物的全身毒性，是一种优秀的喜树碱局部治疗的新剂型。

Description

一种喜树碱纳米凝胶

技术领域

本发明涉及一种喜树碱纳米凝胶以及其制备方法，属于制药领域。

背景技术

银屑病(俗称牛皮癣),是一种慢性、复发性、增殖性表皮疾患,是一公认的皮肤顽疾。临床外用治疗常使用喜树碱及其它激素类药物，但由于皮肤吸收能力差、毒性大，往往给患者带来极大的不便，达不到理想的治疗效果。近年来，新型给药系统特别是以纳米载体为基础的给药系统的发展，为皮肤相关疾病的治疗提供了更多的选择和机会。建立在纳米系统基础上的药物载体可以熟练地控制药物缓慢等时释放，建立皮肤储库在局部皮肤发挥效应。另外，纳米粒径的药物由于粒径小，因此可以在药物停留、专一靶向性方面达到更好的效果，可以提高给药效率降低刺激性和毒性，同时也提高了患者的依从性。如固体脂质纳米粒(SLN)、纳米结构脂质体(NLC)以及脂质体，在研究和实验中都表现出了很好的皮肤渗透性。但是这些药物有限的载药量和相对稳定性的问题，导致其用于临床应用受到了限制。而聚合物纳米粒子，如聚(ε-己内酯)、聚丙烯亚胺(PPI)、壳聚糖、聚乳酸(PLA)等则显示出了良好的局部用药潜力。这些聚合物纳米粒子通过修饰来减少药物与皮肤直接接触的刺激以达到可控性和持续释放的优点。PLGA是一种生物相容性好的聚合物材料，基于PLGA的聚合物纳米粒已经被广泛的用于生物医药领域，它具有生物相容性好、毒性低、易被水解等优点。通过表面修饰阳离子聚合物以及加入化学促渗剂可以增加纳米粒的稳定性和透皮效果。聚酰胺胺(PAMAM)是一种人工合成的阳离子聚合物，分子高度分枝，呈单分散性，其末端氨基丰富，正电性强，并易于修饰连接生物活性物质以改变载体高分子性质，有相关研究表明聚酰胺胺具有良好的促进皮肤渗透的作用。通过PAMAM表面修饰PLGA不仅可以增加PLGA包裹药物(如喜树碱)的稳定性，PAMAM表面的自由氨基还可以接枝化学促渗剂(如油酸)进一步打开皮肤角质层同道，提高皮肤递送效果。

纳米凝胶是聚合物通过物理或化学交联的方式形成的纳米粒径的网状结构，它的优点是可以增加皮肤的滞留时间，增加药物的有效负载。本实验将喜树碱制备成纳米凝胶剂，以提高药物经皮渗透量及皮肤滞留量，为喜树碱新型纳米凝胶剂型的开发研究提供实验依据。

本发明提供一种新型喜树碱纳米凝胶，以PLGA包裹抗银屑病药物喜树碱作为纳米系统的核，将PAMAM包裹在PLGA表面作为纳米系统的壳，采用乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米系统，并用油酸(OA)进行修饰，得到经表面改性的核壳纳米给药系统。并且进一步地，以羟丙甲基纤维素(HPMC)为基质，制备喜树碱纳米凝胶(CPT-PPO gel)。经过油酸修饰的CPT-PPO gel可以显著提高药物皮肤吸收和滞留，而不增加皮肤渗透量，从而不增加药物进入血液循环的量，能有效降低药物的全身毒性，是一种优秀的喜树碱局部治疗的新剂型。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明设计了一种新型喜树碱纳米凝胶，以PLGA包裹抗银屑病药物喜树碱作为纳米系统的核，将PAMAM包裹在PLGA表面作为纳米系统的壳，采用乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米系统，并用油酸(OA)进行修饰，得到经表面改性的核壳纳米给药系统。

并且进一步地，以羟丙甲基纤维素(HPMC)为基质，制备喜树碱纳米凝胶(CPT-PPOgel)。

对其含量、理化性质和体外透皮特性进行考察，结果表明，经过油酸修饰的CPT-PPO gel可以显著提高药物皮肤吸收和滞留，而不增加皮肤渗透量，从而不增加药物进入血液循环的量，能有效降低药物的全身毒性，是一种优秀的喜树碱局部治疗的新剂型。

