CN101524331A - 一种多糖脂质体、其制备方法及用途 - Google Patents

一种多糖脂质体、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多糖脂质体。本发明的多糖脂质体的制备原料包括多糖、磷脂、胆固醇、表面活性剂和聚乙二醇。本发明的脂质体具有较小的粒径和较高的包封率。本发明还特别是涉及一种香菇多糖脂质体。本发明还提供了制备所述多糖脂质体的方法以及所述多糖脂质体用于制备抗肿瘤或调节免疫作用的药物的用途。

Description

一种多糖脂质体、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种多糖脂质体，特别是涉及一种香菇多糖脂质体；本发明还涉及一种多糖脂质体的制备方法和用途。
背景技术
多糖在自然界中广泛存在，它是生命有机体的重要组成部分，并与维持生命所需的多种生理功能有关。多糖在抗肿瘤、抗感染、心血管疾病、糖代谢、抗衰老等方面均具有独特的作用，同时可提高机体免疫功能。
但在实际临床应用过程中，在很多情况下，多糖药物在体内无法达到预期的理想药理活性。这主要是由于多糖类药物在体内到达病灶部位之前大部分已被代谢，且该类药物不具备针对病灶部位的靶向性。因此，如何使得多糖类药物在到达病灶前尽可能少地被代谢，以及“靶向”到达病灶部位，以获得理想的临床使用效果，成为了该技术领域迫切需要解决的一个普遍性问题。
脂质体给药系统因其在临床应用上显示出的良好效果现已受到广泛关注。但其制备，尤其是具有高包封率的多糖脂质体的制备，至今仍是一个公认的难题。若要获得具有较高的药物包封率并且粒径较小的多糖脂质体，则更难以实现。
发明内容
本发明人经过反复研究，获得了一种包封有多糖类药物的脂质体及其制备方法。同时，本发明人意外地发现，本发明的多糖脂质体，具有较高包封率以及较小的粒径。
为此，本发明提供一种脂质体，该脂质体的制备原料包括多糖、磷脂、胆固醇、表面活性剂和聚乙二醇。
本发明还提供一种制备本发明脂质体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将包括上述磷脂、胆固醇和聚乙二醇的原料溶于有机溶剂中，得到油相混合物；
b.将包括上述多糖和表面活性剂的原料溶于水或水溶液中，得到水相混合物；
c.将水相混合物注入油相混合物中，进行乳化处理；
d.在保护性气体中恒温减压蒸发除去溶剂；
e.加入水或水溶液后水浴孵化。
本发明还提供了一种含有上述脂质体的组合物。
本发明还提供将上述脂质体或含有上述脂质体的组合物用于制备抗肿瘤或调节人体或动物免疫功能的药物的用途。
本发明的多糖脂质体粒径可控制在1μm以下，且分布均匀。本发明脂质体的包封率在65％以上。在体内给予本发明的多糖脂质体比给予未包封成脂质体的多糖的药效活性有明显提高。
附图说明
图1为本发明的实施例1脂质体的粒径分布图。
图2为本发明的实施例1脂质体的透射电镜图(放大十万倍)。
具体实施方式
本申请所公开的化合物、组合物、方法、试剂不限于文中具体所列，它们也可以有多种变化形式。对于本申请具体实施方案、尤其是实施例的描述，旨在帮助对于本发明的理解，而非对本发明范围的限制。
下面结合具体的实施方案，以示例的方式对本发明进行详细描述。
本申请所述“脂质体”是指一种由类脂质双分子层构成的、其中包封有药物活性成分的闭合囊泡。所述脂质体可以是单室脂质体，也可以是多室脂质体。本申请中所述脂质体还包括进行了表面修饰的脂质体。
本申请所述多糖可选自香菇多糖、黄芪多糖、银耳多糖、银耳孢糖、人参多糖、灵芝多糖、猪苓多糖等；优选地，所述多糖为香菇多糖或黄芪多糖；最优选地，所述多糖为香菇多糖。
本申请所述“磷脂”可选自大豆磷脂、卵磷脂、氢化大豆磷脂、氢化卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂，及其混合物等。
本申请所述聚乙二醇可选自聚乙二醇800-5000、磷脂化的聚乙二醇衍生物，及其混合物等；优选地，所述聚乙二醇为聚乙二醇1000-2400；更优选地，所述聚乙二醇为聚乙二醇2000。
本发明所述表面活性剂可选自去氧胆酸盐、波洛沙姆、吐温80，及其混合物等；优选地，所述表面活性剂为去氧胆酸盐，例如去氧胆酸钠或去氧胆酸钾。
制备本发明脂质体的原料还可包括可用于制备脂质体的其他物质，例如，本发明脂质体的一个实施方案中，所述原料还可以包括抗氧化剂，从而增强脂质体的存储稳定性。本发明脂质体的又一个实施方案中，所述原料还可以包括冻干保护剂，以便于将脂质体制成冻干粉针剂。
本发明所述抗氧化剂可以是任何可药用的抗氧化剂，例如维生素E、维生素C、半胱氨酸、蛋氨酸、亚硫酸氢钠或其混合物等。
本发明中所述冻干保护剂可以是任何可药用的冻干保护剂，例如甘露醇、海藻糖、蔗糖、甘氨酸或其混合物等。
本发明脂质体的一个实施方案中，所述原料包括以下配比的各种组分：香菇多糖1份，磷脂30-100份、胆固醇2-20份；优选地，香菇多糖1份、磷脂40-90份、胆固醇5-15份；更优选地，香菇多糖1份、磷脂50-70份、胆固醇5-15份。
