CN102973508A

CN102973508A - 一种复方黄芪多糖脂质体长效注射液及其制备方法

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Publication number: CN102973508A
Application number: CN2012104264279A
Authority: CN
Inventors: 贺培益; 陈圆圆; 刘升; 柴保国; 高义
Original assignee: Henan Soar Veterinary Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Henan Soar Veterinary Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明属于药物制剂技术领域，具体公开了一种复方黄芪多糖脂质体长效注射液及其制备方法。每100ml注射液中，其有效成分是：黄芪多糖1～2g、磷脂5～7g、胆固醇1～3g、磷酸二鲸蜡酯0.1～1g、螺内酯0.01～0.02g。本发明制备出的复方黄芪多糖长效注射液是利用磷脂和胆固醇的固有的性质，通过借助外界的一定手段，将黄芪多糖用脂质体的方法进行包裹，得到了类似于生物膜的双分子结构，具有很好的组织相容性、细胞亲和性、提高了黄芪多糖的稳定性，并且拥有很好的缓释性效果，在临床应用中，该注射液和原黄芪多糖注射液相比，在相同的用量下，黄芪多糖注射液仅使用一次即可达到常规注射液2次的良好的效果。

Description

一种复方黄芪多糖脂质体长效注射液及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种复方黄芪多糖脂质体长效注射液及其制备方法。

背景技术

脂质体主要由磷脂和胆固醇构成。磷脂普遍存在于动植物细胞的原生质和生物膜中，是构成细胞膜的主要成分之一，对生物膜的生理活性和机体的正常代谢有重要的调节作用。

胆固醇是一种中性脂质，在各类动物细胞中含量较高。它在膜中主要与磷脂结合起着改变磷脂层性质的作用，它趋向于减弱膜中类脂类与蛋白质之间的连接，作用主要是调节膜的流动性。

脂质体作为载体，其价值在于能包合各种物质，其包合方式完全是物理性的，水溶性的物质可包封在脂质体的水层结构中，而脂溶性物质和两亲性的物质，则结合于脂质体双分子层中。而对于在水相和有机相都不能溶解的物质或者在两相中都溶解非常好的物质不易采用脂质体进行包封。被包封的脂质体能提高被包裹药物的稳定性，并且能达到缓释的效果。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。其性甘、微温，入肺、脾经、具有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿、敛疮生肌等功效。它含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、微量元素等多种生物活性物质，其中黄芪多糖是其主要生物活性成分，它主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。黄芪多糖可显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能，显著增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能，促进血清溶血素形成，提高空斑形成细胞的溶血功能和明显的碳粒廓清作用和明显增加脾重量。另外黄芪多糖是一种干扰素诱导剂，其抗病毒原理：刺激巨噬细胞和T细胞的功能，使E环形成细胞数增加，诱生细胞因子，促进白细胞介素诱生，而使动物机体产生内源性干扰素，从而达到抗病毒的目的。然而在实际应用中黄芪多糖粉易吸潮，稳定性差，难保存，而黄芪多糖注射液是03版《兽药质量标准》上常用于鸡传染性法氏囊病辅助治疗的注射用药品，使用方法为肌肉注射，每日一次，连用两日，通过走访了解到，连需两日注射会带来鸡子严重的应激反应，引起产蛋鸡产蛋量的显著下降。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一次给药就能有效控制疾病、有效提高生物利用度的复方黄芪多糖脂质体长效注射液及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种复方黄芪多糖脂质体长效注射液，每100ml注射液中，其有效成分是：黄芪多糖1～2g、磷脂5～7g、胆固醇1～3g、磷酸二鲸蜡酯0.1～1g、螺内酯0.01～0.02g。

所述的磷脂为卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油。优选为卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰甘油，最优选为注射用卵磷脂。

制备方法：所述制法为薄膜分散法、逆向蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法中的一种。

优选采用超声分散法，即将黄芪多糖在PBS缓冲液中溶解，加至磷脂、胆固醇、磷酸二鲸蜡酯、螺内酯共溶的有机溶剂制成的溶液中，蒸发除去有机溶剂，残液经超声波分散，分离出脂质体，重新混悬于100ml PBS缓冲液中，然后过滤、分装，即得。

