CN101463079A - 小牛软骨蛋白、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属新生小牛软骨蛋白、制备方法和用途。通过对新生小牛软骨蛋白的提取分离纯化，获得一组具有活性的功能蛋白。该蛋白质具有抗衰老、抗肿瘤功能、防治关节疾病和乳腺小叶增生的功能。是一种保健品或者可以制备成药物。可制成口服制剂，如片剂、缓释胶囊、渗透泵控释片或分散片。也可制成膏剂、膜剂、脂肢体、微囊或乳房按摩消毒液等。

Description

小牛软骨蛋白、制备方法及其应用

技术领域

本发明属多功能性食品技术领域，涉及一种多功能小牛软骨蛋白质、制备方法及其应用的研究。

背景技术

刚出生的雄性奶牛(胎牛)，因为没有产奶的功能常常被处死。上海市肿瘤研究所在本世纪初组成由一批中、高级科技人员参加的研究小组共同参与研究小牛软骨类物质的应用开发研究。从小牛软骨组织中抽提以及纯化而获得了既有抑制新生血管形成，又具有抗氧化功能的活性蛋白。经过该中心实验室多年的研究，试验结果证实小牛软骨组织中存在具有抑制鸡胚血管生长及抗氧化的功能等一系列生物活性蛋白质。

上海市肿瘤研究所委托经由国家卫生部确认的保健品检测单位，江苏东南大学验证小牛软骨蛋白对人体具有延缓衰老的抗氧化功能，试验结果证实该类物质可降低老龄大鼠血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)的含量以及提高大鼠血中过氧化物歧化酶活力，从而证实其为一种具有抗氧化功效的产品。同样，经上海同济大学对果蝇生存检测，结果提示实验组比对照组延长平均寿命3.5天(p<0.05)，提示该产品具有延长果蝇寿命的功效.另外，通过毒理学检测提示小牛软骨蛋白属无任何毒性的保健品委托江苏东南大学及上海同济大学鉴定)。小牛软骨蛋白具有抗氧化及延缓衰老等功效。

上海市肿瘤研究所的肿瘤特殊项目检测中心实验室从小牛软骨所提取及纯化的活性蛋白质均由其自主创建的方法并于国际上报道的方法截然不同。国外有报道从鲨鱼软骨中提取的鲨鱼软骨素具有类似作用，但是鲨鱼作为一种野生动物，其来源限制了它的发展。而小牛可以人工饲养，来源广泛价廉，便于推广。综上所述，牛软骨组织内无任何神经，血管以及淋巴系统而仅含有组织间质，故而不存在任何重金属及毒性物质。通过从食用牛软骨中提取的小牛软骨蛋白，无任何毒性作用，并能对人体起到一定的延缓衰老及抗氧化等保健作用。小牛软骨蛋白长期用于防治骨性关节炎，同时对乳腺小叶增生有明显疗效。

发明目的：

本发明为提供一种从食用牛软骨中提取的小牛软骨活性蛋白，制备方法和用途，该小牛软骨活性蛋白具有延缓衰老及抗氧化等保健作用，也有抑制新生血管和辅助治疗肿瘤乳腺癌的功能。长期用于防治骨性关节炎，同时对乳腺小叶增生有明显的辅助治疗作用。可以用于制备保健品和药物。

发明内容：

本发明的目的是提供一种从食用牛软骨中提取的小牛软骨活性蛋白；

本发明的目的还提供一种上述小牛软骨活性蛋白的制备方法；

本发明的另一目的是提供上述小牛软骨活性蛋白的用途，该小牛软骨活性蛋白是具有延缓衰老、抗氧化等保健作用，也有抑制新生血管和辅助治疗肿瘤的功能。长期用于防治骨性关节炎，同时对乳腺小叶增生有明显的辅助治疗作用。可以用于制备保健品或制备保健肿瘤的药物.