除非另有说明，本申请所用“份”均为“重量份”。
本发明脂质体一个实施方案中，所述原料中所述表面活性剂为3-12份。本发明脂质体的另一个实施方案中，原料中的聚乙二醇为1-8份。
本发明脂质体的又一个实施方案中，所述原料中还含有合适用量的抗氧化剂，该用量可由本领域技术人员根据常规已有知识容易地确定，例如可使用1-8份的抗氧化剂。
本发明的脂质体可以以任何适于受试者给药的剂型存在，例如可将本发明的脂质体制成注射剂(例如注射液或粉针剂)、口服制剂(例如片剂、胶囊剂、或颗粒剂等)等。优选地，本发明的脂质体为注射液或粉针剂。
本发明的脂质体可通过包括前述a-e步骤的上述制备方法得到。
其中，如本发明的脂质体需被制成粉针剂，则本发明的脂质体的制备方法还可包括将步骤e所得溶液过滤后进行冷冻干燥的步骤f。
所述步骤a使用的溶剂可以是适于溶解所述原料的任何有机溶剂，例如氯仿或氯仿-甲醇或乙醚。有机溶剂按照能够使得所述原料溶解的量来使用，该用量随原料而变化，通常可由本领域技术人员根据已有常规知识容易地确定。
所述步骤b中的水溶液可以是缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、酒石酸缓冲液等；或氯化钠水溶液，例如生理盐水。所述步骤b中使用的水或水溶液按照能够使得所述原料溶解的量来使用，该用量随原料而变化，通常可由本领域技术人员根据已有常规知识容易地确定。
本发明制备方法中所述步骤c的乳化处理可以是超声处理或高压乳化处理，所述乳化处理通常在低温条件，例如，在10℃以下的温度下进行，乳化的时间以使混合物形成合适的粒径为度，本领域技术人员可通过任何已知的方法确定针对不同粒径的合适的乳化时间，该乳化时间例如可以是3-10min。本发明所述超声处理优选间歇式超声处理；所述高压乳化处理优选循环高压乳化处理。
本发明制备方法中所述步骤d的所述保护性气体可以是氮气等惰性气体。
本发明制备方法中所述步骤d可在适合的温度下旋转蒸发，优选在35-45℃的温度范围内恒温进行。
本发明制备方法中所述步骤e优选在35-50℃的温度范围内进行水浴孵化，更优选地在40℃进行水浴孵化。
本发明制备方法所述步骤e的孵化时间优选为1-2小时。
本发明制备方法所述步骤e的水溶液，可以是氯化钠水溶液、缓冲溶液例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、酒石酸缓冲液等。
优选地，本发明所述b步骤与所述e步骤的反应环境的酸碱度不一致。更优选地，本发明所述b步骤与所述e步骤反应环境的酸碱性相反，所述酸碱性条件相反是表示当所述b步骤与e步骤其中一个步骤的反应环境为酸性时，另一个步骤的反应环境为碱性。特别优选地，所述b步骤的反应环境为碱性，并且所述e步骤的反应环境为酸性。
在本发明制备方法的一个实施方案中，所述a步骤中的原料还包括抗氧化剂。
在本发明制备方法的又一个实施方案中，所述e步骤中的水溶液含有冻干保护剂。冻干保护剂的合适用量可由本领域技术人员通过常规已有知识容易地确定。
本发明的多糖脂质体对于特定的组织或细胞，例如肝脏、骨髓、肿瘤组织、炎症组织等具有明显的靶向性，并具有长循环的特性。
本发明的多糖脂质体可用于治疗或辅助治疗肿瘤疾病，例如肝、卵巢、肠、肺、乳腺、前列腺、胰腺、肾、胃、子宫内膜、食管、头或颈的肿瘤以及癌性胸腹水瘤等肿瘤。本发明的多糖脂质体还具有机体免疫调节的作用，例如可以用于提高肝炎、类风湿性关节炎或艾滋病患者的免疫功能。多糖被包封为脂质体后的给药与单纯的多糖给药相比，其疗效有明显提高。
本发明的多糖脂质体具有包封率高的特点。其中，本发明的多糖脂质体的包封率在65％以上；优选地，包封率在70％以上；更优选地，包封率在80％以上。本发明的脂质体在具备较高包封率的同时具有均匀的较小粒径，通常该脂质体的粒径在1μm以下；优选的粒径为100～500nm；更优选的粒径为140～300nm。
本发明所称脂质体的包封率是指，脂质体内包封的多糖与制备脂质体的原料中的多糖的重量百分比。
本发明的脂质体可以和选自以下的一种或多种其他药物活性成分制成相应的药物组合物：
抗肿瘤药，例如细胞毒剂类如博来霉素(Bleomycin)、阿霉素(Doxorubicin)、丝裂霉素(Mitomycin)、卡莫司汀(Carmustine)、卡铂(Carboplatin)、顺铂(Cisplatin)、异丙铂(Iproplatin)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、吉西他宾(Gemcitabine)、多西他赛(Docetaxel)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、美法仑(Melphalan)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、长春瑞滨(Vinorelbine)、长春新碱(Vincristine)、紫杉醇(Paclitaxel)等，激素或抗激素类如氨鲁米特(Aminoglutethimide)、阿那曲唑(Anastrozole)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、伊立替康(Irinotecan)、利妥昔单抗(Rituximab)、他莫昔芬(Tamoxifen)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)等；
