CN103877149A - 香青兰总黄酮磷脂复合物、香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及香青兰提取物技术领域，是一种香青兰总黄酮磷脂复合物、香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂及其制备方法；该香青兰总黄酮磷脂复合物，按下述制备方法得到:第一步，取适量磷脂溶于低沸点的有机溶剂A中，再加入香青兰总黄酮混匀后得到混合液，磷脂和香青兰总黄酮的质量比为1:1至1:4，按1mg至15mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂计加入有机溶剂，混合液放置在水浴中恒温搅拌0.5小时至2小时。本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂大大提高了香青兰总黄酮在胃肠道中的溶解性，从而提高了其生物利用度，进而更好的发挥了药效作用，且物理性质和化学性质稳定。

Description

香青兰总黄酮磷脂复合物、香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及香青兰提取物技术领域，是一种香青兰总黄酮磷脂复合物、香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂及其制备方法。

背景技术

、磷脂复合物研究进展及背景介绍

磷脂复合物是由意大利学者Bombardelli在研究脂质体时发现的，早期磷脂复合物研究涉及的药物大多是含有酚羟基的黄酮或多酚类成分，后期更多的研究证实，除酚羟基外，一些醇羟基、酰胺基或羰基等极性基团均有可能与磷脂或其他脂质材料（如胆固醇、胆酸钠等）的亲水端通过分子间氢键或范德华力等相互作用形成复合物球状体。不论是亲水性药物还是亲脂性药物，只要含有能复合的极性基团，都可形成脂质复合物。

磷脂复合物多为无定型且在水中能形成胶束，故能增加母体药物的水溶性，而对母体药物脂溶性的增加则是母体药物与磷脂的极性基团部分较强的相互作用，抑制分子中单键的自由转动，而磷脂的两个长脂肪链不参与复合反应，可自由移动，包裹了磷脂的极性部分形成一个亲脂性的表面，使磷脂复合物表现出较强的脂溶性。同时，磷脂复合物是类细胞结构，因此对细胞膜有一定的亲和性，增强了药物的膜通透性。因此，磷脂复合物有着良好的开发研究前景，对于提高天然药物及中药新药的开发和利用、加速传统中药制剂的现代化进程，提高中药制剂技术水平及临床用药质量，均具有重要的理论和实际意义。

、香青兰制剂研究背景及现有技术的缺陷

香青兰为唇形科植物香青兰Dracocephalum Moldevica L.的干燥地上部分，是维吾尔民族药之一，具有重要的药用价值，主要用于治疗冠心病、心绞痛、动脉粥样硬化、高血压、心肌缺血等疾病。香青兰,维吾尔名为巴迪然吉布亚,处方被收载于维吾尔古典医籍《阿里卡农》至今已有800多年的历史,《买克散艾地维》至今已有500多年的历史,《易斯尔阿扎木》和《买克散易克买提》至今已有100多年的历史。它在维吾尔医和民间用于治疗冠心病及血液质旺盛(高血压)、寒性神经性头疼、寒性感冒、气管炎等疾病，几百余年的实践证明,其疗效确切、显著。

标准号为WS3-BW-0178-98的益心巴迪然吉布亚颗粒中记载了其制备方法：水蒸气蒸馏法提取挥发油后，药渣再用水提取，然后制备成颗粒剂。该制剂工艺简单，仅限于简单的水提后加入辅料制成颗粒剂，这样经提取后的提取物不仅包含有效成分，还包含大量的无效成分，致使患者服用剂量大（18g/天），依从性差，存在明显缺陷。

专利文献号为ZL201010594159.2、名称为香青兰总黄酮口崩片及其制备方法的专利公开了以香青兰总黄酮为原料药制备的香青兰总黄酮口崩片，该制剂为一速效制剂，符合急性期发病的患者使用，而对于需要长期服药的慢性病患者顺应性不理想。并且，该香青兰总黄酮溶解性差，在胃肠道中不易被吸收，用该提取物制备成缓释片由于胃肠道中吸收较差从而导致生物利用度低，不能有效发挥其药效作用，存在明显缺陷。