本发明的小牛软骨活性蛋白制备方法为新生小牛耳朵去皮、洗净，捣碎并浸泡于1mol/L的醋酸缓冲液过夜，通常浸泡8-16小时，所述的小牛耳朵和醋酸缓冲液的重量(kg)和体积(L)比为1:0.5-2。离心去沉淀，取上清液部分加入2倍体积的饱和硫酸铵进行分级沉淀(硫酸铵的终饱和度为50％)。置4℃，3-5h，使其充分沉淀离心，如3000rpm离心20min，弃上清液，以生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵，所述的小牛耳朵、生理盐水和饱和硫酸铵的重量(kg)和体积(L)比为1:0.1:0.05，置4℃3-5h，[此时，(NH4)₂SO4的饱和度为33％]重复上述步骤过程2次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以0.02％mol/L pH7.4中文命名(PBS)溶解至装入透析袋。对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止，所述的新生小牛耳朵重量(kg)和所述的PBS的体积(L)比为1:0.01-1。冷冻干燥获得粗小牛软骨蛋白。所获得的粗小牛软骨蛋白经过分子筛柱在37℃，用PBS洗脱进行分离，可得多种蛋白组分，分别命名为小牛软骨蛋白A，小牛软骨蛋白B，小牛软骨蛋白C以及小牛软骨蛋白D和小牛软骨蛋白E一系列的组分，所述的分子筛推荐采用Sephacryl S-200分子筛。经过电泳及Bradford蛋白定量测定，小牛软骨蛋白A含量为5％-30％，小牛软骨蛋白B含量为5％-20％，小牛软骨蛋白C含量为0.5-10％，小牛软骨蛋白D含量为0.2％-5％，小牛软骨蛋白E含量为0.1％-3％。其分子量分别在66Kd、32Kd、32Kd、16Kd、8Kd。

所述的小牛软骨蛋白是一种活性蛋白，无任何毒性，其良好的抗衰老、抗肿瘤功能可作为保健品的主要成分。防治骨性关节炎，同时对乳腺小叶增生有明显的辅助治疗作用，可以用于制备治疗的药物。可制成口服制剂，如片剂、缓释胶囊、渗透泵控释片，分散片。也可制成膏剂，膜剂，脂肢体，微囊，乳房按摩消毒液等。

附图说明：

图1小牛软骨蛋白的分离。

纵坐标为吸光度，横坐标为洗脱时间，单位为(/5min)，随着时间的推移，分子量大的组分先洗脱下来，分子量小的组分最后洗脱出来，根据依次洗脱出的5个峰依次命名为小牛软骨蛋白A，小牛软骨蛋白B和小牛软骨蛋白C以及小牛软骨蛋白D和小牛软骨蛋白E。

图2小牛软骨蛋白对肺腺癌细胞系(SPC-A-I)的杀伤作用。

图①为对照组(生理盐水组)，图②为小牛软骨蛋白对肺腺癌细胞系(SPC-A-I)的杀伤作用，图③为小牛软骨蛋白A对肺腺癌细胞系(SPC-A-I)的杀伤作用，图④为小牛软骨蛋白B对肺腺癌细胞系(SPC-A-I)的杀伤作用。

图3小牛软骨蛋白对人乳腺癌细胞(MDA—MB-231)的杀伤作用。

图①为小牛软骨蛋白对人乳腺癌细胞(MDA—MB-231)的杀伤作用，图②为对照组(生理盐水组)。

图4小牛软骨蛋白对人肠癌细胞(Sw620)的杀伤作用。

图①为小牛软骨蛋白对人人肠癌细胞(Sw620)的杀伤作用，图②为对照组(生理盐水组)。

图5小牛软骨蛋白对人胃癌细胞(SGC-7901)的杀伤作用。

图①为小牛软骨蛋白对人胃癌细胞(SGC-7901)的杀伤作用，图②为对照组(生理盐水组)。

图6小牛软骨蛋白对鸡胚血管的抑制功能。

图①为小牛软骨蛋白组对照组(未加小牛蛋白时)，图②为小牛软骨蛋白对鸡胚血管的抑制功能(1天后)，图③为小牛软骨蛋白A组对照组图(未加小牛蛋白A时)，④为小牛软骨蛋白A对鸡胚血管的抑制功能(1天后)，图⑤为小牛软骨蛋白B组对照组(未加小牛蛋白B时)，图⑥为小牛软骨蛋白B对鸡胚血管的抑制功能(1天后)。

图7小牛软骨蛋白对人乳腺癌细胞株BCAP-37.