抗感染性疾病药物，例如，抗病毒药如更昔洛韦(Ganciclovir)、利巴韦林(Ribavirin)、阿糖腺苷(Vidarabine)、泛昔洛韦(Famciclovir)、拉米夫定(Lamivudine)、阿巴卡韦(Abacavir)、奈韦拉平(Nevirapine)、茚地那韦(Indinavir)等，抗炎药如阿司匹林(Aspirin)、布洛芬(Ibuprofen)、吲哚美辛(Indometacin)、吡罗昔康(Piroxicam)、尼美舒利(Nimesulide)、氨基葡萄糖(Glucosamine)等；
免疫调节剂例如干扰素类或白细胞介素类活性药物等。
本发明的脂质体或上述组合物还可以与以下一种或多种可药用载体、赋形剂或辅料组合使用，例如填充剂、吸收剂、湿润剂、黏合剂、润滑剂、着色剂、调味剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、崩解剂、包衣材料、分散剂和助悬剂等。
本发明的多糖脂质体或其组合物可采用多种方式递送至受试者的目的部位。例如，可以以合适的形式通过口服给药、注射给药(静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射)等给药途径靶向于治疗部位，从而获得增强的免疫调节作用或抗肿瘤作用等。
本发明的脂质体也可以和其他的例如上文所述各活性药物进行体内联合给药，用于获得上述治疗作用。
下面将通过实施例对本发明的实施方案作进一步举例说明。以下实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。
实施例1
脂质体1的原料处方：
  香菇多糖   0.1g
  大豆磷脂   8.0g
  胆固醇   1.0g
  聚乙二醇2000   0.2g
  维生素E   0.2g
  去氧胆酸钠   0.9g
脂质体1的制备：
称取8.0g大豆磷脂、1.0g胆固醇、0.2g聚乙二醇2000和0.2g维生素E，加氯仿900ml，搅拌溶解，得油相混合物。称取0.1g注射级香菇多糖和0.9g去氧胆酸钠，加入注射用水300ml，并加入0.1mol/L氢氧化钠液适量至香菇多糖溶解，用0.1mol/L盐酸调节溶液pH值为7.0～8.0，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后间歇超声乳化约5min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在40℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入0.9％氯化钠溶液200ml，40℃孵化1h，得到脂质体溶液。用微孔滤膜过滤除菌，分装即得100支香菇多糖脂质体注射液。
对脂质体1的评价：
取0.2ml脂质体1置于10ml锥形离心管中，加0.2ml鱼精蛋白(10mg/ml)，振荡均匀，静置3min，加0.05mol/L氢氧化钠溶液至5ml。室温下以3000r/min离心30min，取2ml上清液，向其中加入0.2％硫酸蒽酮溶液(由0.2g蒽酮加100ml浓硫酸配制而成)4ml，振荡混匀，置沸水浴中加热6min，置冰水浴中冷却2min，室温放置10min，测定吸光度；另取经五氧化二磷干燥至恒重的香菇多糖对照品适量，精密称定，加少量0.5mol/L氢氧化钠溶液研磨溶解，加水稀释制成每1ml中含20μg的溶液，同法测定，计算，即得未被包封香菇多糖量。由下式计算包封率：
包封率(％)＝(1-未包封香菇多糖量/香菇多糖总量)×100％
测得样品的香菇多糖包封率为82.8％。
(2)粒径和显微形态
用激光粒度分析仪(美国Backmman DELSA 440S型激光粒度分析仪)测定脂质体1的粒径范围为200～400nm，平均粒径为316nm(附图1)。经透射电镜(荷兰FEI Tecnai G212透射电子显微镜)观察，可见脂质体1外观呈球状，结构清晰(附图2)。
实施例2
脂质体2的原料处方：
  香菇多糖   0.1g
  大豆磷脂   8.0g
  胆固醇   1.0g
  聚乙二醇2000   0.2g
  维生素E   0.2g
  去氧胆酸钠   0.9g