公开号为CN101785799、名称为香青兰总三萜提取物及其制备方法的专利公开了香青兰总三萜化合物的提取方法，香青兰总三萜提取物用于制备肝病药物。该专利香青兰提取物为总三萜提取物，且适用于肝病患者。

申请号为200810014784.8、名称为一种无糖益心香青兰颗粒剂的专利公开了以香青兰提取物为原料药制备的无糖香青兰颗粒剂，该香青兰提取物溶解性差，在胃肠道中不易被吸收，用该提取物直接制备成颗粒剂由于胃肠道中吸收较差从而导致生物利用度低，不能有效发挥其药效作用，存在明显缺陷。

公开号为CN102048811A、名称为香青兰总黄酮缓释片及其制备方法的专利公开了以香青兰总黄酮为原料药制备的香青兰总黄酮缓释片，该香青兰总黄酮溶解性差，在胃肠道中不易被吸收，用该提取物制备成缓释片由于胃肠道中吸收较差从而导致生物利用度低，不能有效发挥其药效作用，存在明显缺陷。

综上所述，现有香青兰提取物存在因溶解性差，在胃肠道中不易被吸收从而导致生物利用度低，不能充分发挥其药效作用。

发明内容

本发明提供了一种香青兰总黄酮磷脂复合物、香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂及其制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有香青兰提取物存在因溶解性差，在胃肠道中不易被吸收从而导致生物利用度低，不能充分发挥其药效的问题。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种香青兰总黄酮磷脂复合物，按下述方法得到: 第一步，取适量磷脂溶于低沸点的有机溶剂A中，再加入香青兰总黄酮混匀后得到混合液，磷脂和香青兰总黄酮的质量比为1:1至1:4，按1mg至15mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂A计加入有机溶剂A，混合液放置在水浴中恒温搅拌0.5小时至2小时；第二步，搅拌后的混合液经水浴减压旋蒸去除有机溶剂A，有机溶剂A去除后按25mg至40mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂B计加入有机溶剂B混匀后进行过滤；第三步，过滤后的滤液经水浴减压旋蒸浓缩至在温度为20℃时的相对密度为1.31至1.34，然后低温真空干燥至质量百分含水量小于等于3%，得到香青兰总黄酮磷脂复合物。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述磷脂为天然磷脂或合成磷脂；或/和，天然磷脂为大豆磷脂；或/和，有机溶剂A为自甲醇、乙醇、四氢呋喃和二氧六环中的一种以上；或/和，有机溶剂B为自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种以上。

上述第一步中，水浴温度为30℃至40℃，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟；或/和，第二步和第三步中，水浴减压旋蒸的温度为30℃至40℃，水浴减压旋蒸的压力为0.08MPa；或/和，第三步中，低温真空干燥的温度为30℃至60℃。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种香青兰总黄酮磷脂复合物的制备方法，按下述步骤进行：第一步，取适量磷脂溶于低沸点的有机溶剂A中，再加入香青兰总黄酮混匀后得到混合液，磷脂和香青兰总黄酮的质量比为1:1至1:4，按1mg至15mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂A计加入有机溶剂A，混合液放置在水浴中恒温搅拌0.5小时至2小时；第二步，搅拌后的混合液经水浴减压旋蒸去除有机溶剂A，有机溶剂A去除后按25mg至40mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂B计加入有机溶剂B混匀后进行过滤；第三步，过滤后的滤液经水浴减压旋蒸浓缩至在温度为20℃时的相对密度为1.31至1.34，然后低温真空干燥至质量百分含水量小于等于3%，得到香青兰总黄酮磷脂复合物。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述磷脂为天然磷脂或合成磷脂；或/和，天然磷脂为大豆磷脂；或/和，有机溶剂A为自甲醇、乙醇、四氢呋喃和二氧六环中的一种以上；或/和，有机溶剂B为自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种以上。