所述的有机溶剂为氯仿、乙醚、乙醇、丙二醇、甲醇、丙醇的一种或者几种。优选为氯仿和乙醚，最优选为氯仿。

本发明制备出的复方黄芪多糖长效注射液是利用磷脂和胆固醇的固有的性质，通过借助外界的一定手段，将黄芪多糖用脂质体的方法进行包裹，得到了类似于生物膜的双分子结构，具有很好的组织相容性、细胞亲和性、提高了黄芪多糖的稳定性，并且拥有很好的缓释性效果，在临床应用中，该注射液和原黄芪多糖注射液相比，在相同的用量下，黄芪多糖注射液仅使用一次即可达到常规注射液2次的良好的效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1：1g黄芪多糖在pH7.4磷酸盐缓冲液中溶解，然后加至溶入5g注射用卵磷脂、1g胆固醇、0.1g磷酸二鲸蜡酯、0.01g螺内酯的氯仿制成的溶液中，蒸发除去氯仿，残液经超声波分散，分离出脂质体，重新混悬于100ml pH7.4磷酸盐缓冲液中得淡黄色的脂质体混悬液，然后0.45μm微孔滤膜过滤2次，0.22μm无菌过滤后分装，即得复方黄芪多糖长效注射液。

实施例2：1.5g黄芪多糖在pH7.4磷酸盐缓冲液中溶解，然后加至溶入6g二硬脂酰磷脂酰甘油、2g胆固醇、0.5g磷酸二鲸蜡酯、0.015g螺内酯的乙醚制成的溶液中，蒸发除去乙醚，残液经超声波分散，分离出脂质体，重新混悬于100ml pH7.4磷酸盐缓冲液中得淡黄色的脂质体混悬液，然后0.45μm微孔滤膜过滤2次，0.22μm无菌过滤后分装，即得复方黄芪多糖长效注射液。

实施例3：2g黄芪多糖在pH7.4磷酸盐缓冲液中溶解，然后加至溶入7g注射用卵磷脂、2g胆固醇、0.5g磷酸二鲸蜡酯、0.02g螺内酯的氯仿制成的溶液中，蒸发除去氯仿，残液经超声波分散，分离出脂质体，重新混悬于100ml pH7.4磷酸盐缓冲液中得淡黄色的脂质体混悬液，然后0.45μm微孔滤膜过滤2次，0.22μm无菌过滤后分装，即得复方黄芪多糖长效注射液。

以上实施例中，所述PBS缓冲液按本领域常规方法配制，例如1L、pH7.4的PBS配方：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.42g、氯化钠(NaCl)：8g、氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，高温高压灭菌后室温保存。

包封率测定

吸取0.5 mL本发明复方黄芪多糖长效注射液于10 mL锥形离心管中，添加0.5 mL鱼精蛋白(10 mg·mL^-1)搅匀。静置3 min，加入3 mL生理盐水，在室温条件下离心30 min(3000 r/min)。上清液以生理盐水定容至10 mL，取l mL此溶液，测定其多糖含量，即游离药物量。沉淀以3 mL 10％triton-100溶解，并补充生理盐水至10 mL。取1 mL此溶液，测定其多糖含量，即包封药物量。计算公式为：包封率=(1-C_f/C_总)×100％，C_f为游离药物量；C_总为包封药物量与游离药物之和。多糖含量的测定采用苯酚-浓硫酸法，经测定，实施例1、2、3的包封率依次为26.94％、45.02%、56.66%。

为验证本发明所述复方黄芪多糖长效注射液的特性，特进行如下试验。

1.试验材料

试验药物：

本发明实施例3制备的复方黄芪多糖长效注射液。

黄芪多糖注射液，河南牧翔动物药业有限公司，批号20111101。

鸡传染性法氏囊病病毒诊断试剂盒，购自河南百奥生物科技有限公司，批号20120508。

鸡传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒，购自河南百奥生物科技有限公司，批号20120508。

鸡传染性法氏囊病毒 IBDV强毒株（毒号：BC-6/85），法氏囊阳性，购自中国兽药监察所。

试验动物：1日龄海兰蛋鸡雏共250只，购自河南雏鹰集团，均未经法氏囊疫苗免疫，试验前经鸡传染性法氏囊病病毒诊断试剂盒检测均为阴性。

动物饲养：动物饲料，购自郑州市嘉吉饲料有限公司。试验鸡均饲养在标准鸡舍，自由采食与饮水。

2.方法

2.1疾病模型的预试

将 IBDV 强毒株 BC-6/85 按照菌种分发证书上的毒力用灭菌生理盐水稀释至1000BID(BID：法氏囊感染剂量)。取饲养至24日龄健康非免疫、体重接近的鸡40羽，分4组，随机分成低感组、中感染组、高感染组和健康对照组。感染组经点眼共0.05ml、0.10ml、0.15ml接种1000IBD病毒液。每天观察记录鸡的精神状态、临床症状、发病情况及死亡情况，连续观察5d，确定复制疾病模型的最佳条件为点眼共0.05ml。