采用种鼠肿瘤组织匀浆法，皮下种植肿瘤的雌性Balb/c裸鼠模型的生长抑制作用。根据抑瘤率公式：抑瘤率＝(肿瘤模型组平均肿瘤体积—治疗组平均肿瘤体积)/肿瘤模型组平均肿瘤体积，计算抑瘤率。种植肿瘤二个月后，结果提示，小牛软骨蛋白组的抑瘤率为31.84％。

具体实施方式

通过下述实施例可以进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。

实施例1：小牛软骨蛋白的制备

新生小牛耳朵10kg去皮、洗净，捣碎并浸泡于1mol/L的10L醋酸缓冲液过夜，通常浸泡12-16小时。离心去沉淀，取上清液部分加入2倍体积的饱和硫酸铵进行分级沉淀(硫酸铵的终饱和度为50％)。4℃，3h以上，使其充分沉淀离心(3000rpm)，20min，弃上清，以1L生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵500ml。置4℃3h以上，[此时，(NH4)₂SO4的饱和度为33％]重复上述步骤过程2次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以0.02％mol/LpH7.4PBS溶解至500ml装入透析袋。对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。冷冻干燥待用。

实施例2：小牛软骨蛋白的分离

取100mg小牛软骨蛋白溶于1ml蒸馏水中，经过Sephacryl S-200分子筛柱在37℃，用PBS洗脱进行分离，可得五个峰，即为几种分子量大小不等的蛋白成分，命名为小牛软骨蛋白A，小牛软骨蛋白B和小牛软骨蛋白C以及小牛软骨蛋白D和小牛软骨蛋白E。(见图例1)

实施例3：小牛软骨蛋白电泳定性分析

方法参照：萨姆布鲁克等，分子克隆试验指南，第二版，1995年，科学出版社，中国，北京。称取小牛软骨蛋白A、小牛软骨蛋白B、小牛软骨蛋白C、小牛软骨蛋白D、小牛软骨蛋白E各10ml，在含1.0毫升双重蒸馏水的试管中充分溶解。配置上样液0.02ml。试样和标准蛋白一起做12％SDS-聚丙酰烯胺凝胶电泳，电泳条件100v约1小时。电泳结束后对聚丙酰烯胺凝胶进行考马斯亮蓝R-250染料染色及脱色。所得结果与标准蛋白比对，小牛软骨蛋白A、小牛软骨蛋白B、小牛软骨蛋白C、小牛软骨蛋白D、小牛软骨蛋白E分子量分别在66Kd、32Kd、32Kd、16Kd、8Kd。

实施例4：Bradford法测定蛋白含量

Bradford试剂盒购于上海基星生物科技公司。其结果为小牛软骨蛋白A含量为7.696％，小牛软骨蛋白B含量为7.68％，小牛软骨蛋白C含量为0.66％，小牛软骨蛋白D含量为0.45％，小牛软骨蛋白E含量为0.16％

实施例5：果蝇生存试验(同济大学医学院营养与保健食品研究所提供数据)

实验动物：Oregon K野生型黑腹果蝇

剂量分组：根据受试物人体推荐剂量(0.2克/人·日)，设1个空白对照组和4个剂量组，各剂量组培养基含小牛软骨蛋白浓度分别为：0.002％、0.007％、0.020％和0.060％。

试验方法：收集8小时内新羽化的果蝇成虫，乙醚麻醉下区分雌雄随机分组，分a别称重后进行试验。每组用果蝇400只，雌雄各半。对照组给予普通玉米粉培养基；试验组分别给予含0.002％、0.007％、0.020％和0.060％小牛软骨蛋白的培养基。试验条件：气温25±1℃，相对湿度45～75％。每四天更换新鲜培养基一次。每天观察记录果蝇生存数和死亡数，直到果蝇全部死亡为止。计算出死亡天数、平均寿命和平均最高寿命等三个指标。

试验结果：

小牛软骨蛋白对果蝇生存试验统计表

a 由寿命最长的20只果蝇计算得出。

※ 试验组与对照组相比寿命延长，统计学检验有显著性差异(p<0.05)。

提示：

※ 在本试验条件下，0.020％浓度组雌蝇与对照组比较分别见到延长平均寿命和平均最高寿命3.4天和1.5天；0.002％浓度组雄蝇与对照组比较分别见到延长平均寿命3.5天，统计学检验均有显著性差异(p<0.05)。

实施例6：安全性毒理学检测(南京公卫预防医学研究所提供实验数据)

