CN108096309A - 一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治鸡球虫病散剂的配方，它是由如下重量份的原料配比制成：青蒿浸膏1.5份、二氧化硅1份、蒙脱石6份，以青蒿浸膏和蒙脱石为原料药，以二氧化硅为辅料制备该散剂，能够较好的防治鸡球虫病。

Description

一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法。

背景技术

鸡球虫病是由艾美尔属（Eimeria）球虫引起的一种世界性的常见禽类寄生虫病，雏鸡感染球虫后，大量肠上皮细胞受损、出血, 严重者造成死亡，给养鸡业造成巨大的经济损失，数额高达数十亿美元，目前临床用于防治鸡球虫病的药物有30多种,但是有关药物残留问题的担忧，尤其是耐药性的产生导致疗效逐渐下降，迫使科研工作者必须重新寻找高效、低毒、不易产生耐药性的抗鸡球虫新药，或研究抗鸡球虫疫苗，中兽药以其应用范围广、作用效果明显、毒副作用小、低耐药性、无药物残留等优势吸引了大量研究者的关注。

青蒿为菊科植物黄花蒿的干燥地上部分，味苦性寒,有清热解暑,除虱,截疟等功能，主治暑邪发热,阴虚发热,夜热早凉,骨蒸劳热,疟疾寒热和湿热黄疽等，大量实验与临床研究进一步证明，其有效成分为青蒿素，青蒿素不仅是有效的抗疟新药,而且对弓形体病、鸡球虫病、血吸虫、附红细胞体病及卡氏肺抱子虫等寄生虫也有明显的防治作用，如饲料中添加青蒿素可显著抑制卵囊增殖，抑制卵囊孢子化，影响卵囊壁的形成，减少球虫对肠道造成的损伤，蒙脱石又名微晶高岭土，是一种硅铝酸盐矿物质，蒙脱石的药用机理主要取决于它的吸附性能和胶凝特性，蒙脱石可以吸附于消化道黏膜，固定病原微生物，使其破裂、脱水以至失活；蒙脱石可清除病原微生物产生的毒素和机体所排放的有害因子，使病灶处于有利于恢复的环境中，因此，本专利开展青蒿提取物联合蒙脱石防治鸡球虫病的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种原料来源广泛、价格低廉、使用效果好的防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法。

本发明的技术方案是一种防治鸡球虫病散剂的配方，它是由如下重量份的原料配比制成：青蒿浸膏1.5份、二氧化硅1份、蒙脱石6份。

所述的制备方法包括如下步骤：

步骤1：通过石油醚低温提取法获取青蒿浸膏，备用；

步骤2：分别准确称量下述重量份的各物质：青蒿浸膏1.5份、二氧化硅1份，蒙脱石6份备用；

步骤3：将上述剂量的青蒿浸膏与二氧化硅室温粉碎混合，充分搅拌，使其均匀，过80目筛；

步骤4：将步骤3中获得的粉末与上述剂量的蒙脱石均匀混合，过80目筛，获得青蒿散剂。

所述的青蒿浸膏的青蒿素含量不少于15%。

本发明具有以下优点：本发明提供了一种防治鸡球虫的中兽药，青蒿散剂的配方及其制备方法；以青蒿浸膏和蒙脱石为原料药，以二氧化硅为辅料制备该散剂，能够较好的防治鸡球虫病。

附图说明

图1为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对雌性Wistar大鼠体重的影响对照图。

图2为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对雄性Wistar大鼠体重的影响对照图。

图3为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对对照组wistar大鼠肝脏的影响图。

图4为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对灌胃组wistar大鼠肝脏的影响图。

图5为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对对照组wistar大鼠肾脏的影响图。

图6为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对灌胃组wistar大鼠肾脏的影响图。

图7为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对对照组wistar大鼠脾的影响。

图8为本发明一种防治鸡球虫病散剂的配方及其制备方法的青蒿散对灌胃组wistar大鼠脾的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实验部分

1.1组方组成：

表1不同的配比制备的新制剂（W/W）：

配方	青蒿提取物	二氧化硅	蒙脱石
				1	1	1	3
2	1.5	1	3
				3	2	1	3
4	1	1	6
				5	1.5	1	6
6	2	1	6
				7	1	1	9
8	1.5	1	9
				9	2	1	9
对照	0	1	0
				生产厂家	江苏斯威森生物医药工程研究中心有限公司	山东省寿光市昌泰微纳化工厂	寿光中联精细蒙脱石有限公司