制备：称取8.0g大豆磷脂、1.0g胆固醇、0.2g聚乙二醇2000和0.2g维生素E，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.1g注射级香菇多糖和0.9g去氧胆酸钠，加入注射用水300ml，并加入0.1mol/L氢氧化钠液适量至香菇多糖溶解，用0.1mol/L盐酸调节pH值为7.0～8.0，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后间歇超声乳化约5min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在40℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入2％甘露醇的磷酸缓冲液(pH值6.0～6.5)200ml，40℃孵化1h，得到脂质体2的溶液。
所得溶液用微孔滤膜过滤除菌，分装为100支，-50℃预冻2h，逐渐升温至-6℃，共约8h，继续逐渐升温至30℃，共12h，得淡黄色块状物，即脂质体2的粉针剂形式。
将所得粉针剂复溶后按实施例1所述方法，测定脂质体2的包封率为84.3％，平均粒径为318nm，经透射电镜观察，可见脂质体2的外观呈球状，结构清晰。
实施例3
脂质体3的原料处方：
  香菇多糖   0.1g
  大豆磷脂   6.1g
  胆固醇   0.8g
  聚乙二醇1000   0.2g
  维生素E   0.2g
  去氧胆酸钠   0.5g
制备：称取6.1g大豆磷脂、0.8g胆固醇、0.2g聚乙二醇1000和0.2g维生素E，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.1g注射级香菇多糖和0.5g去氧胆酸钠，加入注射用水300ml，并加入0.1mol/L氢氧化钠液适量至香菇多糖溶解，用0.1mol/L盐酸调节pH值为7.0～8.0，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后间歇超声乳化约6min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在35℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入pH值6.0～6.5磷酸盐缓冲溶液200ml，40℃孵化1.5h，得到脂质体溶液。如实施例1所述方法测得香菇多糖包封率为82.2％，平均粒径为302nm。经透射电镜观察，可见脂质体3的外观呈球状，结构清晰。
实施例4
脂质体4的原料处方：
  香菇多糖   0.1g
  大豆磷脂   5.2g
  胆固醇   0.7g
  聚乙二醇2000   0.2g
  维生素E   0.2g
  去氧胆酸钠   0.7g
制备：称取5.2g大豆磷脂、0.7g胆固醇、0.2g聚乙二醇2000和0.2g维生素E，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.1g注射级香菇多糖和0.7g去氧胆酸钠，加入注射用水300ml，并加入0.1mol/L氢氧化钠液适量至香菇多糖溶解，用0.1mol/L盐酸调节pH值为7.0～8.0，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后间歇超声乳化约6min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在40℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入2％甘露醇水溶液200ml，45℃孵化1.5h，用微孔滤膜过滤，得到脂质体4的溶液。如实施例2的方法制备脂质体2的粉针剂。将其复溶后，按实施例1的方法测得香菇多糖包封率为75.1％，平均粒径为297nm。经透射电镜观察，可见脂质体4的外观呈球状，结构清晰。
实施例5
脂质体5的原料处方
  黄芪多糖   0.2g
  大豆磷脂   10.0g
  胆固醇   1.5g
  聚乙二醇2000   0.3g
  去氧胆酸钠   1.0g
制备：称取10.0g大豆磷脂、1.5g胆固醇和0.3g聚乙二醇2000，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.2g黄芪多糖和1.0g去氧胆酸钠，加注射用水300ml，搅拌至溶解，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后间歇超声乳化约6min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在40℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入注射用水200ml，40℃孵化1.5h，用微孔滤膜过滤除菌，分装为100支，即得黄芪多糖脂质体注射液。按实施例1的方法测得黄芪多糖包封率为75.2％，平均粒径为293nm。经透射电镜观察，可见脂质体5的外观呈球状，结构清晰。
