CN103705929B - 一种生物相容性微乳及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物相容性微乳，其特征在于，包括卵磷脂，胆固醇，胆盐和水，它们的重量比为：1:0.013:1:18。本发明还公开了所述生物相容性微乳的制备方法以及其作为药物载体在制备药物中的用途。

Description

一种生物相容性微乳及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物相容性微乳及其制备方法。

背景技术

微乳（microemulsion，ME）是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例自发形成的一种低黏度、各向同性且热力学稳定的胶体分散体系，外观为透明或半透明，粒径一般介于10～100nm之间，其作为药物的载体，可以解决稳定性差、溶解性差、有刺激性、生物利用度低、药物释放过快等多种问题。尤其能够增加难溶性药物的溶解度，是难溶性药物的理想载体。

微乳作为一种新型药物载体，具有极大的应用潜力。主要具有以下几个优点：

①微乳制剂可以提高难溶性药物的溶解度，并可同时增溶不同极性的药物。

②微乳制剂粒径小，可以有效、快速的通过胃肠道上皮细胞，大大提高药物的生物利用度。

③微乳制剂可以制成多种剂型，包括口服制剂，注射制剂和透皮吸收制剂。

④其处方一经确定，制备方法简单。

微乳制剂尽管在提高生物利用度方面有独到之处，但其存在的问题也不容忽视：微乳中含有大量的表面活性剂和助表面活性剂，它们大多对胃肠道粘膜有刺激性，长期使用可能造成全身慢性毒性反应。因而努力寻找高效低毒的表面活性剂和助表面活性剂，是微乳制剂得以广泛应用的有效途径。

生物相容性药用辅料：

由于药用辅料与药物一同发挥作用，其安全性问题一直是影响其在药物制剂中应用的重要问题。理想的药用辅料应具有以下特性:成型性好、用量小、作用强、生理安全性大、无生物活性、化学性质稳定等。其中具有生物降解性和组织相容性的药用辅料（生物相容性药用辅料）最为理想。具有生物相容性的药用辅料，不与机体发生应答和排异反应，不易产生有害反应；且在机体内溶解性好，能够减少用量，促进药物的吸收利用。内源性物质，指来源于机体，与人的生存和健康息息相关的成分。随着分子生物学和生物化学的不断发展，越来越多的内源性生物活性物质会展现其药用价值，被广泛应用于药品、保健食品和化妆品领域，而内源性物质作为药用辅料应用的较少。目前可用于药用辅料的内源性物质有卵磷脂、胆盐、胆固醇等。

卵磷脂是生命的基础物质，存在于每个细胞之中，更多的是集中在脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官。卵磷脂属于一种混合物，其构成成分包括磷酸、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯以及磷脂。卵磷脂被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”,人类生命自始至终都离不开它的滋养和保护，具有调节血糖、促进神经发育和延缓衰老等功效。

纯净的卵磷脂（磷脂酰胆碱）常温下为一种无色无味的白色固体，由于制取或精制方法、储存条件不同被氧化而呈现淡黄色至棕色。卵磷脂含量在55%以下的大部分应用在保健食品、营养食品中，也可应用做医药辅料。60%-80%大部分应用在化妆品、药用辅料中，90%以上的主要应用在制药行业。目前，我们国内临床上使用的“脂肪乳”原料就是采用卵磷脂，其本质是卵磷脂与水乳化的产物，安全性良好，可用于注射给药。

胆盐是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐。它是胆汁中参与脂肪消化和吸收的主要成分。胆汁中的胆盐有很多功用：乳化脂肪，促进脂肪消化；与脂肪酸结合，促进脂肪酸的吸收；促进脂溶性维生素的吸收；抑制肠道细菌的生长；促进胆固醇的溶解。

胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。胆固醇可作为乳化剂使用，其作用为降低界面张力，形成牢固的界面膜。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种生物相容性微乳；本发明的另一个目的是提供一种生物相容性微乳的制备方法；本发明的另一个目的是提供一种生物相容性微乳作为药物载体在制备药物中的用途。