目的：对该产品进行食品毒理学安全性评价。

项目：1、急性毒性试验；

      2、遗传毒性试验(鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验；

骨髓微核试验；小鼠精子畸形试验)；

     3、30天喂养试验。

检测结果及判定：

1、小牛软骨蛋白雌、雄小鼠经口LD₅₀均>21.5g/kg·bw，根据急性毒性(LD₅₀)剂量分级标准，该样品属无毒级。

2、遗传毒性试验(Ames试验、骨髓微核试验、小鼠精子畸形试验)的阴性结果表明，未见小牛软骨素有遗传毒性作用。

3、大鼠30天喂养试验结果表明，与对照组比较上海肿瘤特殊项目检测中心送检的小牛软骨蛋白三个剂量组动物的一般情况、体重、食物利用率、血液学、血液生化学、脏体比及其病理组织学检查均未见异常，其中高剂量组雌性大鼠的摄入剂量为1.123g/kg·bw/d，雄性大鼠为1.086g/kg·bw/d，分别相当于人体推荐摄入量(3.33mg/kg·bw/d)的337倍和326倍。

实施例7：小牛软骨蛋白、小牛软骨蛋白A、小牛软骨蛋白B对肺腺癌细胞系(SPC-A-I)的杀伤作用

对照组为体外培养的肺腺癌细胞系(SPC-A-I)，实验组为加入100mg的小牛软骨蛋白的肺腺癌细胞系(SPC-A-I)，可以观察到小牛软骨蛋白对体外培养的癌细胞具有明显的抑制作用。(见图例2。)

实施例8：小牛软骨蛋白对人乳腺癌细胞(MA—MB-231)的杀伤作用

对照组为体外培养的乳腺癌细胞(MDA—MB-231)，实验组为加入100mg的小牛软骨蛋白的乳腺癌细胞(MDA—MB-231)，可以观察到小牛软骨蛋白对体外培养的癌细胞具有明显的抑制作用。(见图例3。)

实施例9：小牛软骨蛋白对人人肠癌细胞(Sw620)的杀伤作用

对照组为体外培养的人肠癌细胞(Sw620)，实验组为加入100mg的小牛软骨蛋白的人肠癌细胞(Sw620)，可以观察到小牛软骨蛋白对体外培养的癌细胞具有明显的抑制作用。(见图例4。)

实施例10：小牛软骨蛋白对人胃癌细胞(SGC-7901)的杀伤作用

对照组为体外培养的人胃癌细胞(SGC-7901)，实验组为加入100mg的小牛软骨蛋白的人胃癌细胞(SGC-7901)，可以观察到小牛软骨蛋白对体外培养的癌细胞具有明显的抑制作用。(见图例5。)

实施例11：小牛软骨蛋白、小牛软骨蛋白A、小牛软骨蛋白B对新生血管的抑制作用

对照组为6日龄鸡胚，实验组为加入100mg的6日龄鸡胚，可以观察到小牛软骨蛋白对鸡胚新生血管具有明显的抑制作用。(见图例6。)

实施例12：小牛软骨蛋白对肺腺癌细胞系(SPC-A-I)裸鼠模型的生长抑制作用4只裸鼠分别注射(SPC-A-I)肺腺癌细胞系，其中试验组为2只裸鼠局部注射小牛软骨蛋白(见右侧)，对照组2只裸鼠为仅注射生理盐水(见左侧)。种植肿瘤二个月后，结果提示对照组出现明显的肿瘤组织，而试验组未见明显肿瘤生长。(见图例7。)

实施例13：小牛软骨蛋白缓释胶囊

将1g的小牛软骨蛋白与0.03乙基纤维素、0.03g羟甲基纤维素和0.1g乳糖用80％的乙醇溶解，回收乙醇，60℃干燥1小时，再加入0.1g乳糖，用95％的乙醇制粒，过20目筛，50℃烘0.5小时，过20目筛整粒，装成0.28g.粒^-1的胶囊。

实施例14：小牛软骨蛋白散剂

由以下原料制成散剂，小牛软骨蛋白适量、麝香草酚4-8g、氧化锌40-50g、白陶土300-400g、薄荷油10-30ml、滑石粉800-900g、淀粉100-120g、香精0.5-1ml、乙醇10-20ml、水杨酸苯胺40-50g、硼酸100-200g。制备方法为：取水杨酸苯胺、硼酸、氧化锌、白陶土、淀粉研匀，的混合物(1)；取混合物(1)少量，将麝香草酚、香精、薄荷油、乙醇的混合液喷入、研匀后，加入以上混合物混匀，得混合物(2)，另取少量滑石粉，缓缓加入小牛软骨蛋白研匀后，得混合物(3)，将(3)加到(2)中混匀，最后添加滑石粉，过100-200目筛，混匀即得。