实施例6
脂质体6的原料处方
  黄芪多糖   0.2g
  大豆磷脂   10.0g
  胆固醇   1.5g
  聚乙二醇2000   0.7g
  去氧胆酸钠   0.9g
制备：称取10.0g大豆磷脂、1.5g胆固醇和0.7g聚乙二醇2000，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.2g黄芪多糖和0.9g去氧胆酸钠，加注射用水300ml，搅拌至溶解，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后间歇超声乳化约6min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在40℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入含2％甘露醇的磷酸盐缓冲溶液(pH值6.5)200ml，40℃孵化1.5h，得到脂质体6溶液。
如实施例2所述方法得到脂质体6的粉针剂。复溶后，如实施例1所述方法测得黄芪多糖包封率为84.5％，平均粒径为308nm。经透射电镜观察，可见脂质体6的外观呈球状，结构清晰。
实施例7
脂质体7的原料处方
  香菇多糖   0.1g
  大豆磷脂   5.0g
  胆固醇   0.6g
  聚乙二醇2000   0.2g
  维生素E   0.2g
  吐温80   0.4g
制备：称取5.0g大豆磷脂、0.6g胆固醇、0.2g聚乙二醇2000和0.2g维生素E，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.1g注射级香菇多糖和0.4g吐温80，加入注射用水300ml，并加入0.1mol/L氢氧化钠液适量至香菇多糖溶解，用0.1mol/L盐酸调节pH值为7.0～8.0，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后循环高压乳化约6min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在40℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入pH值6.0～6.5磷酸盐缓冲溶液200ml，40℃孵化1.5h，得到脂质体7的溶液。按实施例1所述方法测得香菇多糖包封率为80.2％，平均粒径为293nm。经透射电镜观察，可见脂质体7的外观呈球状，结构清晰。
实施例8
脂质体8的原料处方
  香菇多糖   0.1g
  大豆磷脂   6.1g
  胆固醇   1.5g
  聚乙二醇2000   0.2g
  维生素E   0.2g
  吐温80   0.4g
制备：称取6.1g大豆磷脂、1.5g胆固醇、0.2g聚乙二醇2000和0.2g维生素E，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.1g注射级香菇多糖和0.4g吐温80，加入注射用水300ml，并加入0.1mol/L氢氧化钠液适量至香菇多糖溶解，用0.1mol/L盐酸调节pH值为7.0～8.0，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后用间歇超声乳化约6min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在40℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入2％含甘露醇的磷酸盐缓冲液(pH值6.0～6.5)200ml，40℃孵化1.5h，得到脂质体8的溶液。采用如实施例2的方法制备脂质体8的粉针剂。将其复溶后，按实施例1的方法测得香菇多糖包封率为82.1％，平均粒径为305nm。经透射电镜观察，可见脂质体8的外观呈球状，结构清晰。
实施例9
脂质体9的原料处方：
  香菇多糖   0.1g
  大豆磷脂   7.0g
  胆固醇   0.8g
  聚乙二醇1000   0.6g
  维生素E   0.2g
  去氧胆酸钠   0.5g
制备：称取7.0g大豆磷脂、0.8g胆固醇、0.5g聚乙二醇1000和0.2g维生素E，加氯仿900ml，搅拌使溶解，得油相混合物。称取0.1g注射级香菇多糖和0.6g去氧胆酸钠，加入注射用水300ml，并加入0.1mol/L氢氧化钠液适量至香菇多糖溶解，用0.1mol/L盐酸调节pH值为7.0～8.0，得水相混合物。冰水浴冷却下，将水相混合物缓缓加入油相混合物中，然后间歇超声乳化约6min，得乳白色均一的W/O型乳剂。在35℃和氮气保护下减压旋转蒸发除去溶剂得淡黄色浓稠胶状物，加入pH值6.0～6.5磷酸盐缓冲溶液200ml，40℃孵化1.5h，得到脂质体溶液。如实施例1所述方法测得香菇多糖包封率为75.0％，平均粒径为312nm。经透射电镜观察，可见脂质体9的外观呈球状，结构清晰。