申请人对生物相容性微乳及其提取方法进行了广泛深入的研究，从而完成了本发明。

本发明提供了：

1.一种生物相容性微乳，其特征在于，包括卵磷脂，胆固醇，胆盐和水，它们的重量比为：1:0.013:1:18。

2.按照项目1的微乳，其中还包括肉豆蔻酸异丙酯，

其中卵磷脂，胆固醇，胆盐，肉豆蔻酸异丙酯和水的重量比为：1:0.013:1:0.3:18。

3.按照项目1的微乳，其中还包括聚氧乙烯氢化蓖麻油，

其中卵磷脂，胆固醇，胆盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油和水的重量比为：1:0.013:1:1:18。

4.按照项目1的微乳，其中还包括聚氧乙烯氢化蓖麻油和肉豆蔻酸异丙酯，其中卵磷脂，胆固醇，胆盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油，肉豆蔻酸异丙酯和水的重量比为：1:0.013:1:1:0.3:18。

5.按照项目4的微乳，其中还包括95%乙醇，其中卵磷脂，胆固醇，胆盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油，肉豆蔻酸异丙酯，95%乙醇，水的重量比为：1:0.013:1:1:0.3:8:18。

本发明微乳中还可以包括聚氧乙烯氢化蓖麻油和/或肉豆蔻酸异丙酯的替代性物质，这些物质对于本领域技术人员来说是已知的。

在本发明的一种具体实施方案中，本发明微乳仅由卵磷脂，胆固醇，胆盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油，肉豆蔻酸异丙酯，95%乙醇，水组成，它们的重量比为：1:0.013:1:1:0.3:8:18。

胆盐/卵磷脂作为混合表面活性剂对难溶性油相胆固醇有良好的增溶作用，并且胆盐/卵磷脂及其降解产物都是在机体生理条件下存在的成分，可被机体完全吸收，具有高度的安全性，并且胆盐与卵磷脂合用时可显著降低卵磷脂降解产物（溶血磷脂）的溶血毒性。所以胆盐、卵磷脂、胆固醇形成的微乳液是良好的药物载体。

本发明生物相容性微乳载药体系基于人体内源性物质（胆盐、胆固醇、卵磷脂）并且用量低，所述生物相容性微乳的优势在于：1.可以有效解决由于微乳表面活性剂含量过高而引起的不良反应（微乳剂表面活性剂的含量一般在30%以上，常用药用辅料具有一定的毒性，常常会引起一系列的不良反应，这也是限制微乳广泛应用的主要原因）。2.配方组成为人体内源性生物相容材料，易被人体接受，不产生应答和排异反应，不易产生有害作用。3.生物相容性材料在体内溶解性好，易被机体吸收，有助于能够提高药物的生物利用度。

本发明也提供了：

6.一种项目1-5任一项中所述微乳的制备方法，包括下面步骤：

（1）按处方比例称取一定量的卵磷脂和任选的聚氧乙烯氢化蓖麻油和/或95%乙醇，溶解；

（2）将处方量胆固醇和任选的肉豆蔻酸异丙酯混合，溶解；

（3）将处方量将胆盐加入水中，溶解；

（4）向步骤（1）制得溶液中加入步骤（2）的溶液，搅拌均匀，再加入步骤（3）的溶液。

7.按照项目6的制备方法，其中步骤（1）按处方比例称取一定量的卵磷脂和聚氧乙烯氢化蓖麻油，优选卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油和95%乙醇。

8.按照项目6或7的制备方法，其中步骤（2）将处方量胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯混合。

9.按照项目6-8任一的制备方法，其中步骤（1）、（2）和（3）所述溶解是在37℃水浴中进行的。

本发明也提供了：

10.项目1-5任一项中所述微乳作为载体在制备药物、保健食品、营养食品或化妆品中的用途。

本发明生物相容性微乳可以应用在保健食品、营养食品中，也可应用做医药辅料。本发明生物相容性微乳还可以作为“脂肪乳”，可用于注射给药。

具体实施方式

下面通过具体实施例详细描述本发明，但是无论如何不得解释为对本发明的限制。

仪器与材料

仪器MD110-2型电子分析天平，81B-2型恒温磁力搅拌器，纳米粒径测定仪（Malvern），8002型水浴锅。

材料PC50卵磷脂（上海太伟药业，批号20120301），胆固醇（美国SIGMA公司，批号MKBD9436V），猪胆盐（北京双旋微生物培养基制品厂，批号20120420），肉豆蔻酸异丙酯（美国SIGMA公司，批号20120322），聚氧乙烯氢化蓖麻油（德国巴斯夫公司，批号512882），95%乙醇（分析纯），双蒸水。

