CN101015549A - 雷公藤内酯醇脂质体纳米颗粒的制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种雷公藤内酯醇脂质体的制备及检测方法，其特征是按以下步骤制备：(1)将雷公藤内酯醇，卵磷脂及胆固醇用二氯甲烷溶解，旋转蒸发除去二氯甲烷制成均匀脂膜(2)以磷酸氢二钠为碱性液，磷酸二氢钠为酸性液配成pH＝6.8的PBS液(3)向所得均匀脂膜加入二氯甲烷与PBS液混匀，超声处理，制得W/O型乳剂(4)减压蒸馏除去大部分溶媒，涡动搅拌，并进一步完全除去残留溶媒，制得脂质体。本发明所得产品可降低雷公藤内酯醇的局部刺激性与毒副作用，提高药物的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及一种雷公藤内酯醇脂质体的制备方法，具体是用反相蒸发法制备雷公藤内酯醇脂质体，并对其形态学、包封率等进行研究的方法。
背景技术
雷公藤内酯醇是从卫矛科雷公藤属植物雷公藤根皮中提取分离到的坏氧二萜内酯(C20H2406＝360.41)，为无色柱状晶体，无臭，较难溶解。雷公藤内酯醇是一种免疫抑制剂，由于它生理活性强，具有显著的抗炎，抗肿瘤，抗生育及免疫调节作用，临床上常用于治疗白血病等肿瘤性疾病，并在多种自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎等)及肾、心脏移植排斥反应中也发挥着重要的作用。但它也是一个毒性较大的药物，目前，在雷公藤内酯醇制剂的临床用药中，在表现出理想的疗效时，同时也出现严重的毒副反应。其有效用量与中毒量值非常接近，这就大大地限制了雷公藤的临床使用。为解决此焦点问题，雷公藤内酯醇新剂型的开发，已成为众多科学家锲而不舍的目标。
药物载体输送系统亚微粒的研究是国内外医药学领域的重要研究方向。纳米粒脂质体是指把药物包裹在由卵磷脂和胆固醇所形成的脂质双分子层中的纳米粒，粒径10～1000nm的固态胶体颗粒。由于脂质体是由在体内生物降解的磷脂等组成，其作为药物载体对组织细胞具有很强的亲和力，此特点符合雷公藤内酯醇对剂型的要求。纳米粒经注射收后很快被网状内皮组织系统所识别，主要集中在单核巨噬细胞丰富的器官，尤其在肝，脾，骨髓中，具有很强的靶向性，减少对其它器官的毒副作用，并达到缓释长效的作用，提高生物利用度，使达到治疗所需的药量减少一半。
脂质体的制备方法有很多，包括薄膜分散法、注入法、超声波分散法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法、熔融法、表面活性剂法、离心法、反相蒸发法等。但上述前9种制备方法，在对脂溶性药物囊化和包封率方面都有不能令人满意之处，且部分方法在制备上也是克服不了的，主要是由于机械的应力或大量脂质在水相中的分散所致。Szoka与Papahadjopoulos报道的反相蒸发法是相对高效率的制备方法。
发明目的
本发明的目的是为了提供一种雷公藤脂质体纳米颗粒的制备方法，该方法制得的产品不仅可有效保持雷公藤内酯醇原有的性质和作用，而且可以减少雷公藤内酯醇毒副作用而又达到明显的治疗效果，提高雷公藤药物服用的安全性。
本发明所述雷公藤脂质体纳米颗粒的制备方法其特征是按以下步骤制备：(1)将雷公藤内酯醇，卵磷脂及胆固醇用二氯甲烷溶解，旋转蒸发除去二氯甲烷制成均匀脂膜，(2)以磷酸氢二钠为碱性液，磷酸二氢钠为酸性液配成pH＝6.8的PBS液，(3)向所得均匀脂膜加入二氯甲烷与PBS液混匀，超声处理，制得W/O型乳剂，(4)减压蒸馏除去大部分溶媒，涡动搅拌，并进一步完全除去残留溶媒，制得脂质体。
本发明所述步骤(1)中雷公藤内酯醇：卵磷脂用量：胆固醇用量(mg∶mg∶mg)为(范围1～2∶50～150∶20～50)，所述步骤(3)中雷公藤内酯醇量(mg)∶二氯甲烷用量(ml)∶PBS液用量(ml)为(范围1～3∶10～20∶2～10)。