1.2 制备方法：

青蒿浸膏的制备：

称取适量青蒿叶粗粉，置于反应容器中，用超声波预处理20min；加入石油醚，其中温度控制在50℃，以800r/min的搅拌速度搅拌2h，过滤收集提取液，重复四次，合并提取液；提取液在60℃水浴加热，真空浓缩至无石油醚，获得提取物浸膏。

青蒿散剂的制备：

分别准确称量青蒿浸膏1.5份，二氧化硅1份，蒙脱石6份，备用，将上述剂量的青蒿浸膏与二氧化硅室温粉碎混合，充分搅拌，使其均匀，过80目筛；将该粉末与上述剂量的蒙脱石均匀混合，过80目筛即得青蒿散剂。

稳定性试验

1.3.1 影响因素试验

1）原样测定

精密称取50 mg青蒿散样品2份于称量皿中，加入少量甲醇溶解，置于10 mL棕色容量瓶中，超声溶解5 min，再用甲醇定容，且使其混匀，将供试品溶液移入5 mL离心管中4 000 r/min离心5 min，然后吸取上清液，用0.2 μm有机滤膜过滤，弃去初滤液，保留后续滤液。待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱，结果见表1-1。

2）光降解试验

准确称取青蒿散样品2份各约20g分别平摊于称量瓶中置于光强度为4500LUX的光箱内分别于第5天和第10天后取出，备用。准确称取上述强光降解青蒿散5天样品50 mg，10天样品50 mg分别置于容量瓶10ml容量瓶中，分别加入少量甲醇后，超声溶解5 min，再用甲醇定容并混匀，将供试品溶液移入5 mL离心管中4 000 r/min离心5 min，然后吸取上清液，用0.2 μm有机滤膜过滤，弃去初滤液，保留后续滤液，待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱，结果见表1-1。

强光照射试验结果表明，青蒿散各考察项目中青蒿素含量并无明显变化，说明本品对光照不敏感，为了能更好的保证产品的质量，拟定避光保存。

3) 高温试验

准确称取丹参酮乳房注入剂样品2份各约20g分别平摊于称量瓶中置于高温60℃的干燥器中室温分别于第5天和第10天后取出，备用。准确称取上述高温降解青蒿散5天样品50mg，10天样品50 mg分别置于容量瓶10ml容量瓶中，分别加入少量甲醇后，超声溶解5 min，再用甲醇定容并混匀，将供试品溶液移入5 mL离心管中4 000 r/min离心5 min，然后吸取上清液，用0.2 μm有机滤膜过滤，弃去初滤液，保留后续滤液，待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱，结果见表1-1。

高温试验表明，青蒿散各考察项目中青蒿素含量有明显下降，说明本品对高温敏感，为了能更好的保证产品的质量，拟定25℃以下保存。

4) 高湿试验

准确称取丹参酮乳房注入剂样品2份各约20g分别平摊于称量瓶中置于高湿75%的干燥器中室温分别放置5天，10天后取出，备用，准确称取上述高湿降解丹参酮乳房注入剂5天样品2g，10天样品2g分别置于60ml分液漏斗中，分别加入30ml乙腈后，用力振摇2分钟，再加入10ml正己烷，用力振摇2分钟，取下层液，再加入正己烷10ml，用力振摇2分钟，静置，分层，取下层溶液，置于蒸发皿中，挥干，用甲醇溶解并定容至25ml，再用0.2µm滤头过滤，待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱，结果见表1-1。

高湿试验结果表明，青蒿散各考察项目均未有明显变化，说明高湿环境对青蒿散影响并不明显，为了能更好的保证产品的质量，拟定在干燥密封环境保存。

5）室温样品测定

准确称取丹参酮乳房注入剂样品2份各约20g分别平摊于称量瓶中置于温度为25℃的干燥器中室温分别于第5天和第10天后取出，备用，准确称取上述高温降解青蒿散5天样品50 mg，10天样品50 mg分别置于容量瓶10ml容量瓶中，分别加入少量甲醇后，超声溶解5min，再用甲醇定容并混匀，将供试品溶液移入5 mL离心管中4 000 r/min离心5 min，然后吸取上清液，用0.2 μm有机滤膜过滤，弃去初滤液，保留后续滤液，待系统稳定后，分别进样1针，用DAD检测器记录图谱，结果见表1-1。