上述第一步中，水浴温度为30℃至40℃，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟；或/和，第二步和第三步中，水浴减压旋蒸的温度为30℃至40℃，水浴减压旋蒸的压力为-0.08MPa；或/和，第三步中，低温真空干燥的温度为30℃至60℃。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂，原料按重量份数包括香青兰总黄酮磷脂复合物4份、油相3份、表面活性剂和助表面活性剂共6份，表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3︰1至1︰1；该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂按下述方法得到：将所需量的香青兰总黄酮磷脂复合物加入到所需量的油相中并混匀，再加入所需量的表面活性剂和助表面活性剂，在温度为40℃下恒温水浴搅拌至澄清，得到香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂。

下面是对上述发明技术方案之三的进一步优化或/和改进：

上述油相为辛癸酸甘油单酯、辛酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、油酸乙酯和大豆油中的一种以上；或/和，表面活性剂为Cremophor EL或Tween 80；或/和，助表面活性剂为PEG400或1,2-丙二醇或乙醇；或/和，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟。

本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂的制备方法，原料按重量份数包括香青兰总黄酮磷脂复合物4份、油相3份、表面活性剂和助表面活性剂共6份，表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3︰1至1︰1；该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂按下述方法进行：将所需量的香青兰总黄酮磷脂复合物加入到所需量的油相中并混匀，再加入所需量的表面活性剂和助表面活性剂，在温度为40℃下恒温水浴搅拌至澄清，得到香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂。

下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：

上述油相为辛癸酸甘油单酯、辛酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、油酸乙酯和大豆油中的一种以上；或/和，表面活性剂为Cremophor EL或Tween 80；或/和，助表面活性剂为PEG400或1,2-丙二醇或乙醇；或/和，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟。

本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂大大提高了香青兰总黄酮在胃肠道中的溶解性，从而提高了其生物利用度，进而更好的发挥了药效作用，且物理性质和化学性质稳定。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。

实施例1，该香青兰总黄酮磷脂复合物，按下述制备方法得到: 第一步，取适量磷脂溶于低沸点的有机溶剂A中，再加入香青兰总黄酮混匀后得到混合液，磷脂和香青兰总黄酮的质量比为1:1至1:4，按1mg至15mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂A计加入有机溶剂A，混合液放置在水浴中恒温搅拌0.5小时至2小时；第二步，搅拌后的混合液经水浴减压旋蒸去除有机溶剂A，有机溶剂A去除后按25mg至40mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂B计加入有机溶剂B混匀后进行过滤；第三步，过滤后的滤液经水浴减压旋蒸浓缩至在温度为20℃下的相对密度为1.31至1.34，然后低温真空干燥至质量百分含水量小于等于3%，得到香青兰总黄酮磷脂复合物。本发明中，去除有机溶剂A的方法可以是旋转蒸发法，也可以是冷冻干燥法，还可采用其它挥发溶剂的方法，只要能够将有机溶剂A挥发干净，并且不影响药物的稳定性即可。本发明中所述的香青兰总黄酮为专利号为ZL 200710203385.1、名称为“香青兰提取物和香青兰滴丸及其生产方法”中的香青兰提取物。

实施例2，该香青兰总黄酮磷脂复合物，按下述制备方法得到: 第一步，取适量磷脂溶于低沸点的有机溶剂A中，再加入香青兰总黄酮混匀后得到混合液，磷脂和香青兰总黄酮的质量比为1:1或1:4，按1mg或15mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂A计加入有机溶剂A，混合液放置在水浴中恒温搅拌0.5小时或2小时；第二步，搅拌后的混合液经水浴减压旋蒸去除有机溶剂A，有机溶剂A去除后按25mg或40mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂B计加入有机溶剂B混匀后进行过滤；第三步，过滤后的滤液经水浴减压旋蒸浓缩至在温度为20℃时的相对密度为1.31或1.34，然后低温真空干燥至质量百分含水量小于等于3%，得到香青兰总黄酮磷脂复合物。

