CN103191424A

CN103191424A - 一种提高畜禽免疫功能的黄芪多糖纳米脂质体及其制备方法

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Publication number: CN103191424A
Application number: CN2012102036827A
Authority: CN
Inventors: 王德云; 袁海星; 范云鹏; 余韵; 胡元亮; 刘家国; 赵晓娟
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明涉及一种提高畜禽免疫功能的黄芪多糖纳米脂质体及其制备方法，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。用硫酸铵梯度法制备黄芪多糖纳米脂质体，制备的黄芪多糖纳米脂质体包封率高达83.41％。黄芪多糖纳米脂质体能明显提高动物抗体效价、淋巴细胞增殖及细胞因子含量，效果显著好于黄芪多糖。本发明黄芪多糖纳米脂质体显著提高了黄芪多糖的免疫增强活性。

Description

一种提高畜禽免疫功能的黄芪多糖纳米脂质体及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种黄芪多糖纳米脂质体的制备方法，及其提高畜禽免疫功能的应用，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。

二、背景技术

黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是黄芪的主要有效成分，在调节免疫、抗病毒、抗衰老等方面具有重要的作用。目前大多数的黄芪多糖制剂在使用过程中药物在到达作用部位之前，已被降解代谢或排除，血液中有效药物浓度水平维持时间短，因此需要大剂量或是连续给药。研究新型的黄芪多糖制剂或是选择一种高效的载体以提高治疗效果并降低使用剂量，对黄芪多糖的临床应用具有重要意义。脂质体具有靶向释药、缓释、无免疫原性、降低药物毒副作用等优势，近年来作为药物载体已被广泛研究。

脂质体是由类脂质制备的具有复层或单层单位膜结构的小囊，其结构类似生物膜，在体内能生物降解。由于脂质体成份为磷脂和胆固醇，也是生物细胞膜的主要成分，属机体内源性物质，具有良好的生物相容性和可降解性、无毒和无免疫原性。脂质体的结构与生物细胞相似，易被细胞吸附、融合、脂交换、内吞而被细胞摄取；且具有一定的弹性和变形性，比相同粒径的其他类型的纳米粒容易进入病灶组织。因此，脂质体已成为现代药物载体研究的内容之一。同时脂质体还可用作免疫佐剂，早在1974年由Allison等首次报道脂质体能增强机体的体液和细胞介导的免疫应答，对疫苗的增效作用可达数十倍甚至更高。

脂质体具有靶向释药、缓释、无免疫原性、降低药物毒副作用等优势。脂质体是微米级类脂质双分子层结构，大小于1～100μm之间。如果在脂质体的类脂质双分子层中加入适当表面活性剂，则可形成纳米脂质体。纳米脂质体除粒径小于普通脂质体外，还具有高度的自身变形性，更易于提高其生物利用度。如将黄芪多糖包封于脂质体中，脂质体包封黄芪多糖后在动物体内可以持续释放，可以有效维持黄芪多糖在机体内的有效浓度，提高了其生物利用度。因而脂质体可以作为黄芪多糖的一种优良载体。

本发明首次将黄芪多糖制备成脂质体，并将其和动物疫苗一起应用，建立了黄芪多糖纳米脂质体的制备方法，发现黄芪多糖纳米脂质体能显著提高黄芪多糖的免疫增强作用，提高其生物利用度。

三、发明内容

技术问题

本发明针对黄芪多糖在体内代谢快，难以维持长时间的高血药浓度问题，提供一种黄芪多糖纳米脂质体的制备方法，达到显著提高黄芪多糖免疫增强作用目的，并应用于畜禽临床。

技术方案

将大豆卵磷脂150mg、胆固醇25mg、吐温-80 37.5mg、乙醇10m1超声混合。在温度43℃，恒流泵用60r/min将混合后的液体滴入10ml 0.25mol/L硫酸铵溶液中，滴入过程中摇床振荡。用旋转蒸发仪减压蒸发，除去混合液中的乙醇。在1L的PBS溶液(V_{空白脂质体}∶V_PBS＝1∶100)中透析24h，使脂质体内外形成硫酸铵梯度，制得空白脂质体。取黄芪多糖15mg溶入10ml PBS溶液中，得黄芪多糖溶液，取10mL黄芪多糖溶液与10mL空白脂质体混合，50℃摇床振荡10min，将所得脂质体过0.45μm微孔滤膜2次，0.22μm微孔滤膜2次，即得黄芪多糖纳米脂质体。

将黄芪多糖纳米脂质体和新城疫疫苗一起应用于鸡，能显著提高血清中新城疫抗体效价、淋巴细胞增殖、细胞因子IL-2和IFN-γ的含量，对提高畜禽免疫功能，防制疾病具有重要应用价值。

有益效果

动物疫病主要靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存在刺激性强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点，从中药中开发免疫增强剂已成为热点。