室温试验表明，青蒿散各考察项目中青蒿素含量没有明显变化，说明本品对高温敏感，为了能更好的保证产品的质量，拟定25℃以下保存。

表1-1 青蒿散影响因素试验结果

试验日期：2016年02月27日-2016年03月07日

1.3.2 加速试验

取样品适量，模拟上市包装，置于温度为30 ± 2℃，RH60±5%的环境下6个月，分别在0、1、2、6个月时取样分析，结果见表1-2。

表1-2 青蒿散加速（稳定性）试验30℃试验日期：2016年03月24日-2016年09月24日

加速试验结果表明，6个月内青蒿散考察项目中外观肉眼观察无变化，能够顺利挤压出，各批次无菌检测符合规定，含量变化较小，在合格范围内，符合规定，为了保证产品的质量，本品推荐25℃以下保存。

青蒿散急性毒性实验

本散剂的原料药包括青蒿和蒙脱石，大量研究已经表明此两种物质均为无毒物质，然而对联合使用后毒性大小尚无评价，因此本研究通过青蒿散对Wistar大鼠单次灌胃给药，观察大鼠所产生的急性毒性反应，测定其对大鼠的半数致死量及其95 %的可信限，为青蒿散的安全性评价及临床研究提供基础资料。

）材料与方法

1.1）试验动物

Wistar大鼠60只，体重150-200g，雌雄各半，雌性应未产无孕，购于甘肃中医药大学实验动物中心，饲养大鼠的温度为：223℃，相对湿度为50%-60%，12h自然采光，每笼饲养同性别大鼠5只，用大鼠专用饲料饲喂，自由采食和饮水，饲料和饮水清洁，试验前大鼠饲养7天，并观察其健康状况，所选大鼠应健康，饲养状态良好。

1.2）青蒿散

本试验所用青蒿散由我公司按照上述配方研制。取适量青蒿散，以食用大豆油配制成系列浓度（150，115.5，88.9，68.5，52.7，40.6，31.3，23.3 mg·mL^-1）。

1.3）仪器设备与试剂

磁力搅拌器、电子天平、鼠笼（带饲喂器、饮水器和垫料）。

）试验方法

2.1.1）分组与给药

健康wistar大鼠随机分为6组，每组10只，其中5个给药组，1个为空白对照组，分别按4120、5160、6460、8080和10100 mg/kg体重给药，对照组给予同体积的大豆油灌胃，根据各剂量组大鼠的死亡只数，计算出青蒿散的半数致死量，采用改良寇氏法计算LD₅₀及其95%可信限。

2.1.2）中毒症状观察

动物给药后，每天观察大鼠的采食、饮水、精神、死亡、被毛和自主活动等情况，连续观察7d并记录观察结果，给药当天，至少每2h观察1次，然后每天上午、下午各观察大鼠1次，详细记录大鼠出现毒性反应的时间、持续时间、恢复以及大鼠死亡时间、死亡情况、中毒症状等，对死亡大鼠及时解剖，记录病变情况，并在实验结束时将所有存活大鼠解剖，观察腹腔内液体状况和实质性器官的病理变化。

）试验结果

2.2.1）一般观察

大鼠毒性症状随青蒿散的剂量增加而逐渐加重， 4120 mg/kg剂量组仅见自发活动减少；6460和8080 mg/kg组可见少量个体震颤、强制性-阵挛性抽搐，死亡等症状；10100.0mg/kg 剂量组小鼠可见震颤、强制性-阵挛性抽搐、角弓反张、死亡等症状。4120 mg/kg 剂量组小鼠药一天后即恢复至正常状态；5160 mg/kg 剂量组小鼠药两天后雌性死亡一只；6460和8080 mg/kg组给药两天后雌雄均死亡一只；四天后6460mg/kg组一雄两雌死亡，其余个体均恢复正常；四天后8080mg/kg组两雄两雌死亡，其余个体均恢复正常；10100.0mg/kg剂量组给药一天后死亡两只雌性，两天后死亡四只，四天后死亡两只，剩余两只六天后恢复正常。大部分存活动物出现症状后可逐渐缓解，溶媒对照组小鼠未见异常。

2.2.2）动物死亡情况

给药后观察7d，统计各个剂量组的死亡率，结果见下表。

表1 试验大鼠的给药情况及LD₅₀测定结果

2.3）体重变化

给药后分别于1天、4天和7天观察雌性wistar大鼠的体重变化，结果表明给药1天后各剂量组小鼠体重没有差异；然而给药4天后，除4120 mg/kg组外，其余组的大鼠体重均显著降低；给药7天后同时是这样的差异。

图1青蒿散对雌性Wistar大鼠体重的影响。Control:对照组；A：4120 mg/kg组；B：5160 mg/kg组；C：6460 mg/kg组；D：8080 mg/kg组；E：10100 mg/kg组。