实施例3，作为上述实施例的优化，实施例3中磷脂为天然磷脂或合成磷脂；或/和，天然磷脂为大豆磷脂；或/和，有机溶剂A为自甲醇、乙醇、四氢呋喃和二氧六环中的一种以上；或/和，有机溶剂B为自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种以上。

实施例4，作为上述实施例的优化，实施例4的第一步中，水浴温度为30℃至40℃，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟；或/和，第二步和第三步中，水浴减压旋蒸的温度为30℃至40℃，水浴减压旋蒸的压力为-0.08MPa；或/和，第三步中，低温真空干燥的温度为30℃至60℃。

实施例5，该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂，原料按重量份数包括香青兰总黄酮磷脂复合物4份、油相3份、表面活性剂和助表面活性剂共6份，表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3︰1至1︰1；该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂按下述制备方法得到：将所需量的香青兰总黄酮磷脂复合物加入到所需量的油相中并混匀，再加入所需量的表面活性剂和助表面活性剂，在温度为40℃下恒温水浴搅拌至澄清，得到香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂。本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂于透射电镜下观察外观和形态，呈圆球型，太小均匀，室温放置24小时，溶液澄清，HPLC测定剩余含量，平均为零时的99.2％至99.7％，提示药物未发生降解；在25℃条件下贮存6个月，溶液澄清，紫外分光光度法测定剩余含量，为初始时的97.1％至98.5％，质量稳定。本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂加100倍的水，磁力搅拌3分种可发生乳化，乳化后的平均粒径均≤1μm。

实施例6，该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂，原料按重量份数包括香青兰总黄酮磷脂复合物4份、油相3份、表面活性剂和助表面活性剂共6份，表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3︰1或1︰1；该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂按下述制备方法得到：将所需量的香青兰总黄酮磷脂复合物加入到所需量的油相中并混匀，再加入所需量的表面活性剂和助表面活性剂，在温度为40℃下恒温水浴搅拌至澄清，得到香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂。本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂中药物含量可为67mg/g 至167mg/g。

实施例7，作为上述实施例的优化，实施例7中油相为辛癸酸甘油单酯、辛酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、油酸乙酯和大豆油中的一种以上；或/和，表面活性剂为Cremophor EL或Tween 80；或/和，助表面活性剂为PEG400或1,2-丙二醇或乙醇；或/和，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟。

一、本发明上述实施例中有机溶剂对药物的前期探索性研究

1.1 有机溶剂对药物化学性质的影响考察

在前期研究工作中，对香青兰总黄酮在非极性的低沸点有机溶剂的溶解度进行了系统考察，按照药典凡例中近似溶解度的方法：取香青兰总黄酮细粉适量，置于25℃±2℃一定容量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30秒钟；观察30分钟内的溶解情况如看不见溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解。结果显示香青兰总黄酮极微溶解于甲醇、无水乙醇、三氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氧六环中，几乎不溶于丙酮和二氯甲烷中。同时，以香青兰总黄酮中有效成分田蓟苷为指标，用HPLC测定香青兰总黄酮在水、甲醇、无水乙醇、三氯甲烷、四氢  呋喃、乙酸乙酯、二氧六环、丙酮和二氯甲烷的溶解度，具体方法如下：分别取过量香青兰总黄酮加入装有10 mL的水、二氧六环、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的7个25 mL锥形瓶中，并超声至香青兰总黄酮不再溶解为止，分别用封口膜封好后放入37（± 2）℃恒温水浴振荡器中，振摇 48 h，在整个过程中保持锥形瓶有固体药物存在，混悬液在6000 r·min ^-1 条件下离心15 min，上清液过0.45μm 微孔滤膜，续滤液用甲醇稀释1倍至5倍后用HPLC测定田蓟苷含量，计算香青兰总黄酮在各介质中的平衡溶解度。结果表明香青兰总黄酮在水、二氧六环、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿的溶解度依次降低。