本发明同时对雷公藤脂质体纳米颗粒进行包封率测定、形态学检查与粒度测定。本发明对所制备的雷公藤内酯醇脂质体进行包封率测定，是因为雷公藤内酯醇有剧毒，其是否被包合，对其剂型的改变具有重要意义，因此包封率是其最重要的指标。本发明所述的雷公藤内酯醇脂质体的包封率检测步骤为：将葡聚糖凝胶G-75用PBS液充分膨胀后加到凝胶柱上，精密吸取脂质体混悬液1ml上柱，用PBS液洗脱，控制流速1ml/min，分离脂质体与游离药物，收集游离药物部分，水浴蒸干，乙酸乙酯分次提取，合并提取液并定容至25ml，20μl进样，进行高效液相色谱测定，再按下列公式计算雷公藤内酯醇的包封率。
游离药物量(mg)＝脂质体中药物总量×(A游离/A注射剂)
包封率％＝[1-(A游离/A注射剂)]×100％；
本发明对不同批次的雷公藤内酯醇脂质体作了多次包封率测定，其值平均达到86.81％。
本发明显微镜观察测定包括
①生物显微镜观察
取脂质体液置Olympus IMT-2型倒置生物显微镜放大400倍下观察，可见脂质体形态轮廓清晰，呈圆球形囊状颗粒，在暗视野下可观察到双层脂质膜。
②电子显微镜观察
取脂质体液，采用磷钨酸负染法制样，以透射电镜放大5万倍进行观察，拍照，可见脂质膜较厚，其水层与脂质双分子层相间排列。
本发明的粒度测定步骤为取脂质体适量以2％氯化钠溶液稀释，用BI-90动态激光散射粒度测定仪测定脂质体粒度及分布。粒径分布范围为135～358nm，平均粒径为255nm。
本发明中雷公藤内酯醇脂质体的高效液相色谱测定方法如下：
A.色谱条件
色谱柱为Hypersil ODS(4.0×25mm，5μm)；检测器为DAD二极管阵列检测器；流动相为乙腈-水(25∶75，V/V)；流速为1.0ml/min；检测波长220nm；灵敏度0.02AUFS；进样量20μl。
B.雷公藤内酯醇注射剂的制备
精密称取105℃干燥至恒重的雷公藤内酯醇对照品2.1mg置于-小试管中，加入0.2ml 1，2-丙二醇，在水浴上加热，不时振摇，使雷公藤内酯醇完全溶解后，添加少量注射用水，稀释，然后将此溶液定量转移至10ml量瓶中，小试管用注射用水洗涤数次，洗液合并到量瓶中，边振摇边慢慢添加注射用水至刻度，摇均，即得雷公藤内酯醇注射剂。
精密称取105℃干燥至恒重的雷公藤内酯醇对照品2.1mg置于-小试管中，加入0.2ml 1，2-丙二醇，在水浴上加热，不时振摇，使雷公藤内酯醇完全溶解后，添加少量注射用水，稀释，然后将此溶液定量转移至10ml量瓶中，小试管用注射用水洗涤数次，洗液合并到量瓶中，边振摇边慢慢添加注射用水至刻度，摇均，即得雷公藤内酯醇注射剂。
本发明在研究过程中曾用所制得的脂质体液经微孔虑膜(0.45μm)过滤，取续滤液直接进行高效液相测定，但在高效液相测定过程中，流动相会破坏部分脂质体，致使原本已被包合的雷公藤内酯醇又游离出来，与原本游离的部分一起被检测出来，检测值偏高，从而降低了包封率，影响了实验的准确度。因此，本实验参考了文献，采用葡聚糖凝胶G-75分离脂质体及游离药物，并进行包封率测定。
本发明对所制备的雷公藤内酯醇脂质体进行包封率测定，是因为雷公藤内酯醇有剧毒，其是否被包合，对其剂型的改变具有重要意义，因此包封率是其最重要的指标。本发明在研究过程中进行了脂质体流出曲线考察，即将葡聚糖凝胶G-75用PBS液充分膨胀后加到凝胶柱上，精密吸取脂质体混悬液1ml上柱，用PBS液洗脱，控制流速1ml/min，每2ml搜集一份，以缓冲液为空白，在220nm处进行紫外检测，测定吸收度。取脂质体混悬液1ml上葡聚糖凝胶柱，用PBS液洗脱，流速1ml/min，每2ml搜集一份，以缓冲液为空白对照，在220nm处进行紫外检测，测定其吸收度。结果表明脂质体集中在第5ml～14ml之间，游离药物于第15ml起检测到，表明脂质体与游离药物能完全分开。据此，可以分离脂质体与游离药物，收集游离药物部分，并根据公式计算雷公藤内酯醇的包封率。