实施例1

（1）按处方比例，称取10克卵磷脂，置于烧杯内，恒温热水浴溶解，磁力搅拌均匀后，备用。

（2）将0.13克胆固醇在恒温热水浴溶解，备用。

（3）将10克胆盐加入18克水中，恒温热水浴溶解，备用。

（4）向步骤（1）制得溶液中缓慢加入步骤（2）的溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，再加入步骤（3）的溶液。即得到本发明的微乳。

实施例2

（1）按上述项目5的微乳处方比例，称取10克卵磷脂，10克聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40），8克95%乙醇，置于烧杯内，37℃水浴溶解，磁力搅拌均匀后，备用。

（2）按项目5的微乳处方，将0.13克胆固醇加入3克肉豆蔻酸异丙酯中，37℃水浴溶解，备用。

（3）按项目5的微乳处方，将10克胆盐加入18克水中，37℃水浴溶解，备用。

（4）向步骤（1）制得溶液中缓慢加入步骤（2）的溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀，再加入步骤（3）制得的溶液。即得到本发明一种优选的微乳。

实验例1

实施例2微乳理化性质：

1.粒径及形态：

采用马尔文粒径仪测定粒径及粒子分布系数PDI值，3次测定粒径分别为：19.03nm，19.23nm，19.20nm。PDI依次为：0.165，0.147，0.147。4万倍电镜视图显示，该微乳的形态为球形小体，大小均匀为纳米级。粒径在10～100nm之间，符合微乳液的定义。

2.稳定性：

（1）高速离心加速实验：取适量所制得的微乳液于离心管中，置于高速离心机中，室温条件下，以3500r·min-1进行离心，离心两次，每次10min，离心后，观察；微乳剂仍保持澄清透明，未见油水分层，表明所制得的微乳液动力学稳定性良好。

（2）50℃水浴对微乳剂稳定性的影响取适量所制得的微乳液于西林瓶内，密封瓶口，置于50℃水浴中观察，经过3天水浴，微乳剂仍保持澄清透明，未见油水分层，表明所制得的微乳高温下性质稳定。

（3）微乳室温外观稳定性的考察将微乳于室温放置三个月，观察现象。结果微乳在室温条件下，未发生分层情况，表明按照优选的微乳处方制备的微乳常温下性质稳定。（4）微乳冷藏外观稳定性的考察将微乳于冰箱（4℃）放置三个月，结果胆固醇微乳在4℃的条件下，未发生分层情况，且无冰片析出，表明按照优选的微乳处方制备的微乳在低温下性质稳定。

实验例2

实施例2微乳生物相容性：

样品配制：

培养液：含10%胎牛血清的RPMI1640培养液。每升培养液中含有RPMI1640培养基粉10.4g，胎牛血清100ml，青霉素10万单位，少量酚红，碳酸氢钠水溶液调至PH值7.0-7.4，加双蒸水配制。

样品液制备：按实施例2制备的微乳2ml，灭菌，加20ml培养液，37℃震荡浸提24h，0.45um无菌微孔滤膜过滤，分装备用。用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液将浸提液稀释为25%、50%、75%、100%的不同浓度。

阴性对照液：37℃放置24h的完全培养液。

阳性对照液：含0.5%苯酚的培养液。

细胞株：小鼠成纤维细胞株L929。

细胞培养：

培养条件：37℃，5%CO2，饱和湿度。

试验方法：MTT法。取处在对数生长期的L929细胞，用培养液稀释制成浓度为5×104/ml的L929单细胞悬液，接种在96孔培养培养板各孔，每孔0.20ml，培养24h，使L929细胞贴壁。吸出溶液，依次加入0.20ml阴性对照液、不同浓度微乳样品液和阳性对照液各6孔。培养48、96、144h后吸出溶液，加入0.20ml新鲜的培养液及20ul的5mg/ml的MTT溶液，轻轻摇匀，37℃温育4h。移出溶液，用0.20ml生理盐水清洗2次，每孔加入0.20mlDMSO（二甲基亚砜），轻轻震荡10min，酶联免疫测定仪于550nm处测定吸光度OD值。