以甲醇-二氧六环为复合溶剂的考察

以甲醇-二氧六环为溶剂，设定药物质量浓度为10mg/ml，香青兰总黄酮与大豆磷脂的投料比分别为3:1 、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4（w/w）。将大豆磷脂溶于甲醇和二氧六环的混合溶剂中，按投料比例加入香青兰总黄酮，水浴恒温搅拌，减压蒸馏除去有机溶剂，得到香青兰总黄酮磷脂复合物半成品，再加入二氯甲烷，使香青兰总黄酮磷脂复合物半成品充分溶解，微孔滤膜过滤，滤液减压蒸馏回收二氯甲烷，低温真空干燥，即得香青兰总黄酮磷脂复合物。

本发明的目的，是选择合适的复合溶剂系统，提高香青兰总黄酮与磷脂的复合效率和质量稳定性。所选择的溶剂系统可同时满足以下条件：1）磷脂和香青兰总黄酮都能够溶解形成澄清透明的溶液；2）系统中不含水分，极性小，有利于磷脂和香青兰总黄酮分子间的复合；3）溶剂系统蒸发效率高，易挥除，无有机溶剂残留；4）制备过程中香青兰总黄酮性质稳定。

照如下方法测定复合率

复合率（包封率）：利用香青兰总黄酮磷脂复合物在二氯甲烷中易溶，而游离香青兰总黄酮不溶于二氯甲烷的特征，进行复合率测定。

香青兰总黄酮磷脂复合物药物总含量测定：采用紫外分光光度法测定香青兰总黄酮磷脂复合物中总黄酮含量，具体方法为：分别精密量取田蓟苷对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置于25 mL量瓶中，用甲醇:二氧六环（1:1）稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。以甲醇:二氧六环（1:1）的溶剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在324 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，溶液浓度为横坐标X，绘制标准曲线。得标准曲线方程：Y=0.0479X+0.0164（r=0.9999）。另精密称取香青兰总黄酮磷脂复合物半成品0.05 g，用甲醇与二氧六环的混合溶剂（1:1）溶解并稀释至50 ml，精密吸取5ml溶液至50 ml，用甲醇与二氧六环的混合溶剂（1:1）定容至刻度，得到供试品溶液，按上述方法测定吸光度,代入线性方程，计算复合物中总黄酮的含量，记为W _总 。

香青兰总黄酮磷脂复合物中与磷脂结合的药物含量测定：利用香青兰总黄酮几乎不溶于二氯甲烷，而磷脂和香青兰总黄酮磷脂复合物均易溶于二氯甲烷的理化特性，分离未复合香青兰总黄酮和香青兰总黄酮磷脂复合物后，采用紫外分光光谱法测定与磷脂结合的总黄酮含量，具体方法如下：分别精密量取田蓟苷对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置于25 mL量瓶中，用甲醇:二氧六环（1:1）稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。以溶剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在324 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标Y，溶液浓度为横坐标X，绘制标准曲线。得标准曲线方程：Y=0.0479X+0.0164（r=0.9999）。另精密称取香青兰总黄酮磷脂复合物半成品0.05 g，用二氯甲烷充分溶解后定容至50ml，取5 mL二氯甲烷续滤液35℃减压旋干，用适量甲醇与二氧六环的混合溶剂（1:1）溶解转移至50mL量瓶中，加适量甲醇与二氧六环的混合溶剂（1:1）稀释至刻度后，依据上述方法测定吸光度，代入线性方程，计算与磷脂结合的总黄酮含量，记为W _复合 。

复合率按下式计算：复合率％＝（W _复合 /W _总 ）×100％

二、本发明上述实施例香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂在胃肠生物酶环境中的稳定性

试验样品：香青兰总黄酮溶液（DMFS）

香青兰总黄酮磷脂复合物（Phospholipid Complex）溶于水中制成混悬液

本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂

将试验样品分别置于含有1%（重量/体积，g/ml）胃蛋白酶的人工胃液，置37℃水浴中孵育，涡旋混匀，分别于1分钟、5分钟、30分钟、60分钟取样，每次取样0.5ml，加冷的Tris溶液（取Tris试剂6.07g，加水至500ml）0.1ml，涡旋混匀后，离心，10000rpm，5min，取上清液照前述紫外分光光度法依法测定香青兰总黄酮残余百分比，平均结果如表1所示。