本发明所制备的雷公藤脂质体纳米颗粒，平均包封率达到86.81％，粒径分布范围为135～358nm，平均粒径为255nm，不仅具有显著的抗炎，抗肿瘤，抗生育及免疫调节作用，而且能使有效服用量大大低于雷公藤中毒用量，减少雷公藤内酯醇毒副作用而又达到明显的治疗效果，提高雷公藤药物服用的安全性。
附图说明
图1为本发明生产流程示意图。
具体实施方式
(1)中将雷公藤内酯醇，卵磷脂及胆固醇按比例2：100∶25(mg∶mg∶mg)用二氯甲烷溶解，40℃下旋转蒸发除去二氯甲烷制成均匀脂膜，所述步骤(3)中向所得均匀脂膜中按雷公藤内酯醇量(mg)∶二氯甲烷用量(ml)∶PBS液用量(ml)比例2∶15∶5加入二氯甲烷与PBS液混匀，超声30min处理，制得W/O型乳剂，所述步骤(4)中减压蒸馏除去大部分溶媒，涡动搅拌30min，进一步完全除去残留溶媒，制得脂质体。
实施例1：
以9.437g的磷酸氢二钠为碱性液，8g磷酸二氢钠为酸性液各配成1000ml，同体积混合即得pH＝6.8的磷酸缓冲液(PBS液)。称取雷公藤内酯醇2mg，卵磷脂100mg及胆固醇25mg，置于100ml圆底烧瓶中，加入二氯甲烷6ml溶解，将烧瓶置于40℃温水中，旋转蒸发除去二氯甲烷制成一均匀脂膜；向脂膜中加入二氯甲烷15ml溶解脂膜，加入PBS液5ml，混和均匀，于超声波清洗机中进行30分钟连续超声处理，制得W/O型乳剂。将W/O型乳剂在减压下蒸馏除去溶媒，注意减压调节。大部分溶媒除去后，呈高粘性凝胶状。接着涡动搅拌30分钟使相转移，形成水悬液(脂质体混悬液)。定量转移至10ml量瓶中，用PBS液定容至刻度，摇均，即得试验用脂质体。
Claims (4)
1、一种雷公藤内酯醇脂质体的制备方法，其特征是按以下步骤制备：(1)将雷公藤内酯醇，卵磷脂及胆固醇用二氯甲烷溶解，旋转蒸发除去二氯甲烷制成均匀脂膜，(2)以磷酸氢二钠为碱性液，磷酸二氢钠为酸性液配成pH＝6.8的PBS液，(3)向所得均匀脂膜加入二氯甲烷与PBS液混匀，超声处理，制得W/O型乳剂，(4)减压蒸馏除去大部分溶媒，涡动搅拌，并进一步完全除去残留溶媒，制得脂质体。
2、根据权利要求1所述的雷公藤内酯醇脂质体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中雷公藤内酯醇∶卵磷脂用量∶胆固醇用量(mg∶mg∶mg)为(范围1～2∶50～150∶20～50)，所述步骤(3)中雷公藤内酯醇量(mg)∶二氯甲烷用量(ml)∶PBS液用量(ml)为(范围1～3∶10～20∶2～10)。
3、根据权利要求1所述的雷公藤内酯醇脂质体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中将雷公藤内酯醇，卵磷脂及胆固醇按比例2∶100∶25(mg∶mg∶mg)用二氯甲烷溶解，40℃下旋转蒸发除去二氯甲烷制成均匀脂膜，所述步骤(3)中向所得均匀脂膜中按雷公藤内酯醇量(mg)∶二氯甲烷用量(ml)∶PBS液用量(ml)比例2∶15∶5加入二氯甲烷与PBS液混匀，超声30min处理，制得W/O型乳剂，所述步骤(4)中减压蒸馏除去大部分溶媒，涡动搅拌30min，进一步完全除去残留溶媒，制得脂质体。
4.根据权利要求1所述的雷公藤内酯醇脂质体的制备方法，其特征在于所述的雷公藤内酯醇脂质体的包封率检测步骤为：将葡聚糖凝胶G-75用PBS液充分膨胀后加到凝胶柱上，精密吸取脂质体混悬液1ml上柱，用PBS液洗脱，控制流速1ml/min，分离脂质体与游离药物，收集游离药物部分，水浴蒸干，乙酸乙酯分次提取，合并提取液并定容至25ml，20μl进样，进行高效液相色谱测定，再计算其包封率。
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2006
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