实施例10
以上述制备而得的香菇多糖脂质体(脂质体9)为例考察了本发明多糖脂质体的机体免疫调节作用和体内抗肿瘤作用。上述治疗作用通过测定巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)和淋巴细胞活性以及抑瘤率来确定。
小鼠肿瘤模型制备：
取健康成熟的昆明种雄性小鼠，体重20～24g(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。用H22肝癌细胞(武汉大学医学院教研室赠与)接种小鼠并传代，在本实验室至少进行3代以上的传代复制。从传代小鼠腹腔抽取含有肿瘤细胞的腹水，用RPMI1640培养液(Gibco)稀释至细胞终浓度为2×107/ml，从小鼠右腋下皮下注射该稀释液以接种肿瘤，注射剂量为0.2ml/只小鼠。模型小鼠平均瘤重均大于0.4g，瘤重范围在1.13-3.1g。
实验分组和给药：
根据小鼠接受的受试药物及给药剂量，分为肿瘤模型组、环磷酰胺组、香菇多糖与环磷酰胺联合给药组，以及香菇多糖脂质体与环磷酰胺联合给药组。具体分组如下表1所列。
表1受试药物分组
Figure A20081018924600171
Figure A20081018924600181
肝脏巨噬细胞吞噬活性测定、脾淋巴细胞转化活性测定和NK细胞活性测定中采用的给药方式为，动物在接种H22肝癌细胞第二天随机分为上述四组，腹腔连续给药15天。抑瘤率测定中采用的给药方式为，动物在接种H22肝癌细胞第四天随机分为上述四组，腹腔连续给药15天。
(1)巨噬细胞活性测定
末次给药24h后，处死小鼠。制备肝细胞悬液：用75％酒精浸泡小鼠片刻，无菌取出小鼠肝脏，用D-Hank’s液洗涤3次，称重，然后将同一组动物的肝脏混合，按照重量与体积1∶1的比例加入RPMI1640培养液(Gibco)匀浆，将细胞终浓度稀释调整为2×105/ml。
于96孔酶标板中每孔加100μl如上所得的肝细胞悬液，置二氧化碳孵化箱培养24h。用RPMI1640培养液(Gibco)洗涤3次，即得贴壁单层巨噬细胞。然后，每孔加入0.072％的中性红(Solarbio公司)生理盐水溶液10μl，培养4小时，弃上清，每孔再加入醋酸-乙醇(1∶1)150μl。将96孔板置于摇床中振荡10分钟至结晶完全溶解，置酶标仪(ZS-3型，北京新风机电技术公司)上，在492nm的波长处测定各孔的吸光度，并计算巨噬细胞吞噬活性(OD值)。实验结果采用SPSS统计软件进行分析。所有数据都以x±s表示。采用t检验进行组间比较。结果如下表2所示。
表2受试药物对肝脏吞噬细胞活性影响(x±s)
Figure A20081018924600182
注：与环磷酰胺组相比，**P＜0.01；与香菇多糖+环磷酰胺组相比，##P＜0.01。
该实验结果显示：环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，巨噬细胞活性差异较小，表明环磷酰胺对荷瘤小鼠肝脏巨噬细胞吞噬活性影响较小；香菇多糖+环磷酰胺组与环磷酰胺组比较，巨噬细胞吞噬活性差异很小，表明香菇多糖对荷瘤小鼠肝脏巨噬细胞吞噬活性影响也较小；香菇多糖脂质体+环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，以及与环磷酰胺组比较，巨噬细胞吞噬活性均显著增强(P＜0.01)，表明香菇多糖脂质体能够显著增强荷瘤小鼠肝脏巨噬细胞吞噬活性；香菇多糖脂质体+环磷酰胺组与同等剂量的香菇多糖+环磷酰胺组比较，荷瘤小鼠的巨噬细胞吞噬活性显著增强(P＜0.01)。由此也证实了包封为脂质体的香菇多糖能显著提高肝脏巨噬细胞的活性。
(2)天然杀伤细胞测试
末次给药24h后，处死小鼠。制备脾细胞混悬液：用75％酒精浸泡小鼠片刻，无菌取出小鼠脾脏，用D-Hank’s液洗涤3次，称重，然后将同一组动物的脾脏混合，按照重量与体积1∶1的比例加入RPMI1640培养液(Gibco)进行匀浆，将细胞终浓度稀释调整为2×106/ml。
在96孔酶标板E孔中加入效应细胞(如上制备的脾细胞)100μl、RPMI1640培养液(Gibco)100μl；T孔加靶细胞(K562细胞(华中科技大学同济医学院基础医学院实验平台中心提供))100μl、RPMI1640培养液(Gibco)100μl，E+T孔加效应细胞100μl，靶细胞100μl。各设3个复孔。置于37℃二氧化碳孵化箱培养24h。于终止培养前4h加入5mg/ml的MTT(sigma公司)20μl，置于37℃、5％CO2孵箱中继续培养4h后，去上清液，每孔加入150μl DMSO。将96孔板置于摇床中振荡10分钟至结晶完全溶解。以DMSO作为空白溶剂，在492nm的波长处，测定各孔吸光度。结果计算：NK细胞杀伤率＝[1-(DE+T-DE)/DT]×100％。实验结果采用SPSS统计软件进行分析。所有数据都以x±s表示。采用t检验进行组间比较。结果如下表3所示。