具体而言，本发明提供一种载喜树碱纳米粒，其制备方法为：

(1)将喜树碱溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合；

(2)由乳化溶剂挥发法制备载喜树碱纳米粒，并用油酸(OA)进行修饰。

所述步骤(2)的方法优选为：

取10mg步骤(1)获得的含有喜树碱的PLGA，将其溶解在1.5ml二氯甲烷中得到的溶液作为有机相，将有机相加入到14.5ml 0.1％(W/V)PVA、4ml0.5％PAMAM与1.5ml吐温80的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均浆机搅拌15min(35000rpm)使之形成纳米乳；挥干有机相，加入100μl1％(W/V)三磷酸钠(TPP)交联，然后在300rpm下搅拌2h后悬浮于磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，与油酸(OA)温育2h。

本发明进一步还提供了一种喜树碱纳米凝胶，其制备方法为：

将HPMC逐滴加入至不断搅拌的上述获得的喜树碱纳米粒水溶液中直至完全形成凝胶，室温稳定24h备用。

本发明所用仪器与材料：

仪器

BS224S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，DZF-6090真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，F6-10超细匀浆机(规格：145W)，IKA磁力搅拌器，UPWS-I-5T超纯水器(杭州永洁达净化科技有限公司)，FI-IR红外光谱仪(美国瓦里安公司)，TDL-60B低速台式离心机(上海安亭科学仪器)，SHZ-B水浴恒温振荡器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，ADVENCE 400M核磁共振仪(美国瓦里安公司)，LC3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)，2010透射电镜(日本JEOL公司)，TK-12A型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司)，Zeta sizer ZS90粒度分析仪(英国Malvern公司)。

药品和试剂：

PLGA(济南岱罡生物工有限公司，分子量1.5万)，聚乙烯醇(PVA)(常州市天怡工程纤维有限公司)，PAMAM(G3.0，威海晨源化工新材料有限公司)，喜树碱标准品(中国药品生物制品检定所)，喜树碱(CPT)(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，分子量348.36)，油酸(OA)(西格玛公司)，羟丙甲基纤维素(HPMC，济南岱罡生物工有限公司)，美国联合碳化干型透析袋(MD34-70MW:7000D)，除色谱用试剂为HPLC级，其他试剂均为分析纯。

本发明喜树碱含量测定方法：

色谱条件

色谱柱：C₁₈色谱柱(5μm,250mm×4.6mm)；流动相：甲醇/水(70/30，V/V)；检测波长：254nm；流速：1.0ml·min^-1；进样体积：20μl。此条件下喜树碱对照品溶液和样品溶液的HPLC图见附图1所示。

标准曲线的制备和方法学研究

对照品溶液的制备：精密称取CPT对照品3mg，置于100ml容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解并稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，制得质量浓度为0.3、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0μg·ml^-1的CPT对照品溶液。将不同浓度的溶液分别进样20μl，按前述色谱条件进行测定。以峰面积(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，进行回归分析，得到喜树碱的标准曲线方程Y＝594.43X+339053，R＝0.9999，结果表明CPT在0.3～6.0μg·ml^-1时,峰面积与进样量呈良好线性关系。精密度、重复性、稳定性试验的RSD均小于3.0％，符合方法学要求。

本发明的有益之处在于：

本发明通过改性乳化溶剂挥发法制备了载有喜树碱的纳米凝胶，此凝胶作为一种新型药物，具有一定的载药量，可显著增加药物皮肤滞留量，减少药物经皮的渗透，从而延长药物的作用时间，满足局部治疗的要求，是一种新型的局部外用的新剂型。

附图说明

图1为本发明色谱条件下喜树碱对照品溶液和样品溶液的HPLC图：

.A:喜树碱对照品；B:喜树碱标准品。

图2为CPT-PPO透射电镜照片。

图3为CPT-PPO和CPT-PP纳米凝胶体外药物释放透曲线。

图4为CPT，CPT-PP和CPT-PPO纳米凝胶24h药物单位累计透皮量(n＝5，mean±SD,**:p<0.01)。

图5为CPT，CPT-PP和CPT-PPO纳米凝胶的皮肤滞留量。

具体实施方式

实施例1喜树碱纳米粒极其凝胶的制备：

空白及载药纳米粒的制备：

PLGA-PAMAM-OA(PPO)纳米粒是由乳化溶剂挥发法制备，取10mgPLGA溶解在1.5ml二氯甲烷中得到的溶液作为有机相，将有机相加入到14.5ml 0.1％(W/V)PVA、4ml 0.5％PAMAM与1.5ml吐温80的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均浆机搅拌15min(35000rpm)使之形成纳米乳。挥干有机相，加入100μl1％(W/V)三磷酸钠(TPP)交联，然后在300rpm下搅拌2h后悬浮于磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，与油酸(OA)温育2h，即得到空白的纳米粒PPO，未修饰的PLGA纳米粒(PLGA-PAMAM)参照上述方法制备。

载喜树碱载药纳米粒CPT/PLGA-PAMAM-OA(CPT-PPO)制备方法为：首先将喜树碱溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合，后续步骤参照空白纳米粒制备方法。