三、含香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂溶液Caco-2细胞透过性

试验样品：香青兰总黄酮溶液（DMFS）

香青兰总黄酮普通自乳化剂（香青兰总黄酮普通自乳化剂的制备方法和本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂的制备方法的不同之处在于，在香青兰总黄酮普通自乳化剂的制备方法中香青兰总黄酮代替了本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂的制备方法中的香青兰总黄酮磷脂复合物）

本发明实施例所得香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂

香青兰总黄酮普通自乳化剂按下述方法得到：原料按重量份数包括香青兰总黄酮4份、油相3份、表面活性剂和助表面活性剂共6份，表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3︰1至1︰1；该香青兰总黄酮普通自乳化剂按下述方法得到：将所需量的香青兰总黄酮加入到所需量的油相中并混匀，再加入所需量的表面活性剂和助表面活性剂，在温度为40℃下恒温水浴搅拌至澄清，得到香青兰总黄酮普通自乳化剂。

精密量取0.5mL同浓度的香青兰总黄酮溶液、香青兰总黄酮普通自乳化剂和本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂，加至培养在12孔板的Caco-2细胞上，在细胞下面加入1.5mL的HBSS溶液作为接受介质，37度空气浴中孵育，于30、60、120、180、240min取样200μl，紫外分光光度法测定, 计算累计透过量，平均结果如表2所示。

四、本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂对大鼠心肌缺血损伤保护作用

1、采用大鼠急性实验性心肌缺血模型比较香青兰总黄酮、香青兰总黄酮磷脂复合物和本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂的抗心肌缺血作用活性。

、仪器

Cardimax FX-101B心电图仪，日本琴岛福田公司产品。

数码相机，日本尼康公司产品。

病理图像采集与分析系统, 北京航空航天大学图象中心产品。

、药品与试剂

工具药：硝苯地平片(心痛定)，陕西汾河制药有限公司，批号1202641，5mg/片。临用前研碎，用0.5%的CMC配制成所需浓度的药液供动物给药用。

红四氮唑(TTC)，上海试剂三厂生产，批号20060118。以磷酸盐缓冲液配制成1%的溶液供染色用。

、动物

Wistar大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

、试验方法

雄性Wistar大鼠100只，体重253.3±10.0(238-274)g。按体重随机分为10组，每组10只；假手术组和模型对照组灌服0.5%CMC，3个受试物组分别灌服香青兰总黄酮（DMF）、香青兰总黄酮磷脂复合物（DMFPC）和本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂（DMFPC-SEDDS），剂量均为3.78g生药/kg，工具药组灌服心痛定；给药体积均为5mL/kg，每天给药1次，连续5天。于末次给药后30 min，12%水合氯醛（360 mg/kg）腹腔注射麻醉，并在必要时腹腔注射适量水合氯醛维持麻醉，测定正常Ⅱ导心电图后，左胸部去毛，锁骨正中线与第四肋骨交点为中心，沿锁骨正中线切开皮肤、肌层，环肌层作荷包缝合，串线备扎，切断第四肋骨，以环形勾将心脏拉出胸腔，于左心耳下1.5 mm处以6/0号丝线结扎冠脉左前降支，将心脏放回胸腔，抽出腔内空气，并作肌层的荷包结扎，缝合皮肤；结扎后15、30、45、60、90、120、180 min测定II导心电图，测量ST段升高值。动物回置笼饲养，24h后经左心室注射5%四环素溶液0.2 mL/只，立即取心脏，生理盐水冲洗，沿心脏长轴方向将心脏切片，厚度为1.5 mm，将切片置于360nm处产生荧光，并数码成像并保存备用，将切片置于1%TTC液中染色5 min后，取出心脏切片。由于梗死区染为白色，危险区(结扎冠脉所支配心肌)未染色为红色，非危险区为黄色，数码成像后，通过图像分析系统测定各区域的面积，并计算其体积，按下式计算：