表3受试药物对NK细胞杀伤率的影响(x±s)
Figure A20081018924600201
注：与环磷酰胺组相比，*P＜0.05；与香菇多糖+环磷酰胺组相比，#P＜0.05。
该实验结果显示：环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，NK细胞杀伤率显著降低(P＜0.05)，表明环磷酰胺对荷瘤小鼠NK细胞杀伤率具有抑制作用；香菇多糖+环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，NK细胞杀伤率降低，但与环磷酰胺组比较，NK细胞杀伤率增大，但无统计学意义，表明香菇多糖与环磷酰胺联合用药时，能够部分消除环磷酰胺对荷瘤小鼠NK细胞的毒副作用；香菇多糖脂质体+环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，以及与环磷酰胺组比较，NK细胞杀伤率均显著增大(P＜0.05)，表明香菇多糖脂质体与环磷酰胺联合用药时，不仅能够消除环磷酰胺对荷瘤小鼠NK细胞的毒副作用，还能够显著提高荷瘤小鼠脾NK细胞的杀伤率；香菇多糖脂质体+环磷酰胺组与同等剂量的香菇多糖+环磷酰胺组比较，NK细胞杀伤率显著增大(P＜0.05)，表明香菇多糖脂质体与香菇多糖相比能显著增强荷瘤小鼠NK细胞杀伤率。
(3)淋巴细胞增殖活性测试
如上所述，制备脾细胞混悬液。向96孔培养板中每孔分别加入脾细胞悬液100μl。各受试药物组分别设对照孔和试验孔。在试验孔中加入PHA-P(sigma公司)100μl(12.5μg/ml)，对照孔中加入RPMI1640(Gibco)100μl。置于37℃、5％CO2孵箱中培养24h。此后步骤如以上第(2)部分所述。结果计算：转化率＝(OD试验孔-OD对照孔)/OD对照 孔×100％。实验结果采用SPSS统计软件进行分析。所有数据都以x±s表示。采用t检验组间进行比较。结果如下表4所示。
表4受试药物对脾脏淋巴细胞增殖率的影响(x±s)
Figure A20081018924600202
注：与环磷酰胺组相比，*P＜0.05；与香菇多糖+环磷酰胺组相比，#P＜0.05。
该实验结果显示：环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，脾脏淋巴细胞增殖率显著降低(P＜0.05)，表明环磷酰胺对荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞增殖率具有抑制作用；香菇多糖+环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，淋巴细胞增殖率差异很小，但与环磷酰胺组比较，淋巴细胞增殖率增大，表明香菇多糖与环磷酰胺联合用药时，能够消除环磷酰胺对荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的毒副作用；香菇多糖脂质体+环磷酰胺组与肿瘤模型组比较，以及与环磷酰胺组比较，淋巴细胞增殖率显著增大(P＜0.05)，表明香菇多糖脂质体与环磷酰胺联合用药时，不仅能够消除环磷酰胺对荷瘤小鼠淋巴细胞的毒副作用，还能够显著提高荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的增殖率；香菇多糖脂质体+环磷酰胺组与同等剂量的香菇多糖+环磷酰胺组比较，淋巴细胞增殖率显著增大(P＜0.05)，表明香菇多糖脂质体与香菇多糖相比能显著提高荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性。
(4)抑瘤率测定
末次给药24h后，处死小鼠。分离小鼠肿瘤，将肿瘤称重，并计算抑瘤率。结果如下表2所示。实验结果采用SPSS统计软件进行分析。所有数据都以x±s表示。采用t检验进行组间比较。实验结果如下表5所示。
表5受试药物的抑瘤率比较(x±s)
Figure A20081018924600211
与环磷酰胺相比，*P＜0.05
按照《抗肿瘤药物药效学指导原则》疗效评价标准：抑瘤率≤40％为无效，抑瘤率＞40％且经统计学处理P＜0.05(与肿瘤模型组比较)为有效的评价标准。
实验结果显示：香菇多糖+环磷酰胺组与环磷酰胺组比较，抑瘤率增大，表明香菇多糖可以增强环磷酰胺的抑制肿瘤作用，但该差异无统计学意义；而香菇多糖脂质体+环磷酰胺组与环磷酰胺组比较，抑瘤率显著增大(P＜0.05)，表明香菇多糖脂质体能够显著增强环磷酰胺的抑制肿瘤作用。由此证明了香菇多糖脂质体具有优于香菇多糖的明显抗肿瘤活性。

Claims (38)

1.一种多糖脂质体，其特征在于制备所述脂质体的原料包括多糖、磷脂、胆固醇、表面活性剂和聚乙二醇。
2.权利要求1的脂质体，其特征在于所述多糖为香菇多糖、黄芪多糖、银耳多糖、银耳孢糖、人参多糖、灵芝多糖、猪苓多糖，或其混合物。
3.权利要求1的脂质体，其特征在于所述多糖为香菇多糖或黄芪多糖。