给药后分别于1天、4天和7天观察雄性昆明小鼠的体重变化，结果表明给药1天后各剂量组小鼠体重没有差异；然而给药4天后8080和10100 mg/kg组大鼠的体重显著低于对照组；给药7天后6460、8080和10100 mg/kg组的大鼠个体体重仍旧显著低于对照组和其他组。

图2青蒿散对雄性wistar大鼠体重的影响。Control:对照组；A：4120 mg/kg组；

B：5160 mg/kg组；C：6460 mg/kg组；D：8080 mg/kg组；E：10100 mg/kg组。

2.4）病理学检查

实验过程中对刚死亡个体及时进行观察并解剖，结果表明死亡个体均毛发直立、个体消瘦；解剖可见均有肝脾肿大，胃内有大气泡，实验结束后，大鼠全部处死，选取对照组个体进行剖检，所有实质性器官未发现肉眼可见变化，切片镜检结果见图A、 B、 C。

2.5） LD₅₀计算及其毒性判定

将试验所得数据用Bliss 法（SPSS13.0软件）计算，青蒿散的wistar大鼠LD₅为3608.25mg/kg，LD₅₀为7360 mg/kg，LD₉₅为12608.17 mg/kg， LD₅₀的95 %可信限为6256.38～8658.82mg/kg，根据《化学药物急性毒性试验技术指导原则》，判定该散剂为无毒物质。

图3：对照组，青蒿散对wistar大鼠肝脏的影响；

图4：10100mg/kg灌胃组，青蒿散对wistar大鼠肝脏的影响；

图5：对照组，青蒿散对wistar大鼠肾脏的影响；

图6：10100mg/kg灌胃组，青蒿散对wistar大鼠肾脏的影响；

图7：对照组，青蒿散对wistar大鼠脾的影响；

图8：10100mg/kg灌胃组，青蒿散对wistar大鼠脾的影响。

青蒿散对鸡柔嫩艾美尔球虫病治疗效果的观察

鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳球虫(Eimeria)寄生于肠道所引起的一种危害严重的寄生虫病，给养禽业造成巨大的经济损失，其中致病力最强的为柔嫩艾美尔球虫(E. tenella)和毒害艾美尔球虫(E. nacatrix)，两种球虫都在盲肠下形成大型裂殖子, 引起广泛出血；雏鸡感染球虫后，大量肠上皮细胞受损、出血, 严重者造成死亡，而集约化养鸡场是球虫病爆发的最适宜场所，发病率为50%～70%，死亡率达20%～30%，严重时达到70%～80%，全世界每年因鸡球虫病造成的损失达20亿美元，抗球虫药年消费超过30亿美元。

目前，国内外对该病的防治主要以药物为主,但由于抗药性、药物残留等问题的困扰以及抗生素的限制应用或禁用,给该病的防治带来了前所未有的挑战，接种疫苗从理论上讲是避免药物抗性和解决药物残留的有效办法，然而目前该方法仍旧存在一系列难题，如疫苗会诱导非常严重的反应，影响鸡的正常活动；生产疫苗成本很高；而且疫苗并不是在所有的地区都有效等等，本研究利用青蒿素抑制鸡球虫卵囊增殖，抑制卵囊孢子化，影响卵囊壁的形成等功效，结合蒙脱石的吸附性能和胶凝特性研制出抗鸡球虫新药青蒿散，为禽类球虫病的防治提供了一个新的方法。

1）材料与方法

1.1）实验药物

青蒿散，由我公司自行研制，百球清（妥曲珠利溶液，生产批号：CN25266），购自拜耳四川动物保健有限公司。

）实验动物

1日龄黄羽肉鸡，共90只，购自甘肃省兰州市某种鸡场，笼舍经氨水喷洒后，用甲醛与高锰酸钾熏蒸法消毒，确保试验环境无其他影响因素，饲养时统一供暖及光照，笼养密度均匀，使用未添加任何抗球虫药物饲料饲喂，自由饮水、采食。

）球虫卵囊

柔嫩艾美耳球虫卵囊由中国农业科学院兰州兽医研究所馈赠，实验前将球虫卵囊人工感染无球虫雏鸡传代1次，取盲肠内容物收集卵囊，28℃孢子化48 h后，获得具感染力柔嫩艾美耳球虫卵囊，供试验使用。