梗死区占危险区的百分比=梗死区体积/危险区体积×100；

梗死区占左室的百分比=梗死区体积/（危险区体积+非危险区体积）×100。

将每一指标按抑制程度的大小排序，第1位得3分，第2位得2分，第3位得1分，再将每一受试物各项指标的评分相加得总分，总分越高，该样品的活性越强，排序相同取平均分。

、试验结果

6.1 对II导联心电图ST段抬高的影响

大鼠冠脉前降支结扎后，模型组的II导心电图ST段明显抬高，与假手术组比较差异有显著性意义(P<0.001)，呈现明显的缺血性损伤表现。大鼠灌服DMF、DMFPC和DMFPC-SEDDS后均能不同程度抑制ST段抬高，最大抑制和平均抑制的程度顺序见表3。

对心肌梗死范围的影响

大鼠灌胃给予DMF、DMFPC和DMFPC-SEDDS，能不同程度缩小结扎冠脉引起的心肌梗死范围，使梗死区占左室体积百分数分别缩小了23.5%、25.8%、27.5%、22.1%、12.0%、20.3%、25.0%。使梗死区占危险区体积百分数分别缩小了12.1%、17.9% 、19.4%、13.5%、10.2% 、13.0%、22.1% ，平均结果见表4所示；对冠脉结扎所致大鼠心肌缺血疗效评分的影响见表5所示。

、结论

经综合评分DMF、DMFPC和DMFPC-SEDDS活性强弱：DMFPC-SEDDS>DMFPC>DMF。

与现有技术方法相比，本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂具有以下优点：

1）含低沸点的非极性有机溶剂系统作为复合溶剂：选择的有机溶剂可保证香青兰总黄酮与磷脂的复合溶液澄清，其极性可确保香青兰总黄酮与脂质材料的复合稳定性，且不影响香青兰总黄酮的质量稳定，且低沸点的非极性有机溶剂容易被蒸除，制得的复合物中无有机溶剂残留，复合率在95％至98%，制备及贮存过程中药物含量无明显变化。

）药物/磷脂用量合理：基于复合溶剂的突破，香青兰总黄酮与磷脂的质量比为1:1至1:4，即可获得复合完全的复合物。磷脂用量与理论推测值相吻合。

）将香青兰总黄酮制备成香青兰总黄酮磷脂复合物显著改善了香青兰总黄酮的溶解性，且自乳化剂能够较好的提高药物的溶出速率，因此，以香青兰总黄酮磷脂复合物制得的本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂不仅大大提高了香青兰总黄酮在胃肠道中的溶解性，从而提高了其生物利用度，进而更好的发挥药效作用，且稳定性好，物理性质和化学性质稳定。

综上所述，本发明香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂大大提高了香青兰总黄酮在胃肠道中的溶解性，从而提高了其生物利用度，进而更好的发挥了药效作用，且物理性质和化学性质稳定。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

Claims (10)

1.一种香青兰总黄酮磷脂复合物，其特征在于按下述方法得到: 第一步，取适量磷脂溶于低沸点的有机溶剂A中，再加入香青兰总黄酮混匀后得到混合液，磷脂和香青兰总黄酮的质量比为1:1至1:4，按1mg至15mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂A计加入有机溶剂A，混合液放置在水浴中恒温搅拌0.5小时至2小时；第二步，搅拌后的混合液经水浴减压旋蒸去除有机溶剂A，有机溶剂A去除后按25mg至40mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂B计加入有机溶剂B混匀后进行过滤；第三步，过滤后的滤液经水浴减压旋蒸浓缩至在温度为20℃时的相对密度为1.31至1.34，然后低温真空干燥至质量百分含水量小于等于3%，得到香青兰总黄酮磷脂复合物。