实施例15：小牛软骨蛋白片剂

由以下原料制成片剂(mg/每片)，小牛软骨蛋白适量小牛软骨蛋白适量、甘露醇200-400、糖精钠1-4、淀粉浆适量、薄荷油1-2、硬脂酸镁8-12、玉米淀粉8-10.制备：将小牛软骨蛋白与甘露醇混合，将糖精钠溶于少量纯水，与淀粉浆混合。上述混合粉末与淀粉浆混合制粒，60度干燥，过16目筛，加入薄荷油、硬脂酸镁与玉米淀粉，混匀。放置24h以上，用5/8时平冲压片。

实施例16：小牛软骨蛋白软膏剂

由以下原料制成软膏剂，小牛软骨蛋白适量、十六醇、十八醇混合物、月桂醇硫酸钠、白凡士林、液状石蜡、甘油、对羟基苯甲酸乙酯。制法：取月桂醇硫酸钠、甘油、对羟基苯甲酸乙酯、及水混合溶解，加热至80度左右，缓缓加入至加热到同温的十六醇、十八醇混合物、白凡士林、液状石蜡相中，不断搅拌制成乳剂基质，将小牛软骨蛋白加入混匀。

实施例17：小牛软骨蛋白渗透泵控释片

由以下原料制成渗透泵控释片，小牛软骨蛋白适量、乳糖、乙基纤维素、乙醇、硬脂酸镁、滑石粉、醋酸纤维素、PEG400适量、丙酮适量。制备：(1)制备片芯，以乙基纤维素乙醇液作粘合剂，将小牛软骨蛋白与乳糖混匀制成软材，过16目筛制备湿粒，于60度烘干，过16目筛整粒，加入硬脂酸镁、滑石粉混匀后进行压片；(2)包衣，取片芯适量，置包衣锅内转动，吹热风，用喷枪将适当浓度的醋酸纤维素溶液喷雾在滚动的片芯上，待片面稍湿润即用冷风吹干，热风干燥，如此重复直至包衣膜厚度符合要求。(3)激光打孔，用激光打孔机打孔，使孔径符合规定(0.1-1.0mm)。

实施例18：小牛软骨蛋白膜剂

由以下原料制成膜剂，小牛软骨蛋白适量、PVA100-150g、甘油10-20g。制备：取适量PVA，加入甘油，蒸馏水浸泡至充分膨胀，在水浴上加热溶解，加入烷基苯醇醚，搅拌均匀，脱气泡，制成药膜。

实施例19：小牛软骨蛋白脂质体

取二棕榈酰磷脂酰胆碱及胆固醇(1：1)溶于氯仿与异丙醇混合液中，将含有小牛软骨蛋白的缓冲液加入上述混合液中，在浴式超声仪内进行超声处理5分钟，然后于45度下减压除去有机溶媒，加适量缓冲液，再继续减压蒸发10-15分钟除去微量有机溶媒，通过葡聚糖凝胶柱分离除去未包载的小牛软骨蛋白。

实施例20：小牛软骨蛋白微囊

由以下原料制成微囊，小牛软骨蛋白适量、硬脂酸10-20g、乙基纤维素乙醇液10-20ml、乙醇适量。制备：取硬脂酸放入小喷雾器在水浴中熔化，将小牛软骨蛋白、乙基纤维素乙醇液、乙醇的混合物加入，然后用5-10磅/口寸²压缩空气将液体喷入适宜的接受器中，待冷却与沉降完全后收集，得大小8-100微米的球形微囊。

实施例21：小牛软骨蛋白乳房消毒按摩液的制备

称取卵磷脂250mg，胆固醇60mg，加入5ml乙醇中搅拌溶解为溶液1。将小牛软骨蛋白25mg，维生素C3mg，海藻糖8mg溶于25ml磷酸缓冲液PBS得到溶液2。将溶液2在磁力搅拌下45℃，搅拌，同时将溶液1缓缓加入溶液2中，搅拌5分钟后温度下调至40℃。并搅拌至乙醇挥发尽，在停止搅拌40℃孵化8分钟。制得小牛软骨蛋白脂质体。取卡波姆250mg，甘油1g，加入少量PBS使之溶解，取三乙醇胺330mg，加入葡萄柚籽提取物GSE 40mg溶解于37mlPBS中，将其加入卡波姆溶液搅拌时卡波姆溶胶均匀。将小牛软骨蛋白脂质体和卡波姆溶胶以5—10：1搅拌并混匀使之成均质液体。