黄芪多糖是黄芪的主要活性成分，不仅能增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，而且能促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌。黄芪多糖做为免疫增强剂和抗病毒药物已被广泛应用于兽医临床。但是，目前大多数的黄芪多糖制剂在使用过程中药物在到达作用部位之前，已被降解代谢或排除，有效血药浓度水平维持时间短，因此需要大剂量或是连续给药，但是连续给药有很多缺点。利用脂质体包封黄芪多糖，可以使黄芪多糖在动物体内持续释放，维持长时间的血药浓度，提高其生物利用度。

本发明采用硫酸铵梯度法将黄芪多糖制备成纳米脂质体，包封率较高、粒径小，不仅便于药物的吸收，而且可以使药物缓慢地释放，有效地延长了药效，能显著提高动物细胞免疫功能和体液免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.黄芪多糖纳米脂质体的制备国内外未见报道，本发明提供了一种黄芪多糖纳米脂质体的制备方法，填补了国内外研究的空白。

2.黄芪多糖纳米脂质体的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施，证明黄芪多糖的免疫增强作用弱，通过制备成纳米脂质体后能够显著提高其免疫增强活性，表现为明显提高抗体效价、淋巴细胞增殖、细胞因子IL-2和IFN-γ的含量，与黄芪多糖比，在免疫后期效果更好，具有较强的缓释作用，从而增强动物体免疫功能。因此，黄芪多糖纳米脂质体可以作为研制新型免疫增强剂的材料，为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。

四、具体实施方式

1.黄芪多糖纳米脂质体的制备

1)空白脂质体的制备

①将大豆卵磷脂150mg、胆固醇25mg、吐温-80 37.5mg、乙醇10mL，超声混合；

②在温度43℃，恒流泵用60r/min将混合后的液体滴入10mL 0.25mol/L硫酸铵溶液中，滴入过程中摇床振荡；

③用旋转蒸发仪减压蒸发，除去混合液中的乙醇；

④在1L的PBS溶液(V_{空白脂质体}∶V_PBS＝1∶100)中透析24h，使脂质体内外形成硫酸铵梯度，制得空白脂质体。

2)载药

①取APS 15mg溶入10ml PBS溶液中。

②取10mL APS溶液与空白脂质体等体积混合，50℃摇床振荡10min。

③将所得脂质体过0.45μm微孔滤膜2次，0.22μm微孔滤膜2次，得黄芪多糖纳米脂质体。

3)黄芪多糖纳米脂质体包封率的测定采用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量从而计算出脂质体的包封率。

①标准曲线精密称取干燥至恒定质量的葡萄糖10mg定容于100mL量瓶中，得质量浓度为0.1mg/mL葡萄糖对照品溶液。在6支带塞试管中分别加入葡萄糖对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸馏水至2mL，再各加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，迅速垂直液面加入浓硫酸5mL，混匀后在沸水浴中加热15min，冷却后用分光光度仪在490nm处测定吸光度值(以0mL葡萄糖对照品溶液管吸光度值为校正值)，以葡萄糖质量浓度对吸光度值进行线性回归，得回归方程Y＝13.066X-0.0121，R²＝0.9976。

②APS脂质体混悬液中多糖总含量测定精密吸取100μL APS脂质体，加蒸馏水至2mL，按制备标准曲线的方法测得吸光度值，将吸光度值求平均数后代入回归方程，计算，即得浓度C_总＝0.67mg/mL。

③APS脂质体包封的多糖含量测定吸取APS脂质体1mL于100mL PBS溶液(V_脂∶V_PBS＝1∶100)中透析24h，得包封的APS脂质体，精密吸取透析后的脂质体100μL，加蒸馏水至2mL，按制备标准曲线的方法测得吸光度值，将吸光度值求平均数后代入回归方程，计算，即得浓度C_样＝0.56mg/mL。

④包封率计算包封率＝C_样×100％/C_总＝0.56×100％/0.67＝83.41％。

4)粒度测定

采用激光散射粒度测定仪测定粒径，平均粒径为89nm左右。

2.黄芪多糖纳米脂质体免疫增强活性比较

以根据最佳制备条件制备的黄芪多糖纳米脂质体(APSL)为研究对象，以黄芪多糖(APS)和空白纳米脂质体(BL)作为对照，测定了它们对鸡新城疫(ND)疫苗免疫后机体抗体效价、淋巴细胞增殖、1gG和IgM含量、细胞因子IL-2和IFN-γ含量的影响。