2.根据权利要求1所述的香青兰总黄酮磷脂复合物，其特征在于磷脂为天然磷脂或合成磷脂；或/和，天然磷脂为大豆磷脂；或/和，有机溶剂A为自甲醇、乙醇、四氢呋喃和二氧六环中的一种以上；或/和，有机溶剂B为自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种以上。

3.根据权利要求1或2所述的香青兰总黄酮磷脂复合物，其特征在于第一步中，水浴温度为30℃至40℃，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟；或/和，第二步和第三步中，水浴减压旋蒸的温度为30℃至40℃，水浴减压旋蒸的压力为-0.08MPa；或/和，第三步中，低温真空干燥的温度为30℃至60℃。

4.一种根据权利要求1或2或3所述的香青兰总黄酮磷脂复合物的制备方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，取适量磷脂溶于低沸点的有机溶剂A中，再加入香青兰总黄酮混匀后得到混合液，磷脂和香青兰总黄酮的质量比为1:1至1:4，按1mg至15mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂A计加入有机溶剂A，混合液放置在水浴中恒温搅拌0.5小时至2小时；第二步，搅拌后的混合液经水浴减压旋蒸去除有机溶剂A，有机溶剂A去除后按25mg至40mg香青兰总黄酮中加入1ml有机溶剂B计加入有机溶剂B混匀后进行过滤；第三步，过滤后的滤液经水浴减压旋蒸浓缩至在温度为20℃时的相对密度为1.31至1.34，然后低温真空干燥至质量百分含水量小于等于3%，得到香青兰总黄酮磷脂复合物。

5.根据权利要求4所述的香青兰总黄酮磷脂复合物的制备方法，其特征在于磷脂为天然磷脂或合成磷脂；或/和，天然磷脂为大豆磷脂；或/和，有机溶剂A为自甲醇、乙醇、四氢呋喃和二氧六环中的一种以上；或/和，有机溶剂B为自三氯甲烷、二氯甲烷或乙醚中的一种以上。

6.根据权利要求4或5所述的香青兰总黄酮磷脂复合物的制备方法，其特征在于第一步中，水浴温度为30℃至40℃，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟；或/和，第二步和第三步中，水浴减压旋蒸的温度为30℃至40℃，水浴减压旋蒸的压力为0.08MPa；或/和，第三步中，低温真空干燥的温度为30℃至60℃。

7.一种使用根据权利要求1或2或3所述的香青兰总黄酮磷脂复合物的香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂，其特征在于原料按重量份数包括香青兰总黄酮磷脂复合物4份、油相3份、表面活性剂和助表面活性剂共6份，表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3︰1至1︰1；该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂按下述方法得到：将所需量的香青兰总黄酮磷脂复合物加入到所需量的油相中并混匀，再加入所需量的表面活性剂和助表面活性剂，在温度为40℃下恒温水浴搅拌至澄清，得到香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂。

8.根据权利要求7所述的香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂，其特征在于油相为辛癸酸甘油单酯、辛酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、油酸乙酯和大豆油中的一种以上；或/和，表面活性剂为Cremophor EL或Tween 80；或/和，助表面活性剂为PEG400或1,2-丙二醇或乙醇；或/和，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟。

9.一种根据权利要求7或8所述的香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂的制备方法，其特征在于原料按重量份数包括香青兰总黄酮磷脂复合物4份、油相3份、表面活性剂和助表面活性剂共6份，表面活性剂和助表面活性剂的质量比为3︰1至1︰1；该香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂按下述方法进行：将所需量的香青兰总黄酮磷脂复合物加入到所需量的油相中并混匀，再加入所需量的表面活性剂和助表面活性剂，在温度为40℃下恒温水浴搅拌至澄清，得到香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂。

10.根据权利要求9所述的香青兰总黄酮磷脂复合物自乳化剂的制备方法，其特征在于油相为辛癸酸甘油单酯、辛酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、油酸乙酯和大豆油中的一种以上；或/和，表面活性剂为Cremophor EL或Tween 80；或/和，助表面活性剂为PEG400或1,2-丙二醇或乙醇；或/和，搅拌速率为2000转/分钟至2400转/分钟。