）实验分组及处理

1日龄黄羽肉鸡饲喂至12日龄，粪便检查无球虫卵囊；经观察试验用鸡精神状态良好，饮食饮水正常，可以满足试验需要，13日龄时进行称重分组，平衡体重后平均分为6组，每组15只，分别为空白对照组、感染对照组、药物对照组（25mg/L）、青蒿散（ART）低剂量组（100ppm）、ART中剂量组（300 ppm）、ART高剂量组（500 ppm），14日龄时，球虫感染各组鸡每只经口接种5×10⁴个孢子化卵囊，在球虫接种前1天开始用药至试验结束，期间自由饮水，空白对照组与感染对照组的饲料中无药物添加，其他饲养条件保持一致，观察感染后各组鸡群发病情况，包括精神、饮食欲以及粪便等，感染后第3天开始，每天进行粪便卵囊计数，计算每克粪便中卵囊数，即OPG值，第4天开始，进行血便计分。对病死鸡进行剖检，观察盲肠的病变情况并计分。

评价指标

感染后7 d，鸡群称重后采血备用，随后扑杀，剖检试验鸡，观察鸡群盲肠病变，并剖检分离试验鸡盲肠，对盲肠病变进行计分，按抗球虫药效测定方法计算相对增重率、存活率、血便计分、盲肠病变值（病变记分×10）、每克粪便中卵囊数量（OPG）及抗球虫指数（ACI）。

统计分析

所有试验数据均用SPSS 13.0软件进行单向方差分析（One- way ANOVA)，应用excel软件对试验数据整理作图。

结果

2.1 临床症状及眼观变化

攻毒感染后3 d，感染对照组的试验鸡开始出现腹泻，随即各给药组也出现腹泻，但是饮食欲正常，感染后第4—5天，感染对照组开始排出大量血便，病鸡精神沉郁，嗉囊胀满，闭眼缩颈，呆立，羽毛逆立蓬松，饮食欲减退或废绝，并逐渐开始消瘦，并有3只死亡，剖检可见两侧盲肠肿胀充血，纵向剪开盲肠后流出大量鲜红色血液，肠壁变薄，感染后第6天，血便减少，死亡2只，ART低剂量组临床症状及血便情况较感染对照组有所减轻，病鸡精神萎靡，饮食欲减退，ART低剂量组各死亡3只，剖检可见盲肠出血病变，肠壁稍增厚，盲肠内出现盲肠芯，ART中、高剂量组的临床症状和血便情况与ART低、中剂量组相似，然而无死亡情况，药物对照组未出现死亡，临床症状也明显减轻，食欲趋于正常，饮欲增加，也有少量血便或腹泻，感染后第7天处死试验鸡，可见感染对照组盲肠芯的数量较多，盲肠比正常盲肠大、变粗，有灰白色环状病灶，低剂量给药组盲肠病变较感染对照组减轻，有个别盲肠含有盲肠芯，肠粘膜粗糙，可见明显坏死灶，药物对照组、中和高剂量药物组的盲肠内有少量出血，盲肠内容物减少，剖检可见个别盲肠肠壁稍增厚，有少量坏死灶。

评价指标结果

由表1可见，空白对照组、感染对照组、药物对照组、ART低剂量组、ART中剂量组、ART高剂量组、的抗球虫指数以此为：200、40.48、170.9、130.4、179.2、178.7；结果表明ART具有高效的抗球虫效果，且ART中剂量组的抗球虫效果最好，ACI值达179.2。

表1 各组抗球虫指数评价结果

组别	试验鸡数/只	存活鸡数/只	存活率/%	增重率/%	相对增重率/%	病变值	卵囊值	抗球虫指数
									空白对照组	15	15	100	113.0	100.0	0	0	200.0
感染对照组	15	10	66.7	52.3	46.3	32.5	40	40.5
									药物对照着	15	15	100	87.9	77.8	18.7	5	170.9
ATR低剂量组	15	12	80.0	71.4	63.2	21.5	5	130.4
									ART中剂量组	15	15	100	88.1	82.3	15.8	5	179.2
ART高剂量组	15	15	100	86.3	69.7	17.7	5	168.7

Claims (3)

1.一种防治鸡球虫病散剂的配方，其特征在于：它是由如下重量份的原料配比制成：青蒿浸膏1.5份、二氧化硅1份、蒙脱石6份。

2.一种防治鸡球虫病散剂的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤：

步骤1：通过石油醚低温提取法获取青蒿浸膏，备用；

步骤2：分别准确称量下述重量份的各物质：青蒿浸膏1.5份、二氧化硅1份，蒙脱石6份备用；

步骤3：将上述剂量的青蒿浸膏与二氧化硅室温粉碎混合，充分搅拌，使其均匀，过80目筛；

步骤4：将步骤3中获得的粉末与上述剂量的蒙脱石均匀混合，过80目筛，获得青蒿散剂。

3.如权利要求1所述的一种防治鸡球虫病散剂的配方，其特征在于：所述的青蒿浸膏的青蒿素含量不少于15%。