Claims (12)

1.一种小牛软骨蛋白，其特征在于，它是以胎牛的软骨组织为原料提取而成的活性蛋白。

2.如权利要求1所述的一种小牛软骨蛋白，其特征在于，所述的胎牛的软骨组织为小牛软骨。

3.如权利要求1所述的小牛软骨蛋白，其特征在于所述的提取是下述步骤(1)，或者(1)和(2)的二种步骤：

(1)小牛软骨蛋白的去皮、洗净，捣碎后浸泡于的醋酸缓冲液，搅拌，离心去沉淀，取上清液用硫酸铵进行三级分级沉淀，沉淀用PBS(磷酸盐缓冲溶液)溶解，透析去除铵离子，洗脱液冷冻干燥获得粗小牛软骨蛋白；

(2)将(1)获得的粗小牛软骨蛋白采用分子筛进行分离，获得分子量分别在66Kd、32Kd、32Kd、16Kd和8Kd的小牛软骨蛋白A、小牛软骨蛋白B、小牛软骨蛋白C、小牛软骨蛋白D和小牛软骨蛋白E。

4.如权利要求3所述的小牛软骨蛋白，其特征在于，所述的小牛软骨蛋白A、小牛软骨蛋白B、小牛软骨蛋白C、小牛软骨蛋白D和小牛软骨蛋白E的重量比例为17：17：1：1：1。

5.如权利要求3所述的小牛软骨蛋白，其特征在于.所述的小牛软骨蛋白中含有小牛软骨蛋白A的重量为5％-30％，含有小牛软骨蛋白B的重量为5％-20％，含有小牛软骨蛋白C的重量为0.5-10％，含有小牛软骨蛋白D的重量为0.2％-5％，含有小牛软骨蛋白E的重量为0.1％-3％。

6.一种如权利要求1所述的小牛软骨蛋白的制备方法，其特征在于采用步骤(1)，或者(1)和(2)的二种步骤：

(1)新生小牛耳朵去皮、洗净，捣碎并浸泡于1mol/L的醋酸缓冲液浸泡8-16小时，所述的小牛耳朵和醋酸缓冲液的重量kg和体积L比为1:0.5-2；离心去沉淀，取上清液部分加入2倍体积的饱和硫酸铵分别进行三级分级沉淀，在4℃置3-5小时，沉淀离心分离；以生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵，所述的小牛耳朵、生理盐水和饱和硫酸铵的重量kg和体积L比为1:0.1:0.05，置4℃3-5h，重复上述步骤过程2次；然后以0.02％mol/LpH7.4PBS(磷酸盐缓冲溶液)溶解，装入透析袋进行透析至无NH4+为止，所述的新生小牛耳朵重量kg和所述的PBS(磷酸盐缓冲溶液)的体积L比为1:0.01-1；冷冻干燥粗小牛软骨蛋白；

(2)将(1)获得的粗小牛软骨蛋白采用分子筛柱在37℃，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)洗脱进行分离，分别获得分子量在66Kd、32Kd、32Kd、16Kd和8Kd的小牛软骨蛋白A、小牛软骨蛋白B、小牛软骨蛋白C、小牛软骨蛋白D和小牛软骨蛋白E。

7.如权利要求6所述的小牛软骨蛋白的制备方法，其特征在于，所述的分子筛是Sephacryl S-200～500的分子筛。

8.一种如权利要求1所述的小牛软骨蛋白用于制备保健品或制备抗肿瘤的药物。

9.如权利要求8所述的小牛软骨蛋白的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤的药物是如权利要求6所述的肿瘤是肺腺癌细胞。

10.如权利要求8所述的小牛软骨蛋白的用途，其特征在于，所述的或抗肿瘤的药物含有如权利要求8所述的小牛软骨蛋白A或小牛软骨蛋白B。

11.如权利要求8所述的小牛软骨蛋白的用途，其特征在于，所述的保健品或抗肿瘤的药物是口服制剂、膏剂、膜剂、脂肢体、微囊或按摩消毒液。

12.如权利要11所述的小牛软骨蛋白的用途，其特征在于，所述的口服制剂是片剂、缓释胶囊、渗透泵控释片或分散片。

Images