4.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化大豆磷脂、氢化卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇衍生化磷脂，或其混合物。
5.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述表面活性剂为去氧胆酸盐、波洛沙姆、吐温80，或其混合物。
6.权利要求5的脂质体，其特征在于所述表面活性剂为去氧胆酸钠或去氧胆酸钾。
7.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述聚乙二醇选自聚乙二醇800-5000、磷脂化的聚乙二醇衍生物及其混合物。
8.权利要求7的脂质体，其特征在于所述聚乙二醇为聚乙二醇1000-2400。
9.权利要求8的脂质体，其特征在于所述聚乙二醇为聚乙二醇2000。
10.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述原料还包括抗氧化剂，和/或冻干保护剂。
11.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述原料包括多糖1份，磷脂30-100份、胆固醇2-20份，表面活性剂3-12份，聚乙二醇1-8份。
12.权利要求11的脂质体，其特征在于所述原料重量配比为多糖1份，磷脂40-90份、胆固醇5-15份。
13.权利要求11的脂质体，其特征在于所述原料重量配比为多糖1份，磷脂50-70份、胆固醇5-15份。
14.权利要求12的脂质体，其特征在于所述抗氧化剂为1-8份。
15.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征所述脂质体的包封率在65％以上。
16.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述脂质体的包封率在70％以上。
17.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述脂质体的包封率在80％以上。
18.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述脂质体具有1μm以下的粒径。
19.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述脂质体具有100～500nm的粒径。
20.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述脂质体具有140～300nm的粒径。
21.权利要求1-3任一项的脂质体，其特征在于所述脂质体以注射液或粉针剂形式存在。
22.一种含有权利要求1-21之一的脂质体的组合物。
23.权利要求22的组合物，其特征在于所述组合物还含有一种可药用载体。
24.权利要求22或23的组合物，其特征在于所述组合物还含有一种或多种抗肿瘤药物或免疫调节药物活性成分。
25.权利要求22或23的组合物，其特征在于所述组合物以注射液或粉针剂的形式存在。
26.一种制备权利要求1-21的脂质体的方法，包括以下步骤：
a.将包括磷脂、胆固醇和聚乙二醇的原料溶于有机溶剂中，得到油相混合物；
b.将包括多糖和表面活性剂的原料溶于水或水溶液中，得到水相混合物；
c.将水相混合物注入油相混合物中，并进行乳化处理；
d.在保护性气体中恒温减压蒸发除去溶剂；
e.加入水或水溶液后水浴孵化。
27.权利要求26的方法，其特征在于所述方法还包括以下步骤：
f.将步骤e所得溶液过滤后进行冷冻干燥。
28.权利要求26或27的方法，其特征在于所述步骤a的有机溶剂为氯仿或氯仿-甲醇。
29.权利要求25或26的方法，其特征在于所述步骤c的乳化处理为间歇超声处理或循环高压乳化处理。
30.权利要求26或27的方法，其特征在于所述步骤e的水浴孵化在35-50℃下进行。
31.权利要求30的方法，其特征在于所述步骤e的水浴孵化在40℃下进行。
32.权利要求26或27的方法，其特征在于进行所述b步骤与所述e步骤反应环境的酸碱度不一致。
33.权利要求26或27的方法，其特征在于进行所述b步骤与所述e步骤反应环境的酸碱性相反。
34.权利要求33的方法，其特征在于所述e步骤中进行水浴孵化的时间为1-2h。
35.权利要求26或27的方法，其特征在于所述步骤a的所述原料还包括抗氧化剂。
36.权利要求26或27的方法，其特征在于所述步骤e的所述水溶液含有冻干保护剂。
37.权利要求1-21任一项的脂质体用于制备抗肿瘤或调节机体免疫作用的药物的用途。
38.权利要求22-25任一项的组合物用于制备抗肿瘤或调节机体免疫作用的药物的用途。
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