2.2 试验动物分组与处理

将30日龄的供试鸡随机分为4 组，每组 30 只，自由采食与饮水。除健康对照组外，其余组通过点眼共接种IBD病毒液0.05 mL的方式进行攻毒，攻毒24h后立即给药，分组与给药情况详见表1。

2.3观察指标

攻毒后第3d将各组试验鸡每组取5只剖杀，取出待检鸡的法氏囊，置于某容器内，加五倍体积左右的生理盐水或干净自来水，充分剪碎或匀浆，静置 5 分钟，然后按照鸡传染性法氏囊病病毒诊断试剂盒上的说明书要求检测，结果显示采集的样品中均检测到法氏囊病毒的存在。攻毒后第10d将每组抽取10只静脉采血，分离血清，按照鸡传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒的要求检测抗体水平，所有试验鸡称重、剖杀，观察病理变化，分别采集法氏囊观察病理变化，计算病变发生率:将采集的法氏囊、脾脏、胸腺称重，计算法氏囊等免疫器官指数。

鸡免疫器官指数测定：在试验结束时，各组剩余的鸡全部处死，用分析天平称重（先期死亡者称取尸重），剖检取出法氏囊、脾脏、胸腺，用滤纸吸净表面水分，电子天平（感量 0.1g）称重，按以下公式计算法氏囊指数、脾指数、胸腺指数。

法氏囊指数（mg/g）= 法氏囊重（mg）/体重（g）；

胸腺指数（mg/g）= 胸腺重（mg）/体重（g）；

脾指数（mg/g）= 脾脏重（mg）/体重（g）。

3.试验结果

3.1发病情况、临床症状与病理变化

攻毒3d后，不同组鸡的法氏囊眼观病理变化见表2。治疗组（即长效组和常规组）和健康对照组鸡精神、饮食欲基本正常。攻毒对照组的鸡基本上均发病，呈现典型症状，病鸡精神萎顿、呆立或伏卧，聚堆怕冷，全群呈极度衰弱状态，采食量明显减少，饮水量增加，排白色或水样稀便，有的鸡泄殖腔周围沾污粪便；有2只鸡死亡，死亡鸡剖检，法氏囊严重发黄、有胶冻样渗出物、剖开后内部呈豆腐渣样、有大量出血点，法氏囊经鸡传染性法氏囊病病毒诊断试剂盒检测均含有显示阳性。

攻毒后，第10天不同组鸡抗体水平见表3，免疫器官指数差异性比较见表4。

由上述试验结果表明，本发明复方黄芪多糖长效注射液和常规黄芪多糖注射液均对鸡感染IBDV强毒株后有一定的保护作用，攻毒后给药组鸡出现病理变化的数量少，且病变程度轻于攻毒对照组，另外通过对比长效组和常规组的数据，不难看出复方黄芪多糖长效注射液能达到和常规黄芪多糖注射液同样的具有抗病毒和提高免疫力的功能，而剂量和使用次数均为常规剂量的一半，这大大减少了实际操作中的人力和物力，以及动物的应激性，可用于传染性法氏囊的治疗和预防。

Claims

1.一种复方黄芪多糖脂质体长效注射液，其特征在于每100ml注射液中，其有效成分是：黄芪多糖1～2g、磷脂5～7g、胆固醇1～3g、磷酸二鲸蜡酯0.1～1g、螺内酯0.01～0.02g。

2.如权利要求1所述的复方黄芪多糖脂质体长效注射液，其特征在于：所述的磷脂为卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油。

3.一种制备如权利要求1或2所述的复方黄芪多糖脂质体长效注射液的方法，其特征在于所述制法为薄膜分散法、逆向蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法中的一种。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：采用超声分散法，即将黄芪多糖在PBS缓冲液中溶解，加至磷脂、胆固醇、磷酸二鲸蜡酯、螺内酯共溶的有机溶剂制成的溶液中，蒸发除去有机溶剂，残液经超声波分散，分离出脂质体，重新混悬于100ml PBS缓冲液中，然后过滤、分装，即得。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为氯仿、乙醚、乙醇、丙二醇、甲醇、丙醇的一种或者几种。