结果：见表-1

表-1

MTT光度法测定的生物相容性微乳液培养L929时相对细胞存活率

一般认为，相对细胞存活率RGR>75%的生物材料对细胞没有毒性影响,实验证明各组样品的相对细胞存活率均高于75%，证明该微乳配方生物相容性良好。

本发明的微乳可以用于提取中药植物中的活性成分。

实施例2的微乳提取穿心莲：

（1）微乳浸渍：称取穿心莲药材20g，量取按照上述实施例2配制的微乳200ml，将二者置于锥形瓶中，振荡，充分接触后，室温浸渍提取4天，抽滤得滤液。

（2）微乳超声：称取穿心莲药材20g，量取上述实施例2配制的微乳200ml，将二者置于锥形瓶中，振荡，充分接触后，超声30min，抽滤得滤液。

乙醇提取穿心莲：

（1）乙醇浸渍：称取穿心莲药材20g，量取60%乙醇200ml，将二者置于锥形瓶中，振荡，充分接触后，室温浸渍提取4天，抽滤得滤液。

（2）乙醇超声：称取穿心莲药材20g，量取60%乙醇200ml，将二者置于锥形瓶中，振荡，充分接触后，超声30min，抽滤得滤液。

不同提取液提取效率比较：

分别精密量取上述穿心莲提取液各2ml于10ml离心管中，精密加入6ml甲醇，涡旋振荡仪振荡1min，静置，于10000r离心10min，将上清液转移至25ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45μm滤膜滤过，上高效液相色谱仪测定含量。色谱条件如下：

色谱柱:迪马C18色谱柱（150mm，5μm）,流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱:0-5min，22%-25%A，5-30min，25%-30%A，30-50min，30%-40%A；流速：1.0ml·min-1；检测波长采用双波长为225nm和254nm；进样量:20μL；柱温:25℃。

各提取液的含量测定结果如下：

由上述结果可知，微乳作为提取溶媒，无论是浸渍法，还是超声法，对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的提取效率均高于乙醇。其中对脱水穿心莲内酯的提取更具优势作用，发挥了本发明微乳对多组分提取的优势。更为突出的优势在于，微乳作为溶媒浸渍提取的效率明显高于超声提取，说明该提取溶媒可降低能耗，是一种优质高效的提取溶媒。

脱水穿心莲内酯具有抗炎解热作用，能抑制炎症时毛细血管通透性的增高和炎性水肿的发展,并能减少炎性渗出量，临床用于呼吸道及肠道感染性疾病有较好疗效。本发明生物相容性微乳提取脱水穿心莲内酯的优势还在于本发明含有脱水穿心莲内酯的生物相容性微乳可以直接口服用于治疗肠道感染性疾病。

实验例3

微乳提取液和乙醇提取液口服生物利用度比较

血样采集及处理

家兔清醒状态下耳缘静脉注射麻醉剂乌拉坦溶液（5ml/kg），麻醉后将其捆绑于兔台，分离颈部总动脉，埋管，分别采集空白血样各约5ml,肝素抗凝，采集空白血后每组分别灌胃给药实施例2微乳浸渍穿心莲提取液和乙醇浸渍穿心莲提取液各5ml，分别于灌胃后5min,15min,30min,45min,1h,1.5,2h,3h,4h,5h,7h采集血样约5ml，肝素抗凝。

将上述采集的血样置于4℃低温离心机中3000r/min离心20min，分离血浆，备用。精确取给药后各时间点血浆1ml，置于10ml具塞离心管中加入6ml三氯甲烷，于漩涡混合器中混合5min后，3000r/min离心20min，精确吸取三氯甲烷层4ml，于37℃水浴挥干，残留物用1ml甲醇超声溶解，过0.45μm滤膜，进高效液相测定含量。

标准曲线的制备

精密称取穿心莲内酯对照品5.mg于50ml容量瓶中甲醇定溶至刻度，配成储备液备用。取7支空白10ml具塞离心管，每管分别精确加入空白血浆1ml，再分别精确加入标准品储备液8，16，24，32，40，48，56μl，按照上述血样处理方法处理，按面积归一法计算得标准曲线方程。色谱条件C18柱（150mm，5μm，迪马公司）；流动相：甲醇：水（50：50）；流速：1.0ml/min,检测波长λ=225nm，柱温为室温。