CPT-PPO的电镜形态观察

采用磷钨酸负染法，将CPT-PPO稀释至适当浓度，滴于300目铜网表面，5～6min后用滤纸吸去多余液体，加入1滴1％磷钨酸溶液(pH 7.0)染色5min，滤纸吸去多余液体，晾干后将此铜网置透射电子显微镜下观测并拍照，电镜检测结果见附图2，纳米粒大部分成规则的球形，外观圆整，大小均匀，纳米粒之间无粘连。

包封率的测定

取3批制备好的载药凝胶，在2000rpm·min^-1条件下用超滤管超滤15min，将沉淀用二氯甲烷溶解，过滤，滤液按照样品溶液处理方法制备成供试品溶液，按前述色谱条件测定，计算3批样品中喜树碱的含量，计算得到的量代入公式(1)计算包封率。所制得的喜树碱纳米粒包封率为78.7±6.9％。

实施例2空白及载药凝胶(PPO gel,CPT–PPO gel)的制备：

凝胶剂的制备方法如下：称取喜树碱0.01g溶于40ml乙醇中，超声使其溶解，逐滴加入溶胀后的羟丙甲基纤维素(HPMC)并不断搅拌至完全形成凝胶，室温稳定24h备用，即得喜树碱凝胶(CPT gel)。

纳米凝胶的制备方法参照喜树碱凝胶制备方法，将HPMC逐滴加入至不断搅拌的空白及载药纳米粒水溶液中直至完全形成凝胶(PPO gel,CPT-PPO gel,，PP gel，CPT-PPgel)，室温稳定24h备用。

实施例3体外释放动力学研究：

将一定量载药纳米凝胶CPT-PPO和CPT-PP分别放入透析袋中，置于pH7.4的PBS溶出杯中，温度控制在37±1℃，搅拌速度为300rpm。在不同时间(1、2、4、6、8、12、22、24、48、72h)取透析液0.5ml，甲醇定容，使用HPLC测定喜树碱的浓度，计算不同时间喜树碱的溶出百分率。结果如附图3所示.。

由图可知，纳米凝胶体外药物释放基本遵循一级动力学方程，OA修饰过的载药纳米凝胶与未修饰的载药纳米凝胶在药物释放上没有明显的差异。

实施例4体外经皮渗透研究：

取体质量合格的小鼠，脱颈致死，取腹部皮肤，处理后置于Franz立式扩散池上，角质层朝向供给池，真皮层朝向接收液。供给池分别放入CPT gel、CPT-PP gel、CPT-PPO gel，接收池为PBS(PH＝7)缓冲液，搅拌速度300rpm，水浴温度(37±1℃)，搅拌24h后取样，提取液经0.5μm微孔滤膜过滤，使用HPLC测定并计算单位面积累计渗透量，结果见附图4。

由附图4可知，CPT-PPO gel，CPT-PP gel及CPT gel体外经皮渗透量分别为3.5432μg·cm-2,30.1023μg·cm-2，27.8429μg·cm-2,CPT纳米凝胶与普通CPT凝胶相比，24h渗透量有非常显著性差异(p＜0.01)，即CPT-PPgel>CPT-PPOgel>CPTgel；结果说明，经修饰的纳米凝胶可以显著增加CPT的透皮效果，其中经OA修饰的纳米凝胶与未用OA修饰的凝胶相比，24h渗透量无显著性差异(p>0.05)。

实施例5药物皮肤滞留量测定

将经皮渗透试验完成后的皮肤取下，刮掉表明残留喜树碱药物，用PBS(pH＝7.4)冲洗角质层和真皮层，滤纸吸干水分，称重。然后剪碎皮肤，将碎片转移至5ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，超声30min，冷却至室温后，甲醇定容得提取液。取一定量上述提取液，PBS稀释10倍后取20μl进样，按照公式(2)计算皮肤的CPT滞留量(mg.g-1)。

式中为t时间内单位质量皮肤累计滞留量，C为皮肤药物浓度，V为皮肤样品溶液体积，m为皮肤的质量。CPT凝胶的单位质量皮肤滞留量结果见附图5.