(1)动物分组及处理

350只14日龄雏鸡随机均分为7组，分别为APSL的高(4mg·mL^-1)、中(2mg·mL^-1)、低(1mg·mL^-1)3个剂量组、APS组(4mg·mL^-1)、BL组、疫苗组(VC)和空白对照组(BC)。14日龄时，除空白对照组外均用NDV-IV系疫苗免疫，28日龄二免。在首次免疫的同时，1～5组分别肌肉注射相应药物，0.5mL/只，疫苗组和空白对照组注射等量生理盐水。分别于首免前和首免后7、14、21、28d检测外周血T淋巴细胞增殖和血清HI抗体效价的动态变化，于首免后14、21、28d检测血清中IL-2和IFN-γ含量的变化。

(2)免疫应答试验血清抗体效价的变化

在首免后第14天，APSL高、中剂量的抗体水平均高于APS组，显著高于其它四个组(P＜0.05)；在免首后21和28天，APSL高、中剂量的抗体水平均显著其它五个组(P＜0.05)；在免首后7和14天，APS组的抗体效价显著高于BL、疫苗组和空白组(P＜0.05)(见表1)。

表1免疫应答试验抗体效价的动态变化(Log₂)

Table 1 The dynamic changes of antibody titers in in immune response test(Log₂)

H＝高剂量组，M＝中剂量组，L＝低剂量组，以下表同。

H＝high dose，M＝medium dose，L＝low dose.The followings are the same.

(3)免疫应答试验外周血淋巴细胞增殖的变化

在首免后14～28天，APSL中剂量组的A₅₇₀值均为最高，并显著高于低剂量、APS、BL、疫苗组和空白组(P＜0.05)；在首免后第7、14和28天时，APS组的A₅₇₀值均显著高于疫苗组和空白组(P＜0.05)。(见表2)。

表2免疫应答试验外周血淋巴细胞增殖的动态变化(A₅₇₀值)

Table 2 The dynamic changes of lymphocyte proliferation in immune response test(A₅₇₀ value)

(4)血清中IFN-γ浓度的变化

在首免后第21和28天，APSL中剂量组的IFN-γ浓度均为最高，并显著高于高剂量组以外的其它所有组(P＜0.05)；在首免后第14、21、28天，高、中剂量组均显著高于低剂量组(P＜0.05)；APSL高剂量组仅在第28天时显著高于APS组，其它时间点均不显著；在首免后第14和21天，APS组的IFN-γ浓度显著高于疫苗组和空白组(P＜0.05)(见表3)。

表3血清中IFN-γ浓度的变化(pg·mL^-1)

Table 3 The changes of concentrations of IFN-γ in every group(pg·mL^-1)

(5)血清中IL-2浓度的变化

在首免后第21和28天，APSL中剂量组的IL-2浓度均为最高，并显著高于高剂量组以外的其它所有组(P＜0.05)；在首免后第21、28天，高、中剂量组均显著高于低剂量组；高剂量组仅在第28天时显著高于APS组，其它时间点均不显著；在首免后第14、21、28天，APS组的IL-2浓度显著高于疫苗组和空白组(P＜0.05)(见表4)。

表4血清中IL-2浓度的变化(pg·mL^-1)

Table 4 The changes of concentrations of IL-2 in every group(pg·mL^-1)

根据以上动物试验结果可以得出黄芪多糖纳米脂质体不仅可以提高鸡淋巴细胞增殖、血清抗体效价和细胞因子IL-2和IFN-γ含量，从而提高机体免疫功能。说明本发明涉及的蜂胶黄酮脂质体可用于提高禽机体免疫功能以达到抵抗疾病的目的。综合评价以中剂量(2mg·mL^-1)效果最好，从临床生产成本考虑每只鸡用量为注射1mg。

Claims

1.一种黄芪多糖纳米脂质体的制备方法，采用硫酸铵梯度法制备黄芪多糖脂质。

(1)采用硫酸铵梯度法制备黄芪多糖纳米脂质体(以制备20mL黄芪多糖纳米脂质体为例)。

将大豆卵磷脂150mg、胆固醇25mg、吐温-80 37.5mg、乙醇10ml超声混合。在温度43℃，恒流泵用60r/min将混合后的液体滴入10ml 0.25mol/L硫酸铵溶液中，滴入过程中摇床振荡。用旋转蒸发仪减压蒸发，除去混合液中的乙醇。在1L的PBS溶液(V_{空白脂质体}∶V_PBS＝1∶100)中透析24h，使脂质体内外形成硫酸铵梯度，制得空白脂质体。取黄芪多糖15mg溶入10ml PBS溶液中，得黄芪多糖溶液，取10mL黄芪多糖溶液与10mL空白脂质体混合，50℃摇床振荡10min，将所得脂质体过0.45μm微孔滤膜2次，0.22μm微孔滤膜2次，即得黄芪多糖纳米脂质体。

(2)按照上述方法制备黄芪多糖纳米脂质体的平均包封率为83.41％士0.15％，平均粒径89nm左右。

2.权利要求1所述方法获得的黄芪多糖纳米脂质体能够显著提高动物免疫功能，具有较好免疫增强活性。