按照标准血样的配制方法，在本试验的色谱条件下，线性范围为（0.1-2.3μg/ml），以样品峰面积对浓度作图，经线性回归得标准曲线方程：A=1.8394C-0.3068(R2=0.9924)线性关系较好。

结果：

两种提取溶液提取的穿心莲内酯血药浓度

灌胃实施例2微乳提取液和乙醇提取液后，家兔血浆中的穿心莲内酯的浓度见表1

表1灌药后血药浓度

两种溶液提取的穿心莲内酯生物利用度参数见表2。

表2生物利用度参数

微乳提取的穿心莲内酯口服后血药浓度上升快，于30min时血药浓度达到峰值，在0.5h到2h时间段血药浓度处于一个较高水平，在2h到3h时间段又形成一个吸收峰，在3h后血药浓度开始下降，形成明显的双吸收峰。乙醇提取的穿心莲内酯口服灌胃家兔后，血药浓度上升速度较缓，于3h时血药浓度达到峰值，之后血药浓度迅速下降。与乙醇提取液相比，微乳提取液的相对生物利用度可达142%，说明微乳提取液的口服吸收利用程度明显高于乙醇提取液。

实验例4

采用二甲苯所致小鼠耳肿胀试验表征提取液的抗炎作用;采用细菌脂多糖所致大鼠发热试验表征提取液的解热作用

一、对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

实验小鼠按体重随机分为模型组、醋酸泼尼松组、实施例1微乳组和对比例1乙醇组，每组7只。实验动物连续给药4d，模型组给予自来水，醋酸泼尼松组按0.2g/kg，微乳组和醇提组均按2g/kg（相当于生药）给药，实验前禁食(不禁水)5h。末次给药后30min乙醚浅麻醉,用定量加样器于小鼠右耳正反两面各精确涂布0.01mL二甲苯,30min后脱颈椎处死动物。用直径5mm打孔器在其左右耳对称部位取下耳片,称重,以两耳重量差值代表肿胀度。分别计算二甲苯致小鼠耳肿胀的肿胀度和抑制率。结果见表3。

表-3.对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

注:与空白组比较,**P<0.01;与醇提组比较,^△△P<0.05

二、对LPS所致大鼠发热的影响

实验分组同小鼠耳肿胀实验。以电子体温计测定大鼠肛温，每日1次，连续3日;第4日连续测定3次，每次间隔0.5h，测定完毕后选取合格动物(3次测定平均体温介于37～38℃，且波动在0.3℃内)进行试验。所有动物按300μg/kg皮下注射LPS生理盐水溶液，注射后3.5h测定体温，并按体温分层随机均分为4组，阿司匹林0.2g/kg组及模型对照组、微乳2g/kg组、醇提2g/kg组。4h时灌胃给予相应药物（模型组给予常水），4.5h、5.5h时测定肛温，计算与初始体温相比的体温变化值。结果见表-4.

表-4.对LPS所致大鼠发热的影响

注:与空白组比较,**P<0.01;与醇提组比较,△P<0.01△△P<0.05

综上，本发明制备的微乳作为提取溶媒，用于提取穿心莲，具有更高的提取效率，同时提取液的口服生物利用度更高。微乳提取穿心莲具有能耗低、提取效率高、提取物吸收利用度高而且抗炎能力强等突出优势。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种生物相容性微乳，其特征在于，包括

卵磷脂，胆固醇，胆盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油，肉豆蔻酸异丙酯，95％乙醇和水，其中卵磷脂，胆固醇，胆盐，聚氧乙烯氢化蓖麻油，肉豆蔻酸异丙酯，95％乙醇，水的重量比为：1:0.013:1:1:0.3:8:18。

2.一种权利要求1所述微乳的制备方法，包括下面步骤：

(1)按处方比例称取一定量的卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油和95％乙醇，溶解；

(2)将处方量胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯混合，溶解；

(3)将处方量胆盐加入水中，溶解；

(4)向步骤(1)制得溶液中加入步骤(2)的溶液，搅拌均匀，再加入步骤(3)的溶液。

3.按照权利要求2的制备方法，其中步骤(1)、(2)和(3)所述溶解是在37℃水浴中进行的。

4.权利要求1所述微乳在制备药物、保健食品、营养食品或化妆品中的用途。