由附图5可知，CPT-PPOgel,CPT-PLGAgel及CPTgel体外皮肤滞留量分别为0.2145mg·g-1，1.4268mg·g-1，1.8212mg·g-1)，CPT纳米凝胶与普通CPT凝胶相比，皮肤滞留量有非常显著增加(p＜0.01)，CPT-PPOgel皮肤滞留量比CPT-PPgel显著增加(p＜0.05)。皮肤滞留量CPT-PPOgel>CPT-PPgel>CPTgel；结果说明，PLGA经PAMAM修饰后，可以显著增加CPT在皮肤的滞留，有效的提高CPT的局部治疗效果。

实施例6制备凝胶的处方工艺优化

(1)单因素考察：

为了优化喜树碱纳米粒的制备工艺，本发明人进行了单因素考察，考察因素为：PVA浓度、PLGA浓度、PAMAM浓度、均浆机转速、转速时间、投药量。考查指标为纳米粒粒径、电位与载药量。

我们发现当上述条件固定在：PLGA的质量定为6.67mg·ml^-1、0.1％(w/v)的PVA、0.5％(w/v)的PAMAM、搅拌时间定为15min、转速应为35000rpm、投药量定为10mg时，为最佳处方工艺，制得的纳米粒粒径、电位及载药量都较为理想，工艺稳定、重现性好。

(2)最佳处方工艺验证

依照上述单因素考察所获得的制备纳米粒的最佳工艺处方，分别制备三批次载药凝胶(n＝3)，用激光粒度分析仪测定其粒径分布与Zeta电位值，并进行纳米粒的包封率、载药量测定。结果为粒径253.2nm，电位15.5mV，载药量15.35μg·mg^-1，包封率为84.2％。

(3)PAMAM与OA修饰对透皮效果的影响

为了证明PAMAM、OA修饰对皮肤滞留量的影响，本发明人合成了CPT-PPgel，将CPTgel，CPT-PP gel及CPT-PPO gel分别作用于小鼠皮肤，进行了皮肤滞留量试验，结果发现，经过修饰的纳米凝胶对小鼠皮肤滞留量的影响与其余两种凝胶相比有显著性差异。这可能是因为OA表面修饰的PLGA-PAMAM纳米粒可以进一步打开皮肤的角质层通道，增加活性药物到达皮肤深层(病灶组织)的机率。同时，由于增加了纳米凝胶的油水分配系数，可使更多的药物停留在皮肤，减少药物进入体循环的量，在表皮和真皮层形成药物贮库，使药物持久地对病变部位起治疗作用^[12]。

(4)包裹药物的选择：

喜树碱是具有抗癌活性的天然药物之一，在肿瘤治疗领域有一定的潜力。但是由于其低水溶性和较大的毒性，其临床使用一直受到限制。为了克服上述缺点，研究者们使用纳米载药体系来包裹喜树碱载药，以进行肿瘤的靶向或缓释递送]。关于喜树碱对于局部用药的研究则少有报道。本文制备喜树碱纳米凝胶并研究其在皮肤局部用药的效果，也为银屑病的局部治疗提供了一个新的思路。

综上所述，本发明通过改性乳化溶剂挥发法制备了载有喜树碱的纳米凝胶，此凝胶作为一种新型药物，具有一定的载药量，可显著增加药物皮肤滞留量，减少药物经皮的渗透，从而延长药物的作用时间，满足局部治疗的要求，有望成为局部外用的新剂型。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种载喜树碱纳米粒的制备方法，其特征在于其步骤如下：

（1） 将喜树碱溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合；

（2）取10mg步骤（1）制得的含有喜树碱的PLGA，将其溶解在1.5ml二氯甲烷中得到的溶液作为有机相，将有机相加入到14.5 ml 0.1%（W/V）PVA、4 ml 0.5%PAMAM与1.5 ml吐温80的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均浆机以35000 rpm的转速搅拌15 min使之形成纳米乳；挥干有机相，加入100 µl1%（W/V）三磷酸钠交联，然后在300 rpm下搅拌2 h后悬浮于pH8.0的磷酸盐缓冲液中，与油酸温育2 h。

2.权利要求1所述方法制备得到的载喜树碱纳米粒。

3.一种喜树碱纳米凝胶的制备方法，其特征在于其步骤为：

（1）将喜树碱溶于适量乙醇中与含有PLGA的有机相充分混合；

（2）取10mg步骤（1）制得的含有喜树碱的PLGA，将其溶解在1.5ml二氯甲烷中得到的溶液作为有机相，将有机相加入到14.5 ml 0.1%（W/V）PVA、4 ml 0.5%PAMAM与1.5 ml吐温80的混合溶液中，恒定的速度搅拌使之形成粗乳液，然后用超细均浆机搅拌15 min使之形成纳米乳；挥干有机相，加入100µ l1%（W/V）三磷酸钠交联，然后在300 rpm下搅拌2 h后悬浮于pH8.0的磷酸盐缓冲液中，与油酸温育2 h；

（3）将HPMC逐滴加入至不断搅拌的步骤（2）得到的纳米粒水溶液中直至完全形成凝胶，室温稳定24 h。

4.权利要求3所述的制备方法制备得到的喜树碱纳米凝胶。